CN107552021B

CN107552021B - 一种羟基生物磁珠及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107552021B
Application number: CN201710893232.8A
Authority: CN
Inventors: 陈丽华; 吕淑丽; 罗细亮
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2037-09-28
Also published as: CN107552021A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羟基生物磁珠及其制备方法和应用。该羟基生物磁珠，包括Fe₃O₄颗粒核心，该颗粒核心外包覆金壳，金壳外包覆氨基聚乙二醇(PEG)，金壳与PEG形成稳定的Au‑N键，1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂将PEG的氨基与硫酸软骨素(CSA)中的羧基链接形成抗非特异生物分子吸附的功能层。本发明首次将硫酸软骨素与氨基聚乙二醇复合修饰于金磁微粒上作为抗污基层界面。硫酸软骨素含有丰富的有利于抗非特异生物分子吸附的有效官能团，如酰氨键、‑OH、C‑O‑C，其中C‑O‑C可在所制备的金磁微粒表面形成一层致密的水化层，与来自硫酸软骨素的酰氨键、‑OH协同，形成了可有效防止非特异生物分子吸附的基底材料表面。

Description

一种羟基生物磁珠及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羟基生物磁珠及其制备方法和应用。

背景技术

金磁微粒是指内核为磁性材料,表面包覆金壳的复合微粒。该材料由于具有化学性能稳定、能够有效固定生物分子、在外加磁场中可迅速分离等特点，已广泛用于环境、生物和医药领域，如重金属富集、细胞和蛋白的分离提纯、高精确度的免疫学检测以及靶向药物输送等。但由于实际样品中，如工业废水、海水、人畜血液、痰液和尿液成分复杂，含有大量的有机、无机和生物干扰分子，污染磁珠修饰界面，引起界面有效功能基层的钝化，导致磁珠选择性、精确性和分散性变差，甚至出现团聚及沉降，从而限制了磁珠的应用空间。因此制备一种在复杂体系中能够有效抵制各种污染物的作用，且性能稳定又富含大量有效官能团的磁珠至关重要。

发明内容

针对现有技术存在的生物磁珠抗污性能差，容易钝化等上述问题，本发明提供一种羟基生物磁珠，该磁珠外层为抗污基层，由硫酸软骨素、氨基聚乙二醇和交联剂形成，本发明还提供该生物磁珠的制备方法以及应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种羟基生物磁珠，包括Fe₃O₄颗粒核心，该颗粒核心外面包覆金壳，金壳的外面包覆氨基聚乙二醇(PEG)，金壳与PEG形成稳定的Au-N键，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂将PEG的氨基与硫酸软骨素(CSA)中的羧基链接形成抗非特异性生物分子吸附的功能基层。

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，本发明中简称CSA)，是一种由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺双糖单位交替连接组成，属于没有分支结构的线性阴离子天然多糖高分子材料，其富含羟基、生物相容性良好、且来源丰富。硫酸软骨素在生物过程如神经发育，癌症转移，脊髓损伤等过程中发挥着重要作用，因此广泛应用于组织工程，靶向给药和基因传递。

本发明首次将硫酸软骨素与氨基聚乙二醇复合并修饰于金磁微粒上作为抗污基层界面。硫酸软骨素含有丰富的有利于抵抗非特异性生物分子吸附的有效官能团，如酰氨键、-OH、C-O-C，其中C-O-C可在所制备的金磁微粒表面形成一层致密的水化层，与来自硫酸软骨素的酰氨键、-OH协同,形成了可有效抗非特异性生物分子吸附的基底材料表面。它的粒径大小约在100-200nm左右，呈均匀球形，利用电化学测试方法测得该磁珠在蛋白、噬菌体、牛奶、血清等复杂生物体系中具有优良的抗污染性能，非特异生物分子吸附率1.5-4.5％，且在各种pH、盐度和缓冲溶液，以及复杂体系的牛奶血清中物理化学性质相对稳定，具有超顺磁性、可联合不同的功能性配基，如酶、抗体、抗原、DNA等物质。这意味着该磁珠经过适当的设计和修饰即可实现在复杂生物体系中有效分离提纯目标细胞和蛋白，以及可以实现直接在复杂生物体系中进行高精确度的免疫学检测的目标,应用前景广泛。

