JPH07506185A - 非特異的抗ハプテン抗体を使用するイムノアッセイ及び該イムノアッセイに使用するための材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非特異的抗ハブテン抗体を使用するイムノアッセイ及び該イムノアッセイに使用 するための材料 発明の分野 本発明はイムノアッセイの分野に関する。

発明の背景 イムノアッセイによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断試験は一般に、対象分析物に対して 特異的結合親和性を有する抗体を必要とする。かかる試験構成において、抗原分 析物は、抗体に直接結合するかまたはハブテン−ラベルコンジュゲートと競合す る（競合アッセイ）。

前者の場合、抗体−抗原複合体を凝集アッセイで増殖させ得る。代替的にサンド イッチアッセイでは、抗原に対して親和性を有する別の抗体をソゲナルラベルに 結合し、第−抗体−抗原複合体と結合させ得る。シグナル応答は分析物濃度に正 比例する。

競合アッセイにおいては、実際には典型的小分子から成る分析物とハプテン−ラ ベルコンジュゲートとの間で競合が生じる。シグナル応答は分析物濃度に反比例 する。

はとんどの標的分析物は原則として、競合ア・ソセイまたはサンドイッチアッセ イのフォーマットを用いて検出され得る。公表された方法が極めて十分に目的を 果たした実例は多数存在している。しかしながら、これらの方法の有効性は、単 一アッセイは単一分析物のみに特異的であるという点である程度限定されている 。多重分析物アッセイ（ｔａｕＤｉ−ａｎａｌｙｔｅ　ａｓｓａｙ）は難しい。

利用可能な種々のイムノアッセイフォーマットのいくつかの例を以下に挙げる。

Ｍｏｃｈｉｄａらの米国特許第４．１１１１５．０８４すは、洗浄及び分離の段 階を伴う不均一型（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイを開示している 。不溶化した抗分析物抗体が、ハプテンに結合している分析物（ハブテン−分析 物コンジュゲート）に対する第−捕捉相として作用する。洗浄後、可溶性の欅識 抗ハブテン抗体を添加し、（抗分析物抗体／ハブテンー分析物コンジュゲート／ 抗ハブテン抗体）の複合体を検出する。５ａｄｅｈらの米国特許第４．２４３． ７４９号は、同様のサンドイッチアッセイの別のフォーマットを開示している。

５ａｄｅｈらは特に、低分子量（ハブテン）抗原を測定することを目的としてい る。競合アッセイフォーマットを用い、未知の分析物とハプテン−分析物コンジ ュゲートとを不溶性抗分析物抗体と共にインキュベートする。洗浄段階１麦、可 溶性の標識抗ハブテン抗体を添加し、系を再度洗浄し、（抗分析物抗体／ハブテ ンー分析物コンジュゲート／抗ハブテン抗体）の標識複合体を検出する。

Ｋａｎｇら、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　３２（９）　：　１６８２−１６８ ６（１９８６）は、２つのアッセイフォーマットを記載している。第一のアッセ イフォーマントは、抗ハプテン抗体でコートされた微粒子（共通捕捉粒子）と、 ハブテンに結合した抗分析物抗体（ハブテン−抗分析物抗体コンジュゲート）と 、標識された抗分析物抗体とを使用するエンザイムイムノアッセイを提供する。

試料中に分析物が存在するならば、（抗ハブテン抗体でコートされた微粒子／ハ プテン−抗分析物抗体コンジュゲート／分析物／標識抗分析物抗体）の複合体が 形成されて検出される。フルオレセインが捕捉ハプテンとして有用である。微粒 子はラテックス粒子である。

Ｋａｎｇらの第二のアッセイフォーマットは、Ｂｕｎｔｉｎｇの米国特許第４． ２７１．１４０号のアッセイフォーマットと同様である。このアッセイフォーマ ットは、固相に結合した抗ハブテン抗体と、抗分析物抗体に結合したハブテン（ ハブテン−抗分析物抗体）と、標識分析物とから構成されている。

３成分全部の複合体が検出される。

凝集アッセイにおいては、抗体または抗原（またはハブテン）が小粒子に結合し 得る。凝集可能担体として使用されている粒子は、ラテックス、木炭、カオリナ イト、ベントナイト、無機コロイド粒子、微生物細胞及び赤血球などである。Ｍ ｏｃｈｉｄａの米国特許第４．３０８．０２６号参照。これらのコーテッド粒子 （抗体または抗原でコートされた粒子）と抗原または抗体を含有する試料とを混 合すると、コーテッド粒子は、肉眼で検出可能な凝集物を形成するであろう。

凝集の特性は、普通なら均質な懸濁液からラテックスポリマー粒子が凝集するこ とである。定性的なラテックス凝集試験は、いかなる計器の補助もなく単一スラ イド上で実施し得る。各々を異なる特異性の抗体で感作し次いで一緒に混合した 異なる着色のラテックス粒子を用いて２種以上の抗原を同時に検出し得る。＋１ ａｄＨｅｌｄ、　Ｓ、　Ｇ、ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　９７ ：　１５３−８（１９８７）参照。１９８８年５月１７日付けのｌ１ａｄｆｉｅ ｌｄらの米国特許第４．７４５．０７５号。米国特許第４．４１９．４５３号は 更に、アモシッドイｘ　ｏ　−（Ａｍｏｃｉｄ　ｙｅｌｌｏｗ）　、ブリリアン トクロセイン（ｂｒｉｌｌａｎｔ　ｃｒｏｃｅｉｎ）　３　Ｂ　Ａ赤色染料、カ ルコオイルブルー（Ｃａｌｃｏ　Ｏｉｌ　Ｂｌｕｅ）　Ｎ染料で染色したラテッ クス粒子を開示している。米国特許第４．７４５．０７５号は、β型溶血連鎖球 菌（Ｂｅｔａ　ｌｌａｅｍｏｌｙｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）を群別す るために、赤または青に染色した黄色ブドウ球菌（肛す含む市販の試験キットが 存在すると記載している。

Ｈｉｌｌｙａｒｄらの米国特許第５．０８６．００２号は赤血球凝集アッセイを 開示しており、このアッセイでは、凝集試薬が、少なくとも１種の特定分析物結 合分子に結合した少なくとも１種の赤血球結合分子から成り、赤血球結合分子は 、（直接アッセイの場合には）分析物、（間接アッセイの場合には）分析物結合 試薬の非存在下に赤血球と共にインキュベートされたときに凝集を生じない。赤 血球は好ましくは、被検血液試料に内因性である。コンジュゲート混合物及び分 析物類似体と赤血球結合分子とのコンジュゲートも凝集試薬として使用し得る。

Ｃｈａｎｇの米国特許第４．４３３．０５９号は、各抗体の特異性が変性しない ように共有結合的に「尾−尾」結合した２つの抗体を用いる凝集イムノアッセイ 試薬を開示している。一方の抗体は赤血球のような指示物質に含まれる抗原に特 異的である。

発明の概要 本発明の１つの目的は分析物（Ａ）のイムノアッセイを提供することである。イ ムノアッセイは、抗ハプテン抗体（αＨ）と、分析物に結合したハブテン（Ｈ− Ａ）と、抗分析物抗体（αＡ）とを使用する。検出のためにαＡを標識し得る。

試料中に分析物が存在しない場合、複合体【（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ月が形成 される。試料中に分析物が存在する場合、分析物は（αＡ）に対して（Ｈ−Ａ） と競合し、複合体（（αＡ　）（Ａ　）］を形成するであろう。適当なインキュ ベーション期間後、（（αＨ）（Ｈ−Ａ　）（αＡ）ｌまたは（（αＡ　）（Ａ 　）ｌの存在を検出または測定する。（（αＨ）（Ｈ−Ａ　）（αＡ）ｌの量は 試料中の分析物の量に反比例し、他方、（（αＡ　）（Ａ　）ｌの量は試料中の 分析物の存在量に正比例する。

上記アッセイは、抗ハプテン抗体が粒子、好ましくは微粒子にコートされている 凝集アッセイフォーマットで実施し得る。この場合、分離段階が不要である。複 合体（（αＨ）（Ｈ−Ａ　）（αＡ月の形成がコーテッド粒子の凝集中に肉眼で 検出できる。

