CN1922201A - 一种制备和纯化重组蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种以蛋白或颗粒形式表达的重组蛋白的新的纯化方法。在该纯化方法中，通过疏水相互作用来纯化蛋白。这种相互作用使该蛋白的收率和纯度提高了15％－80％。经过进一步纯化后，该蛋白可作为疫苗和药物。

Description

一种制备和纯化重组蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种新的制备和纯化病毒抗原蛋白和其它重组治疗性蛋白的方法，所述蛋白是由原核或真核细胞系统产生的。
发明背景
目前，在生物技术领域，采用原核和真核细胞系统来制备各种治疗性蛋白分子是一种常规的方法。该方法通过构建合适的分子遗传学表达系统并将其整合到质粒中，在细胞的生长过程中对其进行适当地诱导以促进目的蛋白的产生，在所述细胞系统中表达目的蛋白。
类似地，为了提高病毒抗原的产量，使用各种可增殖病毒的细胞底物(substrates)，这也是一种常规的操作。该方法中，首先大量增殖细胞，然后用需要的病毒“感染”细胞以促进病毒的繁殖。另外，也可培养转染的细胞。然后，从培养物上清液中或通过细胞裂解收集病毒。
在上述的两种方法中，然后通过浓缩、纯化和适当的进一步处理(如灭活或剪切<cleaved>)，根据具体情况来制备治疗性的制剂或疫苗。
上述方法面临如下挑战：
a)以更经济的方式回收目的蛋白或抗原；
b)对目的蛋白进行纯化以去除杂质，例如宿主细胞蛋白、培养基组分及所采用的方法中所使用的其它物质；
c)对纯化后的蛋白进行浓缩以便后续处理；
d)在纯化的各个阶段维持蛋白的功能结构和活性，并且保持回收的效率；
e)根据该方法最终制备出来的具有治疗价值的制剂与对照产物相比，具有相同或更好的效果。
为了达到上述目的，人们采用了各种各样的方法。重组分子可以在酵母例如Sacharomyces cerevisiae、Pichia pastoris或大肠杆菌以及其他生物中以异源蛋白的形式进行表达。许多生物药物和其它多肽，例如乙型肝炎抗原、胰岛素、溶栓酶、促红细胞生成素(Erythropoeitin)、人生长激素，都已经通过重组DNA技术制备得到。纯化表达宿主的培养物，获得产物即表达的蛋白。类似地，通过不同类型的初级或连续细胞系的培养物，也可以制备若干种病毒疫苗。与疫苗的制备相类似，增殖后的病毒要经过适当地纯化、浓缩和灭活/或使用。
通常的纯化步骤有澄清、离心、过滤和超滤、硫酸铵沉淀、硅珠的使用、连续离心、速率区带梯度离心(rate zonal gradient centrifugation)、各种色谱方法例如凝胶渗透(gel permeation)、体积排阻(size exclusion)、亲和色谱以及离子交换等。上述纯化方法的缺点在于：步骤繁琐，产物损耗，设备和耗材昂贵，有时要使用氯化铯等有毒物质，有的方法由于下游步骤费用昂贵导致实际上无法获得产物。
发明内容
根据本发明的描述，在大肠杆菌、酵母、真核细胞等载体中表达重组蛋白，通过使用HIMAX方法提取和纯化。应当理解，“HIMAX”由本发明人定义，仅仅针对下面描述的本发明方法而言。
发明目的
本发明目的之一是提供一种使用HIMAX方法从载体中制备和纯化重组蛋白的方法；
本发明目的之二是制备一种高纯度且不丧失其生物活性的重组蛋白；
本发明目的之三是在重组蛋白的制备过程中，使得核酸或可能的其它杂质的干扰可以忽略不计；
本发明目的之四是提供一种同时浓缩和纯化各种重组蛋白、病毒抗原和生物药剂分子的方法；
本发明目的之五是提供一种省时、经济的蛋白纯化方法；
本发明目的之六是提供一种从细胞裂解产物和液体(fluid)中纯化活的并且灭活了的病毒抗原的方法；
本发明目的之七是结合使用Zn、Ca、Mg等二价阳离子与醋酸盐、磷酸盐和氯化物等阴离子，来纯化重组蛋白。
因此，本发明涉及一种制备和纯化如病毒抗原、其它重组治疗性蛋白的方法，其特征在于所述纯化是通过这里所描述的一种称为HIMAX的新方法来完成的，然后回收所述蛋白。
本发明进一步涉及如下方法和纯化过程：
(a)在无去垢剂的条件下裂解载体细胞，获得细胞裂解物；
(b)在1000g至10,000g之间对细胞裂解物进行离心；
(c)通过倾析(decantation)从步骤(b)中获得固形物，所述的固形物包含所述蛋白；
(d)在pH值为6-7.5的缓冲液中悬浮所述的固形物；最好用本发明描述的去垢剂进行处理以溶解(solubulize)可能存在的微量杂质；
(e)作为HIMAX技术的一部分，所述的蛋白质被加入的浓度为0.2％-10％的二价离子盐所捕获而形成不溶性的基质(matrix)，所述二价离子盐的阴离子为硫酸盐、氯化物和/或醋酸盐；
(f)将所述不溶性基质离心，最好形成颗粒；
(g)用pH值8.0-8.5的Tris缓冲液或pH值7.0-8.0的含有EDTA的Tris缓冲液重复进行解吸附步骤，从不溶性的基质/颗粒中释放出被结合的抗原；
