CN105505848A - 一种拉沙热病毒核蛋白及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拉沙热病毒核蛋白及制备方法和应用，步骤：A、引物设计；B、用引物F和R进行PCR扩增获得目的基因；C、融合表达载体pMAL-C2X-LAV-NP构建；D、将获得的融合载体进行培养，挑取转化有表达载体的克隆株Escherichia？coli？Rosetta？(DE3)/pMAL-C2X-LAV-NP加入LB过夜培养，加入氨苄青霉素和氯霉素抑制杂菌生长；E、培养物加LB扩大培养并加入氨苄青霉素和氯霉素抑制杂菌生长；F、加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，分离得到菌体；G、倒尽培养基残液，PBS重悬菌体。该蛋白NP在ELISA检测人群血清药物中的应用。方法简单，操作方便，易于生产，制备的蛋白纯度高，产量大，可溶性强，易纯化，适合作为检测用抗原，检测方法灵敏度强，特异性好，检测周期短，有很广的应用面。

Description

一种拉沙热病毒核蛋白及制备方法和应用

技术领域

本发明属于病原检测技术领域，具体涉及一种拉沙热病毒核蛋白NP的制备方法及其在拉沙热病毒核蛋白抗体检测中的应用。结果显示基因工程生产的拉沙热病毒核蛋白NP能与相应抗体特异性的结合，NP蛋白抗原用于NP抗体的检测时具有很高的灵敏度和显著的特异性，具有开发成为检测试剂盒的应用价值。

背景技术

拉沙热病毒（Lassavirus,LAV）能够引起拉沙热（Lassafever）急性传染疾病，该疾病为人畜共患病，病程一般为1～4周，主要在尼日利亚、利比亚、塞拉里昂、几内亚等西非国家中流行，美洲、欧洲也曾发现输入性病例，引起较高的发病率与死亡率。人感染拉沙病毒后，大多数病人症状较轻，表现为发热、呕吐、腹泻、咽炎等症状，严重者出现多脏器功能障碍、衰竭，从而导致死亡，传播能力极强。近年来，随着中国和非洲经济文化联系的日益密切，大量人员频繁来往于中非之间，拉沙热疫情将对中国的公共卫生体系建设和拉沙热疫情的防控带来严峻的挑战和威胁。为此，国家有关部门对此次疫情给以了高度关注，发布了拉沙热防控的指导性文件，启动了相应的应急科技支撑项目。虽然拉沙热病毒没有在世界范围内造成大规模流行，但是，随着经济全球化进程的深入，非洲贸易、旅游、合作、及人员往来的增多，拉沙热病毒对各国人民的威胁与日俱增，像中国这样一个人口众多，人流量大的国家，迫切需要对此类病毒的入侵做好储备性工作，尤其是2014年西非的埃博拉出血热疫情的爆发，更需要特异性的检测方法能对埃博拉出血热等病毒感染和拉萨出血热感染进行鉴别。拉沙热病毒感染的早期核酸和抗体检测技术的建立和完善是有效进行拉沙热病毒防控的重要措施。

血清学检测方法之中，敏感性和特异性最高的检测方法是ELISA法，可用于检测拉沙热病毒抗原、特异性IgM、IgG抗体，目前尚无商品化检测试剂盒。原核表达系统pMal-c2x是基因工程技术中重要的的表达载体，其序列中具有诱导调控原件，可以人为控制蛋白的表达。通常MBP标签能够增大在原核表达系统中表达的融合蛋白的可溶性，提高其表达量。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种含有拉沙热病毒核蛋白NP蛋白基因的融合质粒，该质粒表达能在细胞中能大量表达产生可溶性拉沙热病毒核蛋白NP，适合作为检测用抗原，检测方法灵敏度强，特异性好。

本发明的另一个目的是在于提供了一种拉沙热病毒核蛋白NP的制备方法，该方法简单易行，操作方便，易于生产，制备的蛋白纯度高，产量大，可溶性强，易纯化，可快速获得较多且纯度较高的重组蛋白。

本发明的再一个目的是在于提供了一种重组基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP在ELISA检测人群血清药物中的应用，该应用方法效果佳，检测灵敏度强，特异性好，操作简单，设备要求低、检测周期短，有很广的应用面。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

