CN105675675B - 磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器及方法 - Google Patents

磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器及方法。采用抗体修饰电极捕获禽流感病毒H5N1，然后标记磁珠；在磁场控制下，采用电化学方法使磁珠标记物转化生成普鲁士蓝；基于生成的普鲁士蓝的电化学还原峰定量检测禽流感病毒，形成生物传感器。本发明的方法创新了提出了磁性纳米料子的新性质，在充分利用磁珠的分离富集功能的基础上引入电化学转化产生电化学活性普鲁士蓝，获得其能灵敏检测禽流感病毒H5N1的生物传感器，方法简便、低成本，可灵敏检测禽流感病毒H5N1，应用前景好。

Description

磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器及方法
技术领域
本发明涉及纳米材料科学及电化学生物传感领域，尤其是一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器及方法。
背景技术
磁性纳米材料作为一种纳米材料，不但具有比表面积大、生物相容性好、富含表面功能基团、表面自由能高等优点，广泛用于高效固定大量生物分子，而且基于其独特磁性在磁分离富集和磁热疗等领域备受重视。然而，当前磁珠涉及的应用主要基于磁性，其本身化学/电化学性质的应用鲜有开拓。
生物传感研究中，信号输出和放大是决定检测性能的最关键因素之一，当前基于纳米材料优异性质而实现信号输出和放大是研究前沿和应用热点。当前研究中，磁性材料常用于在样品中快速和高效分离目标物，在信号输出方面应用极少。其它纳米材料，如贵金属纳米颗粒、碳纳米管/纤维和半导体量子点等，因具有优异表面修饰功能和独特的光、电、热等性质而广泛用于信号输出，但前期修饰和功能化过程中涉及大量分离步骤，频繁使用离心、超滤和透析等手段，繁琐而耗时。因此，可快速分离且信号输出/放大功能丰富的新材料和新方法可望显著便利生物传感器构建与检测，提升性能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器及方法，基于磁珠标记物高效放大信号进行禽流H5N1生物传感检测。
本发明采用以下技术方案：
一、一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器：
包括由磁珠转化而成的普鲁士蓝和三电极系统，三电极系统以饱和甘汞电极为参比电极，碳电极为对电极，Con A修饰磁珠标记电极为工作电极。
二、一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法：
制备获得作为参比电极的饱和甘汞电极和作为对电极的碳电极，所述Con A修饰磁珠标记电极和普鲁士蓝具体制备过程如下：
1)处理磁珠水溶液制备获得Con A修饰磁珠分散液；
2)由Con A修饰磁珠分散液处理获得Con A修饰磁珠标记电极；
3)将Con A修饰磁珠标记电极置于铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中，采用三电极系统，Con A修饰磁珠标记电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，碳棒为对电极，进行多电位阶越(1.60V，450s；0V，250s)扫描获得普鲁士蓝。
本发明将普鲁士蓝在0.1M酸性K2SO4溶液中-0.3V～0.5V扫循环伏安，根据普鲁士蓝的氧化或还原峰电流定量样品中禽流感病毒H5N1的浓度。
所述步骤1)具体如下：
1.1)将磁珠水溶液在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液；
1.2)将用于羧基化磁珠的柠檬酸与磁珠分散液混合，静置于旋转仪上12h过夜得到羧基化磁珠分散液，柠檬酸的含量为0.1mmol-0.3mmol每毫克磁珠；
1.3)将上述羧基化磁珠分散液依次进行磁性分离、去除上清液，然后将磁珠用磷酸盐缓冲液清洗三次，然后分散于15mL MES缓冲液中，使得磁珠的最终浓度约为1mg/mL，4℃下保存；
1.4)将EDC(2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到1mL上述羧基化磁珠的MES分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离、去除上清液，用磷酸盐缓冲液重复清洗三次，得到活化磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液中；
1.5)取活化磁珠与伴刀豆球蛋白A(Con A)于常温下反应，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离、去除上清液，用磷酸盐缓冲液重复清洗三次，得到Con A修饰磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液中，在冰箱中4℃保存；