本発明の別の目的は、試料中の抗体（αＡ）を検定するために、抗ハブテン抗体 （αＨ）と、アッセイ対象抗体の抗原に結合したハブテン（Ｈ−Ａｇ）と、標識 抗体（αＡ＊）とに・試料を接触させるイムノアッセイを提供することである。

もし複合体（（αＨ）（Ｈ−Ａ　ｇ　）（αＡ＊））が形成されたならば、得ら れた複合体は試料中の抗体（αＡ）の量に反比例し、残留した（αＡ＊）の量は 試料中の（αＡ）の量に正比例する。

本発明の別の目的は、試料中の抗体（αＡ）の直接凝集アッセイを提供すること であり、このアッセイでは、抗ハブテン抗体でコートされた粒子（Ｐ−αＨ）と 、ハブテンと抗体に対する抗原とのコンジュゲート（１１−Ａｇ）とに試料を接 触させる。コーテッド粒子の凝集は試料中の抗体の量に正比例する。

本発明の別の目的は、抗ハブテン抗体でコートされない粒子の添加を伴った上記 凝集アッセイを提供することである。コーテッド粒子及び非コーテッド粒子の色 は、凝集またはその欠如の可視化が強調されるような色である。

本発明の別の目的は、固相に付着させた抗ハブテン抗体を使用し且つ固相が好ま しくは粒子から成る多重分析物アッセイを提供することである。多重分析物アッ セイは競合凝集アッセイフォーマットで実施し得る。

本発明の別の目的は、上記アッセイを行うための試薬及びキットを提供すること である。

本発明の別の目的は、種々のチャンバを有しており、各チャンバが特定分析物用 試薬を収容しており、試薬が特定のアッセイ対象分析物に結合したハプテンから 成る多重分析物アッセイデバイスを提供することである。

本発明の別の目的は、凝集アッセイに使用できるように、抗ハプテン抗体でコー トされ好ましくは固定された染色赤血球を提供することである。本発明は更に、 コーテッド染色赤血球を収容した凝集アッセイキット、及び、凝集アッセイに使 用するためのコーテッド染色赤血球を含む組成物を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、分析物非存在下の抗ハプテン微粒子の凝集を示す。

図２は、分析物の存在下の凝集阻止を示す。

図３Ａ及びｌｌ３Ｂは、多重分析物アッセイデバイスの一例を示す。

図４は、抗体試験用サンドイッチアッセイフォーマットを示す。

図５は、薬物アッセイにおける陰性反応、閾値反応、陽性反応の写真を示す。

本発明は、分析物（Ａ）のイムノアッセイを提供する。イムノアッセイは、抗ハ ブテン抗体（αＨ）と、分析物に結合したハプテン（Ｈ−Ａ）と、抗分析物抗体 （αＡ）とを使用する。検出のためにαＡを標識し得る。試料中に分析物が存在 しない場合、複合体（（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）ｌが形成される。試料中に分 析物が存在する場合、分析物が（αＡ）に対して（ｌ（−Ａ）と競合し複合体（ （αＡ　）（Ａ　）ｌが形成される。

適当なインキュベーション期間後、複合体Ｉ（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡＮを非複 合化Ｈ−Ａ及びαＡから分離し、複合体（（αＡ　）（Ａ月がもしあれば該複合 体から分離する。次いで（（αＨ）（Ｈ−Ａ　）（αＡ）ｌ　または（（αＡ　 ）（Ａ　）ｌの存在を検出または測定する。（（αＨ）（Ｈ−Ａ　）（αＡ）ｌ の量は試料中の分析物の量に反比例し、他方、（（αＡ　）（Ａ月の量は試料中 の分析物の存在量に正比例する。

上記アッセイは競合アッセイフォーマットで実施でき、その場合、抗ハブテン抗 体を固相に付着させ得る。

上記アッセイはまた、抗ハブテン抗体を粒子、好ましくは微粒子にコートする凝 集アッセイフォーマットで実施しく与る。凝集アッセイでは分離段階が不要であ る。複合体（（αＩ−１）（Ｉ（−Ａ　）（αＡ）ｌの形成は、コーテッド粒子 の凝集中に肉眼で検出できる。

また、多数エピトープを含む分析物のために、抗ハプテン抗体でコートされた粒 子（Ｐ−αＨ）と、ハブテンと分析物に対する抗体とのコンジュゲート（Ｈ−α Ａ）とを用いる直接凝集アッセイも開示されている。コーテッド粒子の凝集の程 度は試料中の分析物の存在量に正比例する。

また、試料中の抗体（αＡ）を検出及び測定するために、抗ハプテン抗体（αＨ ）と、抗体に結合する抗原に結合したハプテン（Ｈ−Ａｇ）と、標識抗体（αＡ ＊）とに試料を接触させるイムノアッセイ方法も開示されている。複合体］（α １−１　）（Ｈ−Ａ　ｇ　）（αＡ＊））が形成されるならば、得られた該複合 体は試料中の抗体（αＡ）の量に反比例し、残留した（αＡ＊）の量は試料中の （αＡ）の量に正比例する。

また、試料中の抗体（αＡ）を検定するために、抗ハブテン抗体でコートされた 粒子（Ｐ−αＨ）と、ハブテンと抗体に対する抗原とのコンジュゲー）（Ｈ−Ａ ｇ）とを試料に接触させる直接凝集アッセイも開示されている。コーテッド粒子 の凝集は試料中の抗体の量に正比例する。

また、抗ハブテン抗体を使用する多重分析物アッセイ及びアツセイデバイスも本 文中に開示されている。上記アッセイすべてを実施する試薬及びキット、例えば 抗ハブテン抗体でコートされ固定された染色赤血球も本文中に開示さ本発明は、 均一型（ｈｏ膳ｏｇｅｎｏｕｓ）　、サンドイッチ、競合及び凝集アッセイフォ ーマットを含む複数のフォーマットで実施し得る。サンドイッチアッセイフォー マットまたは競合アッセイフォーマットにおいては、抗ハブテン抗体が固相に付 着でき、従って固相は、種々の分析物のアッセイに使用できる非特異的（ｇｅｎ ｅｒｉｃ）固相となる。固相材料はイムノアッセイに使用される固相材料のいず れでもよい。

天然材料、合成材料または合成的に変性された天然産材料を使用し得る。これら の材料として、多糖類、例えば、紙、セルロース、並びに、酢酸セルロース及び ニトロセルロースのようなセルロース誘導体を含むセルロース材料ニジリカ：ガ ラス繊維；失活アルミナ及び珪藻土のような無機材料、または、塩化ビニル、塩 化ビニル−プロピレンコポリマー、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーのような ポリマーから成る多孔質ポリマーマトリックス中に均一に分散したその他の微細 無機材料；天然布（例えば木綿）及び合成布（例えばナイロン）；シリカゲル、 アガロース、デキストラン及びゼラチンのような多孔質ゲル；ポリアクリルアミ ドのような高分子フィルム；磁性粒子二マイクロタイタープレート；ポリスチレ ンチューブ：タンパク質結合メンブラン；アガロース：セファデックス（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｐｉｓｃａｔ ａｖａｙ、　Ｎ、　Ｊ、　）、トリスアクリル（Ｐｏｉｎｔｅｔ−Ｇｉｒａｒｄ 、　Ｆｒａｎｃｅ）　；ケイ素粒子；多孔質繊維状マトリックスなどがある。

本発明の１つの実施態様は、アッセイ対象分析物を含む試料を、ハプテン−分析 物コンジュゲート（Ｈ−Ａ）と、特定のアッセイ対象分析物に対する抗体（抗分 析物抗体、αＡ）とに混合する競合アッセイフォーマットを提供する。

検出のために抗分析物抗体を酵素、放射性、蛍光または化学的ラベルによって標 識する。次いで、抗ハプテン抗体を付着させておいた固相に混合物を流し、複合 体（（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ月が形成される十分な時間インキュベートする。

