CN113834931A - 电化学磁性生物传感器检测基因组整体dna甲基化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法。该方法基于磁珠富集样本和酶催化反应的双重放大策略，先将生物素化的5‑甲基胞嘧啶抗体固定于表面共价偶联有中性链霉亲和素的磁珠；具有5‑甲基胞嘧啶抗体包被的磁珠富集待测DNA样本中含有的5‑甲基胞嘧啶DNA链；葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体再与表面捕获有5‑甲基胞嘧啶DNA链的磁珠发生免疫亲和反应；在含有葡萄糖的溶液体系中，利用磁性基底表面普鲁士蓝掺杂的丝网印刷碳电极检测葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应中产生的过氧化氢；工作电极表面可检测到的电化学信号与待测样本中的5‑甲基胞嘧啶DNA含量呈线性相关。本发明具有仪器简单、操作方便、易于微型化等优点。
Description
技术领域
本发明属于电化学传感器领域，具体涉及一种电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法。
背景技术
DNA甲基化是表观遗传学的核心组成之一，其在正常细胞的功能维持、胚胎发育等重要生命过程中发挥调控作用。DNA甲基化是指在CpG二核苷酸 (5’-CpG-3’)处的胞嘧啶碱基5号碳原子上添加一个甲基，生成5-甲基胞嘧啶 (5-mC)。在不改变基因碱基序列的情况下，CpG岛的甲基化程度发生改变，实现转录水平上的基因表达调控。现有研究发现，基因组整体DNA甲基化水平降低和CpG岛高甲基化的异常变化与多种慢性疾病的发生密切相关，包括癌症在内。因此，建立操作简便的基因组整体DNA甲基化方法，在疾病的早期诊断和风险预测等方面极具应用潜力。
目前现有的基因组整体DNA甲基化的检测方法主要包括：变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography,HPLC)，M.Sssl甲基转移酶分析，氯乙醛反应法。涉及到重亚硫酸盐预处理的方法要求大量的克隆测序步骤，若处理不完全可能导致假阳性，并且该方法无法区分5-甲基胞嘧啶和5- 羟甲基胞嘧啶(5-hmC)；甲基转移酶分析则存在酶活性不稳定和放射性污染的问题；虽然氯乙醛的试剂价格较低且稳定性好，还避免了放射性污染，但费时费力，此外，氯乙醛是一种有毒物质。
电化学方法检测基因组整体DNA甲基化具有仪器简单、操作方便、易于微型化等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于磁珠富集和氧化酶催化反应的基因组DNA 甲基化电化学检测方法。本发明采用磁珠富集和酶催化反应的双重放大策略，利用磁性基底上经普鲁士蓝掺杂的丝网印刷碳电极检测基因组整体DNA甲基化。
本发明所采取的技术方案是：
一种电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其具体如下：基于磁珠富集和酶催化反应的双重放大策略，先将表面共价偶联有链霉亲和素的磁珠用5-甲基胞嘧啶抗体进行修饰，然后利用磁珠捕获待测基因组DNA样本中含有的5-甲基胞嘧啶DNA链，再将葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体与表面捕获有5-甲基胞嘧啶DNA链的磁珠发生免疫亲和反应后，将磁珠滴加至具有磁性基底且表面掺杂普鲁士蓝(prussian blue，PB)的丝网印刷碳电极表面得到电化学磁性生物传感器；最后在含有葡萄糖的溶液体系中，利用电化学磁性生物传感器检测葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应中产生的过氧化氢，根据检测得到的电化学信号换算得到待测基因组DNA样本中5-甲基胞嘧啶DNA含量。
作为优选，用5-甲基胞嘧啶抗体对磁珠进行修饰的方法为：
