CN1908006A - 一种快速纯化制备Fab片段抗体的工艺方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速纯化制备片段抗体的工艺方法，该方法采用膜过滤－疏水层析I－疏水层析II三步法纯化目标产物，首先采用膜过滤分离的方式去除培养基上清中的细胞和细胞碎片，然后用分辨离率较低的疏水层析高效捕获酵母细胞大规模培养上清液中的片段抗体，并高度浓缩目标产物；最后用分辨离率较高的疏水层析，通过控制疏水层析的结合与分离条件，获取纯度不低于90％的片段抗体，整个纯化过程在12小时内即可完成。特别适宜真核细胞和原核细胞培养生产的基因工程产物的纯化，具有稳定性好、可控性强、过程控制指标明确、可操作性强、批次间结果差异小等特点。

Description

一种快速纯化制备Fab片段抗体的工艺方法

                    技术领域

本发明属于生物工程技术领域的蛋白质纯化技术，主要涉及原核细胞和真核细胞大规模培养生产的分泌型片段抗体，尤其是一种快速纯化制备Fab片段抗体的工艺方法，该方法适用于治疗用抗体类药物的生产制备尤其适用于人源化/人-鼠嵌合片段抗体的快速制备。

                    背景技术

抗体治疗已成为当今生物治疗肿瘤、流行性和感染性疾病的重要手段。抗体类药物以其高度的特异性、有效性和安全性成为国际药品市场上一大类新型治疗剂。随着新的结构设计，改进了体内药代动力学，拓宽了免疫学范围，并使得筛选抗非敏感性靶分子抗体和蛋白质组矩阵成为可能。新的分子演化策略增强了抗体亲和力、稳定性和表达水平。

到目前为止，美国FDA共批准了24个抗体药物上市。全球有超过200家公司正在研发治疗用单抗药物，约有335个产品正在研发中，其中100多个已进入临床研究。抗体类药物以其高度的特异性、有效性和安全性成为国际药品市场上一大类新型治疗剂。目前在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30％，其中有相当一部分的小分子抗体。与整个抗体分子相比，小抗体片段如Fab或scFv在药代动力学上表现出更好的组织穿透能力，同时由于抗原结合界面不变，抗体片段拥有全抗体分子的结合特异性。随着重组技术的不断完善，使抗体分子的克隆筛选、人源化以及生产能力得到进一步的革新，以抗体为基础的药剂设计已成为可能。重组抗体的分子体积越来越小，可被重新构建成多价分子，或与其它分子杀伤药物相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒，形成新一代的新型抗体治疗药物。

Pichia pastoris基因表达系统是一种新型外源基因表达系统，兼有原核细胞良好的可操作性及真核表达系统的许多优点，如进行蛋白质的加工、折叠、转录后修饰等，而且酵母比哺乳动物细胞和病毒表达系统操作更简单迅速，费用也更便宜。毕赤酵母利用甲醇作为唯一的碳源，它有2个醇氧化酶基因AOX1和AOX2，该基因具有很强的启动活性，毕赤酵母表达系统正是利用该启动子来启动外源蛋白的表达。表达载体通过同源重组整合入酵母基因组而随同酵母染色体一起复制。实验证明多拷贝整合在大多数情况下可以显著增加外源蛋白的表达水平。

鉴于酵母表达系统及其表达产物具有类似于天然蛋白，且能保持很好的生物学活性，表达条件易于控制，易于工业化生产等优势。我们选用甲醇营养型酵母表达系统进行了抗角蛋白单链抗体分泌表达。查阅国内外文献，目前应用毕赤酵母表达ScFv的报道不多，且表达量在不同的抗体有较大的差别，如Suzuki等报道用毕赤酵母表达抗表皮生长因子ScFv的表达量达到5mg/L，而Ridder等用毕赤酵母表达抗白血病抑制因子ScFv的表达量达到100mg/L。

目前，用生物反应器大规模培养生产蛋白治疗药物已成为当今生物制药领域的主流。申请人将特异性分泌抗角蛋白单链抗体的酵母细胞在5L和80L规模的生物反应器中大规模培养，通过过程参数的严格控制，最高细胞密度达A_600nm≥200，最高片段抗体分泌量≥100mg/L。

