CN1187372C

CN1187372C - 人绒毛膜促性腺激素基因工程合成嵌合肽及其制备方法

Info

Publication number: CN1187372C
Application number: CNB031158943A
Authority: CN
Inventors: 谢毅; 徐万祥; 应康; 邱德义; 顾少华; 廖矛川
Original assignee: Fudan University; Shanghai Institute of Planned Parenthood Research
Current assignee: Fudan University; Shanghai Institute of Planned Parenthood Research
Priority date: 2003-03-19
Filing date: 2003-03-19
Publication date: 2005-02-02
Anticipated expiration: 2023-03-19
Also published as: CN1446825A

Abstract

本发明涉及一种人绒毛膜促性腺激素(hCG)嵌合肽CP7及其衍生物和CP11以及通过基因工程的制备方法。设计的两种hCG嵌合肽分别具有氨基(N)端6个或5个连续的广谱性或单倍型强T-细胞表位，以及羧基端(CTP)hCGβ靶抗原的3个线性B-细胞表位β5^45-52，β9^113-116和β8^137-144。编码CP7和CP11二种hCG嵌合肽的基因都能在大肠杆菌中表达，而且表达产物可通过制备性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)获得。这二个生物合成的CP7和CP11嵌合肽可以用于制备新型的肿瘤治疗性和/或避孕hCG肽疫苗原，此生物合成肽中的又一类6个连续T-细胞表位肽段也可作为半分子用于构建其他靶抗原的基因工程嵌合肽免疫原。

Description

人绒毛膜促性腺激素基因工程合成嵌合肽及其制备方法

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体分析涉及一种hCG生物合成嵌合肽(CP7和CP11)及其制备方法。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)是维持人类早期妊娠的一种胎盘糖蛋白激素，在常见的恶性肿瘤中也都有表达(Triozzi Pand Stevens VC.Humanchorionic gonadotropin as a target for cancer vaccines.Oncol Rep 6：7-17，1999)，其异质二聚体由α和β链构成。作为避孕和/或肿瘤治疗性疫苗原，一直使用天然的hCGβ链和其非常特异的羧基端(CTP)化学合成37肽(hCGβ-CTP)。前者与羊LHα亚单位偶联的hCGβ异源二聚体(HSD-hCG)疫苗已通过人临床II期功效试验(Talwar GP，et al.Avaccine that prevents pregnancy in women.Proc Natl Acad Sci USA 91：8523-8536)，但是由于hCGβ分离纯化成本高、需要诸如破伤风类毒素(TT)和/或白喉类毒素(DT)等大分子蛋白载体，以及包括使用特殊的免疫佐剂、疫苗制剂生产程序复杂而不易按GMP标准批量生产等原因，特别是该疫苗的免疫应答受主要组织相容性复合物(MHC)的免疫应答遗传限制，如在HSD-hCG疫苗的人临床II期试验中有20％的受试妇女出现不应答或无效应答，因而已被判定不可能实际推广应用(Stevens VC.Progress in the development of humanchorionic gonadotropin antifertility vaccines.Am J Reprod Immunol 35：148-155，1996)。后者化学合成的hCGβ-CTP 37肽疫苗，则由于制剂生产等方面的原因，历经十多年的努力仍未能被推上人临床II期功效试验。虽然后者的应用已主要转向一些hCG依赖性恶性肿瘤的治疗(Moulton HM，et al.Active specific immunotherapy with a β-humanchorionic gonadotropin peptide vaccine in patients with metastatic colorectalcancer：antibody response is associated with improved survival.Clin Cancer Res8(7)：2044-2051，2002)，但它的疫苗研制也存在与hCGβ合成肽疫苗同样的问题，另外还有它所产生的抗体专一性虽好，但对靶抗原hCG亲和性差的缺陷。