次に、例えば非結合試薬を水性媒体に溶解させて固相から洗い落とすことによっ て非結合試薬を分離し、標識αＡを検出することによって固相上の複合体１（α Ｈ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）ｌの形成を検出する。分析物が存在しない場合には、複 合体が存在するであろう。試料が分析物を含有している場合には、分析物が標識 抗分析物抗体と結合し、複合体は存在しないかまたは複合体の量は減少する。従 って、複合体の存在量は、試料中の分析物の濃度に反比例する。代替的に、水性 媒体中に残留する非結合標識αＡの存在を検定することもできる。洗浄段階を含 む競合アッセイの実施方法は当業界で公知であり、例えばＭｏｃｈｉｄａらの米 国特許第４，１８５、０８４号を参照するとよい。競合アッセイフォーマットの 一例を後出の実施例１３に示す。

上記方法はまた、凝集アッセイにも適用し得る。現状では、種々の分析物を特に 凝集アッセイフォーマットで試験するためには各分析物毎に特定の試薬セットを 作製しなければならない。これは、製造コストを上げるだけでな（、複数分析物 を単一試験で検定することができないことになる。本発明は以下の利点を有して いる。

１）抗ハブテンでコートされた粒子（Ｐ−αＨ）は多様な試験に使用され得る非 特異的試薬である。

２）アッセイフォーマットは複数分析物試験の実施、即ち単一標本によって多数 の試験を同時に行うことを可能にする。

発明の背景の項で説明した従来技術の凝集イムノアッセイに比較して本発明は、 簡単、迅速、明瞭、経済性、感度及び特異性などの利点を与える。本発明で提供 される凝集アッセイは、結果を肉眼で検出でき、洗浄及び分離の段階を含まない 。他方、従来技術の凝集アッセイは、特定のアッセイ対象分析物に感作された粒 子を必要とし且つ複数分析物の試験ができない。本発明によれば、単一標本によ って複数分析物の試験を実施でき、また種々の試験に非特異的試薬を使用できる 。

好ましい構成を以下に説明する。

系中には４つの主要成分、即ち、抗ハプテン抗体でコートされた微粒子（Ｐ−α Ｈ）と、ハプテン−分析物コンジュゲート（Ｈ−Ａ）と、抗分析物抗体（αＡ） と、分析物（Ａ）を含有する標本とが存在する。分析物（Ａ）の非存在・下では 、複合体（（αＨ）（Ｈ−ＡＸαＡ）ｌの凝集物が形成される。この結果として 凝集が生じる（図１参照）。しかしながら分析物（Ａ）の存在下では、全部の抗 体（αＡ）が分析物（Ａ）に結合し、複合体の形成を架橋する遊離抗体（αＡ） が全く残存しない（図２参照）。従って凝集が全く生じない。即ち、陰性試料で は凝集が生じ、陽性試料では凝集が全く生じないかまたは少ない。図５は、陰性 反応、閾値反応及び陽性反応の場合の凝集量を示している。

ハブテン−抗ハブテン対合に代替して、リガンド−受容体対合、ビオチン−アビ ジン対合、相補的核酸の対合及び凝集可能な任意の対合を使用し得ることも当業 者に理解さ本発明の１つの目的はマルチチャンバ凝集デバイスで実施し得る。各 チャンバは特定分析物を検出するように特定され、特定分析物に特異的な試薬を 収容している。デバイスは好ましくは、試料／反応混合物を各チャンバに同時に 流入させチャンバ内部で反応させ得るが、１つのチャンバ内の反応混合物の逆流 及び別のチャンバの反応混合物との混合を阻止する。

所与の分析物（Ａｘ）の試験には、特異的コンジュゲート（Ｈ−Ａｘ）及び抗Ａ ｘ抗体（αＡｘ）が必要である。しかしながら、この試験フォーマットではコー テッド粒子（Ｐ−αＨ）が全部の分析物に共通であり、系の非特異的試薬となる 。

多重分析物アッセイ用に、分析物特異的成分（Ｈ−Ａｘ）または（αＡｘ）の一 方または双方をマニホールドチャンバデバイス内の各分析物用チャンバのそれぞ れにプレパッケージし得る。好ましいデバイスは、１９８７年１２月２３日出願 のＰａｒｓｏｎｓ、　Ｒ，Ｇ、らの米国特許出願第１３８．２５３号、［凝集反 応デバイス（Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｄｅｖｉｃｅ） Ｊ　；１９９０年１１月１６日出願のＦｏｒｎｅｙ、　Ｒ，Ｊ、らの米国特許出 願第６１４．７６２号、「選択的に含浸させた材料を使用する改良された凝集反 応デバイス（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　Ｄｅｖｉｃｅ　 ｔｌｔｉｌｉｚｉｎｇ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　Ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ　Ｍ ａｔｅｒｉａｌ）Ｊ　；１９９０年１１月１６日出願のＲｏｐｅｌｌａ、　Ｐ、 　Ｊ、らの米国特許出願第６１４．８９５号、［多孔質吸着材料を利用する改良 された凝集反応デバイス（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　Ｒ ｅａｃｔｉｏｎ　Ｄｅｖｉｃｅ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｐｏｒｏｕｓ　Ａｂｓｏ ｒｂｅｎｔＭａｔｅｒｉａｌ）Ｊ　：及び１９９０年１１月１６日出願のＰａｒ ｓｏｎｓ、　Ｒ，Ｇ、らの米国特許出願第６１４，８１７号、「幾何学的に修正 されたチャンバを有する改良された凝集反応デバイス（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ａｇ ｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｄｅｖｉｃｅ　ｌｌａｖｉｎｇ　 Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｃｈａｍｂｅｒｓ）Ｊなどに 開示されている。これらの特許出願は参照によって本明細書に含まれるものとす る。

これらのマルチチャンバデバイスの一例が図３Ａ及び３Ｂに示されている。これ らの図はマルチチャンネルデバイスの２つの図面を示している。好ましくは各チ ャンネル内部に異なるハブテン−分析物コンジュゲート（ｉ−１−Ａ）が収容さ れている。各チャンバ内のコンジュゲート（Ｉ（−Ａ）は、該特定チャンバ内で 検出すべき特定分析物を含む。競合アッセイでは、チャンバの底部を上記の固相 材料のいずれかから作製し得る。デバイスは、試料の一部分を各チャンバに導入 し、コンジュゲートと混合して混合物を形成し、しかも混合物が別のチャンバに 流入することを阻止する手段を有している。同様に、デバイスは、固相に結合し た複合体から非結合試薬を分離し得る手段も含み得る。例えば、分離段階として 洗浄を使用するならば、デバイスは同様に、洗浄液を各チャンバに流入させ、非 結合試薬を伴って各チャンバから排出させるが、非結合試薬を伴う洗浄液を別の チャンバに流入させない。この最後の目的を果たすために、１つのチャンバの試 料混合物を別のチャンバから分離するような同様の手段を使用してもよい。

代替的に、後出の実施例１３で説明するように、そのウェルに抗ハプテン抗体を 結合させた単一のマイクロタイタープレートを使用して競合アッセイフォーマッ トを実施することもできる。

最も好ましい実施態様では、多重分析物アッセイに凝集フォーマットを利用する 。試料混合物を導入する前に、Ｈ−Δコンジュゲートを水溶液に溶解し、各チャ ンネルの底部に滴下して乾燥させる。後出の実施例１０参照。標本と、コーテッ ド粒子（Ｐ−αＨ）と複数の（αＡｘ）とを含む混合物を試料充填ゾーンに導入 する。混合物の一部分が個々のチャンネルに流入するので、各チャンネル内で特 異的コンジュゲートと混合して完全な反応混合物を形成する。抗ハプテン抗体で コートされた微粒子と、ハブテン−分析物コンジュゲートと、抗分析物抗体との 混合によって反応混合物が完成するまでは凝集反応が開始しない。種々のハブテ ン−分析物コンジュゲート（Ｈ−Ａｘ、　Ｈ−Ａｙ、　Ｈ−Ａｚ、、、）を各チ ャンネルに入れ、微粒子と混合した抗分析物抗体（αＡｘ、αＡＭ、αＡｚ、、 、）のカクテルを使用することにより、分析物Ｘ　Ｎ　Ｖ　ｓ　Ｚなどの個別の 同時的アッセイが各チャンネルでそれぞれ生じるであろう。種々の分析物に関す る試験結果は、特異的ハブテン−分析物コンジュゲートを収容した個々のチャン ネルで判明するであろう。