在蛋白质类生物制品尤其是抗体药物的生产工艺中，酵母表达系统产物的分离纯化难度较大，整个工艺过程中的质量控制均显得尤为重要，快速、经济通常是整个过程放大工艺过程的重要评价标准。

根据申请人所进行的资料检索，检索到和本发明相关的有以下参考文献：

[1]王刚，刘玉峰，王琰等。专利人源性重组抗角蛋白基因工程抗体及其制备方法，2002，中国发明专利CN02159427.9。

[2]CorneliaMarty，PatrickScheidegger，KurtBallmer-Hofer，etc.Production of Functionalized Single-Chain FvAntibodyFragments Binding to the ED-B Domain of the B-isoformofFibronectin in Pichia pastoris.21，156-164(2001)。

[3]Leonardo M.Damasceno，Itzcoatl Pla，Hyun-Joo Chang，etc.An optimized fermentation process for high-levelproduction of a single-chain Fv antibody fragment in Pichiapastoris.Protein Expression and Purification 37(2004)18-26。

[4]Harrie L.Glansbeek，Henk M.van Beuningen，Elly L.Vitters，etc.Expression of Recombinant Human Soluble Type IITransforming Growth Factor-b Receptor in Pichia pastoris andEscherichia coli：Two Powerful Systems to Express a PotentInhibitor of Transforming Growth Factor-B.Protein Expressionand Purification 12，201-207(1998)。

[5]Warren Schwartz，David Judd，Michelle Wysocki，etc.Comparison of hydrophobic charge induction chromatographywith affinity chromatography on protein A for harvest andpurification of antibodies.908(2001)251-263。

[6]Koichi Morimoto，Kuniyo Inouye.Single-step purificationof F(ab’)₂ fragments of mouse monoclonal antibodies(IgG1)byhydrophobic interaction high performance liquid chromatographyusing TSKgel Phent-5PW.J.Biochemistry BiophysicsMethods.1992，24：107-117。

[7]Gresham T.Weatherly，Anne Bouvier，Debra D.Lydiard，etc.Initial purification of recombinant botulinum neurotoxinfragments for pharmaceutical production using hydrophobiccharge induction chromatography.952(2002)99-110。

[8]L.Steele，M.Heng，presented at Recovery of BiologicalProducts IX，Whistler，BC，Canada，May 1999。

[9]L.Guerrier，P.Girot，W.Schwartz，E.Boschetti，Bioseparations 9(2000)211。

[10]R.L.Fahrner，D.H.Whitney，M.Vanderlaan，G.S.Blank，Performance comparison of protein A affinity-chromatographysorbents for purifying recombinant monoclonal antibodies.Biotechnol.Appl.Biochem.30(1999)121。

王刚，刘玉峰，王琰等，在中国专利申请“人源性重组抗角蛋白基因工程抗体及其制备方法”(CN02159427.9)^[1]，其权利要求中对有关抗体回收纯化的描述：

大肠杆菌表达产物经饱和硫酸铵盐析，然后充分透析后用金属鳌和亲和层析分离表达，得到人源性抗角蛋白Fab抗体的基因工程产物，但没有说明具体的实验方法。

Cornelia Marty等报道利用了毕赤酵母系统表达并纯化目标产物^[2]。其产物纯化过程是：首先离心细胞培养上清以除去酵母细胞，然后采用阴离子交换层析一步纯化scFv，SDS-PAGE显示取得了比较好的效果，此方法针对于表达效果较好、翻译以后加工比较完全的scFv，但是没有更进一步讨论翻译后加工不完全的细胞系产品的纯化问题。

Leonardo M.Damasceno等，利用毕赤酵母系统表达并纯化A33ScFv^[3]。其首先采用阴离子色谱初步纯化，然后采用疏水色谱获取纯度高于90％的目标产物，总回收率为25％。但仅用于实验室水平生产，而且总回收率较低，不适合进一步的放大生产。

