CN100480271C - 基因vii型新城疫病毒np抗体的重组原核表达检测抗原及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的是一种基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原及制备方法。基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原是应用RT-PCR技术扩增基因VII型新城疫病毒NP基因基础上，将NP基因定向亚克隆到原核表达载体pGEX-6p上，然后转化大肠杆菌表达系统进行诱导表达所得到的基因工程蛋白，该蛋白的表达形式是融合蛋白，表达的融合蛋白的分子量为81.9ku。通过本方法制备的基因工程重组蛋白可用于VII型新城疫抗NP蛋白抗体的检测。

Description

基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原及制备方法

(一)技术领域

本专利涉及的是一种基因工程制品，本发明也涉及这种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种应用基因工程技术制备检测基因VII型新城疫抗体的检测抗原及其制备方法。

(二)背景技术

1997年以来，在我国许多地区爆发了以消化道和呼吸道病变为主要特征的基因VII型新城疫，给养殖业带来了严重的危害。由于该病具有高度发病率和死亡率，如何对该病进行及时准确的诊断具有重要的意义。

以往对基因VII型新城疫血清抗体的检测都是利用全病毒作为抗原，此方法必须将病毒浓缩提纯，再用去污剂裂解后并适当浓缩才能用作抗原，这就使得全病毒抗原制备过程复杂，不易于推广，特别是利用全病毒抗原作为诊断抗原，在亚单位疫苗或活载体疫苗免疫接种时，不能鉴别疫苗免疫和自然感染的抗体。利用原核表达系统表达外源蛋白是一种简便和高效的方法。原核表达系统生产的一些基因工程蛋白可保持必要的抗原性，能够用于病毒感染抗体的检测。研究表明，基因VII型新城疫病毒NP蛋白即属于此类蛋白，因此应用基因工程NP蛋白作为抗原，能够建立鉴别基因VII型新城疫免疫接种和自然感染抗体的检测方法，这将为应用基因工程疫苗预防和控制基因VII型新城疫提供重要的技术支撑。

(三)专利内容

本专利的目的在于提供一种具有无散毒危险、稳定性好、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低的用于检测基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原，本发明的目的还在于提供这种检测抗原的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原是应用RT-PCR技术扩增基因VII型新城疫病毒NP基因基础上，将NP基因定向亚克隆到原核表达载体pGEX-6p(是一种带有GST前导肽的融合表达载体)上，然后转化大肠杆菌表达系统进行诱导表达所得到的基因工程蛋白，该蛋白的表达形式是融合蛋白(GST-NP)，表达的融合蛋白的分子量为80-82ku。经Western blot、Dot-ELISA进行析表明：该蛋白具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。