試験構成の代替形も実現可能である。すべての変形はパネル試験フォーマットま たは単一試験フォーマットとして設計し得る。

アッセイの諸成分の例を以下に示す。

Ａ１分析物 分析物の例は、テストステロン、ステリオール（５ｔｅｒｉ。

ｌ）、プロゲステロン、コルチロステロン、アルドステロンのようなステロイド ；チロキシン及びトリョードチロニンのようなチロイドホルモン；ブラジキニン 、アンギオテンンン、チロイドホルモン放出ホルモン及び黄体形成ホルモン放出 ホルモンのような生理活性ペプチド；エピネフリン、ノルエピネフリン、ヒスタ ミン及びセロトニンのような生理活性アミン：プロスタグランジンなどの低分子 量物質、インシュリン、グルカゴン、副腎皮質刺激ホルモン及びガストリンなど の比較的低分子量の物質、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、成長ホルモン、ヒト胎盤 性ラクトゲン、免疫グロブリンＥ１α−フェトプロティン、肝炎Ｂ抗原などの高 分子量物質である。分析物はハブテン、抗原または抗体であってもよい。抗原の 例としては、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）抗原、腫瘍特異抗原、細胞または 組織の抗原及び血清抗原のような微生物抗原もある。分析物は好ましくは、治療 薬、乱用薬物及び毒素のような小分子である。

Ｂ　粒子及びそのコーティング方法 粒子は好ましくは微粒子、即ち補助的なシグナル生成試薬の使用を要せずに試験 試料中の分析物の存在または濃度を直接肉眼で読取りることかできる肉眼検出可 能な着色微粒子である。このような粒子として使用できる材料は、金のようなコ ロイド金属、及び、米国特許第４．３１３．７３４号及び第４．３７３．９３２ 号に開示されている染色粒子である。コロイドセレン粒子のような非金属コロイ ドの調製及び使用は、１９８７年７月９日出願の共同所有及び同時係属中の米国 特許出願第０７２．０８４号に開示されている。該特許出願は参照によって本明 細書に含まれるものとする。有機ポリマーラテックス粒子も使用できる。これら は、１９８８年９月２３日出願の共同所有及び同時係属中の米国特許出願第２４ ８．８５８号に開示されている。該特許出願は参照によって本明細書に含まれる ものとする。その他の、天然または有機ポリマーの粒子も使用できる。別の好ま しい粒子は、凝集し得る細胞、例えば赤血球、好ましくはＤｕｒａｃｙｔｅ７Ｍ 細胞（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ｌ１ｌｉｎｏｊｓ）のような固定 赤血球である。

赤血球をどのように固定（即ち安定化）できるかの−例が、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎす ｏｇ７．２−００（３）：６４１（１９８８）に示されている。粒子が凝集能力 を有し且つこのような凝集が肉眼検出できる限り、特定粒子の選択が必須ではな い。

抗ハブテン抗体は、公知方法を用いた共有結合及び／または吸着を介して粒子に 付着する。例えば、ラテックス粒子のような粒子は抗体によって受動的にコート され得る（Ｈａｄｆｉｅｌｄら、Ｊ、　Ｉｍｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、前出）。後 出の実施例に開示されたセレン粒子に抗体をコーティングする方法はまた、金粒 子のような別の金属粒子にコートするためにも使用できる。代替方法としては、 ５ｅｎｏの米国特許第５．０７５．１００号に開示された鉄コロイド標識抗体の 調製方法を参照するとハブテンは、通常はタンパク質に結合されたときに実験用 動物中で免疫応答を誘発し得る任意の小分子である。好ましくは、ハブテンだけ が１つの抗原部位を有する。これらのハブテンの例は、フルオレセイン、ローダ ミン、ビオチン及びジニトロフェニル基である。抗／Ｎブテン抗体は当業界で公 知の方法で産生でき、抗体はポリクローナル抗体てもよくモノクローナル抗体で もよい。ポリクローナル抗体は例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、マウスなどのよ うな宿主動物にハブテンを注射することによって産生じ得る。

注射以前に、ハブテンを先ず笠貝（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）　ヘモノア ニンまたはウシ血清アルブミンのような担体と結合させ得る。モノクローナル抗 体は例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　Ｍｕｌｓｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ、　２５６：４９５−４９７（１９７５）に記載された方法に従っ て産生じ得る。抗体はまた、例えばＲｅａｄ　ｉ　ｎｇの米国特許第４．４７４ ．８９３号またはＣａｂｉｌｌｙらの米国特許第４．８１６．５６７号に開示さ れた方法に従って産生された組換えモノクローナル抗体でもよい。Ｆａ　ｂ、Ｆ （ａ　ｂ’）２及びＦｖフラグメントにような抗体フラグメントも抗体の範囲に 包含される。かかるフラグメントは公知技術によって産生され得る。

Ｄ、ハブテン−分析物コンジュゲート 日常的に検定される分析物に対しては、フルオレセイン−分析物コンジュゲート のようなハブテン−分析物コンジュゲートが市販されており、例えばＡｂｂｏｔ ｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ’ＴＤＫ’ｓ　ＦＰＩ＾（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、ＩＬから市販）中のトレーサー として使用されている。ハブテン−分析物コンジュゲートはまた、ｆａｎｇらの 米国特許第４．６６８．６４０号に開示されたような当業界で公知の方法に従っ て産生され得る。

いかなる分析物にも使用できるアッセイフォーマットの例を以下に示す。

ａ、競合アッセイ（図１及び２） 免疫反応の構成員は、抗ハブテン抗体でコートされた微粒子と、ハプテン−分析 物コンジュゲートと、抗分析物抗体と、標本とから成る。

試験では、標本中の分析物が抗分析物抗体に対してハプテン−分析物コンジュゲ ートと競合する。標本中に存在する分析物が多いほど凝集用の抗分析物抗体が少 なく、またその逆もある。従って、観察される凝集は標本中の分析物濃度に反比 例する。

ｂ、抗体の直接サンドイッチアッセイ 同様にして、抗体（Ａｂ）を試験するように構成を設計することもできる。従っ て、当該抗体が分析物となる。抗ハブテン抗体でコートされた微粒子（Ｐ−ｖＨ ）と、当該抗体の特異性の対象である抗原とハプテンとのコンジュゲート（Ｈ− Ａｇ）とを、試料に混合する。試料中の抗体の濃度は、複合体＋（Ｐ−αＨ）（ Ｈ−Ａ　ｇ　）（Ａ　ｂ　）ｌの形成によって生じ凝集の量に正比例する（図４ 参照）。

Ｅ、染色粒子及び染色方法 本発明はまた、凝集プロセスの可視化を強調するための染色赤血球、好ましくは 固定された染色赤血球を提供する。

Ｈａｄｆｉｅｌｄらの米国特許第４．７４５．０７５号の第３欄には、凝集アッ セイで使用される染色赤血球が示唆されている。該特許は、米国特許第４．４１ ９．４５３号及び独国特許出願ＤＴ−３０００−４８３号に見られるような標準 方法に従って赤血球を調製または染色できること、及び、特に適当な色は赤、黄 、青、緑、黒、青緑（シアン）、深紅（マゼンタ）及び白であることを指摘して いる。

本発明は、例えば赤、緑または青に染色できる赤血球を提供する。染色赤血球、 好ましくは市販のＤｕｒａｃｙｔｅＴ′′細胞のような固定赤血球を抗体でコー トすることができ、抗体はその抗原結合能を維持しており染色赤血球を凝集させ る。

染色粒子は同等の性能の非染色対応物よりも低い濃度で使用され得る。好ましく は、染料が細胞に強固に付着し、周囲のアッセイ溶液中に浸出しない。固定赤血 球のような細胞用の好ましい染料は、シバクロムブルー（Ｃｉｂａｃｈｒｏｍｅ 　Ｂｌｕｅ）　３　Ｇ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ 、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）　；リアクティブレンド（１？ｅａｃｔｉｖｅ　Ｒｅ ｄ）　、リアクティブグリーン（Ｒｅａｔｉｖｅ　Ｇｒｅｅｎ）　、リアクティ ブイエｏ　−（Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｙｅｌｌｏｗ）などのような５１ｇ１ａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、のりアクティブカラーシリーズ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ　 Ｃｏ１ｏｒ　５ｅｒｉｅｓ）　ニジアゾニウム染料（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋＋１ ｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのファーストブラック（Ｆａｓｔ　Ｂ ｌａｃｋ）　Ｋ、ファーストブルー（Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ）　Ｂなど）、ヨード アセトアミドまたはマレイミドカップリング作用を有する有機染料（例えばロー ダミンヨードアセトアミド、ローダミンマレイミド、エオシンヨードアセトアミ ド、ニオノンマレイミド、テトラメチルローダミンマレイミド、及びテトラメチ ルローダミンヨードアセトアミド）である。