取10mg/mL表面共价偶联有链霉亲和素的磁珠(型号优选为StreptavidinMagnetic Beads，HY-K0208，MedChemExpress)于离心管中，用缓冲液洗涤两次；然后将磁珠与2倍体积的1mg/mL的生物素化的5-甲基胞嘧啶抗体(型号优选为生物素5-mC抗体，ab179914，Abcam)混合，使磁珠表面的链霉亲和素结合饱和；再用缓冲液稀释，使磁珠浓度为0.5～2mg/mL；最后将离心管置于旋转混合仪上，在4～25℃中旋转孵育1～4小时，清洗两次后重悬，完成磁珠表面的5-甲基胞嘧啶抗体修饰，低温保存以备后用。
作为优选，利用磁珠捕获待测基因组DNA样本中含有的5-甲基胞嘧啶DNA 链的方法为：
待测基因组DNA样本经高温变性解旋并用预冷的含1％BSA的5X SSC缓冲液稀释至指定浓度，加入5-甲基胞嘧啶抗体修饰后的磁珠以富集含5-甲基胞嘧啶的DNA样本，离心管置于旋转混合仪上，在4℃旋转孵育30min，用含 1％BSA的5X SSC缓冲液清洗两次，得到捕获甲基化DNA的磁珠。
作为优选，将葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体与磁珠发生免疫亲和反应的方法为：
将葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体(anti-DNA-GOx)与捕获甲基化DNA 的磁珠混合并置于旋转混合仪上，在4℃旋转孵育30min，用含1％BSA的5X SSC缓冲液清洗两次，得到表面结合葡萄糖氧化酶的磁珠。
作为优选，利用丝网印刷碳电极进行待测基因组DNA样本中5-甲基胞嘧啶 DNA含量检测的方法为：
将表面结合葡萄糖氧化酶的磁珠吸附在具有磁性基底且表面掺杂有普鲁士蓝(型号优选为Carbon Mediator Paste，G2070424P2，Gwent)的丝网印刷工作电极表面，然后加入含有葡萄糖的缓冲液体系，利用电极上吸附的葡萄糖氧化酶对葡萄糖氧化过程中产生的H2O2进行电化学检测，按照标准曲线对所得电化学信号与待测基因组DNA样本中5-甲基胞嘧啶DNA含量之间进行转换，得到待测甲基化DNA含量。
作为优选，用5-甲基胞嘧啶抗体对磁珠进行修饰过程中，所采用的缓冲液组成为：1.8mM KH2PO4，10mM Na2HPO4，2.7mM KCl，137mM NaCl，0.05％ Tween-20。
作为优选，所述待测基因组DNA样本的解旋处理条件为：将待测基因组 DNA样本在95℃处理8～15min后迅速转移至4℃保持3min以上，得到单链 DNA。
作为优选，所述葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体是利用葡萄糖氧化酶偶联试剂盒(型号优选为Glucose Oxidase偶联试剂盒，ab102887，Abcam)处理 DNA抗体(型号优选为Mouse Anti-DNA IgM Monoclonal Antibody，7115， Chondrex)后得到的，且使用的偶联抗体浓度为20～50μg/mL。
作为优选，所述电化学检测在电化学工作站上进行，采用两电极体系并使用计时电流法，测量电压为-0.2～0V，测量时长为100～300s，得到时间-电流曲线；测试使用的含有葡萄糖的缓冲液体系组成为：2～10mM葡萄糖，20～80mM Tris-HCl。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1.本发明不涉及重亚硫酸盐处理，避免因化学处理不完全导致的假阳性问题，也可避免重亚硫酸盐无法区别5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的缺点。
2.本发明不涉及PCR测序步骤，满足低成本的使用需求。
3.本发明使用包被了5-甲基胞嘧啶抗体的磁珠特异性富集基因组整体DNA 中含有的5-甲基胞嘧啶DNA，无需将DNA固定在电极上。由于DNA直接提取自细胞，具有相当长度，因此被磁珠捕获的5-甲基胞嘧啶DNA链上可以结合多个葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体，提高对5-甲基胞嘧啶的检测灵敏度。