基因VII型新城疫病毒NP基因的核苷酸序列及其推倒的氨基酸序列如下：

1　　ATGTCGTCTGTTTTCGACGAATACGAGCAGCTTCTCGCTGCTCAGACCCGCCCTAACGGA

1     M  S  S  V  F  D  E  Y  E  Q  L  L  A  A  Q  T  R  P  N  G

61   ACTCATGGAGGGGGAGAGAAAGGGAGCACTTTAAAGGTTGAGGTCCCAGTATTTACCCTA

21    T  H  G  G  G  E  K  G  S  T  L  K  V  E  V  P  V  F  T  L

121  AACAGTGATGATCCAGAGGATAGATGGAATTTTGCGGTATTCTGTCTTCGGATTGCTGTT

41    N  S  D  D  P  E  D  R  W  N  F  A  V  F  C  L  R  I  A  V

181  AGCGAGGATGCCAACAAACCACTCAGGCAAGGTGCTCTTATATCCCTCTTATGCTCCCAT

61    S  E  D  A  N  K  P  L  R  Q  G  A  L  I  S  L  L  C  S  H

241  TCTCAGGTGATGAGAAACCATGTTGCCCTTGCAGGGAAACAGAATGAGGCCACACTGGCT

81    S  Q  V  M  R  N  H  V  A  L  A  G  K  Q  N  E  A  T  L  A

301  GTTCTTGAGATCGATGGTTTTGCTAACAGTGTGCCCCAGTTCAACAATAGGAGTGGAGTG

101   V  L  E  I  D  G  F  A  N  S  V  P  Q  F  N  N  R  S  G  V

361  TCTGAGGAGAGAGCACAGAGATTCATGGTAATCGCAGGATCTCTCCCTCGGGCATGCAGC

121   S  E  E  R  A  Q  R  F  M  V  I  A  G  S  L  P  R  A  C  S

421  AACGGTACTCCGTTTGTCACAGCTGGGGTTGAAGATGATGCACCAGAAGATATCACTGAC

141   N  G  T  P  F  V  T  A  G  V  E  D  D  A  P  E  D  I  T  D

481  ACTCTGGAAAGAATCCTATCTATCCAAGTTCAGGTATGGGTCACAGTAGCAAAGGCCATG

161   T  L  E  R  I  L  S  I  Q  V  Q  V  W  V  T  V  A  K  A  M

541  ACTGCATATGAGACAGCAGATGAGTCAGAAACAAGAAGAATAAATAAGTATATGCAGCAA

181   T  A  Y  E  T  A  D  E  S  E  T  R  R  I  N  K  Y  M  Q  Q

601  GGTAGAGTTCAGAAGAAGTACATCCTTCATCCTGTATGCAGGAGTGCAATTCAACTCACA

201   G  R  V  Q  K  K  Y  I  L  H  P  V  C  R  S  A  I  Q  L  T

661  ATCAGACATTCTCTGGCGGTCCGTATTTTCCTAGTTAGTGAGCTCAAGAGGGGCCGCAAT

221   I  R  H  S  L  A  V  R  I  F  L  V  S  E  L  K  R  G  R  N

721  ACAGCAGGCGGGAGCTCTACGTATTACAACTTGGTCGGGGATGTAGACTCATACATCAGA

241   T  A  G  G  S  S  T  Y  Y  N  L  V  G  D  V  D  S  Y  I  R

781  AACACCGGGCTTACTGCATTTTTCCTAACACTCAAATATGGAATCAATACCAAGACGTCA

261   N  T  G  L  T A  F  F  L  T  L  K  Y  G  I  N  T  K  T  S

841  GCCCTCGCACTCAGCAGCCTCACAGGTGATATCCAAAAAATGAAACAGCTCATGCGTTTA

281   A  L  A L  S  S  L  T  G  D  I  Q  K  M  K  Q  L  M  R  L

901  TATCGGATGAAAGGTGAGAATGCACCATACATGACATTGTTAGGTGACAGTGACCAGATG

301   Y  R  M  K  G  E  N  A  P  Y  M  T  L  L  G  D  S  D  Q  M

961  AGCTTTGCACCAGCTGAGTATGCACAACTTTATTCTTTTGCCATGGGCATGGCATCAGTC

321   S  F  A  P  A  E  Y  A  Q  L  Y  S  F  A  M  G  M  A  S  V