另一方面，在疫苗发展史上，合成肽疫苗曾被寄希望能成为继全病毒或病原菌疫苗和蛋白亚单位疫苗之后的第三个里程碑。尽管用化学合成方法具有可以恒定地获得含有效B细胞表位的肽抗原，而且相对稀少抗原，其制备成本可以大幅度地降低等优点，但合成长度受仪器和方法学的限制，仅含靶抗原1或2个B-细胞表位的化学合成肽疫苗很难达到令人满意的免疫学效果，因而化学合成肽疫苗研制数十年，至今仍无可被临床上实际推广应用的实例。随着″Promiscuous″(非选择性，广谱性)即可被大多数MHC(单倍型主要组织相容性复合物)II类分之识别的T-细胞表位被鉴定(Sinigaglia F，et al.A malaria Tcell epitope recognized in association with most mouse and human class II molecules.Nature 336：778-780，1998；Panina-Bordi gnon P，et al.Universally immunogenic Tcell epitopes：promiscuous binds to human class II and promiscuous recognitionby T cells.Eur J Immunol 19：2237-2242，1989)，又发展形成了在一合成肽中同时组合靶抗原自身B-细胞表位和自身或外源T-细胞表位这一研制化学合成嵌合肽疫苗新趋势(Xu WX.Trends in the development of chimeric peptide vaccines containing B-and T-cell epitopes.US Chin J Microbiol Immunol 2(4)：95-100，2000)。许多研究也取得了预期的新成果，如由于合成肽中T-细胞表位的存在，减少了它对佐剂的依赖性，一般仅通过人用铝盐佐剂的吸附，就能产生与用福氏完全佐剂一样或很接近的免疫学效果，尤其是合成肽中广谱性T-细胞表位的选用，均能在遗传背景不同的受试近交系小鼠品系中产生广泛有效的免疫应答(Greenstein JL，et al.A universal T cellepitope-containing peptide from hepatitis B surface antigen can enhance antibodyspecific for HIV gp120.J Immunol 148：3970-3977，1992；Lou YH，et al.A zonapellucida 3 peptide vaccine induces antibodies and reversible infertility withoutovarian pathology.J Immunol 155：2715-2720，1995)。很明显，组合B-和T-细胞表位的嵌合肽疫苗有着良好的发展前景。但是，这一嵌合肽疫苗同样受到化学合成长度的限制，也不可能尽可能多地组合B-和T-细胞表位，以达到最佳的免疫学效果。为此也就有了通过基因工程研制生物合成嵌合肽疫苗这一新策略的尝试，如利用昆虫细胞表达系统研制疟原虫多价即含自身12个特异B-细胞表位和10个Th-或Tc-细胞表位的嵌合肽疫苗的研究(Shi YP，et al.Immunogenicity and in vitro protective efficacy of arecombinant multistage Plasmodium falciparum candidate vaccine.Proc Natl AcadSci USA 96：1615-1620，1999)。

从hCGβ嵌合肽疫苗研制现状来看，也已有复合并用hCGβ环肽^38-57(内含β5线性B-细胞表位^45-52)和hCGβ-CTP^109-145(内含β9和β8特异的线性B-细胞表位^{113-116，137-144})合成肽疫苗的建议，因为hCGβ环肽和hCGβ-CTP合成肽(均与DT偶联)疫苗1∶1混合物的抗体应答水平显著高于两者单独免疫的效果，而且与单一合成肽疫苗的抗血清相比较，混合物免疫产生的抗血清中和以及结合靶hCG的能力也有明显的改善(Stevens VC.Progress in thedevelopment of human chorionic gonadotropin antifertility vaccines.Am J ReprodImmunol 1996，35：148-155)。但是，这一设想的付诸实施显然存在不少障碍，例如，两合成肽的单独合成，进而再分别与提供Th-细胞表位的TT或DT蛋白载体偶联等步骤，均使疫苗制备程序复杂化，也会大大增加此复合疫苗的生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供两个编码hCGβ的3个线性B-细胞表位和外源性6个Th-细胞表位(包括HBsAg^19-33和Pf-CS^326-345二个广谱性表位)的合成基因(CP7和CP11)和它们的重组表达质粒。构建的pET11c-CP7和pET11c-CP11质粒均能在大肠杆菌中以包涵体形式表达嵌合肽CP7和CP11蛋白。本发明通过基因工程实现了优化的hCGβ环肽和hCGβ-CTP的线性连接，表达的两个hCG嵌合肽由于在其N端掺入了足够多的外源广谱性或单倍型T细胞表位，不再需要与其他大分子蛋白载体偶联，因而为筛选免疫原性更佳并能在遗传背景不同的被免疫人群中产生广泛免疫应答的hCG合成肽免疫原奠定了基础。所独特设计的二个hCG嵌合肽及其它们的编码基因都能在大肠杆菌中表达，可廉价恒定地提供此二种生物合成hCG嵌合肽免疫原。