4.本发明由于使用的丝网印刷碳电极掺杂了普鲁士蓝，以此作为过氧化氢还原的中介体，克服了由于直接高电位氧化检测过氧化氢而产生很多干扰电流的缺点。
5.本发明由于使用磁性基底的丝网印刷电极，不需要外加磁场即可将磁珠固定在工作电极表面，减小了整个测试体系所需要的空间，符合便携式场景的使用需求。
6.本发明的电化学测试溶液体系仅包含缓冲液和葡萄糖，降低了床旁检测使用过程中的复杂度。
附图说明
图1为测定5-甲基胞嘧啶的非固定化电化学磁性生物传感器的示意图。
图2为丝网印刷碳电极的检测结果，其中A为丝网印刷碳电极在-0.1V电压下检测过氧化氢(0、0.5、1、1.5、2mM)的计时电流曲线；B为丝网印刷碳电极在不同电压(0、-0.1、-0.2V)下对不同浓度的过氧化氢的响应；C为丝网印刷碳电极在不同测试电压下的灵敏度。图中误差棒表示三次重复测量的标准偏差。
图3为电化学磁性生物传感器的特异性评估结果，其中A为使用等量(25 ng)的全甲基化(JURKAT)和无甲基化(whole genomic amiplification，WGA) 样本在葡萄糖溶液中的计时电流响应值，空白对照组(NoDNA)使用了等体积的缓冲液，50mM Tris-HCl；B为不同质量(5、10、20、25ng)的全甲基化(JURKAT) DNA在葡萄糖溶液中的计时电流响应；C为不同质量的全甲基化DNA与计时电流响应值之间的线性关系。图中误差棒表示三次独立实验的标准偏差。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。
本发明的检测原理如图1所示：具有链霉亲和素包被的磁珠与生物素化的 5-甲基胞嘧啶抗体结合，能够特异性地富集含5-甲基胞嘧啶的单链DNA。随后，用葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体孵育磁珠，使磁珠表面连接有葡萄糖氧化酶。磁珠在磁性基底的作用下固定在丝网印刷碳电极上。在含有葡萄糖的测试溶液中，磁珠表面的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化反应产生H2O2，丝网印刷碳电极中掺杂有普鲁士蓝作为还原H2O2的中介体，可以在低电位下用计时电流法进行检测。通过磁珠富集样本和酶催化反应的两步信号放大策略，实现基因组整体甲基化的检测。
在本实施例中，电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法的具体实现步骤如下：
(1)磁珠表面5-甲基胞嘧啶抗体修饰：取10mg/mL表面共价偶联有链霉亲和素的磁珠(Streptavidin Magnetic Beads，HY-K0208，MedChemExpress)于离心管中，用缓冲液洗涤两次；然后将磁珠与2倍体积的1mg/mL的生物素化的5-甲基胞嘧啶抗体(生物素5-mC抗体，ab179914，Abcam)混合，使磁珠表面的链霉亲和素结合饱和；再用缓冲液稀释，使磁珠浓度为0.5～2mg/mL；将离心管置于旋转混合仪上，在4℃中旋转孵育2小时，清洗两次后重悬，完成磁珠表面的抗体修饰，低温保存以备后用。
其中本步骤清洗磁珠的缓冲液组成为：1.8mM KH2PO4，10mM Na2HPO4， 2.7mM KCl，137mM NaCl，0.05％Tween-20。
(2)磁珠捕获甲基化DNA：待测基因组DNA样本经高温变性解旋并用预冷的5X SSC缓冲液(含1％BSA)稀释至指定浓度，加入步骤(1)中修饰好的磁珠以富集含5-甲基胞嘧啶的DNA样本，离心管置于旋转混合仪上，在4℃旋转孵育30min，用5X SSC缓冲液(含1％BSA)清洗两次。
待测基因组DNA样本经高温变性解旋所采用的处理条件为：95℃处理8～15 min后迅速转移至4℃保持3min以上，得到单链DNA，更有利于5-甲基胞嘧啶抗体识别。
(3)磁珠表面结合葡萄糖氧化酶：葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体 (anti-DNA-GOx)与步骤(2)得到的磁珠混合后置于旋转混合仪上，在4℃旋转孵育30min，用5X SSC缓冲液(含1％BSA)清洗两次。