Harrie L.Glansbeek等，用亲和色谱吸附纯化酵母培养产物中的TGFbsRII^[4]。采用镍柱一步纯化目标产物，纯度高于90％。但没有探讨其回总回收率。由于其对于产品有一定的要求(必须有His标签)，而且成本较高，因此有一定的局限性。

W.Schwartz等，比较了疏水色谱(HCIC)和亲和色谱(Protein A)分离纯化某些单克隆抗体的效果，结论是疏水色谱可以获得更好的回收率，纯化目标产物的纯度更高^[5]。

Koichi Morimoto等用疏水色谱吸附纯化F(ab’)₂片段抗体^[6]，在SDS-PAGE和胶过滤两种方法显示F(ab’)₂在单色谱峰中有较高的均质性；Koichi Morimoto和Kuniyo Inouye用Tsk gel Phenyl-5PW疏水色谱吸附纯化IgG1型F(ab’)₂片段抗体，其纯度达到98％，但其都在小规模实验阶段进行，尚未进入中试放大工艺生产。

Gresham T.Weatherly等，采用疏水电荷感应色谱(HCIC)从毕赤酵母培养产物中吸附纯化基因同源相似性高达58％的两种蛋白rBoNTA(Hc)和rBoNTB(Hc)^[7]。报道中指出，虽然两种蛋白基因相似性很高，可是经过计算和实验证实两者之间的疏水性和亲水性有着比较大的区别，采用HCIC可以较好的分离两者。L.Steele等，也采用疏水电荷感应色谱(HCIC)成功分离纯化重组碱性蛋白酶[8]，L.Guerrier等采用HCIC分离纯化单克隆抗体同样取得了很好的效果^[9]。其中Gresham T.Weatherly的试验规模已经达到中试生产规模，但是上述文献中没有更进一步讨论该方法(HCIC)的适用范围，有一定的局限性。

在治疗性抗体的纯化工艺中，除考虑到产品的纯度、回收率，还必需考虑的重要一点是工艺过程的质量控制，有效去除杂质包括来自宿主细胞的蛋白、DNA、抗体异构体、碎片，以及小分子和潜在的污染物如：内毒素、滤过性病毒等^[10]。

                        发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，申请人在以往工作的基础上，经过长时间的摸索和大量的实验，发明了一种快速纯化制备片段抗体的工艺方法，该方法适用于原核细胞和真核细胞大规模培养物中片段抗体纯化的生产，大大提高了目标产物的纯度，并且工艺衔接紧密，从而保证了最短工艺周期，最大限度地保持了目的蛋白的活性，提高了生产效率，具有高效、快速、成本低、纯度高、稳定、批次间结果差异小等特点。

本发明实现上述任务采用的技术方案是：一种快速纯化制备Fab片段抗体的工艺方法，其特征在于，该方法采用膜过滤-疏水层析I-疏水层析II三步法纯化目标产物，首先采用膜过滤分离的方式去除培养基上清中的细胞和细胞碎片，然后用分辨离率较低的疏水层析高效捕获酵母细胞大规模培养上清液中的Fib片段抗体，并浓缩目标产物；最后用分辨离率较高的疏水层析，通过控制疏水层析的结合与分离条件，获取纯度不低于90％的Fab片段抗体。

本发明的工艺方法首次采用了参数控制，设定pH，电导，流速，压力，温度上/下限指标，以此标准控制各步纯化，并结合AKTA层析系统配置的软件，设置了自动操作方案，大大节省了时间、人力。本发明特别适宜真核细胞和原核细胞培养生产的基因工程产物的纯化，具有稳定性好、可控性强、过程控制指标明确、可操作性强、批次间结果差异小等特点。

