CN105536725A - 高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本案涉及高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，包括：1)将乳化剂分散于有机溶剂中得到油相；2)将琼脂糖粉末溶解于去离子水中得到水相A；3)将四氧化三铁分散至去离子水中得到水相B；将水相B加到水相A中制得水相C；4)将水相C加至油相中，制得反相微乳液；5)将4)降温至35～45℃，滴加十六烷基三甲基氯化铵、氨水和正硅酸四乙酯，反应4～8hr，制得反相微乳反应液；6)滴加PSA硅烷化试剂，反应3～6hr，迅速降温至10～20℃，将微球迅速冷却固化，加入破乳剂破乳，磁性分离即可。本案制得的磁性微球具有单分散、高悬浮性、生物相容性及高磁性能响应，在酶的固定化、免疫测定、细胞分离等领域具有良好的应用前景。

Description

高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法
技术领域
本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法。
背景技术
本世纪70年代以后，磁性分离技术开始应用于生物学、环境学等领域，目前已经在细胞学、分子生物学、生物医学、生物化学、有机污染物检测、环境分析等方面取得了令人瞩目的研究成果。磁性分离技术是以磁性粒子为载体，包被抗原、抗体、酶等生物分子或者是修饰功能性基团，在外加磁性的定向控制下，通过吸附、清洗、洗脱等操作，可以从复杂的生物体系、土壤、水等样本中分离得到目标物分子，具有磁性分离简单方便、吸附特异性高、检测限低等众多的优点，从而作为一类新型材料被广泛应用。
磁性粒子作为生物分子载体具有：单分散、高的比表面积、良好的分散性、较快的磁性能响应、较好的水溶性以及较多的活性官能团等特点。目前，报道制备纳米粒子的方法有如下几种：共沉淀法、热分解法、乳液法、溶剂热法等，为了防止合成出来的磁性粒子之间产生团聚、沉降现象，通常需要在其表面引入高密度保护层，如无机材料或聚合物，通常要实现这些要求必须对磁性粒子进一步进行表面改性。表面改性一般都通过多层组装，而最外层还需要修饰相应的功能基团。常用功能化的活性官能团有氨基、羧基、环氧基等，其中氨基化修饰的磁性粒子能够在特定偶联试剂(如戊二醛)的作用下将多肽、蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到磁性粒子表面，也可以轻易地进行羧基化等改性，是医学与分子生物学研究最为重要的载体之一。
在现有技术中，对氨基修饰的磁性微球主要存在以下缺陷：1)合成方法相对简单，未能封闭其磁性核心，容易带来非特异性吸附，且不易长期存放，不耐氧化，限制了其在免疫分析、医学诊断等方面的应用；2)采用共沉淀法制备的磁性四氧化三铁严重团聚，即使再包覆二氧化硅之后，磁性微球依然存在团聚现象，且粒径不均一，极大限制了其在生化领域方面的应用；3)若通过水热合成方法来制备四氧化三铁，并在其表面包覆一层二氧化硅封闭其磁性核心，接着再在其表面修饰氨基，氨基磁性微球表面较为光滑、粒径分布均匀，但球与球的粘连现象严重，极大降低了其有效的表面积，不具备单分散性能，而且这种磁珠相较于小于100nm粒径的磁珠更容易发生沉降，液相体系中的悬浮性不佳，限制其在生化分析领域中的应用；此外，该法制备过程耗时较长。总而言之，开发一种具有量产功能的单分散、生物相容性、表面氨基较多、较好的磁性能响应兼有悬浮性能的氨基修饰磁性粒子成为一个迫切需要解决的技术问题。
琼脂糖是一种天然多糖类层析介质，它具有理想介质的许多特性：高亲水性、高多孔、含较多可活化羟基、不与生物大分子发生非特异性吸附，而将琼脂糖包覆于磁性粒子表面制备磁性琼脂糖微球在酶的固定化、免疫测定、细胞分离、靶向药物、化学分析等领域有着广泛的应用前景。这是因为磁性琼脂糖微球有着较好的生物相容性，易悬浮不沉降，单分散性好等诸多优势，但在实际使用过程中还存在以下不足：1、琼脂糖壳层是多孔的，将磁性物质包埋于琼脂糖内，在酸性外部条件下会造成磁性物质泄露，导致磁性下降，易被氧化，非特异性吸附增加的缺陷。2、琼脂糖的水溶性和生物相容性是因为它极易溶胀水分子的特性，所以磁性琼脂糖微球干燥后脱水易结板，不能再度分散于水相，所以它不能被准确定量，这也极大限制其在微量分析和免疫测定中的应用。
综上所述，现有氨基修饰磁性粒子的技术不能满足免疫测定、生物偶联等领域的应用，所以需要开发一种具有高悬浮、较好的生物相容性、不漏磁、不易被氧化、可被干燥且易于实现产业化的氨基修饰磁性微球。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供了一种高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其能够实现对氨基修饰磁性微球的工业化生产，制得的氨基修饰磁性微球具有单分散、高悬浮、高磁性能响应的特性，而且该磁性微球不漏磁，能够被干燥并准确定量。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，包括：