本步骤中使用的葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体是由葡萄糖氧化酶偶联试剂盒(Glucose Oxidase偶联试剂盒，ab102887，Abcam)按操作手册处理DNA 抗体(Mouse Anti-DNA IgM Monoclonal Antibody，7115，Chondrex)后得到，使用的偶联抗体浓度为20～50μg/mL。
(4)电化学检测：通过丝网印刷工艺用碳浆在磁性基底上形成磁性基底丝网印刷碳电极作为工作电极，工作电极表面掺杂有普鲁士蓝(Carbon Mediator Paste，G2070424P2，Gwent)，作为过氧化氢还原的中介体同时印刷与工作电极对应的对电极，从而构成双电极体系。将步骤(3)得到的磁珠滴加在丝网印刷工作电极表面进行吸附，其中该丝网印刷碳电极由于采用磁性基底，因此磁珠可在磁性基底作用下直接吸附于工作电极表面，得到电化学磁性生物传感器。将该电化学磁性生物传感器中加入含有葡萄糖的缓冲液体系，利用葡萄糖氧化酶对葡萄糖氧化过程中产生的H2O2进行电化学检测。该电化学检测在电化学工作站上进行，采用两电极体系并使用计时电流法，测量电压为-0.2～0V，测量时长为 100～300s；得到时间-电流曲线；测试使用的含有葡萄糖的缓冲液体系组成为： 2～10mM葡萄糖，20～80mM Tris-HCl。
(5)由于工作电极表面可检测到的电化学信号与待测基因组DNA样本中的5-甲基胞嘧啶DNA含量呈线性相关，因此可预先获取两者之间的标准曲线，然后将步骤(4)所得电化学信号与待测样本甲基化DNA含量之间进行转换，得到待测基因组DNA样本中5-甲基胞嘧啶DNA含量，即待测甲基化DNA含量。
为验证并优化本实施例使用的磁性基底丝网印刷碳电极对H2O2的检测性能，在不同浓度的H2O2溶液中使用计时电流法进行测试(图2)。如图2A所示，在 -0.1V的测试电压下，浓度范围在0～2mM的H2O2溶液中，本发明使用的磁性基底丝网印刷碳电极的电流响应随H2O2浓度增大而增强。在不同的测试电压(0、 -0.1、-0.2V)下，针对各浓度的测试结果，取计时电流法第60s的电流值，做浓度-电流响应曲线(图2B)，根据响应曲线求出丝网印刷碳电极在不同测试电压下的灵敏度(图2C)，选择-0.1V作为后续基因组甲基化测试的电压值。
在该测试电压下，本实施例评估了电化学磁性生物传感器的特异性。如图 3A所示，使用25ng的不同核酸样本，包括全甲基化基因组DNA(JURKAT， SD1121，ThermoScientific)，无甲基化基因组DNA(WGA)，无DNA(NoDNA) 的缓冲液。
接着，本实施例评估了电化学磁性生物传感器的对不同浓度的5-甲基胞嘧啶 DNA的分析性能。如图3B所示，随着5-甲基胞嘧啶DNA浓度从5到25ng的增加，计时电流的响应随之增强。如图3C所示，计时电流第60s的电流值与5- 甲基胞嘧啶DNA浓度在5～25ng范围内获得线性关系。
需注意的是，虽然上述用于测试的样本为全甲基化基因组DNA(JURKAT)，但实际的(JURKAT，SD1121，Thermo Scientific)可以通过用试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kit，69504，Qiagen)从目标细胞系中提取。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其特征在于：基于磁珠富集和酶催化反应的双重放大策略，先将表面共价偶联有链霉亲和素的磁珠用5-甲基胞嘧啶抗体进行修饰，然后利用磁珠捕获待测基因组DNA样本中含有的5-甲基胞嘧啶DNA链，再将葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体与表面捕获有5-甲基胞嘧啶DNA链的磁珠发生免疫亲和反应后，将磁珠滴加至具有磁性基底且表面掺杂普鲁士蓝的丝网印刷碳电极表面得到电化学磁性生物传感器；最后在含有葡萄糖的溶液体系中，利用电化学磁性生物传感器检测葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应中产生的过氧化氢，根据检测得到的电化学信号换算得到待测基因组DNA样本中5-甲基胞嘧啶DNA含量。