所述步骤1)具体如下：
2.1)将干净的金磁电极在二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯(DTSP)的丙酮溶液中浸泡，丙酮洗3次，然后超纯水洗3次，获得DTSP修饰金磁电极；
2.2)在DTSP修饰金磁电极上滴加伴刀豆球蛋白A溶液，常温下反应，用PBS缓冲液(pH 7.0)清洗，获得蛋白A修饰金磁电极；
2.3)在伴刀豆球蛋白A修饰金磁电极表面滴加禽流感病毒H5N1抗体溶液，常温下反应，用PBS缓冲液(pH 7.0)清洗，获得抗体修饰金磁电极；
2.4)在抗体修饰金磁电极表面滴加牛血清白蛋白(BSA)溶液，常温下反应以封闭非特异性结合位点，用PBS缓冲液(pH 7.0)清洗，最终获得传感电极；
2.5)在传感电极表面滴加禽流感病毒H5N1悬浊液，常温下培育，用PBS缓冲液清洗，获得检测电极；
2.6)取Con A修饰磁珠分散液滴加到检测电极表面，常温反应，用PBS缓冲液清洗，获得Con A修饰磁珠标记电极。
所述的干净的金磁电极采用以下方式清洗：金磁电极依次在砂纸、0.5μm氧化铝粉末和0.05μm氧化铝粉末中打磨，打磨后经充分清洗，再依次在超纯水、乙醇和超纯水中各超声5分钟，配制Prihna溶液滴加5μL于电极表面，保持5分钟，最后采用大量水进行清洗。
所述步骤1.2)中柠檬酸与磁珠分散液的配比为0.1mmol-0.3mmol每毫克磁性纳米料子。
所述步骤1.5)中活化磁珠与Con A的质量比为1：5-1：10，时间为1h，反应时间为45-90min。
所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M-0.05M，pH≤6.0；所述的MES，浓度为0.01M-0.05M，pH≤6.0。
所述步骤2.2)中DTSP浓度为1-5mM，反应时间为4-18h。优选的反应时间是12h。
所述步骤2.2)中伴刀豆球蛋白A溶液的浓度为0.1-0.5mg mL-1，反应时间为45-90min。
所述步骤2.3)中禽流感病毒H5N1抗体溶液的浓度为0.1－0.5mg mL-1，反应时间为45-90min。
所述步骤2.4)中用于封闭的牛血清白蛋白溶液的浓度为5％-10％，反应时间为45-90min。
所述步骤2.5)中禽流感病毒H5N1的浓度为0.0025-0.16HAU，禽流感病毒H5N1培育时间为30-60min。
所步骤2.6)中Con A修饰磁珠分散液用量为5-10μL，培育时间为30-60min。
所述步骤3)种铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中铁氰化钾和硫酸钾的浓度分别为0.1-5mM和0.1M。
所述多电位阶跃采用以下参数：第一阶段，电压1.60V，时长450s；第二阶段电压0V，时长250s。
所述多电位阶跃替换为循环伏安法，循环伏安法参数为：高电位1.65V，低电位为-0.3V，所用溶液pH≤6.0。
本发明采用抗体修饰电极捕获禽流感病毒H5N1，然后标记磁珠；在磁场控制下，采用电化学方法使磁珠标记物转化生成普鲁士蓝；基于生成的普鲁士蓝的电化学还原峰定量检测禽流感病毒。
本发明的有益效果是：
采用本发明的方法可在前期基于磁分离而简便修饰操作，检测时通过原位电化学转化磁珠生成高电化学活性普鲁士蓝而显著放大信号，实现对目标物的便利和灵敏检测。
本发明的方法创新了磁性纳米料子的新性质，在充分利用磁珠的分离富集功能的基础上引入电化学转化产生电化学活性普鲁士蓝，获得电化学信号输出和放大功能。
本发明生物传感技术可简便、低成本和灵敏检测禽流感病毒H5N1，并且在生物检测领域应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明中生物传感器构建和检测原理示意图。
图2为本发明中制备的Con A修饰磁珠的红外表征图。
图中a、b和c三条曲线分别为羧基化磁珠、Con A修饰磁珠和Con A的红外表征曲线。
图3为本发明中不同修饰电极的扫描电镜图。
A、B、C分别表示电极表面捕获禽流感病毒H5N1、标记Con A修饰磁珠和电化学转化磁珠标记物的扫描电镜表征。
图4为本发明方法中不同禽流感病毒H5N1浓度时生物传感器的循环伏安响应曲线和工作曲线。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明技术方案，下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明的实施例如下：
实施例1
将15mL磁珠水溶液置于50mL离心管中，在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液。
再加入15mL浓度为0.4M的柠檬酸水溶液，超声30min，常温条件(25℃)条件下旋转反应20h。依次进行磁性分离、去除上清液，将磁珠用磷酸盐缓冲液清洗的步骤三次，然后分散于15mL MES缓冲液中(磁珠的最终浓度约为1mg/mL)，4℃下保存。