其技术构思是：申请人将原核表达系统pMAL-C2X，通过基因工程手段，与拉沙热病毒核蛋白NP进行重组，获得融合质粒（图1）。原核表达系统生产融合抗原，方法简单，不易污染。成功构建的pMAL-C2X-LAV-NP表达载体，可以用于制备高产量、高纯度的检测用抗原拉沙热病毒核蛋白NP，且制备过程简单方便，检测活性高。

一种基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP的制备方法，其步骤是：

A、引物设计：设计两条引物扩增拉沙热病毒核蛋白NP基因，正向引物为5’-GAATTCATGAGTGCCTCAAAGGAAAT-3’(F),反向引物为5’-GTCGACTTACAGAACGACTCTAGGTGTC-3’(R)；

B、PCR扩增基因：用扩增引物F（正向引物）和R扩增基因（反向引物），扩增模板为合成基因，序列已公开（GeneBankaccessionnumberNC_004296）。PCR反应的试剂如下：将5μl的10xTaq聚合酶缓冲液、1μl的dNTP混合物、1μl的引物F、1μl的引物R、1μl的扩增模板、1μl的TaqDNA聚合酶和40μl的121℃、20min灭菌后的MiliQ超纯水混合，PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性30秒、53℃复性45秒、72℃延伸90秒、72℃最后延伸300秒，循环30次，获得扩增带（图2）。

C、融合载体构建：0.8%（m/v）琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，胶回收，与pGEM-TEasy载体（由PROMEGA公司原产，CATNO:A137A，请见遗传资源表）连接，测序验证序列。用EcoRI和SalI双酶切含NP基因的DNA片段，与同样双酶切的pMAL-C2X（由NEB公司原产），4℃下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌Rosetta（DE3）由Novagen公司原产，CATNO:71400）。培养菌株过夜，提取质粒，双酶切验证表明融合载体pMAL-C2X-LAV-NP构建成功。

D、将步骤C获得的融合载体进行培养，挑取转化有表达载体的克隆株pMAL-C2X-LAV-NP-Rosetta（DE3）至5ml加入新鲜LB（加入50mg/ml氨苄青霉素和35mg/ml氯霉素抑制杂菌生长），过夜培养。

E、100μl培养物加至5ml新鲜LB（加入50mg/ml氨苄青霉素和35mg/ml氯霉素抑制杂菌生长），37℃培养3h，测OD600=0.2~0.4。

F、加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，诱导条件为：IPTG浓度0.03mM、诱导温度30℃、诱导时间4h。诱导完毕，吸取1ml菌液，8,000rpm离心10min，分离得到菌体。

G、倒尽培养基残液，1mlPBS重悬菌体，超声波破碎细胞，OD600<0.1。12,000rpm离心10min，分离溶液相与固相，SDS-PAGE验证目的蛋白有表达（图3）。使用直链淀粉树脂纯化收集溶液相中的带有MBP-tag的目的抗原LAV-NP（图4），获得基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP。

将获得的克隆株EscherichiacoliRosetta(DE3)/pMAL-C2X-LAV-NP在武汉大学保藏，该菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)/pMAL-C2X-LAV-NPEscherichiacoliRosetta(DE3)/pMAL-C2X-LAV-NP已于2015年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山），保藏编号为CCTCCM2015719。

含有拉沙热病毒核蛋白NP蛋白基因的融合质粒构建过程中所述的IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA（或其他带有lacZ基因载体DNA）以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。

检测用拉沙热病毒核蛋白NP在使用western-blot、ELISA方法检测拉沙热病毒核蛋白抗体以及该ELISA方法在人群血清样本检测中的用途，一种重组基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP在ELISA检测人群血清药物中的应用，它包括下列步骤：

A.western-blot检测拉沙热病毒核蛋白NP抗体。将样品进行SDS-PAGE后，150mA，45min将样品转移到PDVF膜上。5%（m/v）脱脂奶粉，4℃下封闭过夜。TBST(Tris-BufferedSalinewith0.05%Tween-20)洗涤5次，每次间隔5min。2000倍稀释阳性抗体LAV-NP作为一抗，室温孵育1.5hour。同样方法洗涤5次，孵育2000倍稀释的带有AP标记—羊抗兔二抗(由碧云天公司提供，CATNO:A0258)，在室温下孵育1hour。洗涤后，将膜加入到含有底物BCIP（300×）10μl，底物NBT（150×）20μl，底物工作液3ml的染色槽中，显色约5分钟后用无菌水终止反应。实验结果显示抗原在Western-blot试验中表现了极强的灵敏性及特异性（图5）。

