CN104133067A

CN104133067A - 一种基于磁性Fe3O4@Au复合纳米材料电化学检测人免疫球蛋白E的方法

Info

Publication number: CN104133067A
Application number: CN201410380007.0A
Authority: CN
Inventors: 黄勇; 黄国银; 李桂银; 周治德; 梁晋涛; 马龙飞; 管明源
Original assignee: Guilin University of Electronic Technology
Current assignee: Guilin University of Electronic Technology
Priority date: 2014-08-05
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2034-08-05
Also published as: CN104133067B

Abstract

一种基于磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料电化学检测人免疫球蛋白E(hIgE)的方法，通过一步还原法制备出Fe₃O₄Au复合纳米材料，在该材料上标记hIgE抗体；然后将该材料与hIgE、生物素化hIgE适配体混合，形成hIgE抗体-hIgE-hIgE适配体复合物；再将亲合素化碱性磷酸酶吸附到复合物上，通过碱性磷酸酶的生物催化沉积反应，使银离子在磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料表面催化还原成银单质并沉积到该复合纳米材料表面。通过检测银单质的溶出伏安电流值，实现对hIgE的检测。本发明中磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料粒径为35-45nm，且粒径分布均匀，具有超顺磁性。

Description

一种基于磁性Fe3O4Au复合纳米材料电化学检测人免疫球蛋白E的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于磁性复合纳米材料电化学检测人免疫球蛋白E的方法。

背景技术

人免疫球蛋白E (human immunoglobμLin E, hIg E)，是一类具有σ链的亲同种细胞抗体，是参与过敏性鼻炎、过敏性哮喘和湿疹等发病机制调节的主要抗体，是过敏反应的主要始动因素之一。目前，人血清Ig E水平是体外诊断过敏性疾病的一个重要指标。检测方法主要有放射过敏原吸附试验、CAP过敏原检测法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法、荧光免疫分析法等。其中放射免疫分析法有辐射，不安全；其他检测方法操作复杂，灵敏度不高，难以实现早期疾病的诊断与研究，且无法满足快速检测的需求。Kejun Feng, Yan Kang, Jingjin Zhao, at al. Electrochemical immunosensor with aptamer-based enzymatic amplification[J]. Analytical biochemistry. 378(1). 38-42(2008)，报道了在金电极表面自组装巯基乙胺用于固定抗体的方法进行检测hIg E，检测的敏感性和特异性有了很大的提高；需要建立一种快速、灵敏、操作简便的hIg E检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是制备一种粒径为35-45 nm的磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料，并利用该复合纳米材料电化学检测hIg E。

为了解决这个技术问题，本发明的技术方案如下（未注明的用量和比例以质量计）：

步骤1：磁性Fe₃O₄纳米材料的制备

1) 将FeSO₄·7H₂O水溶液和PEG-20000水溶液混合，不断搅拌下滴加一定浓度稀氨水调节溶液pH值为10左右，溶液呈墨绿色；

2) 30℃持续搅拌下逐滴加入H₂O₂溶液，此时溶液呈黑色；

3) 将溶液转移至高压反应釜中，于160℃下恒温反应6 h；

4) 磁分离收集下层沉淀，先后用纯水和无水乙醇磁分离洗涤，然后将其置于70℃下烘干；烘干后研磨即得Fe₃O₄纳米粒子。

步骤2：磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料的制备

1) 将10 mg步骤1制备的Fe₃O₄纳米粒子加入120 mL 50g/L PEG-20000中，并超声分散均匀；

2) 在搅拌下加入氯金酸溶液，并持续搅拌1-2 h；

3) 在搅拌下加入盐酸羟胺溶液，并持续搅拌反应1 h；

4) 磁分离收集下层沉淀，先后用50 g/L PEG-20000水溶液和纯水进行磁分离洗涤，即得Fe₃O₄Au复合纳米材料。

优选氯金酸溶液浓度为1%；盐酸羟胺溶液浓度为80 mmol/L；分散介质为50 g/L PEG-20000水溶液，在该条件下所得磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料粒径为35-45 nm，且粒径分布均匀，具有超顺磁性，其饱和磁场强度为54.58 emu/g。

步骤3：hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料的制备

1) 将步骤2制备的Fe₃O₄Au复合纳米材料重悬于纯水中，调节浓度为1 mg/mL；

2) 在Fe₃O₄Au复合纳米材料溶液中逐滴加入一定比例的hIg E抗体，37℃恒温孵育2 h;

3) 用BSA封闭1 h，溶液中BSA终浓度为1%；

4) 用含1% BSA的pH7.4的PBS溶液进行磁分离洗涤，即得hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料。

步骤4：hIg E的电化学检测

1) 将步骤3制备的hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料重悬于含1% BSA的pH7.4的PBS溶液中，调节浓度为1 mg/mL。

2) 取一定体积步骤3制得的标记有hIg E抗体的Fe₃O₄ Au纳米粒子的悬浮液置于500μL离心管中，加入含不同浓度hIg E溶液和生物素化hIg E适配体溶液于37℃孵育0.5 h；免疫反应完成后，磁分离，所得沉淀用PBS洗涤3次，并重悬于pH7.4的PBS中；

