CN100487114C - 从发酵液收获晶体 - Google Patents

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Abstract

一种从发酵液中生产结晶和/或无定形代谢物悬液的方法，包括用一或多种凝固剂和/或一或多种絮凝剂处理所述发酵液；并从该凝固和/或絮凝的发酵液中用分离装置分离所述发酵液的生物量，从而得到结晶和/或无定形代谢物悬液。

Description

从发酵液收获晶体
技术领域：
本发明涉及一种简单有效的从发酵液获得结晶和/或无定形代谢物悬液的方法。
发明内容：
已经惊喜发现一种简单有效的从发酵液生产结晶和/或无定形代谢物悬液的方法，可用下步骤生产：(a)用一或多种凝固剂(coagulant)和/或一或多种絮凝剂处理所述发酵液，及(b)从该凝固和/或絮凝的发酵液中用分离装置分离所述发酵液的生物质(biomass)，从而得到结晶和/或无定形代谢物悬液。
发明详述：
本发明提供了一种简单有效的从发酵液生产结晶和/或无定形代谢物悬液的方法。
本发明方法可被用到未处理过的发酵液或经过首次处理，例如pH调节，温度调节，和/或水稀释的发酵液。
目的代谢物：
本发明目的代谢物可以是抗生素如青霉素或头孢菌素，或化学商品如柠檬酸。所述代谢物也可以是蛋白，例如治疗性蛋白如胰岛素或酶。所述酶可以是水解酶，转移酶，裂解酶，异构酶，或连接酶。
在优选实施方案中，所述方法可应用到蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，纤维素酶，和氧化还原酶。
蛋白酶：
合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶，优选微生物来源的蛋白酶，还包括了经过化学修饰或蛋白工程化的突变体。所述蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶类蛋白酶。碱性蛋白酶的实例可以是枯草溶菌素，特别是那些来源于芽孢杆菌属(Bacillus)的蛋白酶，例如枯草溶菌素(subtilisin)Novo，枯草溶菌素Carlsberg，枯草溶菌素309，枯草溶菌素147和枯草溶菌素168(WO 89/06279)。胰蛋白酶类蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属(Fusarium)蛋白酶，见WO 89/06270和WO 94/25583所述。
有用的蛋白酶的实例是见WO 91/00345，WO 92/19729，WO 98/20115，WO 98/20116和WO 98/34946所述的变异体，特别是在位置27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，195，206，218，222，224，235和274处发生一个或多个位点取代的变异体。
脂酶：
合适的脂酶包括细菌或真菌来源的脂酶，也包括了经过化学修饰或蛋白工程化的脂酶突变体。可以采用的脂酶例如来源于腐质霉属(与嗜热酶属(Thermomyces)同义)的脂酶，例如见EP 258 068和EP 305 216所述的来源于H.Lanuginosa(T.Lanuginosus)的脂酶或见WO 96/13580所述的来源于H.insolens的脂酶；假单胞菌属脂酶，例如来源于P.alcaligenes或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，葱头假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)，司徒茨氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1，372，034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌菌株(Pseudomonas sp.)株系SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂酶，例如来源于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Dartois等，1993，Biochemica et BiophysicaActa，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。
其它实例还可以采用见WO 92/05249，WO94/01541，EP 407 225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202所述中的脂酶变异体。
淀粉酶：
合适的淀粉酶(α和/或β-淀粉酶)包括细菌或真菌来源的淀粉酶，也包括了经过化学修饰或蛋白工程化的淀粉酶突变体。淀粉酶包括了，例如见GB1,296,839详述的来源于芽孢杆菌属，例如来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)特定株系的α-淀粉酶。
可以采用的淀粉酶实例有WO 94/02597，WO 94/18314，WO 96/23873和WO 97/43424所述的变异体，特别是在位置15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444处发生一个或多个位点取代的变异体。
纤维素酶：