B．ELISA检测拉沙热核蛋白NP抗体。抗原与包被液（0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液pH9.6）充分混合，4摄氏度包被过夜，每孔加入抗原稀释液100μl（包被抗原浓度：1.5μg/ml）。PBST(含0.05%tween-20)洗涤5次，注满后，静置3min，拍干。5%（质量体积）脱脂奶粉在37摄氏度下，封闭1hour，注满，PBST洗涤5次。兔源拉沙热核蛋白NP抗体用PBST，加入1%(m/v)脱脂奶粉，稀释成500、1000、2,000、4000四个稀释倍数，37度孵育1.5hour。兔抗体IgG（由碧云天公司提供，CATNO:A7016）作为阴性对照，在同样条件下孵育。PBST洗涤5次。酶联HRP的二抗用PBST（加入1%脱脂奶粉）稀释4,000倍，37度孵育30min。PBST洗涤5次，静置3min后，拍干剩余的液体。加入TMB底物显色液，每孔100μl，室温下显色5min，终止液（2M硫酸）终止反应，每孔50μl，OD450读数。实验结果表明，制备的抗原在ELISA试验中表现了较强的灵敏性（表1）和显著的特异性(图6)。

表1.灵敏性试验

C．人群血清样品ELISA检测。在国内无法获得阳性样品的客观限制下，申请人利用现有的资源，对拉沙热核蛋白NP在检测领域的进一步应用进行了努力：对来源于广东省出入境检验检疫局的122份人血清进行了ELISA检测，具体过程如下：抗原与包被液充分混合，4摄氏度包被过夜，每孔加入混合液100μl（抗原包被量：抗原量1.5μg/ml）。洗涤剂PBST(含0.05%tween-20)洗涤5次，注满后，静置3min，拍干。5%（m/v）脱脂奶粉在37摄氏度下，封闭1hour,注满，PBST洗涤5次。122份人血清用PBST（加入1%脱脂奶粉）稀释5,000倍，37度孵育1.5hour，一份样品三个平行。PBST洗涤5次。酶联HRP的二抗用PBST（加入1%脱脂奶粉）稀释4,000倍，37度孵育30min。PBST洗涤5次后，拍干剩余的液体。加入TMB底物显色液，每孔100μl，室温下显色5min，然后加入2M硫酸终止液终止反应，每孔50μl，2min内OD450读数。将三个平行取平均数，求出样本内标准差和平均数，变异系数大于10%重新做。求出122个检测值平均数和标准差，最后，得到人血清检测的阳性判断标准：阴性：<0.632，阳性：>0.632（图7）。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、原核表达载体pMAL-C2X与拉沙热核蛋白NP的融合表达，使得后续的纯化过程简单而高效，蛋白回收纯度较高。制备过程简单，耗时短，从菌株培养到获得纯抗原，仅需要12小时的时间。

2、制备的检测用抗原在检测相应兔源抗体时表现了较高的灵敏度和显著特异性，证明了本发明的实用价值。在检测人源血清的应用中，结果显示该方法达到了100%的特异性，为本发明的进一步研发提供了坚实的实用基础。

附图说明

图1为一种拉沙热病毒核蛋白NP融合表达载体构建示意图。

图2为一种PCR扩增拉沙热病毒核蛋白NP的结果图。

Lane1:1kbDNAmarker;Lane2:LAV-NP;Lane3:negativecontrol.