本发明还提供了HBsAg^19-33-HBcAg^85-140-Pf-CS^326-345这一半分子T-细胞表位肽载体。这一种载体也可用于设计构建其他靶抗原的基因工程嵌合肽或它(们)的编码基因。

本发明的内容具体描述如下：

根据免疫学原理和hCG疫苗研究现状，特别针对其推广应用所面临的主要障碍，例如，如何能廉价恒定地获得hCG疫苗抗原？怎样在具特异性的基础上增加hCGβ-CTP合成肽抗血清中和hCG的性能？能否避免使用提供体内免疫应答所需Th细胞表位的大分子蛋白载体和特殊佐剂，以方便疫苗制剂生产并降低生产成本？另外，还有″疫苗百家姓″的问题，即如何避开MHC遗传限制，在欲避孕妇女的被免疫人群包括hCG激素依赖性恶性肿瘤患者的有效免疫应答率？我们设计了旨在解决以上问题的又一类新型优化的hCG嵌合肽免疫原CP7和CP11，它们均由hCGβ中3个线性B细胞表位和包括2个广谱性表位在内的6个外源Th细胞表位组成。见SEQ.NO1和SEQ.NO3，CP11实际上是CP7的衍生物，前者仅是将CP7中的Pf-CS^326-345与hCGβ^38-57的位置作了互换。它们均可单独应用，也可作为复合疫苗使用，如果两者单独免疫所产生的抗体种类不完全但能互补的话。

本发明还提供了编码hCG嵌合肽CP7和CP11的DNA序列，见SEQ.NO3和SEQ.NO4。CP7和CP11的五个B-和T-细胞表位片段均选自己上市在临床应用或已经过人临床试验证明无明显副作用的疫苗组份。hCGβ的二个片段(38-57和111-145)编码基因序列依据已克隆的hCGβcDNA序列(Fiddes JC and Goodman HM.The cDNA for the β-subunitof human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough intothe 3’-untranslated region.Nature 286：684-687，1980)，其中部分氨基酸密码子改用了大肠杆菌偏爱的密码子。CP7和CP11嵌合肽中以hCGβ环肽^38-57代替β5^45-52表位(Stevens VC，et al.The identification of peptide sequences of human chorionicgonadotropin containing a conformational epitope.Immunol Litters 12：11-18，1986)，以hCGβ-CTP^111-145代替β9^113-116和β8^137-144两个特异表位(Dirnhofer S，et al.Themolecular basis for epitopes on the freeβ-subunit of human chorionicgonadotrophin(hCG)，its carboxyl-terminal peptide and the hCGβ-core fragment.J Endocrinol 141：153-162，1994)，是基于生物合成的肽需要一定的长度，以方便表达产物的SDS-PAGE电泳检测，以及适当增加合成肽长度也有利于它们的免疫原性增强这二点考虑。hCGβ-CTP^109-145中Thr(苏氨酸)¹⁰⁹和Cys(半胱氨酸)¹¹⁰两个残基的弃用，则是为了避免设计分子中过多的Cys残基。

本发明的CP7和CP11两个hCG嵌合肽通过上述各表位或肽片段编码基因片段拼接，并在其5’端加上EcoR I-Nde I酶切位点和ATG起始密码子，以及在其3’端末接上TAA终止密码子和BamH I酶切位点后，以完整的目的嵌合肽阅读框重组插入可经IPTG诱导的pET11c这一细菌表达质粒，最终在低成本且便于操作的大肠杆菌中实现了CP7和CP11的表达。表达产物经用可识别hCGβ^133-139序列的单克隆抗体OT3A的免疫印迹(Western blottingtest)鉴定，证实了所设计构建的CP7和CP11 hCG嵌合肽的特异表达。

本发明构建的生物合成hCG嵌合肽CP7和CP11中，其N端的六个Th细胞表位的选择依据以下公开信息：

1、广为所知，HBsAg是一能诱发自身抗体生成的强力免疫原，表明它本身具有强Th-细胞表位。所鉴定的HBsAg^19-33则是可被不同HLA-DR和-DQ单倍型识别的″广谱性″T细胞表位。Greenstein JL等报道：此肽与HIV-1被膜gp120第三可变区结构域(V3环，能引导有效中和抗体区)共线性化学合成的嵌合肽，仅用铝盐佐剂吸附就在全部6种不同近交系小鼠品系中都诱发产生了抗V3环肽抗体(Greenstein JL，et al.A universal T cell epitope-containing peptide from hepatitis B surface antigen can enhance antibody specificfor HIV gp120.J Immunol 148：3970-3977，1992)；