合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶，也包括了经过化学修饰或蛋白工程化的突变体。合适的纤维素酶包括了来源于芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、草根霉属(Thielavia)和支顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US5,776,757和WO 89/09259的来源于Humicola insolens、嗜热毁丝霉菌(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是带有护色效果(colour care benefits)的碱性或中性纤维素酶，所述纤维素酶的实例见EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397和WO 98/08940所述的纤维素酶。其它实例为WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US 5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和WO 99/01544所述的纤维素酶变异体。
氧化还原酶：
根据本发明处理的氧化还原酶包括过氧化物酶(EC 1.11.1.7)和氧化酶，如漆酶和过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)。
过氧化物酶：
本发明方法所用的过氧化物酶优选由真菌或细菌等微生物产生。
特别优选鬼伞属过氧化物酶，特别是长根鬼伞(C.macrorhizus)或灰盖鬼伞(C.cinereus)过氧化物酶，或其变体。
漆酶及漆酶相关酶：
在本发明范畴，漆酶及漆酶相关酶是指酶分类(EC 1.10.3.2)包含的任何漆酶，酶分类(EC 1.10.3.1)包含的任一chatechol氧化酶，酶分类(EC 1.3.3.5)包含的任一胆红素氧化酶或酶分类(EC 1.14.18.1)包含的任一单酚单加氧酶。
微生物漆酶可以来源于细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)，合适的实例有来源于如下菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属Neurosrora)，例如粗糙脉孢霉(N.crassa)，Podospora，葡萄孢属(Botrytis)，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属(Lentinus)，灰侧耳菌属(Pleurotus)，栓菌属，例如T.villosa和T.verdicolor，丝核菌属(Rhizoctonia)，例如茄属丝核菌(R.solani)，鬼伞属，例如褶纹鬼伞(C.plicatilis)和灰盖鬼伞，小脆柄菇属(Psatyrella)，毁丝霉属(Myceliophthora)，例如嗜热毁丝霉菌，Schytalidium，多孔菌属(Polyporus)，例如P.pinsitus，射脉菌属(Phlebia)，例如辐射射脉菌(P.radita)(WO 92/01046)或革盖菌属(Coriolus)，例如毛革盖菌(C.hirsutus)(JP 2-238885)。
发酵
本发明发酵液可从本领域已知任何种属的任何微生物获得。
在优选实施方案中，所述目的代谢物可从细菌或真菌来源获得。例如，所述目的代谢物可得自革兰氏阳性细菌如芽胞杆菌菌株，例如嗜碱芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌，短芽胞杆菌，环状芽胞杆菌，凝结芽胞杆菌，灿烂芽胞杆菌，迟缓芽胞杆菌，Bacillus clausii，藓样芽胞杆菌，巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，或苏云金芽胞杆菌；或链霉菌属菌株，例如青色链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌；或得自革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌或假单胞菌菌株。
所述目的代谢物可得自真菌来源，例如来自酵母菌株如念珠菌属，克鲁维酵母属，毕赤酵母属，酵母菌(Saccharomyces)，裂殖酵母属，或Yarrowia菌株，例如卡尔酵母，酿酒酵母，糖化酵母，Saccharomyces douglasii，克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)，诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis菌株。
在优选实施方案中所述目的代谢物可得自丝状真菌菌株如支顶孢属，曲霉属，短梗霉属，隐球菌属，Filibasidium，镰孢菌属，腐质霉属，Magnaporthe，毛霉，毁丝霉属，Neocallimastix，链孢霉属，拟青霉属，青霉菌，Piromyces，裂褶菌属，踝节菌属，Thermoascus，Thielavia，Tolypocladium，或木霉属菌株，特别的是，所述目的代谢物可得自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，泡盛曲霉(Aspergillus awamor)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)，Fusarium cereals，Fusarium crookwellense，大刀镰孢(Fusarium culmorum)，禾本科镰孢(Fusarium graminearum)，禾赤镰孢(Fusarium graminum)，异孢镰孢(Fusarium heterosporum)，合欢木镰孢(Fusarium negundi)，尖镰孢(Fusarium oxysporum)，多枝镰孢(Fusarium