图3为一种拉沙热病毒核蛋白NP获得表达的结果图。

Lane1:Marker；Lane2：LAV-NP-pMAL-C2X（未加诱导剂）；Lane3-Lane5：LAV-NP-pMAL-C2X（加诱导剂）；Lane6:空载体pMAL-C2X（加诱导剂）。

图4为一种利用MBP-tag纯化拉沙热病毒核蛋白NP的结果图。

Lane1：Marker；Lane2：阴性对照；Lane3：菌体破碎液；Lane4-5：纯化后的洗脱液；Lane6：纯化后溶解获得的拉沙热核蛋白NP。

图5为一种Western-blot检测拉沙热病毒核蛋白与其抗体热异性反应的结果图。

Lane1:空载体（阴性对照）；Lane2:拉沙热病毒核蛋白NP；Lane3:埃博拉病毒核蛋白NP；Lane4:马尔堡病毒核蛋白NP。

图6为一种ELISA验证抗原特异性示意图。

图7为一种以重组基因工程拉沙热病毒核蛋白NP为抗原建立的ELISA方法对人群血清样本的检测结果示意图。

具体实施方式

实施例1：

一种获取高产量、高纯度、检测用拉沙热病毒核蛋白NP融合质粒的制备方法，其步骤是：

A、PCR扩增基因：

原始基因由合成所得，序列已公开（GeneBankaccessionnumberNC_004296）。正向引物为5’-GAATTCATGAGTGCCTCAAAGGAAAT-3’(F),反向引物为5’-GTCGACTTACAGAACGACTCTAGGTGTC-3’(R)；PCR反应的试剂如下：将5μl的10xTaq聚合酶缓冲液、1μl的dNTP混合物、1μl的引物F、1μl的引物R、1μl的扩增模板、1μl的TaqDNA聚合酶和40μl的无菌水混合，PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性30秒、53℃复性45秒、72℃延伸90秒、72℃最后延伸600秒，循环35次，获得扩增带（图2）。0.8%(m/v)琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，纯化后，与pGEM-TEasy载体连接，测序验证序列。

B、融合载体构建：

用EcoRI和SalI双酶切含NP基因的DNA片段，与同样双酶切的pMAL-C2X，酶切体系如下：1μlEcoRI，1μlSalI，10μlT载连接产物，4μl10×Hbuffer，24μlddH20以及1μlEcoRI，1μlSalI，10μlpMAL-C2X，4μl10×Hbuffer，24μlddH20。酶切条件为37度下3小时。0.8%(m/v)琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物，胶回收后，将酶切产物进行连接，连接体系如下：2μlNP基因DNA片段，6μlpMAL-C2X，1μlT4连接酶，1μl10×连接buffer。连接条件为4度下过夜。将连接产物，与40μlRosetta(DE3)在冰上充分混合，注入电转化杯，用1,800v瞬时电击，吸取转化后的转化后产物到1mlSOC培养基中，37℃摇床培养40min，取200ml涂布于固体LB（含氨苄青霉素和氯霉素）培养皿中。37度过夜培养，挑取3-6株单菌落，接至5ml新鲜LB培养基，37度过夜培养，提取质粒，进行双酶切验证，酶切体系如下：0.5μlEcoRI，0.5μlSalI，5μl质粒，2μl10×Hbuffer，12μlddH20。将酶切产物进行0.8%(m/v)琼脂糖凝胶电泳验证，在电泳图上，阳性克隆株会分别在1700bp以及6646bp左右显示两条清晰的条带，将符合上述条件的克隆株pMAL-C2X-LAV-NP-Rosetta(DE3)划平板培养基，4度及-20度分别保存。

克隆菌株在LB固态培养下，呈2mm左右圆形小菌落、边缘光滑清晰、不透明、白色或米白色。在LB液体培养下，呈黄色浑浊液，浑浊度随培养时间的延长而增加。单菌体在显微镜下呈现杆状，大小0.5μm×2μm。该克隆菌具有增殖能力强，蛋白表达能力稳定的特性。

将获得的克隆株EscherichiacoliRosetta(DE3)/pMAL-C2X-LAV-NP在武汉大学保藏中心去保藏，该菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)/pMAL-C2X-LAV-NPEscherichiacoliRosetta(DE3)/pMAL-C2X-LAV-NP已于2015年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山），保藏编号为CCTCCM2015719。

该菌株为大肠杆菌Rosetta（DE3）工程菌株，其生理生化特性与大肠杆菌菌株一致。该菌株中含有pMAL-C2X-LAV-NP质粒，可以用于质粒的扩增和拉沙热病毒NP蛋白的可溶性表达。