作为本发明一种羟基生物磁珠的优选方案，所述羟基生物磁珠的粒径为100～200nm。

本发明还提供一种羟基生物磁珠的制备方法，包括以下步骤：

用稀盐酸除去Fe₃O₄@Au(以下有时称金磁微粒)表面多余的Fe₃O₄，得到纯净的Fe₃O₄@Au；

将Fe₃O₄@Au分散于PEG溶液中，静置48h得到Fe₃O₄@Au@PEG纳米粒子；

用EDC和NHS的混合溶液将硫酸软骨素活化；

将Fe₃O₄@Au@PEG纳米粒子加入到活化好的硫酸软骨素中，室温下，避光反应48h，硫酸软骨素即成功的修饰在金磁微粒表面，形成抗非特异性生物分子吸附的功能基层；

经超纯水洗涤，得到Fe₃O₄@Au@PEG@CSA。

作为本发明一种羟基生物磁珠的制备方法优选方案，用稀盐酸除去Fe₃O₄@Au表面多余的Fe₃O₄具体是这样进行的：将Fe₃O₄@Au溶液与等体积的浓度为3M盐酸溶液在适当的容器中混合均匀，恒温震荡反应，反应结束后迅速弃去上清液，再加入超纯水，涡旋震荡重悬。

作为本发明一种羟基生物磁珠的制备方法优选方案，Fe₃O₄@Au溶液分散于等体积的2mM的PEG溶液中，反应温度为4℃。

作为本发明一种羟基生物磁珠的制备方法优选方案，EDC和NHS的混合溶液的浓度为20mg mL^-1，硫酸软骨素的活化时间30min。

作为本发明一种羟基生物磁珠的制备方法优选方案，由共沉淀法合成的Fe₃O₄核心颗粒，利用化学原位还原法在该核心颗粒的表面形成包裹的金壳。

本发明还提供一种试剂盒，包括疾病标记物、缓冲溶液以及上述羟基生物磁珠。

本发明的羟基生物磁珠经过合理修饰后可用于复杂生物体系当中各种目标蛋白、细胞的富集、各种环境污水中重金属和有害有机物的吸附治理。

本发明的有益效果：

(1)本发明的生物磁珠，可有效抵制10mg mL^-1牛血清蛋白、10^-8cfu mL^-1噬菌体、100％牛奶、100％血清等复杂生物体系的非特异吸附，浸泡前后电化学信号变化率均小于5％，且磁珠本身富含羟基，生物相容性好；

(2)在不同pH、温度、盐离子浓度以及100％牛奶和100％血清下，羟基生物磁珠的物理化学性能相对稳定，利于保存及进一步的修饰，可应用于环境污水当中重金属、有害有机物等的吸附，或复杂生物体系当中目标细胞及蛋白的富集，以及复杂生物体系中直接进行疾病检测和相关诊断试剂盒研发；

(3)本发明生物磁珠的制备工艺流程相对简单，操作简便，适于批量生产，具有潜在的商业价值。

附图说明

图1是A和B是Fe₃O₄和Fe₃O₄@Au纳米粒子的透射电镜图；图C、D、E是Fe₃O₄@Au、Fe₃O₄@Au@PEG和Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的扫描电镜图；

图2是Fe₃O₄和Fe₃O₄@Au的X射线衍射图(XRD)；

图3是Fe₃O₄@Au@PEG和Fe₃O₄@Au@PEG@CSA纳米粒子的红外光谱图和Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的能谱图；

图4是采用振动样品磁强计对Fe₃O₄,Fe₃O₄@Au,Fe₃O₄@Au@PEG,Fe₃O₄@Au@PEG@CSA样品的磁性能的研究；

图5是Fe₃O₄@Au@PEG与Fe₃O₄@Au@PEG@CSA界面抗污染性能的比较；

图6是Fe₃O₄@Au@PEG@CSA金磁微粒分别浸泡在牛血清白蛋白(BSA,10mg mL^-1)，牛奶(100％milk),噬菌体(M13KO7),血清(100％Serum)差分脉冲伏安电流的百分比变化率。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的制备：