1021 TTAGATAAGGGAACTGGCAAGTACCAATTCGCCAGGGACTTTATGAGCACATCATTCTGG

341   L  D  K  G  T  G  K  Y  Q  F  A  R  D  F  M  S  T  S  F  W

1081 AGACTTGGAGTAGAGTATGCTCAGGCTCAGGGAAGTAGCATCAATGAGGACATGGCTGCT

361   R  L  G  V  E  Y  A  Q  A  Q  G  S  S  I  N  E  D  M  A  A

1141 GAGCTAAAACTAACCCCGGCAGCAAGGAGAGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGAGTATCT

381   E  L  K  L  T  P  A  A  R  R  G  L  A  A  A  A  Q  R  V  S

1201 GAAGAAATCGGCAGCATGGACATTCCTACTCAACAGGCGGGAGTCCTCACCGGGCTCAGT

401   E  E  I  G  S  M  D  I  P  T  Q  Q  A  G  V  L  T  G  L  S

1261 GACGAAGGCCCCCGAACTCCACAGGGCGGATCAAACAAGCCGCAAGGGCAACCAAATGCC

421   D  E  G  P  R  T  P  Q  G  G  S  N  K  P  Q  G  Q  P  N  A

1321 GGGGATGGGGAGACCCAATTCATGGATTTTATGAGAGCAGTGGCGAACAGCATGCGGGAA

441      G  D  G  E  T  Q  F  M  D  F  M  R  A  V  A  N  S  M  R  E

1381    GCGCCAAATCCTGCACAGAGCACCACCCATCCAGAGCCTCCCCCAACCCCTGGGGCATCC

461      A  P  N  P  A  Q  S  T  T  H  P  E  P  P  P  T  P  G  A  S

1441    CAAGACAACGACACTGACTGGGGGTACTGA

481      Q  D  N  D  T  D  W  G  Y  ^＊

本发明的产品是采用这样的方法来加工的：

1)设计扩增基因VII型新城疫病毒NP基因的特异性引物；

2)通过RT-PCR扩增NP基因片段；

3)对NP基因进行克隆、测序鉴定；

4)将NP基因定向亚克隆至pGEX-6p原核表达载体；

5)重组表达质粒pGEX-6p-NP转化大肠杆菌中进行诱导表达；

6)重组蛋白的纯化

通过离心收集培养物中的基因工程菌，用PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬，加入溶菌酶至终浓度为1％即1mg/ml，然后进行超声处理，超声处理必须于冰浴条件下进行；以4℃、10000g离心10min，取上清并加入1％的TritionX-100及1mmol/L的DTT至终浓度为1mmol/L；沉淀即为包涵体，将沉淀用组成为30％蔗糖，100mol/L NaCl，50mmol/LTris，pH8.0，1％TritionX-100的包涵体洗涤液洗涤2次，重悬沉淀，加入组成为1.5％(m/v)N-十二烷基肌氨酸钠，25mmol/L三乙醇胺，1mmol/LEDTA，pH8.0的包涵体裂解液重悬，4℃处理2h，再超声处理20S，以12000r/m，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白，向其中立即加入终浓度为2％的Trition X-100，加入9倍体积的组成为0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSH)，2mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，2mmol/L EDTA，20mmol/L Tris，pH8.5]的复性缓冲液，用0.01mol/L PBS、pH7.4透析48h，每12h更换一次透析液。取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化。

将复性后的表达蛋白经SDS-PAGE电泳后，用KCl染色，将凝胶中的目的蛋白带切下、研碎，加入PBS，反复冻融，1000r/min离心10min，上清即为纯化蛋白。

7)重组蛋白抗原性检测

通过免疫印迹、Dot-ELISA方法的检测该蛋白的抗原性。

免疫印记试验：将纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，再将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维膜上，以1:150倍稀释基因VII型新城疫阳性的鸡血清作为一抗，1:10000倍稀释的辣根标记的兔抗鸡IgG作为二抗，底物为4-氯-1-萘酚，结果在约80ku处观察到了特异性的反应条带。