                        附图说明

图1是Fab片段抗体生产的工艺流程图；

图2是疏水层析I色谱图；

图3是疏水层析I电泳图，图中1表示酵母细胞培养上清，2表示疏水层析I洗脱峰，3为Mark，4表示疏水层析I穿过峰；

图4是疏水层析II色谱图；

图5是疏水层析II电泳图，图中1为Mark，2表示疏水层析I洗脱峰，3表示疏水层析II穿过峰，4表示疏水层析II洗脱峰1，5表示疏水层析II洗脱峰2；

图6是Fab片段抗体SEC-HPLC图。

以下结合附图和发明人给出的具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

                    具体实施方式

依照本发明的技术方案，申请人在抗人肝癌Fab片段抗体制备工艺中采用膜过滤-疏水层析I-疏水层析II三步法纯化目标产物。

其中膜过滤是去除培养基上清中的细胞和细胞碎片，疏水层析I是用分辨离率较低的疏水层析高效捕获酵母细胞大规模培养上清液中的Fib片段抗体，并浓缩目标产物；疏水层析II是用分辨离率较高的疏水层析，通过控制疏水层析的结合与分离条件，获取纯度不低于90％的Fab片段抗体。

膜过滤采用分离的方式去除培养基上清中的细胞和细胞碎片等有形物质。相比较去除有形物的其他方法(如离心法)，更易于有效、严格地进行过程控制，以达到治疗用产品的要求。

本发明考虑到原核和真核细胞培养上清中盐浓度较高的特点，整个纯化工艺的选择疏水层析，从而替代了处理复杂、要求较高的离子交换层析和效率相对低下、过程不易放大的凝胶过滤层析。

用分辨离率较低的疏水层析高效捕获大规模细胞培养上清液中的片段抗体，以快速浓缩目标产品；然后用分辨离率较高的疏水层析通过控制疏水层析的结合与分离条件，获取高纯度的基因工程片段抗体，最终获取的片段抗体纯度不低于90％，整个纯化过程在12小时内即可完成。

整个纯化工艺采用同一缓冲系统，通过改变盐浓度的方法进行洗脱，减少了工艺过程缓冲系统置换的步骤，过程衔接紧密，节约了时间并简化了样品处理。整个工艺过程中，申请人就工艺过程的关键参数进行比较分析，如产品回收率与条件，工艺衔接与方法选择，终产品纯度与活性保持，以及工艺过程的放大，选择最佳的参数标准等，以建立高效、快速的Fab抗体纯化工艺。

具体步骤如下：

1)在澄清细胞培养悬液工艺中，采用膜分离，采用孔径为0.8-1.2μm的囊式滤器进行预过滤，此步骤可除去全部的细胞及细胞碎片等固形物。

2)层析分离前的样品加入硫酸铵调节后，再采用0.22μm孔径的膜进行终过滤，以除去100％的杂质和细菌；

3)采用疏水层析获取目标产物。采用两步层析，第一步采用分辨离率较低的疏水介质进行初步纯化分离，第二步采用分离率较高的疏水介质进行进一步精细纯化分离，获取高纯度目标产物。