(h)最后，通过超滤、硅胶色谱、疏水和/或亲和色谱、离子交换、渗滤(diafiltration)、无菌过滤或综合上述方法回收所述蛋白。
本发明进一步涉及类毒素的制备和纯化，例如白喉和破伤风类毒素。
发明详述
下面对本发明进行详细描述：
a)通过重组表达或在适宜的组织培养基上培养的方法获得目的蛋白，然后通过细胞裂解、去除细胞残片和澄清等各种步骤获得澄清的收获物；
b)用HIMAX方法对蛋白或抗原进行初级捕获。简单地说，该方法包括：加入浓度为0.2％-10％的二价离子盐形成不溶性的基质，所述二价离子盐的阴离子为硫酸盐、氯化物和/或醋酸盐；然后，将得到的不溶性基质进行慢速离心以分离被结合的抗原物质；然后用pH值8.0-8.5的Tris缓冲液或pH值7.0-8.0的含有EDTA的Tris缓冲液对获得的颗粒重复进行解吸附步骤；
c)进一步处理含有目的抗原的解吸附后得到的物质。在病毒抗原的情况下，所述的处理可以包括色谱(离子交换)后的灭活步骤；在其它抗原的情况下，可直接对解吸附后得到的物质进行色谱纯化以获得高纯度的蛋白；
d)收集色谱纯化后的含有目的蛋白的部分，即可获得批量的最终产物，然后进行渗滤；和
e)或无菌过滤。
下面的一些重组蛋白和细胞培养物蛋白的实施例，更详细地描述了本发明的上述步骤。
本发明所描述的实施例只是为了详细描述的目的，并不表明本发明受限于这些描述。
本领域技术人员能够实施的各种选择方案，虽然没有在本发明说明书中进行描述，但是也属于本发明的保护范围。
具体实施方式
实施例I
通过重组方法制备乙肝病毒抗原
对发酵后的细胞裂解物进行离心，用去垢剂处理不溶性部分。离心后的上清用高度分散的硅胶(Aerosil)吸附和解吸附(传统技术)(如表1所示)；或者在硫酸盐、氯化物或醋酸盐存在的条件下，加入0.2％至10％(w/v)二价阳离子如钙、镁或锌，形成白色不溶性的基质，采用分批法初级捕获HbsAg。原位形成的基质进一步与抗原相互作用，这种捕获蛋白的方法称为HIMAX方法(表20)。然后，在7000g至10,000g之间离心分离该基质，用pH值为8.5的缓冲液对结合的抗原重复进行解吸附。解吸附后进一步用阴离子交换基质即DEAE进行纯化。
表I和表II中给出了所有中间步骤中HbsAg的活性。
在另一方法中，在硫酸盐、氯化物和醋酸盐存在的条件下，用浓度为0.2至10％的阳离子直接对细胞裂解物进行抗原初级捕获。所有的后续步骤与前述步骤类似。
表III给出了所有中间步骤中HbsAg的活性。
采用HIMAX方法制备HbsAg的流程图
表I  纯化乙型肝炎抗原的传统方法
  序号   纯化步骤   活性(％)
  12   全细胞裂解物可溶性部分   1009
  3456789  不溶性部分(膜结合)去污剂处理离心细胞残片上清(HbsAg蛋白)与高度分散的硅胶(Aerosil)结合，解吸附离子交换色谱   9116342015
表II  采用HIMAX方法纯化乙型肝炎抗原
  序号   纯化步骤   活性(％)
  12345678  细胞裂解物可溶性部分可溶性部分(膜结合HbsAg)去污剂处理离心上清(HbsAg蛋白)吸附和解吸附离子交换色谱   100991848077
表III  采用HIMAX方法纯化乙型肝炎抗原
  序号   纯化步骤   活性(％)
  123   细胞裂解物吸附和解吸附离子交换色谱   1009080
表2和表3的主要区别在于去垢剂的使用：在表2中，用去垢剂处理不溶性部分，然后进行吸附和解吸附处理；而在表3的实验中，细胞裂解物直接通过HIMAX方法进行吸附和解吸附。
实施例II
通过细胞培养方法制备狂犬病病毒抗原(图2)
通过大规模病毒培养，从培养上清液中收集狂犬病病毒。在传统方法中，将收集到的病毒通过超滤进行浓缩，然后采用连续地或分批地蔗糖梯度超速离心进行纯化。而在本发明中，首先采用HIMAX方法即加入如钙、镁或锌的二价阳离子盐使最终浓度提高8-10倍(W/V)，以形成可进一步相互作用的白色不溶性基质，用来分批初级捕获狂犬病病毒抗原，对培养上清液进行纯化。原位形成的基质进一步与抗原相互作用，这种蛋白捕获的方法就称为HIMAX方法。然后，在7000g至10,000g之间离心分离该基质，用pH值为7.2的含有EDTA的Tris缓冲液对结合的抗原重复进行解吸附。
然后，用常规方法对获得的浓缩抗原进行灭活，用阴离子交换基质进一步纯化，获得纯化的狂犬病病毒抗原。然后像疫苗那样，对抗原进行渗滤和搅拌。
表IV给出了HIMAX方法所有中间步骤中狂犬病病毒抗原的纯化产率。
用HIMAX方法制备狂犬病疫苗的流程图
表IV  HIMAX法纯化的狂犬病病毒抗原
  样品批号   体积   HA活性/毫升   回收率
  RAB批次1-2003   1000ml   1280   -
  HIMAX法处理后   120ml   10240   96