实施例2：

一种基因工程拉沙热病毒核蛋白NP的制备方法，其步骤如下：

A、挑取转化有表达载体的克隆株pMAL-C2X-LAV-NP-Rosetta至5ml加入新鲜LB（加入相应浓度抗生素抑制杂菌生长），过夜培养。

B、100μl培养物加至5ml新鲜LB（加入相应浓度抗生素抑制杂菌生长），37℃培养3h，测OD600=0.2~0.4。

C、加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，诱导条件为：IPTG浓度0.03mM、诱导温度30℃、诱导时间4h。诱导完毕，吸取1ml菌液，8,000rpm离心10min，分离得到菌体。

D、倒尽培养基残液，1mlPBS重悬菌体，超声波破碎细胞，OD600<0.1。12,000rpm离心10min，分离溶液相与固相，取40μl上清溶液，加入10μl5×SDS上样缓冲液，99℃变性10min。制成上样品，以不加诱导剂的克隆株pMAL-C2X-LAV-NP-Rosetta菌体破碎液作为阴性对照，用10%(m/v)SDS-PAGE检测表达量。如图3所示，加了诱导剂的pMAL-C2X-LAV-NP-Rosetta菌体破碎液样品显示明显的深条带，不加诱导剂的阴性对照组则不显示条带。

实施例3：

拉沙热核蛋白NP的一步纯化：

使用直链淀粉树脂纯化收集带有MBP-tag的目的抗原。纯化的步骤如下：无菌去离子水润湿分离柱，取1.5ml的直链淀粉树脂加入分离柱，树脂自然沉降，吸去上层储存液，分别用缓冲液平衡树脂：8柱体积（columnvolume）的ColumnBuffer洗柱，之后，进行样品过柱（1ml/min的速度过柱），12柱体积（columnvolume）的ColumnBuffer洗柱，以洗去杂蛋白，用含有10mM的麦芽糖的columnvolume洗脱液洗脱目的蛋白，收集目的蛋白洗脱液。取40μlElute溶液，加入10μl5×SDS上样缓冲液，99℃变性10min，用10%（m/v）SDS-PAGE检测纯化结果。如图4所示，使用直链淀粉树脂能够纯化收集溶液相中的带有MBP-tag的目的抗原，获得基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP。

实施例4：

western-blot检测拉沙热核蛋白NP抗体：

将样品跑SDS-PAGE。150mA，45min将样品转移到PDVF膜上。5%（m/v）脱脂奶粉，4℃下封闭过夜。TBST(Tris-BufferedSalinewith0.05%（v/v）Tween-20)洗涤5次，每次间隔5min。2000倍稀释阳性抗体LAV-NP作为一抗，室温下孵育1.5hour。同样方法洗涤5次，孵育2000倍稀释的酶联AP标记二抗(由碧云天公司提供，CATNO:A0258)，在室温下孵育1hour。洗涤后，将膜加入到含有底物BCIP（300×）10μl，底物NBT（150×）20μl，底物工作液3ml的染色槽中，显色约10分钟后用无菌水终止反应。Western-blot实验结果显示上述重组的基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP与其兔源抗体的反应表现了极强的灵敏性及特异性（图5）。

实施例5：

ELISA检测拉沙热核蛋白NP抗体：

抗原与包被液（0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液pH9.6）充分混合，4摄氏度包被过夜，每孔加入混合液100μl（抗原包被量：1.5μg/ml）。洗涤剂PBST(含0.05%tween-20)洗涤5次，注满后，静置3min，拍干。5%脱脂奶粉在37摄氏度下，封闭1hour,注满，PBST洗涤5次。兔源拉沙热核蛋白NP抗体用PBST（加入1%脱脂奶粉）稀释成500、1000、2000、4000四个稀释倍数，37度孵育1.5hour。以埃博拉病毒核蛋白抗体、马尔堡核蛋白抗体和兔抗IgG(碧云天，CATNO:A7016)作为对照抗体，在同样条件下孵育。PBST洗涤5次。酶联HRP标记二抗(碧云天，CATNO:A0208)用PBST稀释4,000倍，37度孵育30min。PBST洗涤5次后，吸去剩余的液体。加入TMB底物显色液，每孔100μl，室温下显色5min，终止液终止反应（2M硫酸），每孔50μl，OD450读数。实验结果表明，上述重组的基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP在ELISA抗体检测方法中表现了极强的灵敏性（表1）和显著的特异性（图6）。