4)最后采用冷冻干燥保存目标产物。

上述每个步骤具体参数如下：

I预过滤流速1-2L/min，压力0-1bar，温度20-25℃，膜孔径为0.8-1.2μm。

II终过滤流速1-2L/min，压力0-1bar，温度20-25℃，膜孔径为0.22μm。

III样品加入的硫酸铵浓度为0.4-0.8M，电导率50-150ms/cm，如高于此值，用平衡磷酸盐溶液稀释之，如低于此值，用硫酸铵调节之。

IV样品加入硫酸铵时，必须及时搅拌混匀，加入速度控制在5-10g/min；

V疏水层析流速5-20ml/min，压力0.2-0.6，温度20-25℃。

VI以上层析过程中缓冲系统(A)为无机酸缓冲系统+硫酸铵，其中无机酸缓冲系统浓度为0.01-0.05M，硫酸铵浓度为0-1M，pH7.0-8.0。

以下申请人给出对毕赤酵母细胞分泌的基因工程片段抗体Fab进行制备的具体实施例，需要说明的是，该实施例只是一个较优的例子，本发明不限于该实施例。

参见图1，首先，复苏稳定高分泌外源基因的巴氏毕赤酵母菌株。(人源性重组抗角蛋白基因工程抗体及其制备方法CN02159427.9)。

其次，采用分步法诱导表达的方式来培养、诱导表达目标产物，具体方式为：①菌体生长阶段：工程菌株在添加甘油等碳源的简单培养基中分批培养以积累生物量；②分批流加的过渡阶段：此阶段中，向培养基中流加甘油作为生长抑制因子来进一步积累生物量，为诱导表达作准备；③诱导阶段：向培养基中缓慢添加甲醇，使酵母在适应甲醇浓度变化的过程中启动外源蛋白的合成。从而获取基因工程片段抗体Fab。其中菌体生长阶段在三角烧瓶中进行，然后将细菌无菌接种到5L生物反应器中开始诱导表达，过程中严格控制温度、pH、甘油浓度、甲醇浓度等参数，最高细胞密度达A_600nm≥200，最高片段抗体分泌量≥100mg/L。

培养结束后，采用膜过滤-疏水层析I-疏水层析II三步法纯化目标产物。首先膜过滤分离的方式去除培养基上清中的细胞和细胞碎片等有形物质，然后控制疏水层析的结合与分离条件，从而获取高纯度的基因工程片段抗体Fab。

本发明的工艺用连续纯化过程获取Fab片段抗体，其工艺过程主要分以下几步：

1.膜过滤分离：去除100％的细胞及细胞碎片等有形物。

2.疏水层析I：浓缩目标产物，初步纯化。

3.疏水层析II：获取高纯度、无菌、无热源、高活性Fab片段抗体。

4.产品鉴定：包括无菌试验、热源质实验、回收率计算、纯度分析等。

以下进一步给出详细的工艺过程：

一、膜过滤分离

(1)过滤分离系统：10英寸滤壳，0.8μm-1.2μm囊式滤芯(sartorius公司)；蠕动泵YZ35，硅胶管(保定兰格泵有限公司)。

(2)以1-2L/min的流速过滤酵母细胞培养上清，除去细胞及细胞碎片，过滤分离系统进口压力控制：0-1bar，出口压力控制：0-0.5bar；温度10-25℃。

二、疏水层析I

(1)过滤后的培养上清中，加入固体硫酸铵0.5-0.8M，加入速度控制在5-10g/min。调节电导率为50-150ms/cm。如低于此值，则用硫酸铵调节之。

(2)采用囊式滤芯0.22μm(sartorius公司)，其余材料同上述，过滤处理后的样品，流速：1-2L/min，压力：0-1bar，温度20-25℃。

(3)纯化系统：AKTA purifier-100(GE Healthcare公司)；色谱柱：XK26/20(GE Healthcare公司)；层析介质：Phenyl SepharoseHigh Performance(GE Healthcare公司)。

(4)A液：0.4-0.8M硫酸铵，10-50mmol/l磷酸盐缓冲液pH7.0-8.0；B液：10-50mmol/l磷酸盐缓冲液pH 7.0-8.0。

(5)温度10-25℃。以平衡A液充分平衡疏水柱，待280nm的紫外吸收回到基线和电导、pH保持稳定时开始上样，上样完毕后再以平衡A液冲洗去未结合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线和电导、pH保持稳定后，用B液直接洗脱，收集洗脱峰。

三、疏水层析II

(1)疏水层析I洗脱液中加入固体硫酸铵0.5-0.8M，加入速度控制在5-10g/min。调节电导率为50-150ms/cm。如低于此值，则用硫酸铵调节之，并用0.22μm微孔滤器(sartorius公司)过滤之，温度20-25℃。

(2)纯化系统：AKTA purifier-100(GE Healthcare公司)；色谱柱：XK26/20(GE Healthcare公司)；层析介质：PPG 600(TOSOHBioscience公司)。

(3)A液：0.4-0.8M硫酸铵，10-50mmol/l磷酸盐缓冲液pH7.0-8.0；B液：10-50mmol/l磷酸盐缓冲液pH 7.0-8.0。

(4)温度10-25℃。以平衡A液充分平衡疏水柱，待280nm的紫外吸收回到基线和电导、pH保持稳定时开始上样，上样完毕后再以平衡A液冲洗去未结合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线和电导、pH保持稳定后，用40％-70％B液直接洗脱，收集洗脱峰1，用100％B液直接洗脱，收集洗脱峰2，洗脱峰1即为Fab片段。