Dot-ELISA(免疫酶斑点技术)实验：一抗、二抗和底物同上，结果纯化后的重组蛋白与基因VII型新城疫阳性的鸡血清形成了明显的斑点。

采用本专利的方法生产的产品可作为检测基因VII型新城疫的间接-ELISA及Dot-ELISA等抗体检测方法的检测抗原。

其产品优点体现在：

1)由于所制备检测抗原是NP基因原核表达重组蛋白，并非全病毒，因此应用该检测抗原无散毒危险。

2)可用于鉴别亚单位疫苗或活载体疫苗免疫接种与自然感染抗体。

3)所制备的检测基因VII型新城疫的检测抗原具有检测灵敏度高，特异性强，无交叉反应的特点。

4)制备工艺简单、产品性能稳定，成本低，产品付加值高，适合工厂化生产，市场应用前景广。

通过该方法制备的重组蛋白可用于基因VII型新城疫的自然感染与亚单位疫苗或活载体疫苗免疫抗体的鉴别。

融合表达的优点一是便于亲合层析纯化，二是增加蛋白分子量后免疫原性得到提高；该融合蛋白在表达时，大部分以非可溶性的包涵体形式表达，在纯化之前对包涵体采用了较为温和的包涵体裂解方式，因此包涵体蛋白裂解后又经复性处理后，根据Dot-ELISA及Western blot鉴定表明，融合蛋白具有与自然感染新城疫病毒NP蛋白抗体特异性结合的活性，经裂解的包涵体蛋白经24个月仍保持良好的均质胶体状态，无析出和沉淀现象，表明状态稳定。

应用本方法制备的重组蛋白作为检测抗原可以鉴别基因VII型新城疫病毒的自然感染与亚单位疫苗或活载体疫苗免疫的抗体；此外制备的重组蛋白是病毒NP基因的表达产物，并非全病毒，因此在应用该抗原进行检测过程中绝无散毒危险；同时还具有检测反应灵敏度高，无交叉反应现象的优点。