实施例6：

一种拉沙热病毒核蛋白NP在ELISA检测人群血清药物中的应用，其步骤是：

抗原与包被液充分混合，4摄氏度包被过夜，每孔加入混合液100μl（抗原包被量：抗原量1.5μg/ml）。洗涤剂PBST(含0.05%tween-20)洗涤5次，注满后，静置3min，拍干。5%脱脂奶粉在37摄氏度下，封闭1hour，注满，PBST洗涤5次。122份人血清用PBST（加入1%脱脂奶粉）稀释5,000倍，37度孵育1.5hour，一份样品三个平行。PBST洗涤5次。酶联HRP的二抗用PBST（加入1%脱脂奶粉）稀释4000倍，37度孵育30min。PBST洗涤5次后，吸去剩余的液体。加入TMB底物显色液，每孔100μl，室温下显色5min，加入2M终止液硫酸，每孔50μl，OD450读数。Cut-off值如下：LAV-NP阴阳性样品判断值：阴性：<0.632，阳性：>0.632。

实验结果显示，122份样品均为阴性，符合样品来源的背景，显示了基于基因工程拉沙热核蛋白病毒NP在检测效用（图7）。

Claims (4)

1.一种含有拉沙热病毒核蛋白NP蛋白基因的融合质粒的基因工程菌株，其特征在于：该基因工程菌株EscherichiacoliRosetta(DE3)/pMAL-C2X-LAV-NP，CCTCCNo：M2015719。

2.根据权利要求1所述的一种含有拉沙热病毒核蛋白NP蛋白基因的融合质粒的基因工程菌株，其特征在于：所述的基因工程菌株中含有pMAL-C2X-LAV-NP质粒。

3.权利要求1所述的一种基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP的制备方法，其步骤是：

A、引物设计：设计两条引物扩增拉沙热病毒核蛋白NP基因，正向引物为5’-GAATTCATGAGTGCCTCAAAGGAAAT-3’(F),反向引物为5’-GTCGACTTACAGAACGACTCTAGGTGTC-3’(R)；

B、PCR扩增基因：用扩增引物F和R扩增基因，扩增模板为合成基因，序列已公开（GeneBankaccessionnumberNC_004296）；

PCR反应的试剂如下：将5μl的10xTaq聚合酶缓冲液、1μl的dNTP混合物、1μl的引物F、1μl的引物R、1μl的扩增模板、1μl的TaqDNA聚合酶和40μl的121℃、20min灭菌后的MiliQ超纯水混合，PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性30秒、53℃复性45秒、72℃延伸90秒、72℃最后延伸600秒，循环34－36次，获得扩增带；

C、融合载体构建：0.8%m/v琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，胶回收，与pGEM-TEasy载体连接，测序验证序列，用EcoRI和SalI双酶切含NP基因的DNA片段，与同样双酶切的pMal-c2x，4℃下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，培养菌株过夜，提取质粒，双酶切验证表明融合载体pMAL-C2X-LAV-NP构建成功；

D、将步骤（C）获得的融合载体进行培养，挑取转化有表达载体的克隆株pMAL-C2X-LAV-NP-Rosetta(DE3)至5ml加入新鲜LB：加入50mg/ml氨苄青霉素和35mg/ml氯霉素抑制杂菌生长，过夜培养；

E、100μl培养物加至5ml新鲜LB，同时加入50mg/ml氨苄青霉素和35mg/ml氯霉素抑制杂菌生长，37℃培养3h，测OD600=0.2~0.4；

F、加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，诱导条件为：IPTG浓度0.03mM、诱导温度30℃、诱导时间4h，诱导完毕，吸取1ml菌液，8,000rpm离心10min，分离得到菌体；

G、倒尽培养基残液，1mlPBS重悬菌体，超声波破碎细胞，OD600<0.1；

12,000rpm离心10min，分离溶液相与固相，SDS-PAGE验证目的蛋白有表达，使用直链淀粉树脂收集溶液相中的带有MBP-tag的目的抗原LAV-NP，获得基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP。

4.权利要求1所述的一种重组基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP在ELISA检测人群血清药物中的应用。