四、产品鉴定

a.Fab片段无菌试验、热原质检测纯化的Fab用RPMI-1640培养液〔含150ml/L小牛血清〕培养72h，倒置显微镜观察有无细菌生长，热原质检测采用鲎试剂法。

b.回收率测定ELISA法测定层析前后目标蛋白浓度。依下式计算回收率：

c.Fab片段纯度测定：纯化的Fab，采用SDS-PAGE，在非还原条件下进行电泳，电泳结果经考马斯亮蓝R-250染色后，用上海复日图像分析系统扫描，并采用SmartView软件分析，据Fab片段占所有区带总面积的百分比计算Fab片段的纯度。

五、结果

1.疏水层析I浓缩初纯结果

a.由图2、3知，通过疏水层析I杂蛋白和培养基成分在穿过峰中，基本没有目标蛋白损失，目标蛋白(Fab片段抗体)均在洗脱峰中而且被明显浓缩(经计算可浓缩20倍)和初步纯化。

b.此步回收率为90％-99％。

2.疏水层析II浓缩精纯结果

a.由图4、5知，通过疏水层析II少量残留杂蛋白在穿过峰中，目标蛋白(Fab片段抗体)在洗脱峰中被明显分离纯化，电泳纯度达到90％。并且被再次浓缩(经计算可浓缩10倍以上)。

b.由图6知，通过疏水层析II得到了Fab片段抗体，SEC-HPLC纯度达90％。

c.此步回收率为80％-90％。

d.两步纯化总回收率达70％以上。

3.Fab片段抗体细菌及热原质检测结果

按本发明的方法制备的Fab片段抗体培养72h，镜下未见细菌生长，鲎试剂法检测热原质为阴性。

Claims (2)

1.一种快速纯化制备Fab片段抗体的工艺方法，其特征在于，该方法采用膜过滤-疏水层析I-疏水层析II三步法纯化目标产物，首先采用膜过滤分离的方式去除培养基上清中的细胞和细胞碎片，然后用分辨离率较低的疏水层析高效捕获酵母细胞大规模培养上清液中的Fib片段抗体，并浓缩目标产物；最后用分辨离率较高的疏水层析，通过控制疏水层析的结合与分离条件，获取纯度不低于90％的Fab片段抗体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)膜过滤分离：

采用过滤分离系统去除全部的细胞及细胞碎片，以1L/min～5L/min的流速过滤酵母细胞培养上清，除去细胞及细胞碎片，膜孔径为0.45-1.2μm；过滤分离系统进口压力为：0-1bar，出口压力为：0-0.5bar；温度10-25℃；

(2)疏水层析I：

将目标产物浓缩后置入纯化系统进行初步纯化，初步纯化的过程参数为：

a.样品处理：

过滤后液体中加入固体硫酸铵0.4-1M，加入速度控制在5-20g/min之间，调节电导率为50-150ms/cm，以0.22μm孔径膜过滤；

b.吸附条件用缓冲系统A充分平衡层析柱后直接上样，流速1-30ml/min，压力0-6bar，温度10-25℃；

上述缓冲系统A为无机酸缓冲系统+硫酸铵，其中无机酸缓冲系统浓度为0.01-0.05M，硫酸铵浓度为0-1M，pH 7.0-8.0；

c.解吸附条件用缓冲系统A直接洗脱，收集洗脱峰，流速1-30ml/min，压力0-6bar，温度10℃-25℃；

(3)疏水层析II：

获取高纯度、无菌、无热源、高活性Fab片段抗体，其过程参数为：

a.样品处理：疏水层析I收集的洗脱峰中加入固体硫酸铵0.4-1M，调节电导率为50-150ms/cm，0.22μm膜过滤澄清；

b.吸附条件用缓冲系统A充分平衡层析柱后直接上样，流速0-30ml/min，压力0-6bar，温度10℃-25℃；

c.解吸附条件用缓冲系统A等度洗脱，收集洗脱峰，流速1-30ml/min，压力0-6bar，温度10℃-25℃；

(4)经冷冻干燥保存目标产物，即可得到纯度不低于90％的Fab片段抗体。

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