2、在已上市应用的疫苗中，HBcAg也是一种强力免疫原。其85-140肽中存在的各T细胞表位也早已被鉴定(Tiollais P，et al.Biology of hepatitis B virus.Science 213：406-411，1981；Milich DR，et al.Hepatitis B synthetic immunogen comprised ofnucleocapsid T-cell sites and an envelope B-cell epitope.Proc Natl Acad SciUSA 85：1610-1614，1988)。现已清楚HBcAg^85-100为H-2^d、HBcAg^100-120为H-2^f和H-2^q、HBcAg^120-131为B10.S(H-2^s)、HBcAg^129-140为B10(H-2^b)，以及HBcAg^120-140为H-2^s，b的MHC II类限制性T辅助性细胞表位。很清楚，HBcAg^85-140肽中至少含有四个Th-细胞表位。选用由57个氨基酸残基组成的HBcAg此段肽，既是为完善所构建嵌合肽的T细胞刺激广谱性，从而达到增强此T细胞表位肽段的分子佐剂作用，同时也同样是出于生物合成肽需要一定长度的考虑。

3、众所周知，广谱的定义是相对而言的。因此，为了在遗传背景趋异的免疫人群中尽可能地产生接近100％的免疫应答率，我们所在设计的目的嵌合肽中又并用了另一个也广为熟知和应用的广谱性Th-细胞表位---Pf-CS^326-345(Moreno A，et al.CD4⁺ T Cell clonesobtained from Plasmodium falciparum sporozoite-immunized volunteers recognizepolymorphic sequences of the circumsporozoi te protein.J Immunol 151：489-499，1993；Calvo-Calle JM，et al.Binding of malaria T cell epitopes to DR and DQ moleculesin vitro correlates with immunogenicity in vivo.J Immunol 159：1362-1373，1997；Nardin EH，et al.Plasmodium falciparum polyoximes：highly immunogenic syntheticvaccines constructed by chemoselective ligation of repeat B-cell epitopes and a universalT-cell epitope of CS protein.Vaccine 16：590-600，1998；Caspers P，et al.The circumsporoiteprotein gene grom NF54，a Plasmodium falciparum isolate used in malaria vaccine trials.MolBiochem Parasitol 35：185-190，1989.)。

本发明利用基因工程合成前hCG多嵌合肽，其具体步骤如下：

(1)hCG CP7全长cDNA的设计，得到编码hCG嵌合肽CP7的DNA序列SEQ.No2，在hCG CP7基因阅读框的5’-端增加了起始密码子ATG以及之前的EcoR I-Nde I粘性酶切位点，在它的3’-端添加双终止密码子TGATAA以及其后的BamH I粘性酶切位点；

(2)hCG CP7完整基因的拼接；

(3)hCG CP7基因的克隆和测序；

(4)pET11c/hcG CP7重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达，表达载体选用pPET11c质粒，用Nde I和BamH两种限制性内切酶从经DNA测序鉴定的pBS/CP7质粒中酶切出CP7基因片段，然后用T4 DNA连接酶将它重组插入pET11c质粒的Nde I和BamH I位点。此重组质粒经再次DNA测序鉴定后分别转化蛋白酶缺陷型宿主菌BL21(DE3)plysS；

(5)目标表达产物CP7的分离纯化。

hCG嵌合肽CP11的合成步骤与CP7相同。

本发明提供的上述两个生物合成肽(CP7和CP11)都尽可能多地组合了靶抗原hCGβ中3个线性B-细胞表位和外源性蛋白6个Th-细胞表位。通过基因工程制备的目的嵌合肽中既保有了hCGβ-CTPβ9和β8两个特异性的B-细胞表位，也同时掺入了1个β5这一hCGβ的抗体中和表位。由于它们作为免疫原产生的抗血清既能体现抗体的特异性，也能增强它对靶抗原的亲和性和中和作用，因而可形成新的肿瘤治疗和/或人类避孕合成肽疫苗制备方法和生物制品。其中的6个细胞表位串联肽半分子，选用了乙肝表面抗原中1个T-细胞表位HBsAg^19-33，乙肝核心抗原中至少包含4个T-细胞表位的肽段HBcAg^85-140和/或间隔的恶性疟原虫环子孢子蛋白的1个T-细胞表位Pf-CS^326-345。串联组合的Th-细胞表位肽可起调动体内免疫系统中T-细胞应答的分子佐剂作用，因而这样的嵌合肽免疫原不需要特别的免疫佐剂，也方便生产疫苗制剂(一般仅需经过人用铝盐佐剂吸附即可)。其中选用的HBsAg^19-33和Pf-CS^326-345两个T-细胞表位，其特征在于它们都是强且广谱性的T-细胞表位。两者在一个生物合成肽中的组合并用，有助于克服疫苗研制中普遍存在的″疫苗百家姓″这一问题，即可在主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)遗传背景不同的被免疫人群中有可能产生达到95％以上乃至接近100％的有效免疫应答率。