将EDC(2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到1mL上述功能磁珠分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离清洗三次，再分散在1mL磷酸缓冲液中。
取100μL已激活的磁珠与400μL伴刀豆球蛋白A(Con A)于常温下反应1小时。磷酸缓冲液(pH 6.0)洗三次并分散在磷酸缓冲溶液中，冰箱中4℃保存。采用红外光谱法验证了修饰，结果显示Con A修饰磁珠具有磁珠和Con A的特征峰，表明成功修饰。
电化学生物传感器制备方法如图1所示。取处理干净的金电极浸泡在丙酮配制的300μL的2mM二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯(DTSP)溶液中浸泡过夜，获得DTSP组装单分子层。依次用丙酮和水充分清洗后，在电极上滴加5μL的0.1mg/mL蛋白A，常温下反应45min，用PBS缓冲液清洗。取5μL的0.2mg/mL禽流感病毒H5N1抗体滴加到修饰电极表面，常温下反应1小时，用PBS缓冲液清洗电极。用质量分数为5％的BSA封闭非特异性结合位点。5μL不同浓度的H5N1悬浊液滴加到电极表面，常温下培育1小时，用PBS缓冲液清洗。取5μL上述Con A修饰磁珠滴加到电极表面反应30min，用PBS缓冲液清洗。采用扫描电镜表征了电极表面以验证修饰过程，如图3所示。捕获病毒后电极表面可见约60nm颗粒状病毒，标记磁珠后电极表面可见大量颗粒，而电化学转化磁珠标记物后电极表面可见一层多孔颗粒状薄膜，即为普鲁士蓝。
禽流感病毒H5N1检测。将磁珠标记的电极置于10mL的0.4mM铁氰化钾和0.1M硫酸钾混合溶液中，采用三电极系统，以饱和甘汞电极为参比电极，碳电极为对电极，进行多电位阶越(1.60V，450s；0V，250s)扫描获得普鲁士蓝，在0.1M酸性K2SO4溶液中-0.3V～0.5V扫循环伏安表征。
普鲁士蓝还原峰电流信号与禽流感病毒浓度成正比，如图4所示。
采用该方法应用于五个不同禽流感病毒浓度的子实施例检测，结果如表1所示。
表1本发明方法应用于5个浓度实施例的检测参数与性能
由此可得生物传感器的线性检测范围从0.0025-0.16HAU，线性方程为-i＝0.7592lgc+2.3722(R2＝0.908)，检测限(S/N＝3)为7.4×10-4HAU(5μL样品)，如图4所示。
实施例2
将15mL磁珠水溶液置于50mL离心管中，在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液。
再加入不同体积的浓度为0.4M的柠檬酸水溶液，使柠檬酸与磁珠分散液的配比为0.1mmol、0.2mmol和0.3mmol每毫克磁性纳米料子。超声30min，常温条件(25℃)条件下旋转反应20h。依次进行磁性分离、去除上清液，将磁珠用磷酸盐缓冲液清洗的步骤三次，然后分散于15mL MES缓冲液中(磁珠的最终浓度约为1mg/mL)，4℃下保存。
将EDC(2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到1mL上述功能磁珠分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离清洗三次，再分散在1mL磷酸缓冲液中。
取100μL已激活的磁珠与不同浓度伴刀豆球蛋白A(Con A)混合，使活化磁珠与ConA的质量比分别为1：5、1：7.5和1：10，于常温下反应1小时。磷酸缓冲液(pH 6.0)洗三次并分散在磷酸缓冲溶液中，冰箱中4℃保存。采用红外光谱法验证了修饰，结果显示Con A修饰磁珠具有磁珠和Con A的特征峰，表明成功修饰。
当柠檬酸与磁珠分散液的配比为0.1mmol和0.3mmol每毫克磁性纳米料子，活化磁珠与Con A的质量比为1：7.5时，均可成功修饰，但Con A修饰量分别是柠檬酸与磁珠分散液的配比为0.2mmol每毫克磁性纳米料子时的76％和96％。
当柠檬酸与磁珠分散液的配比为0.2mmol每毫克磁性纳米料子，活化磁珠与Con A的质量比分别为1：5和1：10时，均可成功修饰，但Con A修饰量分别是活化磁珠与Con A的质量比为1：7.5时的82％和98％。
实施例3
将15mL磁珠水溶液置于50mL离心管中，在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液。
再加入15mL浓度为0.4M的柠檬酸水溶液，超声30min，常温条件(25℃)条件下旋转反应20h。依次进行磁性分离、去除上清液，将磁珠用磷酸盐缓冲液清洗的步骤三次，然后分散于15mL MES缓冲液中(磁珠的最终浓度约为1mg/mL)，4℃下保存。
将EDC(2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到1mL上述功能磁珠分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离清洗三次，再分散在1mL磷酸缓冲液中。