  RAB批次2-2003   800ml   2560   -
  HIMAX法处理后   95ml   20480   95
  RAB批次3-2003   3000ml   1280   -
  HIMAX法处理后   180ml   20480   96
实施例III
通过细胞培养方法制备甲型肝炎病毒抗原
通过大规模病毒培养，从培养物中收集与细胞结合的甲型肝炎病毒。在传统方法中，收集澄清的以细胞裂解物形式存在的病毒，灭活，再采用连续地或分批地蔗糖梯度超速离心进行纯化。而在本发明中，首先采用HIMAX方法即加入如钙、镁或锌的二价阳离子盐使得最终浓度提高8-10倍(W/V)，以形成可进一步相互作用的白色不溶性基质，分批初级地捕获甲型肝炎病毒抗原，对培养裂解物中的抗原进行纯化。原位形成的基质进一步与抗原相互作用，这种蛋白捕获的方法就称为HIMAX方法。然后，在7000g至10,000g之间离心分离该基质，并用pH值为7.2的含有EDTA的Tris缓冲液对结合的抗原重复进行解吸附。
然后用常规方法对获得的浓缩抗原进行灭活，用阴离子交换基质进一步纯化，获得纯化的甲型肝炎病毒抗原。然后像疫苗那样，对抗原进行渗滤和搅拌。
表V给出了采用HIMAX方法的所有中间步骤中甲型肝炎病毒抗原的纯化产率HIMAX法制备甲型肝炎病毒抗原的流程图
表V  HIMAX法纯化的甲型肝炎病毒抗原
  样品批号   体积   ELISA单位/毫升   回收率
  HAV批次2-03   100ml   2560
  HIMAX法处理后   9ml   20480   72
  HAV批次3-03   150ml   1280
  HIMAX法处理后   16ml   10120   84.3
  HAV批次4-03   90ml   2560
  HIMAX法处理后   90ml   20480   88
实施例IV
白喉类毒素是来源于白喉棒杆菌培养物的纯化蛋白。
对收集到的细胞进行离心或过滤，然后加入0.60％的福尔马林将上清液中的毒素转化为类毒素。将毒素在33℃下温育6周以转化为类毒素。
通过动物试验来证实是否已经脱毒。在传统方法中，需要对类毒素进行浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析以及无菌过滤。通过絮凝检测测量其活性。表VI中列出了类毒素的回收率。
在HIMAX方法对类毒素纯化过程中，在硫酸盐、氯化物或醋酸盐存在的条件下，加入0.2％至10％(w/v)的二价阳离子盐如Zn、Ca或Mg，形成白色不溶性的基质，以分批的方式来捕获类毒素。然后，在7000g至10,000g之间离心分离该基质，用pH值为6.8-7.2的含有100-200mMEDTA的磷酸盐缓冲液溶解结合的抗原。用SDS PAGE电泳检测纯化后样品。
对溶液进行超滤，0.22微米无菌过滤批样。结果如表VII所示。
HIMAX方法制备白喉类毒素的流程图
             收集的细胞
                ↓
             离心/过滤
                ↓
               毒素
                ↓
              类毒素
                ↓
            类毒素浓缩
                ↓
            硫酸铵分级
                ↓
               超滤
                ↓
             无菌过滤
表VI  (纯化白喉类毒素的传统方法)
  序号   纯化步骤   活性(％)
  1   细胞上清液   100
  2   类毒素   90
  3   浓缩的类毒素   90
  4   硫酸铵分级   70
  5   超滤   70
  6   无菌过滤   70
表VII  (纯化白喉类毒素的HIMAX方法)
  序号   纯化步骤   活性(％)
  1   细胞上清液   100
  2   类毒素   90
  3   HIMAX法纯化的批样   85
  4   超滤   85
  5   无菌过滤   85
实施例V
破伤风类病毒是来源于破伤风梭菌培养物的纯化蛋白
对收集到的细胞进行离心或过滤，加入0.40％的福尔马林将上清液中的毒素转化为类毒素。在转化为类毒素的过程中需要将毒素在35℃-36℃下温育4周。
通过动物试验来证实是否已经脱毒。在传统方法中，需要对类毒素进行浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析以及无菌过滤。通过絮凝检测测量其活性。表VIII中列出了类毒素的回收率。
在HIMAX方法对类毒素纯化过程中，在硫酸盐、氯化物或醋酸盐存在的条件下，加入0.2％至10％(w/v)的二价阳离子盐如Zn、Ca或Mg，形成白色不溶性的基质，以分批的方式来捕获类毒素。然后在7000g至10,000g之间离心，从溶液中分离出该基质，用pH值为6.8-7.2的含有100-200mM EDTA的磷酸盐缓冲液溶解结合的抗原。