附图说明

图1为hCG嵌合肽CP7表达和纯化的SDS-PAGE分析。

图2为hCG嵌合肽CP7表达和纯化的蛋白印迹鉴定。

注：1为30℃未诱导工程菌蛋白样品，2为42℃诱导工程菌蛋白样品，3为8Mol尿素溶解未诱导工程菌包涵体蛋白样品，4为8Mol尿素溶解诱导工程菌包涵体蛋白样品，5为经制备性PAGE纯化的CP7表达蛋白，6为低分子量蛋白标准，7为经制备性PAGE纯化的CP7表达蛋白，8为8Mol尿素溶解诱导工程菌包涵体蛋白样品，9为8Mol尿素溶解未诱导工程菌包涵体蛋白样品，10为42℃诱导工程菌蛋白样品，11为未诱导工程菌蛋白样品，黑箭头指示CP7表达蛋白带。

图3为表达和纯化hCG嵌合肽CP11的SDS-PAGE分析。

图4为表达和纯化hCG嵌合肽CP11的蛋白印迹鉴定。

注：1为8Mol尿素溶解未诱导工程菌包涵体蛋白样品，2为8Mol尿素溶解诱导工程菌包涵体蛋白样品，3、经制备性PAGE纯化的CP11表达蛋白，M为低分子量蛋白标准，4为42℃诱导工程菌蛋白样品，5为30℃未诱导工程菌蛋白样品，黑箭头指示CP11表达蛋白带。

具体实施方式

hCG嵌合肽CP7实施例

材料和方法

1、限制性内切酶EcoR I、Sal I、Nde I、BamH I为美国Boehringer Mannheim公司产品，T4 DNA连接酶为英国Biolabs产品，T4多核苷酸激酶为美国New EnglandBiolabs产品，Taq I DNA聚合酶为复旦大学遗传工程国家重点实验室产品，IPTG为美国Promega产品，蛋白质低分子量标准和碱性磷酸酶联羊抗鼠二抗(IgG/HRP)为华美生物工程公司产品，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)和异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)为美国Sigma公司产品，识别hCGβ^133-139序列的单克隆抗体OT3A为荷兰OrganonTechnika的产品。

2、克隆和测序载体pBluescript KS(PBS)购自Stratagene公司，表达载体pET11c和大肠杆菌BL21(DE3)plysS为Novagen公司产品。

3、QIAprep SPIN质粒抽提试剂盒、QIAquick PCR纯化试剂盒和QIAquick胶回收试剂盒为德国QIA公司产品。

4、所设计CP7编码基因的正负链4个(二对)核苷酸碱基片段和构建CP7衍生物CP11基因的Pf-CS^326-345和hCGβ^38-57位置互换8个(四对)核苷酸碱基片段均由生工公司合成。其余片段利用了合成hCG CP7基因时的16个(八对)核苷酸碱基片段，因为CP7和CP11基因中间仅一个广谱性T-细胞表位不同，即前者用Pf-CS^326-345替代了后者的TT^580-599T-细胞表位。

以上材料均有市售。

制备的具体步骤如下：

1、hCG CP7完整基因的设计。

hCG嵌合肽CP7中的外源蛋白T-和目的抗原B-细胞表位排列顺序及其氨基酸序列见SEQ.NO1。

hCG CP7全长cDNA的设计在计算机辅助下完成，阅读框内基本选用大肠杆菌偏爱的密码子，按各T-细胞表位肽段和B-细胞表位肽段已公开发表的编码基因片段进行拼接设计。经PC-GENE软件检索，对个别密码子的组成碱基加以调整，以消除可能的正反重复序列，包括片段与片段之间重叠区碱基互补情况出现以及不合适的酶切位点。在hCG CP7基因阅读框的5’-端增加了起始密码子ATG以及之前的EcoR I-Nde I粘性酶切位点，在它的3’-端添加了双终止密码子TGATAA以及其后的BamH I粘性酶切位点。