(四)具体实施方案

1)设计扩增基因VII型新城疫病毒NP基因的特异性引物；

上游引物：5′CCGGATCCTCTACCGATATGTCGTCTG 3′

下游引物：5′GGGAATTCGGTGTTGTCGATCAGTACC 3′

2)通过RT-PCR扩增NP基因片段；

3)对NP基因进行克隆、测序鉴定；

基因VII型新城疫病毒NP基因的核苷酸序列及其推倒的氨基酸序列如下：

1　　ATGTCGTCTGTTTTCGACGAATACGAGCAGCTTCTCGCTGCTCAGACCCGCCCTAACGGA

1     M  S  S  V  F  D  E  Y  E  Q  L  L  A  A  Q  T  R  P  N  G

61   ACTCATGGAGGGGGAGAGAAAGGGAGCACTTTAAAGGTTGAGGTCCCAGTATTTACCCTA

21    T  H  G  G  G  E  K  G  S  T  L  K  V  E  V  P  V  F  T  L

121  AACAGTGATGATCCAGAGGATAGATGGAATTTTGCGGTATTCTGTCTTCGGATTGCTGTT

41    N  S  D  D  P  E  D  R  W  N  F  A  V  F  C  L  R  I  A  V

181  AGCGAGGATGCCAACAAACCACTCAGGCAAGGTGCTCTTATATCCCTCTTATGCTCCCAT

61    S  E  D  A  N  K  P  L  R  Q  G  A  L  I  S  L  L  C  S  H

241  TCTCAGGTGATGAGAAACCATGTTGCCCTTGCAGGGAAACAGAATGAGGCCACACTGGCT

81    S  Q  V  M  R  N  H  V  A  L  A  G  K  Q  N  E  A  T  L  A

301  GTTCTTGAGATCGATGGTTTTGCTAACAGTGTGCCCCAGTTCAACAATAGGAGTGGAGTG

101   V  L  E  I  D  G  F  A  N  S  V  P  Q  F  N  N  R  S  G  V

361  TCTGAGGAGAGAGCACAGAGATTCATGGTAATCGCAGGATCTCTCCCTCGGGCATGCAGC

121   S  E  E  R  A  Q  R  F  M  V  I  A  G  S  L  P  R  A  C  S

421  AACGGTACTCCGTTTGTCACAGCTGGGGTTGAAGATGATGCACCAGAAGATATCACTGAC

141   N  G  T  P  F  V  T  A  G  V  E  D  D  A  P  E  D  I  T  D

481  ACTCTGGAAAGAATCCTATCTATCCAAGTTCAGGTATGGGTCACAGTAGCAAAGGCCATG

161   T  L  E  R  I  L  S  I  Q  V  Q  V  W  V  T  V  A  K  A  M

541  ACTGCATATGAGACAGCAGATGAGTCAGAAACAAGAAGAATAAATAAGTATATGCAGCAA

181   T  A  Y  E  T  A  D  E  S  E  T  R  R  I  N  K  Y  M  Q  Q

601  GGTAGAGTTCAGAAGAAGTACATCCTTCATCCTGTATGCAGGAGTGCAATTCAACTCACA

201   G  R  V  Q  K  K  Y  I  L  H  P  V  C  R  S  A  I  Q  L  T

661  ATCAGACATTCTCTGGCGGTCCGTATTTTCCTAGTTAGTGAGCTCAAGAGGGGCCGCAAT

221   I  R  H  S  L  A  V  R  I  F  L  V  S  E  L  K  R  G  R  N

721  ACAGCAGGCGGGAGCTCTACGTATTACAACTTGGTCGGGGATGTAGACTCATACATCAGA

241   T  A  G  G  S  S  T  Y  Y  N  L  V  G  D  V  D  S  Y  I  R

781  AACACCGGGCTTACTGCATTTTTCCTAACACTCAAATATGGAATCAATACCAAGACGTCA

261   N  T  G  L  T  A  F  F  L  T  L  K  Y  G  I  N  T  K  T  S

841  GCCCTCGCACTCAGCAGCCTCACAGGTGATATCCAAAAAATGAAACAGCTCATGCGTTTA

281   A  L  A  L  S  S  L  T  G  D  I  Q  K  M  K  Q  L  M  R  L

901  TATCGGATGAAAGGTGAGAATGCACCATACATGACATTGTTAGGTGACAGTGACCAGATG

301   Y  R  M  K  G  E  N  A  P  Y  M  T  L  L  G  D  S  D  Q  M

961  AGCTTTGCACCAGCTGAGTATGCACAACTTTATTCTTTTGCCATGGGCATGGCATCAGTC