1、Fe₃O₄的制备：

室温条件下，称取7.5～9.0g NaOH溶于125～150mL除氧去离子水中，配制成浓度0.1M NaOH溶液，然后称取1.0g FeCl₂·4H₂O及2.7g FeCl₃·6H₂O加入小烧杯中，并用0.40mL的浓盐酸溶解，最后用除氧的去离子水稀释至25mL，上述溶液均氮气氛围下保存。

将配置好的氢氧化钠溶液转移至圆底烧瓶中，加热至80℃后，开始逐滴加入三氯化铁和氯化亚铁的混合溶液，控制速度均匀直至完成，然后在80℃下保温反应60min,即可得到超顺磁的四氧化三铁纳米粒子。将制备得到的四氧化三铁，用水、乙醇洗涤数次，磁分离并定容至等体积除氧的去离子水溶液中备用。取8～10mL的四氧化三铁溶液置于10mL离心管中，50℃真空干燥，计算所得溶液中四氧化三铁浓度在35mM。

2、Fe₃O₄@Au的制备

准确称取25～50mg Na₃C₆H₅O₇·2H₂O(柠檬酸钠)溶解于50～100mL除氧超纯水中，配制成10mM柠檬酸钠溶液备用，再称取14～28mg的NH₂OH·HCl溶解到10～20mL的除氧超纯水中配制成0.2M溶液备用，后称取100～200mg HAuCl₄·4H₂O(氯金酸)溶解于10～20mL除氧超纯水中，配制成浓度24mM的氯金酸，4℃避光保存备用。

移取10mL的四氧化三铁溶液，磁分离后，转移至10mM的柠檬酸钠溶液中，机械搅拌6h后，将溶液逐渐升温至95℃，开始逐滴加入1mL的24mM氯金酸，完毕后恒温反应15min，磁分离并定容至等体积。将上述溶液转移至干燥洁净的烧瓶中，室温条件下，分四次滴加HAuCl₄(24mM)和NH₂OH·HCl(0.2M)，滴速控制在50～100μL min^-1，每次滴加的间隔是15～30min，滴加HAuCl₄总体积10mL，滴加NH₂OH·HCl体积在7mL，连续滴加四次后，室温反应30min。磁分离后，用水和乙醇洗涤数次，即得到Fe₃O₄@Au，定容于除氧的超纯水中，于4℃中保存。

3、Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的制备

取5mL制备的Fe₃O₄@Au溶液置于锥形瓶中，加入等体积的3M盐酸溶液，混合均匀后放于恒温摇床中(200rpm，37℃)60min，反应结束后迅速将锥形瓶置于磁分离器上，用移液枪小心吸取上清液并弃去，再加入超纯水，涡旋震荡重悬，重复上述步骤两到三次。将处理后的金磁微粒分散于等体积的2mM的PEG溶液中，4℃静置48h即得Fe₃O₄@Au@PEG。

分别准确称取100～200mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)置于取样管中，用移液枪加入5～10mL去离子水混合均匀，配制成20mgmL^-1的EDC和NHS混合溶液。

称取20mg的硫酸软骨素置于取样管中，然后加入5mL的20mg mL^-1的EDC、NHS溶液活化30min。然后取5mLFe₃O₄@Au@PEG纳米粒子，磁分离转移至已活化好的硫酸软骨素试管中，室温下，避光反应48h,硫酸软骨素即成功的修饰在金磁微粒表面，然后超纯水洗涤3～4次，4℃避光保存于除氧的超纯水中。

实施例2Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的制备：

1、Fe₃O₄的制备：

参照实施例1配制0.1M浓度的溶液，然后称取1.2g FeCl₂·4H₂O及3.2g FeCl₃·6H₂O加入小烧杯中，并用0.50mL的浓盐酸溶解，最后用除氧的去离子水稀释至30mL，上述溶液均氮气氛围下保存。

将配置好的氢氧化钠溶液转移至圆底烧瓶中，加热至90℃后，开始逐滴加入三氯化铁和氯化亚铁的混合溶液，控制速度均匀直至完成，然后在90℃下保温反应30min,即可得到超顺磁的四氧化三铁纳米粒子。将制备得到的四氧化三铁，用水、乙醇洗涤数次，磁分离并定容至等体积除氧的去离子水溶液中备用。计算所得溶液中四氧化三铁浓度在40mM。