采用SDS电泳测试纯度。
对溶液进行超滤，0.22微米无菌过滤批样。结果如表IX所示。
表VIII (纯化破伤风类毒素的传统方法)
  序号   纯化步骤   活性(％)
  1   细胞上清液   100
  2   类毒素   90
  3   浓缩的类毒素   90
  4   硫酸铵分级   70
  5   超滤   70
  6   无菌过滤   70
表IX (纯化破伤风类毒素的HIMAX方法)
  序号   纯化步骤   活性(％)
  1   细胞上清液   100
  2   类毒素   90
  3   HIMAX法纯化后批样   87
  4   超滤   85
  5   无菌过滤   85

Claims (16)

1.一种制备和纯化蛋白例如病毒抗原蛋白、其他重组治疗性蛋白的方法，其特征在于所述蛋白通过本发明所描述的一种称为HIMAX的新方法进行纯化，然后回收所述的蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白在载体例如原核细胞或真核细胞中表达，所述的真核细胞例如大肠杆菌、酵母等。
3.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其中所述方法和纯化过程包括：
a)在无去垢剂的条件下裂解载体细胞，获得细胞裂解物；
b)在1000g至10,000g之间对细胞裂解物进行离心；
c)通过倾析，从步骤(b)中获得固形物，其中所述固形物中包含所述的蛋白；
d)在pH值为6-7.5的缓冲液中悬浮所述的固形物；最好用本发明描述的去垢剂进行处理以溶解可能存在的微量杂质；
e)作为HIMAX技术的一部分，所述的蛋白被加入的浓度为0.2％-10％的二价离子盐所捕获而形成不溶性的基质，所述二价阳离子盐的阴离子为硫酸盐、氯化物和/或醋酸盐；
f)将所述的不溶性基质离心，最好形成颗粒；
g)用pH值8.0-8.5的Tris缓冲液或用pH值7.0-8.0的含有EDTA的Tris缓冲液重复进行解吸附步骤，从不溶性的基质/颗粒中释放出被结合的抗原；
h)最后，通过超滤、硅胶色谱、疏水和/或亲和色谱、离子交换、渗滤、无菌过滤或综合上述方法回收所述的蛋白。
4.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的蛋白是病毒抗原。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在解吸附(通过层析)步骤之前通过已知方法灭活病毒抗原。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述的蛋白不是病毒抗原。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在解吸附之前不进行灭活步骤。
8.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其中收集经过色谱纯化的目的蛋白部分，进行渗滤和/或无菌过滤。
9.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其中所述二价阳离子优选Zn、Ca、Mg或其组合。
10.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(d)中所述的去垢剂为非离子去垢剂。
11.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(d)中不使用去垢剂。
12.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(h)中的超滤采用截留分子量100-300K的膜过滤器。
13.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(h)中离子交换基质选自阴离子交换树脂，例如硫酸纤维素/DEAE基质。
14.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其中所述的蛋白被高度纯化且不丧失生物活性。
15.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其中的杂质例如核酸片段等，不干扰/影响所述蛋白的制备和纯化。
16.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其中同时制备和纯化病毒抗原、重组蛋白、生物治疗性蛋白等。
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