所设计的编码hCG嵌合肽CP7的DNA序列见SEQ.NO3。

2、hCG CP7完整基因的拼接。全长456个碱基对(正负链两端预留了EcoR I和BamHI粘性末端)的CP7基因，分成20个从31聚到57聚长度不等的寡聚核苷酸片段进行合成(利用了与hCG CP1相同部分的16个寡聚核苷酸片段)。合成后加ddH₂O稀释成20pmol/μl的各片段先经16％聚丙烯酰胺变性胶电泳鉴定纯度，然后各取16μl(不包括正负链5’-端两个片段)在0.5μl 10U/μl的T4多核苷酸激酶(外加2μl 10mmol/L ATP)催化下进行18个片段的5’-端磷酰化。继之使正负链对应片段分别两两退火复性，再通过酶促反应让相邻的DNA片段分级两两相连。最后一次完整基因连接反应液经5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴乙锭(EB)染色，然后在长波长紫外光下对照分子量标准切割下全长目的基因片段，用″压碎浸泡法″回收DNA。

3、hCG CP7基因的克隆和测序。预留基因两端的EcoR I和BamH I粘性末端的CP1基因片段直接通过DNA重组技术插入也经EcoR I和BamH I双酶切的pBS克隆测序载体，再用酶连接反应液转化大肠杆菌TG1宿主菌，最后在涂布20％的X-gal和100mmol/L的IPTG的LB培养基平板上筛选可能是重组克隆的白色菌落。若干抽提的重组质粒经初步的酶切鉴定后，在ABI373A型DNA自动测序仪的PAGE胶上作基因碱基序列分析。最终确定所要的插入基因序列与设计一致的阳性克隆。

4、pET11c/hCG CP7重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达。表达载体选用了带有强T7启动子的可通过IPTG诱导的pET11c质粒。先用Nde I和BamH两种限制性内切酶从经DNA测序鉴定的pBS/CP1质粒中酶切出CP7基因片段，然后用T4 DNA连接酶将它重组插入pET11c质粒的Nde I和BamH I位点。此重组质粒经再次DNA测序鉴定后分别转化蛋白酶缺陷型宿主菌BL21(DE3)plysS。工程菌BL21(DE3)/pET11c-CP1的诱导表达条件如下：在加入含50μg/ml ampicillin和34μg/ml chloramphenicol的50ml LB培养基(250ml摇瓶)中接种目的工程菌。37℃震摇培养3-4小时使培养物的OD₆₀₀值达到0.5，取3ml起始培养物接种于含500μg ampicillin和340μg chloramphenicol的500ml LB培养基(2000ml摇瓶)中，37℃震摇发酵3-4小时使培养物的OD₆₀₀值达到0.8-1.0，然后加入IPTG(终浓度1.0mM)进行诱导，继续发酵4-5小时。菌液在4℃下5000转/分钟离心15分钟，收集细菌沉淀。

5、目的表达产物的SDS-PAGE分析和蛋白印迹(Western blot)鉴定。经诱导表达的细菌沉淀物以每克湿菌体加入5ml溶液的比例重悬于细菌裂解液中，超声破碎细菌0.5-1小时，于4℃离心收集菌体沉淀，再加50ml含0.5％Triton的裂解液进行超声打匀，之后4℃离心取沉淀，加50ml 1mol/L尿素进行洗涤，离心沉淀物加25ml 8mol/L尿素超声悬浮后，离心取上清进行SDS-PAGE分析。重复上样的另一半凝胶进行电转印，硝酸纤维膜上的目的表达蛋白通过与特异的单克隆抗体OT3A(一抗)和辣根过氧化碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗的反应后，用DAB液显色。