321   S  F  A  P  A  E  Y  A  Q  L  Y  S  F  A  M  G  M  A  S  V

1021 TTAGATAAGGGAACTGGCAAGTACCAATTCGCCAGGGACTTTATGAGCACATCATTCTGG

341   L  D  K  G  T  G  K  Y  Q  F  A  R  D  F  M  S  T  S  F  W

1081 AGACTTGGAGTAGAGTATGCTCAGGCTCAGGGAAGTAGCATCAATGAGGACATGGCTGCT

361   R  L  G  V  E  Y  A  Q  A  Q  G  S  S  I  N  E  D  M  A  A

1141 GAGCTAAAACTAACCCCGGCAGCAAGGAGAGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGAGTATCT

381     E  L  K  L  T  P  A  A  R  R  G  L  A  A  A  A  Q  R  V  S

1201   GAAGAAATCGGCAGCATGGACATTCCTACTCAACAGGCGGGAGTCCTCACCGGGCTCAGT

401     E  E  I  G  S  M  D  I  P  T  Q  Q  A  G  V  L  T  G  L  S

1261   GACGAAGGCCCCCGAACTCCACAGGGCGGATCAAACAAGCCGCAAGGGCAACCAAATGCC

421     D  E  G  P  R  T  P  Q  G  G  S  N  K  P  Q  G  Q  P  N  A

1321   GGGGATGGGGAGACCCAATTCATGGATTTTATGAGAGCAGTGGCGAACAGCATGCGGGAA

441     G  D  G  E  T  Q  F  M  D  F  M  R  A  V  A  N  S  M  R  E

1381   GCGCCAAATCCTGCACAGAGCACCACCCATCCAGAGCCTCCCCCAACCCCTGGGGCATCC

461     A  P  N  P  A  Q  S  T  T  H  P  E  P  P  P  T  P  G  A  S

1441   CAAGACAACGACACTGACTGGGGGTACTGA

481     Q  D  N  D  T  D  W  G  Y  ^*

4)将NP基因定向亚克隆至pGEX-6p原核表达载体；

5)重组表达质粒pGEX-6p-NP转化大肠杆菌中进行诱导表达；

表达的融合蛋白的分子量为81.9ku。

6)重组蛋白的纯化

通过离心收集培养物中的基因工程菌，用PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬，加入溶菌酶至终浓度为1％(1mg/ml)，然后进行超声处理，超声处理必须于冰浴条件下进行。以4℃、10000g离心10min，取上清并加入1％的TritionX-100及1mmol/L的DTT至终浓度为1mmol/L；沉淀即为包涵体，将沉淀用包涵体洗涤液(30％蔗糖，100mol/L NaCl，50mmol/LTris，pH8.0，1％TritionX-100)洗涤2次，重悬沉淀，加入包涵体裂解液[1.5％(m/v)N-十二烷基肌氨酸钠，25mmol/L三乙醇胺，1mmol/L EDTA，pH8.0]重悬，4℃处理2h，再超声处理20S，以12000r/m，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白，向其中立即加入终浓度为2％的TritionX-100，加入9倍体积的复性缓冲液[0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSH)，2mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，2mmol/LEDTA，20mmol/L Tris，pH8.5]，用0.01mol/L PBS(pH7.4)透析48h，每12h更换一次透析液。取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化。

将复性后的表达蛋白经SDS-PAGE电泳后，用KCl染色，将凝胶中的目的蛋白带切下、研碎，加入PBS，反复冻融，1000r/min离心10min，上清即为纯化蛋白。

7)重组蛋白抗原性检测

通过免疫印迹、Dot-ELISA方法的检测该蛋白的抗原性。

免疫印记试验：将纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，再将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维膜上，以1:150倍稀释基因VII型新城疫阳性的鸡血清作为一抗，1:10000倍稀释的辣根标记的兔抗鸡IgG作为二抗，底物为4-氯-1-萘酚，结果在约80ku处观察到了特异性的反应条带。

Dot-ELISA(免疫酶斑点技术)实验：一抗、二抗和底物同上，结果纯化后的重组蛋白与基因VII型新城疫阳性的鸡血清形成了明显的斑点。

Claims (2)

1、一种基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原，其特征是：该重组原核表达检测抗原为GST前导肽与NP基因编码蛋白的融合蛋白，其中NP基因的核苷酸序列为：