取100μL已激活的磁珠与400μL伴刀豆球蛋白A(Con A)于常温下反应1小时。磷酸缓冲液(pH 6.0)洗三次并分散在磷酸缓冲溶液中，冰箱中4℃保存。采用红外光谱法验证了修饰，结果显示Con A修饰磁珠具有磁珠和Con A的特征峰，表明成功修饰。
如图1所示，取处理干净的金电极浸泡在丙酮配制的300μL浓度分别为1、2、3、4和5mM二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯(DTSP)溶液中浸泡过夜，获得DTSP组装单分子层。依次用丙酮和水充分清洗后，在电极上滴加5μL浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL蛋白A，常温下反应45min，用PBS缓冲液清洗。
当DTSP的浓度分别为1、3、4和5mM，蛋白A浓度为0.1mg/mL时，电化学阻抗法表征蛋白A修饰量分别为当DTSP浓度为2mM时的86％、98％、102％和96％。当DTSP浓度为2mM，蛋白A浓度分别为0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL时，电化学阻抗法表征蛋白A修饰量分别为当蛋白A浓度为0.1mg/mL时的99％、106％、105％和110％。
综合考虑蛋白A固定效率和试剂使用的经济性，最终选择2mM DTSP和0.1mg/mL蛋白A。
实施例4
将15mL磁珠水溶液置于50mL离心管中，在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液。
再加入15mL浓度为0.4M的柠檬酸水溶液，超声30min，常温条件(25℃)条件下旋转反应20h。依次进行磁性分离、去除上清液，将磁珠用磷酸盐缓冲液清洗的步骤三次，然后分散于15mL MES缓冲液中(磁珠的最终浓度约为1mg/mL)，4℃下保存。
将EDC(2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到1mL上述功能磁珠分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离清洗三次，再分散在1mL磷酸缓冲液中。
取100μL已激活的磁珠与400μL伴刀豆球蛋白A(Con A)于常温下反应1小时。磷酸缓冲液(pH 6.0)洗三次并分散在磷酸缓冲溶液中，冰箱中4℃保存。采用红外光谱法验证了修饰，结果显示Con A修饰磁珠具有磁珠和Con A的特征峰，表明成功修饰。
如图1所示，取处理干净的金电极浸泡在丙酮配制的300μL的2mM二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯(DTSP)溶液中浸泡过夜，获得DTSP组装单分子层。依次用丙酮和水充分清洗后，在电极上滴加5μL的0.1mg/mL蛋白A，常温下反应45min，用PBS缓冲液清洗。取5μL的浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL禽流感病毒H5N1抗体滴加到修饰电极表面，常温下反应1小时，用PBS缓冲液清洗电极。用质量分数为5％的BSA封闭非特异性结合位点。
当禽流感病毒H5N1抗体浓度分别为0.1、0.3、0.4和0.5mg/mL时，电化学阻抗法表征禽流感病毒H5N1抗体固定量分别为禽流感病毒H5N1抗体浓度为0.2mg/mL时的81％、98％、103％和112％。考虑试剂经济性，选择0.2mg/mL禽流感病毒H5N1抗体。
实施例5
将15mL磁珠水溶液置于50mL离心管中，在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液。
再加入15mL浓度为0.4M的柠檬酸水溶液，超声30min，常温条件(25℃)条件下旋转反应20h。依次进行磁性分离、去除上清液，将磁珠用磷酸盐缓冲液清洗的步骤三次，然后分散于15mL MES缓冲液中(磁珠的最终浓度约为1mg/mL)，4℃下保存。
将EDC(2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到1mL上述功能磁珠分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离清洗三次，再分散在1mL磷酸缓冲液中。
取100μL已激活的磁珠与400μL伴刀豆球蛋白A(Con A)于常温下反应1小时。磷酸缓冲液(pH 6.0)洗三次并分散在磷酸缓冲溶液中，冰箱中4℃保存。采用红外光谱法验证了修饰，结果显示Con A修饰磁珠具有磁珠和Con A的特征峰，表明成功修饰。
电化学生物传感器制备方法如图1所示。取处理干净的金电极浸泡在丙酮配制的300μL的2mM二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯(DTSP)溶液中浸泡过夜，获得DTSP组装单分子层。依次用丙酮和水充分清洗后，在电极上滴加5μL的0.1mg/mL蛋白A，常温下反应45min，用PBS缓冲液清洗。取5μL的0.2mg/mL禽流感病毒H5N1抗体滴加到修饰电极表面，常温下反应1小时，用PBS缓冲液清洗电极。用质量分数为5％的BSA封闭非特异性结合位点。5μL浓度为0.16HAU的H5N1悬浊液滴加到电极表面，常温下培育1小时，用PBS缓冲液清洗。分别取5、8和10μL上述Con A修饰磁珠滴加到电极表面反应30min，用PBS缓冲液清洗。采用电位阶跃法获得普鲁士蓝电流信号。