2、Fe₃O₄@Au的制备

参照实施例1配制浓度10mM柠檬酸钠溶液、浓度0.2M的NH₂OH·HCl溶液、浓度24mM的氯金酸备用。

移取15mL的四氧化三铁溶液，磁分离后，转移至10mM的柠檬酸钠溶液中，机械搅拌12h后，将溶液逐渐升温至100℃，开始逐滴加入2mL的24mM氯金酸，完毕后恒温反应45min，磁分离并定容至等体积。将上述溶液转移至干燥洁净的烧瓶中，室温条件下，参照实施例1滴加HAuCl₄总体积在15mL，滴加NH₂OH·HCl体积在10mL，连续滴加四次后，室温反应60min。磁分离后，用水和乙醇洗涤数次，即得到Fe₃O₄@Au，定容于除氧的超纯水中，于4℃中保存。

3、Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的制备

取10mL制备的Fe₃O₄@Au溶液置于锥形瓶中，加入等体积的3M盐酸溶液，参照实施例1除去金磁微粒表面多余的Fe₃O₄。将处理后的金磁微粒分散于等体积的2mM的PEG溶液中，4℃静置48h即得Fe₃O₄@Au@PEG。

参照实施例1配制浓度为20mg mL^-1的EDC和NHS混合溶液。

称取40mg的硫酸软骨素置于取样管中，然后加入10mL的20mg mL^-1的EDC、NHS溶液活化30min。然后取10mL Fe₃O₄@Au@PEG纳米粒子，磁分离转移至已活化好的硫酸软骨素试管中，室温下，避光反应48h,硫酸软骨素即成功的修饰在金磁微粒表面，然后超纯水洗涤3～4次，4℃避光保存于除氧的超纯水中。

将采用实施例1的方法制得的Fe₃O₄@Au@PEG@CSA进行以下检测。

1、图1中图A、B分别是Fe₃O₄和Fe₃O₄@Au纳米粒子的透射电镜图。由图1A的Fe₃O₄@Au透射电镜可知，该金磁微粒与四氧化三铁相比(图1B)，金的密度较大，其衬度也较大，所以颜色较深，证明Fe₃O₄@Au已成功制备。而图1中的图C、D、E分别是Fe₃O₄@Au、Fe₃O₄@Au@PEG和Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的扫描电镜图，对比可知经聚合物修饰后，Fe₃O₄@Au@PEG和Fe₃O₄@Au@PEG@CSA磁性微球粒径增大，由原先的细沙状转变成表面平滑的球形，且两者颗粒均匀，分散良好，没有聚集迹象。

2、图2是Fe₃O₄和Fe₃O₄@Au的X射线衍射图(XRD)，图中a呈现的七个衍射峰(30.15°,35.53°,43.52°,53.70°,57.29°,62.38°,74.51°)与Fe₃O₄的标准比对卡(JCPDS,NO:19-0629)的(220),(311),(400),(422),(511),(440),(622)衍射峰相对应，说明成功的合成了具有尖晶石结构的四氧化三铁；而图中b的五个衍射峰(38.14°,44.48°,64.73°,77.69°,81.68°)与金的标准比对卡(JCPDS,NO:04-0784)的((111),(200),(220),(311),(222))衍射峰相对应，但并未出现四氧化三铁的衍射峰，这主要的原因可能是由于X-射线无法穿透复合粒子的金壳表层所导致，这一现象早在2007年被孙守恒发现，并发表在了JACS上，同时，这也进一步证明合成了具有核壳结构的磁性纳米粒子。