1    ATGTCGTCTGTTTTCGACGAATACGAGCAGCTTCTCGCTGCTCAGACCCGCCCTAACGGA

61   ACTCATGGAGGGGGAGAGAAAGGGAGCACTTTAAAGGTTGAGGTCCCAGTATTTACCCTA

121  AACAGTGATGATCCAGAGGATAGATGGAATTTTGCGGTATTCTGTCTTCGGATTGCTGTT

181  AGCGAGGATGCCAACAAACCACTCAGGCAAGGTGCTCTTATATCCCTCTTATGCTCCCAT

241  TCTCAGGTGATGAGAAACCATGTTGCCCTTGCAGGGAAACAGAATGAGGCCACACTGGCT

301  GTTCTTGAGATCGATGGTTTTGCTAACAGTGTGCCCCAGTTCAACAATAGGAGTGGAGTG

361  TCTGAGGAGAGAGCACAGAGATTCATGGTAATCGCAGGATCTCTCCCTCGGGCATGCAGC

421  AACGGTACTCCGTTTGTCACAGCTGGGGTTGAAGATGATGCACCAGAAGATATCACTGAC

481  ACTCTGGAAAGAATCCTATCTATCCAAGTTCAGGTATGGGTCACAGTAGCAAAGGCCATG

541  ACTGCATATGAGACAGCAGATGAGTCAGAAACAAGAAGAATAAATAAGTATATGCAGCAA

601  GGTAGAGTTCAGAAGAAGTACATCCTTCATCCTGTATGCAGGAGTGCAATTCAACTCACA

661  ATCAGACATTCTCTGGCGGTCCGTATTTTCCTAGTTAGTGAGCTCAAGAGGGGCCGCAAT

721  ACAGCAGGCGGGAGCTCTACGTATTACAACTTGGTCGGGGATGTAGACTCATACATCAGA

781  AACACCGGGCTTACTGCATTTTTCCTAACACTCAAATATGGAATCAATACCAAGACGTCA

841  GCCCTCGCACTCAGCAGCCTCACAGGTGATATCCAAAAAATGAAACAGCTCATGCGTTTA

901  TATCGGATGAAAGGTGAGAATGCACCATACATGACATTGTTAGGTGACAGTGACCAGATG

961  AGCTTTGCACCAGCTGAGTATGCACAACTTTATTCTTTTGCCATGGGCATGGCATCAGTC

1021 TTAGATAAGGGAACTGGCAAGTACCAATTCGCCAGGGACTTTATGAGCACATCATTCTGG

1081 AGACTTGGAGTAGAGTATGCTCAGGCTCAGGGAAGTAGCATCAATGAGGACATGGCTGCT

1141 GAGCTAAAACTAACCCCGGCAGCAAGGAGAGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGAGTATCT

1201 GAAGAAATCGGCAGCATGGACATTCCTACTCAACAGGCGGGAGTCCTCACCGGGCTCAGT

1261 GACGAAGGCCCCCGAACTCCACAGGGCGGATCAAACAAGCCGCAAGGGCAACCAAATGCC

1321 GGGGATGGGGAGACCCAATTCATGGATTTTATGAGAGCAGTGGCGAACAGCATGCGGGAA

1381 GCGCCAAATCCTGCACAGAGCACCACCCATCCAGAGCCTCCCCCAACCCCTGGGGCATCC

1441 CAAGACAACGACACTGACTGGGGGTACTGA。

2、一种制备权利要求1所述的基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原的方法，其特征是：

1)设计扩增基因VII型新城疫病毒NP基因的特异性引物；

2)通过RT-PCR扩增NP基因片段；

3)对NP基因进行克隆、测序鉴定；

4)将NP基因定向亚克隆至pGEX-6p原核表达载体；

5)重组表达质粒pGEX-6p-NP转化大肠杆菌中进行诱导表达；

6)重组蛋白的纯化

通过离心收集培养物中的基因工程菌，用PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬，加入溶菌酶至终浓度为1％即1mg/ml，然后进行超声处理，超声处理必须于冰浴条件下进行；以4℃、10000g离心10min，取上清并加入1％的TritionX-100及1mmol/L的DTT至终浓度为1mmol/L；沉淀即为包涵体，将沉淀用组成为30％蔗糖，100mol/L NaCl，50mmol/LTris，pH8.0，1％TritionX-100的包涵体洗涤液洗涤2次，重悬沉淀，加入组成为1.5％(m/v)N-十二烷基肌氨酸钠，25mmol/L三乙醇胺，1mmol/LEDTA，pH8.0的包涵体裂解液重悬，4℃处理2h，再超声处理20S，以12000r/m，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白，向其中立即加入终浓度为2％的TritionX-100，加入9倍体积的组成为0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽，2mmol/L还原型谷胱苷肽，2mmol/LEDTA，20mmol/L Tris，pH8.5的复性缓冲液，用0.01mol/L PBS、pH7.4透析48h，每12h更换一次透析液，取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化；

将复性后的表达蛋白经SDS-PAGE电泳后，用KCl染色，将凝胶中的目的蛋白带切下、研碎，加入PBS，反复冻融，1000r/min离心10min，上清即为纯化蛋白。