6、目的表达产物CP7的分离纯化。用制备性SDS-PAGE方法[见邹永水、徐万祥等《生物化学与生物物理学报》(2002)，第34卷第5期，第671-674页]一步纯化CP1表达蛋白，每升大肠杆菌培养液可获得电泳条带均一性高于95％以上的0.1-0.5毫克的目的蛋白。蛋白质纯度通过SDS-PAGE方法检测。

hCG嵌合肽CP11实施例：

材料和方法，以及按hCG嵌合肽CP11分子设计的基因构建、目的蛋白表达、鉴定和分离纯化的路线和步骤与上述例相同。

hCG嵌合肽CP11中的T-和B-细胞表位排列顺序及其氨基酸序列见SEQ.NO2。

所设计的编码hCG嵌合肽CP11的DNA序列见SEQ.NO4。

研究结果表明，我们已经成功地hCG嵌合肽CP7和CP11人工基因以及pET11c/CP7和pET11c/CP11重组表达质粒，用它们转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)plysS后都能以包涵体形式表达出CP7和CP11目的蛋白，并通过蛋白印迹实验获得验证(图1～4)。

实验结果表明，hCG嵌合肽CP7和CP11在大肠杆菌中的表达水平约为1％，通过制备性SDS-PAGE方法每升工程菌培养液可收获0.5mg电泳均一性高于90％的目的蛋白。

本发明提供的hCG嵌合肽CP7和CP11基因和目的表达蛋白，可用于研制新型实用化hCG激素依赖性恶性肿瘤治疗疫苗和/或避孕疫苗免疫原，而且使疫苗的制备程序简单，生产成本降低，解决了天然hCGα和hCGβ作为避孕和/或肿瘤治疗性疫苗原所存在的问题。另外，在发展其他抗病毒和/或寄生物合成肽疫苗领域也具有重要意义。

本发明涉及的序列：

SEQ.NO1：hCG嵌合肽CP7中的T-和B-细胞表位排列顺序及其氨基酸序列

(Met)-Phe-Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp(HBsAg^19-33)-Val-V

al-Ser-Tyr-Val-Asn-Thr-Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu-Leu-Trp-Phe-His-Ile-Ser-Cy

s-Leu-Thr-Phe-Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Leu-Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr

-Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg-Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile-Leu(HBcAg^85-140)-Glu-Tyr-Leu-Asn-Lys-

Ile-Gln-Asn-Ser-Leu-Ser-Thr-Glu-Trp-Ser-Pro-Cys-Ser-Val-Thr(Pf-CS^326-345)-Cys-Pro-Thr-

Met-Thr-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Val-Leu-Pro-Ala-Leu-Pro-Gln-Val-Val-Cys(hCGβ^38-57)-Asp-

Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-

Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln(hCGβ^111-145)-(TGATAA)

SEQ.NO2：编码hCG嵌合肽CP7的DNA序列

5’-GAATTCATATGTTTTTCCTGCTGACACGCATCCTGACAATCCCGCAGTCTCTGGACGTAGTATCTTATGTTAATACCAAC

3’-CTTAAGTATACAAAAAGGACGACTGTGCGTAGGACTGTTAGGGCGTCAGAGACCTGCATCATAGAATACAATTATGGTTG

ATGGGTCTGAAGTTCCGTCAACTGCTTTGGTTTCATATCTCTTGCCTTACATTTGGCCGTGAGACAGTACTTGAATATCTGGT

TACCCAGACTTCAAGGCAGTTGACGAAACCAAAGTATAGAGAACGGAATGTAAACCGGCACTCTGTCATGAACTTATAGACCA

ATCTTTCGGTGTATGGATTCGCACCCCGCCTGCGTATCGTCCTCCGAATGCTCCTATCCTTGAATATCTGAACAAAATCCAAAA

TAGAAAGCCACATACCTAAGCGTGGGGCGGACGCATAGCAGGAGGCTTACGAGGATAGGAACTTATAGACTTGTTTTAGGTTTT

TTCTCTTTCAACCGAATGGTCCCCGTGTTCTGTAACTTGCCCCACCATGACCCGCGTTCTGCAGGGTGTTCTGCCGGCCCTGCCT

AAGAGAAAGTTGGCTTACCAGGGGCACAAGACATTGAACGGGGTGGTACTGGGCGCAAGACGTCCCACAAGACGGCCGGGACGGA

CAGGTTGTTTGCGATGACCCCCGCTTCCAGGACTCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCTCTCTTCCGTCTCCGTCCCGTCTGC

GTCCAACAAACGCTACTGGGGGCGAAGGTCCTGAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGAGAGAAGGCAGAGGCAGGGCAGACG

CGGGTCCCTCAGACACCCCGATCCTGCCTCAATGATAAGGATCC-3’

GCCCAGGGAGTCTGTGGGGCTAGGACGGAGTTACTATTCCTAGG-5’