固定赤血球の場合、上記染料の重要な特徴は、染料結合に利用可能な遊離アミノ 基を赤血球が全くまたはほとんど有していないのでアミノ基以外の官能基を介し て赤血球に結合することである。最も好ましい染料は、赤血球好ましくは固定赤 血球に共有結合する染料である。種々の粒子の色強度は、凝集及びその欠如が十 分に識別できるような均合であるのが好ましい。

染色された粒子は、上記凝集アッセイにおいて多重アッセイを実行するために（ 異なる色の）２種以上の粒子集団を混合し得る場合に使用し得る。異なる着色粒 子がほぼ等しい量で存在するのが好ましい。粒子集団のいずれか一方との反応に よって溶液の色が全体的に変化し、この変化は肉眼で容易に観察できる。非特異 的抗ハブテン粒子を使用する多重分析物アッセイフォーマットにおいては、別の 着色粒子、例えば異なる着色のラテックス及びプラスチックの粒子を使用し得る 。これは、ヒトの試験読取り能力を顕著に強化し、複数の試験の同時処理を可能 にする。従って本発明は、個別のアッセイ及び対照の各々を別個に処理する必要 があり時間及び労力の増加を招〈従来技術を凌駕する利点を有している。

クーマノ−ブリリアントブルーＲ−２５０による固定ヒト赤血球の染色 固定ヒト赤血球（Ｄｕｒａｃｙｔｅ”、＾ｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓＳ煎出）を、０．１Ｍのクエン酸緩衝液、ｐＨ３，０に最終濃度５％（Ｖ　／ Ｖ　）で懸濁させた。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０染料（Ｂｉｏｒ ａｄ　Ｌａｂｓ、、Ｒｉｃｈｓｏｎｄ、Ｃ＾）を最終濃度０゜５％（Ｗ／Ｖ）ま で添加し、細胞を室温で１．５時間インキュベートした。最後に、上清の残留色 がほとんどな（なるまで遠心（１００ＯＸＧ、１分）とリン酸塩緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ、１０ｍＭのリン酸ナトリウムと０．１５ＭのＮａＣ１、ｐＨ７，４） による洗浄とを細胞に対して交互に行った。

得られた細胞懸濁液は暗紫色を有していた。

実施例２ シバクロンブルー３０Ａによる固定ヒト赤血球の染色５０ｍＭのＮａＯＨ中のＤ ｕｒａｃｙｔｅ”細胞の１０％懸濁液を調製した。シバクロンブルー３　Ｇ　Ａ 　（Ｓｉｇｓａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を最終濃度５０ｍｇ／ｍｌまで懸濁液に添加 した。懸濁液を室温で１．５時間混合した。実施例１と同様に細胞を遠心し洗浄 した。得られた細胞懸濁液は暗青色を有していた。

実施例２に記載の手順を使用しりアクティブレッド２（ＳｉｇＩＩｌａ　Ｃｈｅ ＋ｅｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いてＤｕｒａｃｙｔｅ” 細胞の１０％懸濁液を染色した。得られた細胞懸濁液は赤色を抗フルオレセイン による固定ヒト赤血球のコーティングｐＨ４，０の０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩 衝液中の０．０５％（Ｗ／Ｖ）の塩化クロムの存在下に１００μｇ／ｍｌの濃度 の親和性精製ウサギ抗フルオレセインでＤｕｒａｃｙｔｅ”細胞の１０％（Ｖ／ Ｖ）懸濁液をコートした。反応試験管を倒立させることによってときどき撹拌し ながら懸濁液を３０℃で１時間インキュベートした。遠心（１０００ｘＧ、１分 ）後、細胞を８倍容のＰＢＳで２回洗浄し、次いで２５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ 緩衝液（ｐＨ８，０）中の１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇ＋ｓａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に室温で３０分間イ ンキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ（実施例１参照）中で最終細胞濃度１ ０％（Ｖ／Ｖ）に再懸濁さ抗フルオレセインによるコロイドセレンのコーティン グ（前出の米国特許出願第０７２．０８４号に記載の方法に従って調製された） 約５７ｍ１の保存セレンコロイド（ＯＤ５５０１２．３）を７５０ＸＧで２５分 間遠心した。軟質ペレットを２０ｍ１のＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 　Ｃｏｒｐ、　、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍ＾）に懸濁させた。遠心及び再懸濁を ２回繰り返した。０．２％の炭酸ナトリウムによって４００ｍ１のＭｉｌｌｉ− Ｑ水のｐｌｌを７８に丁寧に調整した。ｐＨ７，８の溶液に約８．７ｍ１（ＯＤ ５５０＝６８８）のセレンを添加した。次いで、Ｑ、５ｍｇのプロティン−Ａ精 製ウサギ抗フルオレセインＩｇＧをセレン懸濁液に添加した。これを２〜８℃で 一夜穏やかに撹拌した。ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ、　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を濃度０．５％ま で懸濁液に添加した。撹拌をさらに２時間継続した。混合物を上記同様に遠心に よって洗浄した。最終遠心後、ペレットを０．１％のＢＳＡ、５ｍＭの）（ＥＰ ＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチルコピペラジン−Ｎ’　−［２−エタンスルホ ン酸］、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ■１ｃａ１．　Ｃｏ、　、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、 　ＭＯ）、ｐ　Ｈ７、８に懸濁させ、１５μｍを１ｍｌの水に希釈すると０Ｄ５ ５０は２．０であった。

これを２〜８℃で保存した。

実施例６ 抗フルオレセインによるコロイドポリピロールのコーティング ］、　ｍ　Ｉの保存ポリピロール（ＰＰ）、　〜３５０　０Ｄ８００／ｍ１を水 （１ｍｌ）と共に１１００Ｏｘで各５分間ずつ３回遠心することによって洗浄し た（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｃｏ、　、　Ｎｅｅｄ ｈａｍ　Ｈｅｉｇｈｔ、　Ｍ＾）。約２００〜３００μＩの洗浄ＰＰを、０．５ ｍｌの２５０ｍＭのＭ　Ｅ　Ｓ　（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸、 　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ｐＨ７ ，０と、４．５ｍｌの水と、１０〜２５０μｇのプロティン−Ａ精製ウサギ抗フ ルオレセインＩｇＧとに１０分間混合した。ＢＳＡを濃度０．０５％まで混合物 に添加した。懸濁液を更に１０分間撹拌した。次いで、調製物を、（１ｍｌの） ０．５％ＢＳＡ、３５ｍＭのＭＥＳ。

ｐＨ７，０で３回洗浄した。最後に混合物を５０μｌの同じ緩衝液に懸濁させた 。

実施例７ コカイン代謝物質（ベンゾイルエコゲニン）用の固定ヒト赤血球抗フルオレセイ ンアッセイ １ｍｌの抗フルオレセインコーテッドＤｕｒａｃｙｔｅ”細胞（実施例４参照） を３ｍｌのＤＵｒａｃｙｔｅ緩衝液（０，０６７Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８ ，０ｓ　０．７５Ｍ（７）ＮａＣ］、２２０ｍのＥＤＴＡ（，１チレンジアミン 四酢酸、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｓｔｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　 ｌｌｌ０）、１．５％のウシ胎仔血清、６％の両性電解質（Ｐｈａｒｏ＋ａｃｉ ａ　ＩＪＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、及び、０．１ ％のナトリウムアジドに再懸濁させた。このアッセイのために、２５μｍの上記 抗フルオレセインＤｕｒａｃｙｔｅ１細胞と、５μｍのヒツジ抗コカイン坑血清 と、１０μｍの尿標本と、５μｍの希釈フルオレセイン−コカインコンジュゲー ト（０，１５ＭのＮａＣｌで２倍に希釈したＴＤｘコカイントレーサー；トレー サーはＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬより市販されているＴＤｘ　Ｃｏｃａｉｎｅ 　Ｍｅｔａｂ。