步骤1)将乳化剂分散于有机溶剂中，得到油相；
步骤2)将琼脂糖粉末在60～95℃下溶解于去离子水中，得到水相A；
步骤3)将四氧化三铁分散至包含有表面活性剂的去离子水中，得到水相B；将所述水相B加入到水相A中，在70～95℃下机械搅拌反应10～60min，搅拌转速为500～1200rpm，制得水相C；
步骤4)将水相C滴加至油相中，并在70～95℃下机械搅拌反应10～120min，搅拌转速为500～1500rpm，制备得到反相微乳液；
步骤5)将步骤4)的转速调整为200～600rpm，并降温至35～45℃，滴加含10～20wt％十六烷基三甲基氯化铵的水溶液，反应10～20min，随后加入25wt％的氨水和正硅酸四乙酯，继续反应4～8hr，制得包硅磁性琼脂糖微球的反相微乳反应液；
步骤6)向所述反相微乳反应液中滴加PSA硅烷化试剂，以在包硅磁性琼脂糖微球表面修饰上N-丙基乙二胺基，滴加完毕后继续反应3～6hr，随后迅速降温至10～20℃，将包硅磁性琼脂糖微球迅速冷却固化，加入破乳剂，机械搅拌10～20min，在200～600rpm的转速下进行破乳，待磁性分离后即得到高悬浮氨基修饰磁性微球。
优选的是，所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其中，步骤1)中，所述乳化剂占有机溶剂的体积百分比为0.5～12％；所述乳化剂选自司盘20、司盘40、司盘60、司盘80、司盘85中的任意一种或多种；所述有机溶剂选自液体石蜡、正庚烷、正辛烷、90～120℃沸程的石油醚中的任意一种或多种。
优选的是，所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其中，在步骤2)中，所述琼脂糖粉末占去离子水的质量百分比为0.1～4％。
优选的是，所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其中，在步骤3)中，所述四氧化三铁的粒径为80～500nm。
优选的是，所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其中，在步骤3)中，所述表面活性剂选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的任意一种或多种；所述表面活性剂占去离子水的质量百分比为0.001～0.4％；所述四氧化三铁占去离子水的质量百分比为1～10％；所述水相A与水相B的体积比为10：1～8。
优选的是，所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其中，在步骤4)中，所述水相C滴加至油相的滴加速度为0.5～4滴/秒，水相C与油相的体积比为1：1.5～15。
优选的是，所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其中，在步骤5)中，十六烷基三甲基氯化铵的水溶液占水相C的体积百分比为0.4～4％，氨水占水相C的体积百分比为0.3～3％，正硅酸四乙酯占水相C的体积百分比为0.8～5％。
优选的是，所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其中，在步骤6)中，PSA硅烷化试剂占水相C的体积百分比为0.5～3％，PSA硅烷化试剂选自N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基二甲基甲氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基二甲基甲氧基硅烷或其组合。
优选的是，所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其中，在步骤6)中，所述破乳剂选自乙醇、异丙醇、丙酮或其组合。
优选的是，所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其中，在步骤3)中，所述水相B中还包含有酒石酸钠，所述酒石酸钠占去离子水的质量百分比为0.01～0.02％。
本案所用十六烷基三甲基氯化铵、氨水、正硅酸四乙酯和PSA硅烷化试剂的用量均应被限制。若十六烷基三甲基氯化铵的量过少，则会导致最终磁性微球的比表面积小，表面氨基数量少，若十六烷基三甲基氯化铵的量过多则导致后期清洗不易。若氨水加入量过少，则正硅酸四乙酯的水解量减少，将导致琼脂糖表面包覆的二氧化硅层过薄；若氨水加入量过多会导致正硅酸四乙酯水解后自己形成二氧化硅小球，而不会水解到琼脂糖磁性微球的表面。若正硅酸四乙酯的加入量过少，则会导致琼脂糖表面包覆的二氧化硅层过薄，若正硅酸四乙酯的加入量过多，会导致和氨水量过多同样的后果，有大量正硅酸四乙酯水解后自己形成二氧化硅小球。若PSA硅烷化试剂加入量过少则导致表面的N-丙基乙二胺基基团过少，氨基数量降低。并且，在步骤1)-3)中，乳化剂、水性、油相的比例是非常重要的，由它们来协同控制磁性微球的粒径，在油相不变的情况下，水性：乳化剂越多，则磁性微球的最终粒径越大，水性：乳化剂越少，则磁性微球的最终粒径越小。