reticulatum)，粉红镰孢(Fusarium roseum)，接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)，肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)，拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)，Fusarium sulphureum，Fusarium torulosum，Fusarium trichothecioides，Fusarium venenatum，Humicola insolens，Humicola lanuginosa，米黑毛霉(Mucor miehei)，Myceliophthora thermophila，粗糙脉孢霉，产紫青霉(Penicillium purpurogenum)，Trichoderma harzianum，康宁木霉(Trichodermakoningii)，Trichoderma longibrachiatum，Trichoderma reesei，或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株。
这些种属的菌株在一些培养物保藏中心可容易为公众获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，真菌菌种保藏中心(CBS)，和农业研究机构专利保藏中心，北方地区研究中心(Northern Regional Research Center)(NRRL)。
为本发明目的，与已知来源相连的本文术语“从......获得”意味着所述目的代谢物由所述来源或已插入来自所述来源的基因的细胞生产。
所述微生物菌株可用任何本领域已知方法发酵。所述发酵培养基可以是含复合物氮和/或碳源的复合物培养基，如大豆粉(meal)，棉花籽粉，玉米浸泡液，酵母提取物，酪蛋白水解物，糖蜜等等。所述发酵培养基可以是化学成分确定培养液，例如，如WO 98/37179所限定。
所述发酵可以分批进料(fed-batch)，重复分批进料或持续的发酵过程进行。
凝固剂和絮凝剂
根据本发明可用的凝固剂可以是盐，如选自第I族金属盐，第II族金属盐，和第III族金属盐，或其混合物；特别是钙盐，镁盐和铝盐。优选盐为铵盐，磷酸盐，硫酸盐，碳酸盐和柠檬酸盐。卤化物盐，甲酸盐和乙酸盐也可应用，尤其是盐酸盐如氯化钙。
可用盐浓度在0.1-40％(w/w)的范围；优选在0.2-20％(w/w)的范围；更优选在0.3-6％(w/w)的范围。
根据本发明其它可用的凝固剂为短链聚合物，特别是分子量在20道尔顿到500000道尔顿范围的阳离子聚合物，如叔聚胺或季聚胺，例如从CytecIndustries获得的C521，Poly-DADMAC′s(2-丙烯基二甲基氯化铵)，例如C591，或铝源如聚水合氯化铝：Al2(OH)5Cl，例如从Gulbrandsen得到的GC850。
可用短链聚合物浓度通常在0.1-25％(w/w)的范围；优选在0.2-20％(w/w)的范围；更优选在0.3-15％(w/w)的范围。
通常有利的是加入一种以上的凝固剂，例如盐和一或多种短链聚合物。
根据本发明可用的絮凝剂可以是无机和/或有机聚合物，可以为阳离子，阴离子或非离子的。
可用阳离子聚合物是聚胺，可用阴离子聚合物是聚丙烯酰胺。
可用聚合物浓度在0.01-1.0％(w/w)的范围；优选在0.05-0.5％(w/w)的范围。
分离装置
根据本发明可用的分离装置为任何设计样式的两相离心机，特别是连续排泥(sludge decharging)离心机，倾析器(decanter)或旋流器(cyclone)。
可能在一些情况下将絮凝物，特别是阴离子聚合物加入所述分离装置是有利的，从而可避免所述结晶和/或无定形悬液中的生物质(见实施例1)。
结晶和/或无定形悬液
可以凝固和/或絮凝所述代谢物发酵液以使所述结晶和/或无定形代谢物在正确(right)的分离区，并因此可在例如离心过程中分离为生物质部分(代谢物浓度很低)，结晶和/或无定形代谢物组分(代谢物浓度高)及上清部分(代谢物浓度很低)中。所述凝固和/或絮凝的作用使所述结晶和/或无定形代谢物不会掺合成群，所以在分离所述生物质后所述结晶和/或无定形代谢物可被进一步浓缩来达到需要的产量。
根据本发明得到的悬液可用多种方法进一步纯化，如通过研磨，筛选，干燥，过滤，离心，重结晶，层析方法，吸附过程和/或两相提取。
本发明进一步阐述如下实施例，并不是为了限制本发明所要求的范围。
实施例1
从发酵液收获蛋白酶晶体
用本发明方法处理含有WO 91/00345所公开的得自芽孢杆菌菌株(Bacillus sp.)的突变枯草溶菌素的发酵液。
所述蛋白酶发酵液基于下述凝固/絮凝配方以生产规模运行：
温度：12℃
稀释：用水两倍
CaCl2(36％w/w)：4.7％
C521(17％w/w)：12.0％
GC-850(20％w/w)：5.0％
氢氧化钠(3％w/w)：pH7.5
用一整批蛋白酶用Westfalia SB60离心机进行本试验。所述进料含17-20％湿泥体积。
所用离心机装备了喷嘴碗(nozzle bowl)和4m3/hr的标准化泥流量。
本实验进行了21小时，其中所述进料流量是从7.5m3/hr逐步递增到9.5m3/hr。
为避免离心滤液中的生物质，以7.5m3/hr以上的进料流量加入阴离子聚合物。
所用的阴离子聚合物溶液是0.15％(w/w)(聚丙烯酰胺)。
测量在所述试验过程中离心滤液中的湿晶体百分比容量并将其用作产量指示。
表1显示结果。
用两个Alfa Laval NX418倾析器，而不用Westfalia SB60离心机来作第一步提取进行试验。
所述试验显示所述离心过程从生产能力和产量来说优于所述倾析器过程。
表1：
 