１ｉｔｅｓ　Ｋｉｔから得られた）とを、吸引及び吐出の繰り返しによって混合 し、次いで積層型試験カード（前出の係属中の米国特許出願第０７／６１４．８ ４７号の実施例１に開示されたカードと同様のカードであるが、ここで使用され た各カードは１０個の反応チャンネルを含んでいた）に加えた。５〜１０分以内 に試験カードの観察領域で陽性結果または陰性結果の指標となる凝集パターンを 肉眼で検査した。観察ゾーンにおける顆粒状の凝集パターンは試料中にコカイン （ベンゾイルエコゲニン）が存在しないことを示す（陰性結果）。

ベンゾイルエコゲニンを含む試料を使用したときはいかなる凝集も生じない均一 なパターンが観察された（陽性結果）。

２０個の既知のベンゾイルエコゲニン陽性試料と１８個の陰性試料とを試験した 。全部の陽性試料が陽性結果を与え、全部の陰性試料が陰性結果を与えた。

アヘン剤、カンナピノイド（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ）　、アンフェタミン及び フェンンクリジン用の試験も同様に構成した。

各分析物毎の既知の陽性試料及び陰性試料はすべて、それぞれに対応する陽性結 果及び陰性結果を与える。

フェンシフリジン−フルオレセインコンジュゲート（ＴＤｘＰＣＰ　Ｒｅａｇｅ ｎｔ　Ｋｉｔ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｉｉｌ朋からのｐｃ Ｐトレーサー）を抗フルオレセインコーテッドセレン（実施例５参照）の保存調 製物と濃度０．０４％（％）で混合した。

３０μｌの混合物を４つの試験管の各々に分は入れた。０．２５．６０及び１２ ０ｎｇ／ｍｌのフェンシフリジンを含有する５μｍの尿試料を各試験管に添加し た。次いで５μｍの抗フェンシクリジン抗体（ＴＤｘ　ＰＣＰ　Ｒｅａｇｅｎｔ 　Ｋｉｔ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、前出、からのＴＤｘＰＣ Ｐ坑血清）を添加した。室温で〜８分後、１ｍｌの水を各試験管に添加した。混 合物を渦流させ、５５０ｎｍ（ナノメーター）の光学密度を測定した。以下の結 果が得られた。

フェンシフリジン濃度（ｎｇ／ｍｌ）　ＯＤ　５５００　０．２０７ ２５　０．５１５ ６０　０．７５８ １２０　０．８２３ アヘン剤、カンナピノイド、コカイン及びチロキシン（Ｔ４）用の試験も同様に 構成したが、Ｔ４の場合だけは尿試料の代わりに血清を使用した。結果はいずれ も、分析物の濃度増加に伴って０Ｄ５５０が増加することを示した。

チロキシン用のポリピロール−抗フルオレセインアッセイ２つの試験管の各々に 、７μｍの抗フルオレセインコーテッドポリピロール（実施例６参照）と、血清 中濃度がそれぞれＯｕ　ｇ／ｍ　１及び０　、２４　Ｉｔ　ｇ　／　ｍ　Ｉの２ μｌのチロキシン用準と、１．５μｌのＴＤｘフルオレセイン−チロキシントレ ーサーと、１０μｍの抗チロキシン坑血清（ＴＤｘＴｈｙｒｏｘｉｎｅ　Ｋｉｔ 、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、前出）とを混合した。室温で１０ 分間インキュベーション後、反応混合物を１ｍｌの水でクエンチングした。双方 の混合物について８ＱＱｎｍの光学密度を測定した。結果を以下に示す。

０゜２５　３．７３ 積層型反応カード（反応カードは実施例７に記載されている）の別々のチャンネ ルに、コカイン代謝物質、アヘン剤及びＰＣＰ用のＴＤｘアッセイキット（＾ｂ ｌ）□ｉｉ　１ａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ、　［ｔＢ）の各々から得られたＴＤｘフルオレセイン−薬物トレーサ ー溶液のアリコート（１μｌ）を入れて乾燥させた。これらの試薬スポットを反 応チャンネルの狭い真直ぐな部分に配置した。同じ３つのアッセイキットの各々 から得られた３つの抗血清溶液（ＴＤｘ試薬キットから得られた抗血清溶液）を 各２０μｌと、１６μｍの抗フルオレセインコーテッド青色ＤｕｒａｃｙｔｅＴ Ｍ細胞（実施例２及び４）の１０％懸濁液と、６４μＩのＤｕｒａｃｙｔｅ緩衝 液（実施例７）とを混合することによって抗血清カクテルを調製した。このカク テル（１４０μｍ）を、４０μｍの正常（薬物非含有）の尿試料と混合し、得ら れた溶液の４５μｍのアリコートを積層型反応カードに添加し、各々が３つのト レーサーのそれぞれを収容したチャンネルに（毛細管作用を介して）流入させた 。３つのチャンネルの各々において５分以内に強力な凝集パターンを観察した。

ベンゾイルエコゲニン、モルヒネまたはＰＣＰのいずれかを種々の濃度で含有す る試料を用いてこの実験を繰り返した。結果を以下の表に示す。

反応番号 １、２　３　４　５　６　７　８ へンゾイル　０　１６７０　０　０　１６７０　１６７０　０　１６７０モルヒ ネ　０　０　３３０　０　３３０　０　３３０　３３０ＰＣＰ　Ｏ００１６７０ １６７１６７１６７）１ｔ−チャンネル内の凝集 どの場合にも、所与の薬物（ベンゾイルエコゲニン、モルヒネまたはＰＣＰ）が 試料中に存在するときは、当該薬物に対応するトレーサーを収容した反応カード チャンネル内の凝集反応は阻止された。所与の薬物の存在は別の薬物用トレーサ ーを収容したチャンネル内の凝集反応には全く影響しなかった。

実施例１１ 肝炎８表面抗原（ＨＢｓＡｇ）による固定ヒト赤血球のコーティング 実施例４に記載の手順を使用し、シバクロンブルー３６Ａで染色した固定ヒト赤 血球（実施例２参照）を最終濃度１２０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＨＢｓＡ ｇでコートした。コーテッド細胞をｏｕｒａｃｙｔｅ緩衝液（実施例７）に最終 濃ｒｆｌＯ％（Ｖ　／　Ｖ　）で懸濁させた。これらの細胞（２５μｌ）を、１ ２ｎｇ／ｍｌのＨＢ　ｓ　Ａ　ｇを含有する２５μｍの血清またはＨＢｓＡｇ非 含有の血清（２５μｌ）と混合し、積層型反応カード（実施例７）のチャンネル に添加した。ＨＢｓＡｇ含有血清と混合された細胞は強力な凝集物を形成したが 、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ非含有の血清と混合した細胞は凝集しな＋Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　 ｇ用の特異的カラーコード化アッセイ等容量の赤く染色した（非コーテッド）Ｄ ｕｒａｃｙｔｅ”細胞（実施例３）と青く染色した（抗ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇコーテ ッド）ＤｕｒａｃｙｔｃｌＭ（実施例１１）とを混合した。得られた懸濁液は、 暗灰色または黒色を有していた。この混合ＤｕｒａｃｙｔｅＴＭ細胞懸濁液を実 施例］１に記載したような２５　ｎ　ｇ／ｍ　ｌのＨＢｓＡｇを含有する血清試 料またはＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ非含有の血清試料と混合した。ＨＢｓＡｇ含有試料に おいては、青いＤｕｒａｃｙｔｅ１Ｍ細胞が凝集し、（凝集しない赤いＤｕｒａ ｃｙｔｅＴｌ″細胞から成る）淡紅色背景に対比して明瞭に観察された。ＨＢｓ Ａｇ非含有の試料においては、灰色懸濁液が均一色で維持されており凝集の徴候 は出現しなかった。