3) 加入一定体积亲和素标记的碱性磷酸酶溶液，37℃孵育15 min后，用pH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液磁分离洗涤；

4) 加入一定体积含有2 mmol/L AAP和1 mmol/L AgNO₃的甘氨酸-NaOH缓冲液，避光反应15 min，在磁场中用pH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液洗涤；

5) 加入一定浓度的HNO₃溶液，待单质银全部溶解后，将溶液转移至小烧杯中，再加入一定体积含KNO₃的HNO₃溶液；

6) 在电化学工作站上，采用经典三电极系统，先进行恒电位沉积400 s，再进行线性扫描LSV，记录溶出伏安电流值；

7) 根据单质银的溶出伏安电流值大小实现对hIg E的定量检测。

其中步骤1为已知技术。

本发明与现有技术相比具有如下优点

1) 由于磁性Fe₃O₄ 纳米粒的植入，使得磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料具有超顺磁性（见图4），可通过外加磁场即可实现快速分离；

2) 在磁性Fe3O4Au复合纳米材料制备过程中，只需一步还原即可得到粒径分布均匀，具有超顺磁性，饱和磁场强度高的磁性Fe3O4Au复合纳米材料；优选氯金酸溶液浓度为1%；盐酸羟胺溶液浓度为80 mmol/L；分散介质为50 g/L PEG-20000水溶液，在该条件下所得磁性Fe3O4Au复合纳米材料粒径为35-45 nm，且粒径分布均匀，具有超顺磁性，其饱和磁场强度为54.58 emu/g，提高了后续检测的准确度。

3) 在磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料表面进行的免疫反应是一种准均相反应体系，可提高hIg E抗体、hIg E适配体与hIg E的反应效率；

4) 在hIg E抗体-hIg E -hIg E适配体复合物形成过程中，hIg E抗体与hIg E、hIg E与hIg E适配体间的特异性识别反应是同时进行的，可有效缩短hIg E的检测时间；

5) 本发明的检测过程安全、简单、快速，为以后的便携式实时检测提供了思路。

附图说明

图1 基于磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料电化学检测人免疫球蛋白E的方法原理图

图2 磁性Fe₃O₄和磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料 SEM表征图

图3 磁性Fe₃O₄和磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料的XRD表征图

图4 磁性Fe₃O₄和磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料的磁滞回线表征图

图5 基于磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料检测hIg E的方法对不同浓度hIg E对应的响应曲线

具体实施方式

本发明检测hIgE的步骤如下：

1. 磁性Fe₃O₄纳米材料的制备：称取2.50 g FeSO₄·7H₂O溶于30 mL纯水中，加入10 mL 50 g/L 聚乙二醇-20000（PEG-20000）溶液，搅拌均匀；在不断搅拌条件下逐滴滴加30 mL稀氨水溶液，继续加入270 μL 30% H₂O₂溶液并转移至高压反应釜中，于160℃下恒温反应6 h后，磁分离洗涤3次，70℃烘干，即得Fe₃O₄纳米粒子；

2. Fe₃O₄Au复合纳米材料的制备：称取10 mg Fe₃O₄纳米粒子，用120 mL 50g/L的PEG-20000溶液超声分散均匀；搅拌条件下加入1 mL 1.0%氯金酸溶液，反应1 h；加入5 mL 80 mmol/L盐酸羟胺溶液后，继续反应1 h；依次用50 g/L 的PEG-20000溶液进行磁分离洗涤2次，纯水磁分离洗涤3次，即得Fe₃O₄Au复合纳米材料；

3. hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料的制备：在5 mL 1 mg/mL Fe₃O₄Au复合纳米材料溶液中，在搅拌条件下逐滴加入100 μL hIg E抗体溶液， 37℃孵育2 h后加入BSA封闭1 h，溶液中BSA终浓度为1%。磁分离后，沉淀用含1% BSA pH7.4的PBS溶液洗涤两次，即得hIg E标记Fe3O4Au复合纳米材料；

4. 检测hIg E的标准曲线：将hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料重悬于含1% BSA的pH7.4的PBS溶液中，调节浓度为1 mg/mL。在200 μL hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料的溶液中，加入10 μL含不同浓度hIg E溶液和10 μL 10μg/mL生物素化hIg E适配体溶液于37℃孵育0.5 h。免疫反应完成后，用PBS磁分离洗涤3次，重悬于190 μL PBS（pH7.4）中；加入10 μL 10 μg/mL亲和素标记的碱性磷酸酶，于37℃孵育15 min后用pH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液磁分离洗涤3次；再加入200 μL 含有2 mmol/L 抗坏血酸磷酸酯（AAP）和1 mmol/L AgNO₃的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，避光反应15 min，在磁场中用移液枪小心吸走上层溶液，用pH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液洗涤3次；加入300 μL 1.5 mol/L HNO₃将单质银全部溶解后，将溶液转移至5 mL小烧杯中，再加入1 mL含0.6 mol/L KNO₃的0.1 mol/L HNO₃溶液；以玻碳电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在电化学工作站上在进行恒电位沉积120s，再在溶液中进行线性扫描LSV，扫描范围-0.6~0.25 V，扫描速率50 mV/s，得到单质银的溶出伏安电流值。单质银的溶出伏安电流值大小与hIg E的浓度在250~2000 ng/mL范围内成线性关系，其线性方程为：Y=5.56+20.61X，线性相关系数为0.9978。