                倾析器       离心机          倒空碗的间隔
流量            2000l/h      7500l/h         15分钟阴离子聚合物    400l/h       0.0l/h晶体％          0.4-0.6％    0.6-1.0％
流量                         8000l/h         15分钟阴离子聚合物                 50l/h晶体％                       0.6-1.2％
流量                         8500l/h         15分钟阴离子聚合物                 100l/h晶体％                       0.6-1.5％
流量                         9000l/h         15分钟阴离子聚合物                 200l/h晶体％                       0.7-1.5％
流量                         9500l/h         20分钟阴离子聚合物                 250l/h晶体％                       0.7-1.5％
泥％                         0.1-0.3％
实施例2
从发酵液收获α-淀粉酶晶体
发酵在WO95/26397的SEQ ID NO：2公开的得自芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶，如WO96/23873所述它具有双缺失(D1830*+G184*)。
从生产收获槽中取出所述α-淀粉酶发酵液，基于下述絮凝配方在实验室进行试验：
温度：12℃
稀释：用水两倍
CaCl2(36％w/w)：4.7％
C521(17％w/w)：12.0％
GC-850(20％w/w)：5.0％
氢氧化钠(3％w/w)：pH7.5
可以絮凝所述α-淀粉酶发酵液，从而所述酶晶体在正确的分离区(限度颗粒(limits particles))并因而可以在离心步骤中被分离。
所述絮凝液上清的活性显示溶液中只有0.8％的α-淀粉酶。

Claims (5)

1.从发酵液获得结晶淀粉酶或蛋白酶部分的方法，其包括
(a)用一或多种盐和一或多种聚合物处理所述发酵液，其中所述盐选自钙盐，镁盐和铝盐，及
(b)用离心机将此发酵液分离为生物质部分、结晶蛋白部分和上清部分。
2.根据权利要求1的方法，其中所述聚合物分子量在从20道尔顿到500000道尔顿的范围。
3.根据权利要求1的方法，其中所述聚合物是阳离子或阴离子聚合物。
4.根据权利要求3的方法，其中所述聚合物是多胺或聚丙烯酰胺。
5.根据权利要求1的方法，其中所述离心机是连续排泥离心机。
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