実施例１３ 親和力精製抗フルオレセインを緩衝液（１０ｍＭ１７）Ｔ　ｒｉ　５−ＨＣＩ、 ｐＨ９，０，１５０ｍＭのＮａＣｌ）ｉ：よって最終濃度５０μｇ／ｍ　Ｉに希 釈する。この材料の１００μｌのアリコートを９６ウエルのマイクロタイタープ レートの各ウェルで３７℃で１２時間インキュベートする。次いで、未結合の抗 フルオレセインをウェルがら吸引し、０゜１％のＢＳＡを含有する１００μｍの ＰＢＳでウェルを５回洗浄する。この時点でマイクロタイタープレートのウェル は、吸着された抗フルオレセインの不溶性コーティングを有している（コーテッ ドマイクロタイタープレート）。

既知量のフェンシフリジン（ＰＣＰ）と、ＰＣＰ−フルオレセインコンジュゲー トと、アルカリホスファターゼ標識抗ＰＣＰ抗体とを含有する尿試料混合物（１ ００μｌ）を、ウェルに添加し、第一ウェルが遊離ＰｃＰ非含有、第二ウェルが ２５ｎｇ／ｍｌのｐｃｐ含有、第三ウェルが２５０ｎｇ／ｍｌのＰｃＰ含有とな るようにする。マイクロタイタープレートを３７℃で１時間インユベートし、各 ウェルの内容物を吸引し、０．１％のＢＳＡを含有する１００μｍのＰＢＳでウ ェルを５回洗浄する。各ウェルに１００μｌのアルカリホスファターゼ基質試薬 （Ｓｉｇｍａ　１０４　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、１０分 間のインキュベージコン後、ＰＣＰ非含有のウェルは黄色に発色し、ＰＣＰの濃 度増加に伴って色の量が減少することが観察される。このアッセイでは、発色量 が試料中のＰＣＰの量に反比例する。

別の薬物（アヘン剤、アンフェタミン、など）に対する同様のアッセイを、同じ コーテッドマイクロタイタープレートの別のウェルにおいて、上記の例で使用し たＰＣＰ−フルオレセイン及び酵素標識抗ＰＣＰに代えて、薬物の特異的フルオ レセインコンンユゲートとそれぞれの酵素標識抗体対との混合物を含有する試料 を添加することによって行った。

実施例１４ アンフェタミン、カンナピノイド、コカイン、アヘン剤及びＰＣＰ用のフルオレ セイン−薬物トレーサー溶液（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、前出 、から入手し得るそれぞれのＴＤＸアッセイキット）のアリコート（１゜５　ｕ 　Ｉ　）を積層型反応カードのチャンネル２〜６に入れて乾燥させる（図３Ａ及 び３Ｂはカードの２つの図を示す）。陰性対照として、ＰＨ３中で０．５ｍｇ／ ｍｌに希釈した別の１．μｌのフルオレセイン標識Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を各カードのチャンネル １に添加する。陽性対照として、各カードのチャンネル７を乾燥試薬非添加で維 持する。実施例１０に記載のごとく抗フルオレセインコーテッドＤｕｒａｃｙｔ ｅ細胞との抗血清カクテルを調製するが、カンナピノイド及びアンフェタミンに 対する抗血清を更に添加する。この抗体カクテルの２００μｍの試料を２０μｌ の正常（薬物非含有）ヒト尿と混合し、次いで反応カードの中央に導入する。液 体は各チャンネルに同時に流入し、各チャンネル内の乾燥試薬と混合する。５分 後、凝集細胞の出現がチャンネル１〜６で明瞭に観察される。チャンネル１は陽 性反応対照を示し、陰性または陽性のいずれの試料を処理したかに関わりなく陰 性アッセイに類似の反応を示す。チャンネル２〜６はチャンネルに置かれた個々 の薬物トレーサーに対応して５つの薬物（アンフェタミン、カンナピノイド、コ カイン、アヘン剤及びＰＣＰ）の各々に対する個別の反応を生じる。チャンネル ７にはトレーサーまたはその他の試薬が全く存在しないので、このチャンネルの Ｄｕｒａｃｙｔｅ細胞は凝集せず、従って陽性反応対照を与える。

本明細書で言及したすべての刊行物及び特許出願は、それぞれを個別に参照によ って本発明に包含されると明記したと同等に参照によって本発明に包含される。

上記では本発明を明瞭に説明し理解を容易にするために実例及び実施例によっで ある程度詳細に記載したが、当業者の技術的知識を越えない多様な修正及び変更 が請求の範囲に包含されると考えられることは明らかであろう。本明細書に記載 した基本発明の明らかな変更と解釈される将来の技術的進歩も請求の範囲内に包 含される。

特表平７−５０６１８５　（１５） ＦＩＧ、　３Ａ ＦＩＧ、　３Ｂ 陰性反応　しきい値　陽性反応 ＦＩＧ、　５ フロントページの続き （７２）発明者　ユニ、ビンセント・ティーアメリカ合衆国、イリノイ・６００ １５、ディアフィールド、サミット・ドライブ・８７０