当Con A修饰磁珠分散液用量分别为5、8和10μL时，最终普鲁士蓝电流信号分别为2.60、2.62和2.62μA。表明5μL的Con A修饰磁珠分散液足够标记捕获的禽流感病毒。
实施例6
将15mL磁珠水溶液置于50mL离心管中，在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液。
再加入15mL浓度为0.4M的柠檬酸水溶液，超声30min，常温条件(25℃)条件下旋转反应20h。依次进行磁性分离、去除上清液，将磁珠用磷酸盐缓冲液清洗的步骤三次，然后分散于15mL MES缓冲液中(磁珠的最终浓度约为1mg/mL)，4℃下保存。
将EDC(2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到1mL上述功能磁珠分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液(pH 6.0)磁性分离清洗三次，再分散在1mL磷酸缓冲液中。
取100μL已激活的磁珠与400μL伴刀豆球蛋白A(Con A)于常温下反应1小时。磷酸缓冲液(pH 6.0)洗三次并分散在磷酸缓冲溶液中，冰箱中4℃保存。采用红外光谱法验证了修饰，结果显示Con A修饰磁珠具有磁珠和Con A的特征峰，表明成功修饰。
电化学生物传感器制备方法如图1所示。取处理干净的金电极浸泡在丙酮配制的300μL的2mM二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯(DTSP)溶液中浸泡过夜，获得DTSP组装单分子层。依次用丙酮和水充分清洗后，在电极上滴加5μL的0.1mg/mL蛋白A，常温下反应45min，用PBS缓冲液清洗。取5μL的0.2mg/mL禽流感病毒H5N1抗体滴加到修饰电极表面，常温下反应1小时，用PBS缓冲液清洗电极。用质量分数为5％的BSA封闭非特异性结合位点。5μL浓度为0.16HAU的H5N1悬浊液滴加到电极表面，常温下培育1小时，用PBS缓冲液清洗。取5μL上述Con A修饰磁珠滴加到电极表面反应30min，用PBS缓冲液清洗。采用扫描电镜表征了电极表面以验证修饰过程，如图3所示。捕获病毒后电极表面可见约60nm颗粒状病毒，标记磁珠后电极表面可见大量颗粒。
采用循环伏安法转化磁珠标记物，循环伏安法参数为：高电位1.65V，低电位为-0.3V，扫描圈数25，扫描速度0.03V/s。获得的普鲁士蓝的电流信号为2.5μA，与采用电位阶跃法的结果吻合。表明采用循环伏安法电化学转化磁珠标记物也可获得可靠信号。
由上述实施例可见，本发明基于磁性纳米料子的新性质引入电化学转化获得了电化学活性普鲁士蓝，获得其能灵敏检测禽流感病毒H5N1的生物传感器，方法简便、低成本，其技术效果显著突出。

Claims (9)

1.一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器，其特征在于包括由磁珠转化而成的普鲁士蓝和三电极系统，三电极系统以饱和甘汞电极为参比电极，碳电极为对电极，伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极为工作电极；
制备获得作为参比电极的饱和甘汞电极和作为对电极的碳电极，所述伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极和普鲁士蓝具体制备过程如下：
1)处理磁珠水溶液制备获得伴刀豆球蛋白A修饰磁珠分散液；
2)由伴刀豆球蛋白A修饰磁珠分散液处理获得伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极；
3)将伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极置于铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中，采用三电极系统，伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，碳棒为对电极，进行多电位阶越扫描获得普鲁士蓝。
2.根据权利要求1所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体如下：
1.1)将磁珠水溶液在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液；
1.2)将用于羧基化磁珠的柠檬酸与磁珠分散液混合，静置于旋转仪上12h过夜得到羧基化磁珠分散液，柠檬酸的含量为0.1mmol-0.3mmol每毫克磁珠；