5. 实际样本中hIg E的检测：在200 μL hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料的溶液中，加入10 μL浓度为100ng/mL、700ng/mL、1400ng/mL的hIg E溶液和10 μL 10 μg/mL生物素化hIg E适配体溶液，按步骤4的操作进行检测，得到单质银的溶出伏安电流响应值分别为7.39 μA、19.31 μA、33.29 μA。根据标准曲线Y=5.56+20.61X，可得到对应的实际样本溶液中hIg E浓度分别为88.79 ng/mL、667.15 ng/mL、1345.46 ng/mL。

Claims

1.一种基于磁性Fe₃O₄Au复合纳米材料电化学检测hIg E的方法，包括如下步骤：

步骤1：磁性Fe₃O₄纳米材料的制备

称取2.50g FeSO₄·7H₂O溶30 mL纯水中，加入10 mL 50g/L 聚乙二醇-20000（PEG-20000）溶液，搅拌均匀；在不断搅拌条件下逐滴滴加30 mL 2.5%稀氨水溶液，继续加入270 μL 30% H₂O₂溶液并转移至高压反应釜中，于160℃下恒温反应5-7 h后，磁分离洗涤，70℃烘干，即得Fe₃O₄纳米粒子；

其特征在于：还包括以下步骤：

步骤2：Fe₃O₄Au复合纳米材料的制备

称取10 mg步骤1制备的Fe₃O₄纳米粒子，用120 mL 50 g/L的PEG-20000溶液超声分散均匀；搅拌条件下加入1mL 1.0%氯金酸溶液，反应1-2 h；加入5 mL 80 mmol/L盐酸羟胺溶液后，继续反应1 h；依次用50 g/L 的PEG-20000溶液和纯水磁分离洗涤3次，即得Fe₃O₄Au复合纳米材料；

步骤3：hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料的制备

将步骤2制备的Fe₃O₄Au复合纳米材料重悬于纯水中，调节浓度为1 mg/mL；在5 mL Fe₃O₄Au复合纳米材料溶液中，搅拌条件下逐滴加入100 μL hIg E抗体溶液后，于37℃孵育2 h，然后加入牛血清白蛋白（BSA）封闭1 h；磁分离后，沉淀用含1% BSA pH7.4的PBS溶液洗涤两次，即得hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料；

步骤4：hIg E的电化学检测

将步骤3制备的hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料重悬于含1% BSA的pH7.4的PBS溶液中，调节浓度为1 mg/mL；在200 μL hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料的溶液中，加入10 μL含不同浓度hIg E溶液和10 μL 10μg/mL生物素化hIg E适配体溶液于37℃孵育0.5 h，免疫反应完成后，磁分离，所得沉淀用PBS洗涤3次，并重悬于pH为7.4的190 μL PBS中，随后加入10 μL 10 μg/mL亲和素标记的碱性磷酸酶，于37℃孵育15 min，用pH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液磁分离洗涤3次；再加入200 μL 含有2 mmol/L 抗坏血酸磷酸酯和1 mmol/L AgNO₃的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，避光反应15 min，在磁场中用移液枪小心吸走上层溶液，所得沉淀用pH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲溶液洗涤3次，加入300 μL 1.5 mol/L HNO₃将单质银全部溶解后，将溶液转移至5 mL小烧杯中，再加入1 mL含0.6 mol/L KNO₃的0.1 mol/L HNO₃溶液；以玻碳电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在电化学工作站上在进行恒电位沉积120s，再在溶液中进行线性扫描LSV，扫描范围-0.6~0.25V，扫描速率50 mV/s，得到单质银的溶出伏安电流值；根据单质银的溶出伏安电流值大小实现对hIg E的定量检测。

2.根据权利要求1中所述制备方法，其特征在于：步骤3中所述hIg E抗体，其浓度为100 μg/mL。

3.根据权利要求1中所述制备方法，其特征在于：步骤4中所述恒电位沉积，其电位为-0.5 V。

4.根据权利要求1中所述制备方法，其特征在于：步骤4中所述溶出峰，其电位为0.15~0.20 V。

5.根据权利要求1中所述制备方法，其特征在于：步骤4中，在200 μL hIg E标记Fe₃O₄Au复合纳米材料的溶液中，加入10 μL浓度为100ng/mL、700ng/mL、1400ng/mL的hIg E溶液和10 μL 10 μg/mL生物素化hIg E适配体溶液，进行检测，得到单质银的溶出伏安电流响应值分别为7.39 μA、19.31 μA、33.29 μA，根据标准曲线Y=5.56+20.61X，可得到对应的实际样本溶液中hIg E浓度分别为88.79 ng/mL、667.15 ng/mL、1345.46 ng/mL。