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の分析物（Ａ）を検出または定量するために、（ａ）抗分析物抗体（ αＡ）と、抗ハプテン抗体（αＨ）と、ハプテン−分析物コンジュゲート（Ｈ− Ａ）と、試料とを、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝から成る複合体及び｛（α Ａ）（Ａ）｝から成る複合体が形成され得る十分な時間接触させ、（ｂ）（αＡ ）、（Ｈ−Ａ）及び｛（αＡ）（Ａ）｝から複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ ）｝を分離し、 （ｃ）｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝または｛（αＡ）（Ａ）｝の存在を検出 及び測定する段階から成り、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝の量が試料中の分 析物の量に反比例し、１（αＡ）（Ａ）１の量が試料中の分析物の存在量に正比 例することを特徴とするイムノアッセイ方法。
2. ２．抗分析物抗体を標識することを特徴とする請求項１に記載のイムノアッセイ 方法。
3. ３．抗ハプテン抗体を固相に付着させることを特徴とする請求項２に記載のイム ノアッセイ。
4. ４．ハプテン−分析物コンジュゲートと抗分祈物抗体とか液相であることを特徴 とする請求項３に記載のイムノアッセイ方法。
5. ５．分析物が、低分子量物質、比較的低分子量の物質、及び、高分子量物質から 成るグルーブから選択されることを特徴とする請求項１に記載のイムノアッセイ 方法。
6. ６．試料中の分析物（Ａ）を検出または定量するために、（ａ）抗分析物抗体（ αＡ）と抗ハプテン抗体（αＨ）とハプテン−分析物コンジュゲート（Ｈ−Ａ） と試料とを、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝から成る複合体か形成され得る十 分な時間接触させ、 （ｂ）｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝の存在を検出及び測定する段階から成り 、｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（αＡ）｝の量が試料中の分析物の量に反比例すること を特徴とするイムノアッセイ方法。
7. ７．抗ハプテン抗体で粒子をコートし、粒子の凝集が｛（αＨ）（Ｈ−Ａ）（α Ａ）｝の存在の指標となることを特徴とする請求項６に記載のイムノアッセイ方 法。
8. ８．抗ハプテン抗体でコートされない第二粒子を更に含んでおり、コートされた 粒子及びコートされない粒子の各々が異なる色を有しており、非コーテッド粒子 の色はコーテッド粒子の色とは異なる色であり、 凝集の非存在はコーテッド粒子と非コーテッド粒子との混色によって検出され、 凝集の存在は背景の非コーテッド粒子の色に対比する凝集コーテッド粒子の色に よって検出されることを特徴とする請求項７に記載のイムノアッセイ。
9. ９．ほぼ等しい数のコーテッド粒子と非コーテッド粒子とを使用することを特徴 とする請求項８に記載のイムノアッセイ方法。
10. １０．粒子が微粒子であることを特徴とする請求項７に記載のイムノアッセイ方 法。
11. １１．粒子が、細胞、ラテックス微粒子、プラスチック微粒子、セレン微粒子、 鉄微粒子及び金微粒子から成るグループから選択されることを特徴とする請求項 ７に記載のイムノアッセイ方法。
12. １２．細胞が染色赤血球であることを特徴とする請求項１１に記載のイムノアッ セイ方法。
13. １３．分祈物が、低分子量物質、比較的低分子量の物質、及び、高分子量物質か ら成るグループから選択されることを特徴とする請求項６に記載のイムノアッセ イ方法。
14. １４．分析物が、ハプテン、抗原及び抗体から成るグループから選択され、前記 ハプテンは粒子にコートされた抗ハプテン抗体によって認、識されるハプテンま たはハプテン−分析物コンジュゲート中のハプテンと同じではないことを特徴と する請求項１３に記載のイムノアッセイ方法。
15. １５．分析物が、薬物、毒素、ビタミン、ホルモン、微生物抗原、細胞性抗原、 組織抗原、アレルゲン及び酵素から成るグループから選択されることを特徴とす る請求項１４に記載のイムノアッセイ方法。
16. １６．薬物が、乱用薬物または治療薬であり、フェンシクリジン、アヘン剤、カ ンナピノイド、アンフェタミン、コカイン及びステロイドから成るグループから 選択されることを特徴とする請求項１５に記載のイムノアッセイ。
17. １７．試料中の抗体（αＡ）の存在及び量を検出及び測定するために、 （ａ）抗ハプテン抗体（αＨ）と、抗体の結合対象抗原に結合したハプテン（Ｈ −Ａｇ）と、標識抗体（αＡ＊）と試料とを接触させ、 （ｂ）複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａｇ）（αＡ＊）｝または遊離（αＡ＊）の存在 を検出する段階から成り、複合体｛（αＨ）（Ｈ−Ａｇ）（αＡ＊）｝の量が試 料中の抗体（αＡ）の量に反比例し、（αＡ＊）の量が試料中の（αＡ）の量に 正比例することを特徴とするイムノアッセイ。
18. １８．試料中の抗体（αＡ）の存在及び量を検出及び検定するために、 （ａ）抗ハプテン抗体でコートされた粒子（Ｐ−αＨ）と、抗体に対する抗原と ハプテンとから成るコンジュゲート（Ｈ−Ａｇ）と、試料とを接触させ、 （ｂ）コーテッド粒子の凝集を検出及び検定する段階から成り、凝集が試料中の 抗体の量に正比例することを特徴とする直接凝集アッセイ。
19. １９．（ａ）抗分祈物抗体と、 （ｂ）分析物でないハプテンに対する抗体でコートされた粒子と、 から成る分析物検定用試薬。
20. ２０．（ａ）抗分析物抗体を収容した第一容器と、（ｂ）抗ハプテン抗体でコー トされた粒子（αＨ−Ｐ）を収容した第二容器と、 （ｃ）分析物に結合したハプテンから成るコンジュゲート（Ｈ−Ａ）を収容した 第三容器と、 から成るイムノアッセイキット。
21. ２１．抗ハプテン抗体が、抗フルオレセイン抗体、抗ローダミン抗体、抗ビオチ ン抗体、及び、ジニトロフェニル基に対する抗体から成るグループから選択され ることを特徴とする請求項２０に記載のイムノアッセイキット。
22. ２２．（ａ）抗分析物抗体と、粒子（Ｐ）が抗ハプテン抗体でコートされた粒子 （αＨ−Ｐ）とを収容した第一容器と、（ｂ）分析物に結合したハプテンから成 るコンジュゲート（Ｈ−Ａ）を収容した第二容器と、 から成るイムノアッセイキット。
23. ２３．試料中の種々の分析物を検出及び定量するために、複数チャンバを有して おり、各チャンバが、ハプテンとチャンバ内の特定の検出対象分析物とのコンジ ュゲートを収容しており、更に試料の一部分を各チャンバに導入して該チャンバ 内のコンジュゲートと混合し混合物を形成させる手段と、１つのチャンバ内の混 合物が別のチャンバに流入することを阻止する手段とを含むイムノアッセイデバ イス。
24. ２４．粒子が、細胞、ラテックス微粒子、プラスチック微粒子、セレン微粒子、 鉄微粒子及び金微粒子から成るグループから選択されることを特徴とする請求項 ２３に記載のデバイス。
25. ２５．ハプテンが、フルオレセイン、ローダミン、ピオチン及びジニトロフェニ ル基から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２１に記載のデバ イス。
26. ２６．試料中の２つ以上の分析物を同時に検出または定量するために、 （ａ）２つ以上のチャンバを有し、各チャンバが該チャンバ内の検出対象分析物 に特異的なハプテンのコンジュゲート（Ｈ−Ａ）を収容しているデバイスを使用 し、（ｂ）試料と、抗ハプテン抗体でコートされた粒子（Ｐ−αＨ）と、各検出 対象分析物に対する抗体とを混合して混合物を形成し、 （ｃ）混合物の一部分を各チャンバに導入し、該チャンバに導入された該部分は 漏出して別のチャンバに流入することなく、該部分を該チャンバ内のコンジュゲ ート（Ｈ−Ａ）と混合し、 （ｄ）各チャンバ内の凝集の存在を検出または測定する段階から成り、各チャン バ内の凝集の量が該チャンバ内で特異的に検定される試料中の分析物の量に反比 例することを特徴とする凝集アッセイ方法。
27. ２７．抗体によってコートされ、コーテッド赤血球の初期色とは異なる色に染色 されており、コーテッド染色赤血球が凝集アッセイ中に凝集し得ることを特徴と する赤血球。
28. ２８．赤血球が固定されていることを特徴とする請求項２７に記載のコーテッド 染色赤血球。
29. ２９．赤血球の染色に使用される染料が、クーマシーブリリアントブル−Ｒ−２ ５０、シバクロムブル−３ＧＡ、リアクティブカラーシリーズ、ジアゾニウム染 料、ヨードアセトアミドまたはマレイミドカップリング作用を有する有機染料か ら成るグループから選択されることを特徴とする請求項２８に記載の固定された コーテッド染色赤血球。
30. ３０．ヨードアセトアミドまたはマレイミドカップリング作用を有する有機染料 が、ローダミンヨードアセトアミド、ローダミンマレイミド、エオシンヨードア セトアミド、エオシンマレイミド、テトラメチルローダミンマレイミド、及び、 テトラメチルローダミンヨードアセトアミドから成るグループから選択され、リ アクティブカラーシリーズが、リアクティブレッド、リアクティブグリーン、リ アクティブイエローから成るグループから選択され、ジアゾニウム染料が、ファ ーストブラックＫ及びファーストブル−Ｂから成るグループから選択されること を特徴とする請求項２９に記載のコーテッド染色赤血球。
31. ３１．染料が赤血球に共有結合していることを特徴とする請求項２７に記載のコ ーテッド染色赤血球。
32. ３２．（ａ）抗ハプテン抗体でコートされ赤血球のもとの色とは異なる色に染色 された赤血球を収容した第一容器と、（ｂ）別の凝集アッセイ用試薬を収容した 第二容器とから成る分析物用凝集アッセイキット。
33. ３３．赤血球の染色に使用される染料が、クーマシーブリリアントプル−Ｒ−２ ５０、シバクロムブル−３ＧＡ、リアクティブカラーシリーズ、ジアゾニウム染 料、ヨードアセトアミドまたはマレイミドカップリング作用を有する有機染料か ら成るグループから選択されることを特徴とする請求項３２に記載の凝集アッセ イキット。
34. ３４．ヨードアセトアミドまたはマレイミドカップリング作用を有する有機染料 が、ローダミンヨードアセトアミド、ローダミンマレイミド、エオシンヨードア セトアミド、エオシンマレイミド、テトラメチルローダミンマレイミド、及び、 テトラメチルローダミンヨードアセトアミドから成るグループから選択され、リ アクティブカラーシリーズが、リアクティブレッド、リアクティブグリーン、リ アクティブイエローから成るグループから遺択され、ジアゾニウム染料が、ファ ーストブラックＫ及びファーストブルーＢから成るグループから選択されること を特徴とする請求項３３に記載の凝集アッセイキット。
35. ３５．赤血球が固定赤血球であることを特徴とする請求項３３に記載の凝集アッ セイキット。
36. ３６．更に、コーテッド赤血球の色と異なる色の非コーテッド赤血球を収容した 第三容器を含むことを特徴とする請求項３３に記載の凝集アッセイキット。
37. ３７．種々の抗体でコートされ種々の色に染色された固定赤血球を含む分析物用 イムノアッセイキット。