SEQ.NO3：hCG嵌合肽CP11中的T-和B-细胞表位排列顺序及其氨基酸序列(Met)-Phe-Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-Asp(HBsAg^19-33)-Val-Val-

Ser-Tyr-Val-Asn-Thr-Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu-Leu-Trp-Phe-His-Ile-Ser-Cys-

Leu-Thr-Phe-Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Leu-Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-

Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg-Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile-Leu(HBcAg^85-140)-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg

-Val-Leu-Gln-Gly-Val-Leu-Pro-Ala-Leu-Pro-Gln-Val-Val-Cys(hCGβ^38-57)-Glu-Tyr-Leu-Asn

-Lys-Ile-Gln-Asn-Ser-Leu-Ser-Thr-Glu-Trp-Ser-Pro-Cys-Ser-Val-Thr(Pf-CS^326-345)-Asp-Asp-P

ro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-

Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln(hCGβ^111-145)-(TGATAA)

SEQ.NO4：编码hCG嵌合肽CP11的DNA序列

ATCTTTCGGGTGTATGGATTCGCACCCCGCCTGCGTATCGTCCTCCGAATGCTCCTATCCTTTGCCCCACCATGACCCGCGTTC

TAGAAAGCCCACATACCTAAGCGTGGGGCGGACGCATAGCAGGAGGCTTACGAGGATAGGAAACGGGGTGGTACTGGGCGCAAG

TGCAGGGTGTTCTGCCGGCCCTGCCTCAGGTTGTTTGCGAATATCTGAACAAAATCCAAAATTCTCTTTCAACCGAATGGTCCC

ACGTCCCACAAGACGGCCGGGACGGAGTCCAACAAACGCTTATAGACTTGTTTTAGGTTTTAAGAGAAAGTTGGCTTACCAGGG

CGTGTTCTGTAACTGATGACCCCCGCTTCCAGGACTCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCTCTCTTCCGTCTCCGTCCCGTCT

GCACAAGACATTGACTACTGGGGGCGAAGGTCCTGAGGAGAAGGAGTTTCCGGGGAGGGGGGAGAGAAGGCAGAGGCAGGGCAGA

GCCGGGTCCCTCAGACACCCCGATCCTGCCTCAATGATAAGGATCC-3’

CGGCCCAGGGAGTCTGTGGGGCTAGGACGGAGTTACTATTCCTAGG-5’

Claims

1、一种通过基因工程合成的hCG多表位嵌合肽，其特征在于由hCGβ中3个线性B-细胞表位：HBcAg^85-140、hCGβ^38-57、hCG^111-145和包括2个广谱性表位HBsAg^19-33和Pf-CS^326-345在内的6个外源Th细胞表位组成，其氨基酸序列为SEQ.No1。

2、根据权利要求1所述的hCG多表位嵌合肽，其特征在于其中的Pf-CS^326-345与hCGβ^38-57的位置互换，构成具有SEQ.No3的氨基酸序列。

3、一种DNA分子，其特征在于编码hCG嵌合肽SEQ.No1的具有SEQ.No2核苷酸的DNA序列。

4、根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于编码hCG嵌合肽SEQ.No3的具有SEQ.No4核苷酸的DNA序列。

5、一种用于构建权利要求1所述嵌合肽或其编码基因的半分子T-细胞表位肽载体，其特征在于为HBsAg^19-33-HBcAg^85-140Pf-CS^326-345。

6、一种基因工程合成权利要求1所述hCG多表位嵌合肽的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)hCG CP7全长cDNA的设计，得到编码hCG嵌合肽CP7的DNA序列SEQ.No2，在hCG CP7基因阅读框的5’-端增加了起始密码子ATG以及之前的EcoRI-NdeI粘性酶切位点，在它的3’-端添加双终止密码子TGATAA以及其后的BamHI粘性酶切位点；

(2)hCG CP7完整基因的拼接；

(3)hCG CP7基因的克隆和测序；

(4)PET11c/hCG CP7重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达，表达载体选用PPET11c质粒，用Nde I和BamH两种限制性内切酶从经DNA测序鉴定的PBS/CP7质粒中酶切出CP7基因片段，然后用T4 DNA连接酶将它重组插入PET11c质粒的Nde I和BamH I位点，此重组质粒经再次DNA测序鉴定后分别转化蛋白酶缺陷型宿主菌BL21(DE3)PlysS；

(5)目标表达产物CP7的分离纯化。