3、图3中A图是Fe₃O₄@Au@PEG@CSA纳米粒子的红外光谱图。由图3A所示，氨基聚乙二醇修饰的金磁微粒在2923cm^-1与2853cm^-1中有较强的-CH₂的反对称和对称伸缩振动峰，在1628cm^-1处有N-H的伸缩振动吸收峰，而在1261cm^-1处呈现了-C-N的伸缩振动峰，由此说明氨基化的聚乙二醇成功地修饰在金磁微粒表面。由图3B所示，硫酸软骨素包被后，800cm^-1处显示了C-O-S的特征振动峰，由此说明硫酸软骨素成功地修饰在金磁微粒表面。Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的EDS图再一次证明了这个事实，如图3B所示，EDS谱图中除去导电玻璃的特征元素峰外，出现了C、O、N和S峰，其中S就是来自硫酸软骨素。

4、图4是采用振动样品磁强计对样品的磁性能的研究，如曲线(4a,4b,4c,4d)所示，Fe₃O₄的饱和磁化强度值是64.35emu g^-1，Fe₃O₄@Au的饱和磁化强度值为44.07emu g^-1，Fe₃O₄@Au@PEG和Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的饱和磁化强度值依次为35.75和13.57emu g^-1。虽然，合成产物的饱和磁化强度值随着非磁性材料的层层迭代出现下降，但是在室温下均无剩磁和矫顽力，表明所制备的所有产物均具有超顺磁性。尽管所制备样品中的饱和磁化强度值远远低于块状磁铁矿(90emu g^-1)但Fe₃O₄@Au@PEG@CSA的饱和磁化强度值仍然具有13.57emug^-1的强度，这也表明实验中制备的具有优异抗污染性能和含有丰富羟基的磁珠，在外磁场的存在下，仍能轻易地从复杂生物体系中分离。

实施例3不同pH、温度、盐离子浓度以及复杂生物体系(100％牛奶和100％血清)中的稳定性测试

由文献可知，单分散的金磁微粒如果发生团聚会出现UV-vis特征峰的红移，或肉眼观测到由单分散时的酒红色变至蓝色。为表征粒子在不同条件下的分散状态，取16个容积为1.5mL的EP管，并标记为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16放置于磁力架上，每个EP管滴入50uL的1mg mL^-1的硫酸软骨素修饰的金磁粒子，静置5～10min后，用移液枪移去上清，然后往5至9号EP管分别加入pH为3.0、5.0、7.4、8.0、12.0的各种缓冲溶液，12小时后观测其外观，并用紫外监测其界面稳定性。10至14则加入200uL超纯水，分别放置在-20℃、4℃、25℃、37℃下,四个小时后观测其外观，并用紫外检测其界面稳定性，14号试样例外，加热至95℃,恒温放置5min后缓慢降至室温后观测其外观，并用紫外检测其界面稳定性。1至4则加入pH为7.4时盐离子浓度分别为10mM、50mM、100mM、200mM的PBS缓冲溶液，12小时后观测其外观，并用紫外检测其界面稳定性。15、16分别加入100％牛奶、100％血清，12小时后观测其外观，并用紫外检测其界面稳定性。

表1是在不同pH、温度以及盐离子浓度下Fe₃O₄@Au@PEG@CSA稳定性的测试，A代表在该环境下稳定性良好，B代表在该环境下稳定性较差。

表1不同pH、温度以及盐离子浓度下的稳定性

*A：好，B：差

由表1可知，Fe₃O₄@Au@PEG@CSA在盐离子浓度低于100mM，pH为5.0-12，温度4-95℃等条件能够稳定存在12h以上，而在复杂体系，如牛奶、血清中也能稳定存在12h以上。

实施例4抗污染性能电化学测试

1、磁性玻碳电极的预处理：

(1)机械抛光：将Al₂O₃粉倒在抛光布上，然后滴加几滴去离子水，使其呈现泥浆状；用手臂均匀用力，以将玻碳电极(GCE)表面打磨成镜面为宜。

(2)清洗：将打磨好的电极在用蒸馏水浸湿的电极抛光布上打磨数圈，然后依次放入去离子水、无水乙醇、去离子水中，各超声清洗2min。

(3)吹干：将清洗后的电极用氮气从侧面吹干，备用。

2、电极的修饰

取50～100uL硫酸软骨素所修饰的金磁微粒，震荡混匀后，在每支预处理好的磁性玻碳电极表面滴涂10uL，然后将电极放置在鼓风干燥箱里，37℃干燥1h，拿出浸泡在含有200uL的超纯水的离心管中备用。