1.3)将上述羧基化磁珠分散液依次进行磁性分离、去除上清液，然后将磁珠用磷酸盐缓冲液清洗三次，然后分散于MES缓冲液中，使得磁珠的最终浓度为1mg/mL，4℃下保存；
1.4)将EDC和NHS加入到1mL上述羧基化磁珠的MES分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液磁性分离、去除上清液，重复清洗三次，得到活化磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液中；
1.5)取活化磁珠与伴刀豆球蛋白A于常温下反应，用磷酸缓冲液磁性分离、去除上清液，重复清洗三次，得到伴刀豆球蛋白A修饰磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液中，在冰箱中4℃保存。
3.根据权利要求1所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体如下：
2.1)将干净的金磁电极在二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯的丙酮溶液中浸泡，丙酮洗3次，然后超纯水洗3次，获得二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯修饰金磁电极；
2.2)在二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯修饰金磁电极上滴加伴刀豆球蛋白A溶液，常温下反应，用PBS缓冲液清洗，获得蛋白A修饰金磁电极；
2.3)在伴刀豆球蛋白A修饰金磁电极表面滴加禽流感病毒H5N1抗体溶液，常温下反应，用PBS缓冲液清洗，获得抗体修饰金磁电极；
2.4)在抗体修饰金磁电极表面滴加牛血清白蛋白溶液，常温下反应以封闭非特异性结合位点，用PBS缓冲液清洗，最终获得传感电极；
2.5)在传感电极表面滴加禽流感病毒H5N1悬浊液，常温下培育，用PBS缓冲液清洗，获得检测电极；
2.6)取伴刀豆球蛋白A修饰磁珠分散液滴加到检测电极表面，常温反应，用PBS缓冲液清洗，获得伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极。
4.根据权利要求3所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于：所述的干净的金磁电极采用以下方式清洗：金磁电极依次在砂纸、0.5μm氧化铝粉末和0.05μm氧化铝粉末中打磨，打磨后经充分清洗，再依次在超纯水、乙醇和超纯水中各超声5分钟，配制Prihna溶液滴加5μL于电极表面，保持5分钟，最后采用大量水进行清洗。
5.根据权利要求2所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于：
所述步骤1.2)中柠檬酸与磁珠分散液的配比为0.1mmol-0.3mmol每毫克磁性纳米料子；所述步骤1.5)中活化磁珠与伴刀豆球蛋白A的质量比为1：5-1：10，时间为1h，反应时间为45-90min。
6.根据权利要求3所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤2.2)中二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯浓度为1-5mM，反应时间为4-18h；所述步骤2.2)中伴刀豆球蛋白A溶液的浓度为0.1-0.5mg mL-1，反应时间为45-90min；所述步骤2.3)中禽流感病毒H5N1抗体溶液的浓度为0.1－0.5mg mL-1，反应时间为45-90min；所述步骤2.4)中用于封闭的牛血清白蛋白溶液的浓度为5％-10％，反应时间为45-90min；所述步骤2.5)中禽流感病毒H5N1的浓度为0.0025-0.16HAU，禽流感病毒H5N1培育时间为30-60min；所步骤2.6)中伴刀豆球蛋白A修饰磁珠分散液用量为5-10μL，培育时间为30-60min。
7.根据权利要求1所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤3)种铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中铁氰化钾和硫酸钾的浓度分别为0.1-5mM和0.1M。
8.根据权利要求1所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于：所述多电位阶跃采用以下参数：第一阶段，电压1.60V，时长450s；第二阶段电压0V，时长250s。
9.根据权利要求1所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于：所述多电位阶跃替换为循环伏安法，循环伏安法参数为：高电位1.65V，低电位为-0.3V，所用溶液pH≤6.0。
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