2.根据权利要求1所述的电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其特征在于，用5-甲基胞嘧啶抗体对磁珠进行修饰的方法为：
取10mg/mL表面共价偶联有链霉亲和素的磁珠于离心管中，用缓冲液洗涤两次；然后将磁珠与2倍体积的1mg/mL的生物素化的5-甲基胞嘧啶抗体混合，使磁珠表面的链霉亲和素结合饱和；再用缓冲液稀释，使磁珠浓度为0.5～2mg/mL；最后将离心管置于旋转混合仪上，在4～25℃中旋转孵育1～4小时，清洗两次后重悬，完成磁珠表面的5-甲基胞嘧啶抗体修饰，低温保存以备后用。
3.根据权利要求1所述的电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其特征在于，利用磁珠捕获待测基因组DNA样本中含有的5-甲基胞嘧啶DNA链的方法为：
待测基因组DNA样本经高温变性解旋并用预冷的含1％BSA的5X SSC缓冲液稀释至指定浓度，加入5-甲基胞嘧啶抗体修饰后的磁珠以富集含5-甲基胞嘧啶的DNA样本，离心管置于旋转混合仪上，在4℃旋转孵育30min，用含1％BSA的5X SSC缓冲液清洗两次，得到捕获甲基化DNA的磁珠。
4.根据权利要求1所述的电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其特征在于，将葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体与磁珠发生免疫亲和反应的方法为：
将葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体与捕获甲基化DNA的磁珠混合并置于旋转混合仪上，在4℃旋转孵育30min，用含1％BSA的5X SSC缓冲液清洗两次，得到表面结合葡萄糖氧化酶的磁珠。
5.根据权利要求1所述的电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其特征在于，利用电化学磁性生物传感器进行待测基因组DNA样本中5-甲基胞嘧啶DNA含量检测的方法为：
将表面结合葡萄糖氧化酶的磁珠吸附在具有磁性基底且表面掺杂有普鲁士蓝的丝网印刷工作电极表面形成电化学磁性生物传感器，然后加入含有葡萄糖的缓冲液体系，利用电极上吸附的葡萄糖氧化酶对葡萄糖氧化过程中产生的H2O2进行电化学检测，按照标准曲线对所得电化学信号与待测基因组DNA样本中5-甲基胞嘧啶DNA含量之间进行转换，得到待测甲基化DNA含量。
6.根据权利要求2所述的电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其特征在于：用5-甲基胞嘧啶抗体对磁珠进行修饰过程中，所采用的缓冲液组成为：1.8mMKH2PO4，10mM Na2HPO4，2.7mM KCl，137mM NaCl，0.05％Tween-20。
7.根据权利要求3所述的电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其特征在于：所述待测基因组DNA样本的解旋处理条件为：将待测基因组DNA样本在95℃处理8～15min后迅速转移至4℃保持3min以上，得到单链DNA。
8.根据权利要求4所述的电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶共价偶联的DNA抗体是利用葡萄糖氧化酶偶联试剂盒处理DNA抗体后得到的，且使用的偶联抗体浓度为20～50μg/mL。
9.根据权利要求5所述的电化学磁性生物传感器检测基因组整体DNA甲基化的方法，其特征在于：所述电化学检测在电化学工作站上进行，采用两电极体系并使用计时电流法，测量电压为-0.2～0V，测量时长为100～300s，得到时间-电流曲线；测试使用的含有葡萄糖的缓冲液体系组成为：2～10mM葡萄糖，20～80mM Tris-HCl。
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