3、利用电化学技术差分脉冲伏安法(DPV)测试硫酸软骨素修饰的金磁微粒的抗污染性能：将已成功修饰的磁性电极分别浸泡于蛋白、噬菌体、牛奶、血清等复杂生物体系中30min，并测量浸泡前后电极DPV的变化。

图5为Fe₃O₄@Au@PEG与Fe₃O₄@Au@PEG@CSA界面抗污染性能的比较:两柱状图分别表示Fe₃O₄@Au@PEG和Fe₃O₄@Au@PEG@CSA金磁微粒在浸泡10％、20％、50％和100％血清前后的差分脉冲伏安电流的百分比变化率(ΔIp/Ip)，由图可知仅由聚乙二醇修饰的磁珠界面，其浸泡血清前后差分脉冲伏安电流响应值的百分比变化率从10％到26％不等，而复合了硫酸软骨素后，磁珠界面浸泡血清前后差分脉冲伏安电流响应值的百分比变化率则下降到1.0％～2.0％，这说明硫酸软骨素复合后使金磁微粒界面的抗污染性能大大增加，远远优于Fe₃O₄@Au@PEG。

图6是Fe₃O₄@Au@PEG@CSA金磁微粒分别浸泡在牛血清白蛋白(BSA,10mg mL^-1)，牛奶(100％milk)，噬菌体(M13KO7)，血清(100％Serum)差分脉冲伏安电流的百分比变化率。由图可知该界面在10mg mL^-1牛血清白蛋白中差分脉冲伏安电流的百分比变化率为3.0％、牛奶为4.5％、噬菌体(M13KO7)为3.1％、100％血清为1.5％，电流值变化率均在5.0％以内，由此说明Fe₃O₄@Au@PEG@CSA金磁微粒在以上复杂体系中均表现出优异的抗非特异性吸附的性能。

Claims

1.一种羟基生物磁珠，包括Fe₃O₄颗粒核心，该颗粒核心外面包覆金壳，其特征在于，金壳的外面包覆PEG，所述PEG为氨基聚乙二醇，金壳与PEG形成稳定的Au-N键，交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将PEG的氨基与硫酸软骨素(CSA)中的羧基链接形成抗非特异性生物分子吸附的功能基层。

2.根据权利要求1所述的羟基生物磁珠，其特征在于，所述羟基生物磁珠的粒径为100～200nm。

3.一种羟基生物磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

用稀盐酸除去Fe₃O₄@Au表面多余的Fe₃O₄，得到纯净的Fe₃O₄@Au；

将Fe₃O₄@Au分散于PEG溶液中，静置48h得到Fe₃O₄@Au@PEG纳米粒子，所述PEG为氨基聚乙二醇；

用EDC和NHS的混合溶液将硫酸软骨素活化；

将Fe₃O₄@Au@PEG纳米粒子加入到活化好的硫酸软骨素中，室温下，避光反应48h，硫酸软骨素即成功地修饰在金磁微粒表面，形成抗非特异性生物分子吸附的功能基层；

经超纯水洗涤，得到Fe₃O₄@Au@PEG@CSA。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，用稀盐酸除去Fe₃O₄@Au表面多余的Fe₃O₄具体是这样进行的：将Fe₃O₄@Au溶液与等体积的浓度为3M盐酸溶液在适当的容器中混合均匀，恒温震荡反应，反应结束后迅速弃去上清液，再加入超纯水，涡旋震荡重悬。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述Fe₃O₄@Au溶液分散于等体积的2mM的PEG溶液中，反应温度为4℃。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，EDC和NHS的混合溶液的浓度为20mgmL^-1，硫酸软骨素的活化时间30min。

7.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，由共沉淀法合成的Fe₃O₄核心颗粒，利用化学原位还原法在该核心颗粒的表面形成包裹的金壳。

8.一种试剂盒，其特征在于，包括疾病标记物、缓冲溶液以及权利要求1所述的羟基生物磁珠。

9.权利要求1所述的羟基生物磁珠经过适当修饰后可用于各种复杂生物体系中目标蛋白和细胞的富集、环境污水中重金属和有害有机物的吸附治理。