本发明的有益效果是：
1、本案提供一种高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，制得的磁性微球具有单分散、高悬浮性、生物相容性以及较强的磁性能响应，在酶的固定化、免疫测定、细胞分离、环境重金属检测分析等领域具有良好的实用价值和应用前景。
2、本案通过调节水相体积、乳化剂体积和油相体积之间的比例，以及磁性四氧化三铁的粒径、反向微乳液反应的搅拌转速、磁性微球的粒径，来制备不同粒径的高悬浮氨基修饰磁性微球并将其应用于不同的领域。
3、本案在琼脂糖微球降温形成磁性微球的过程中，利用了反相微乳液本身的分散性特点，先包覆一层二氧化硅，接着再修饰长臂伯胺基，无需额外在琼脂糖表面进行活化、交联等步骤，破乳即得到最终的氨基修饰的磁性微球，大大缩短了工艺步骤的同时还提高了磁珠的分散性，避免磁性微球在传统层层修饰组装的过程中带来磁珠黏连现象。
4、本案利用琼脂糖本身的多孔性与十六烷基三甲基氯化铵的致孔效应，正硅酸四乙酯的水解会形成一层致密且粗糙的表面，形成有效保护层使琼脂糖内水分子不易被烘干，且干燥之后还能重新分散于水溶液。此外，十六烷基三甲基氯化铵与琼脂糖错落形成网状粗糙表面更有利于表面修饰更多的氨基基团。
5、本案所用PSA硅烷化试剂具有两个氨基，pKa值分别为10.1和10.9，具有极强的离子交换能力，且PSA硅烷化试剂要比传统的氨基硅烷化试剂(如3-氨丙基三乙氧基硅烷)具有更长的链和两倍的氨基数量，更容易捕获目标分子。
附图说明
图1为Fe3O4(a)和高悬浮氨基修饰磁性微球(b)的磁滞回线图。(由美国LakeShore公司的VSM-7307型振动样品磁强计测得)
图2为制备的高悬浮氨基修饰磁性微球的显微镜图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
本实施例提供一种高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)、20mL司盘85分散于500mL液体石蜡中，并将此混合液升温至80℃，保持上述温度机械搅拌，转速控制在400～500rpm，得到油相；
步骤2)、称取500mg琼脂糖粉末溶解到60mL去离子水中，加热到90℃，机械搅拌，转速控制在700～800rpm，配制成透明琼脂糖凝胶液，标记为水相A；
步骤3)、称取1g磁性四氧化三铁(80-100nm，饱和磁化强度为71.2emu·g-1)分散至20mL去离子水中，加入40μL的吐温20，超声分散5-20min，标记为水相B，然后加入到上述水相A中，机械搅拌，转速调整为600-700rpm，并将此混合液升温至90℃，反应20min，制备得水相C；
步骤4)、将水相C逐滴滴加至油相，滴加速度控制在2-3滴/秒，滴加完毕后，将反应液转速调整为1000-1200rpm，并保持在80℃下反应30min，制备得反相微乳液；
5)、反应完毕后将上述反相微乳液转速调整为300-400rpm，降温至35-40℃，滴加6mL含20％质量分数的十六烷基三甲基氯化铵的水溶液，反应20min，加入4mL质量分数为25％的氨水，滴加5mL正硅酸四乙酯，滴加完毕后反应6hr，制备得包硅磁性琼脂糖微球的反相微乳反应液；
6)、向上述体系滴加4mLN-氨乙基-3-氨丙基二甲基甲氧基硅烷，滴加完毕后反应3hr，迅速降温至20℃，将磁性琼脂糖微球迅速冷却固化，加入乙醇，在转速为400-500rpm进行破乳20min，磁性分离后用去离子水和乙醇反复清洗三次，在50℃的真空干燥箱中干燥过夜得到高悬浮氨基修饰磁性微球，磁性微球粒径为5-10μm，饱和磁化强度为32.8emu·g-1。
实施例2
本实施例提供一种高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，包括：
步骤1)、10mL司盘80分散于400mL90～120℃沸程的石油醚中，并将此混合液升温至65℃，保持上述温度机械搅拌，转速控制在500-600rpm，得到油相；
步骤2)、称取800mg琼脂糖粉末溶解到40mL去离子水中，加热到75℃，机械搅拌，转速控制在700-800rpm，配制成透明琼脂糖凝胶液，标记为水相A；
步骤3)、称取800mg磁性四氧化三铁(200-300nm，饱和磁化强度为82.4emu·g-1)分散至20mL去离子水中，加入100mg的柠檬酸钠，超声分散5-20min，标记为水相B，然后加入到上述水相A中，机械搅拌，转速调整为800-900rpm，并将此混合液升温至85℃，反应40min，制备得水相C；
步骤4)、将水相C逐滴滴加至油相，滴加速度控制在1-2滴/秒，滴加完毕后，将反应液转速调整为800-1000rpm，并保持在75℃下反应40min，制备得反相微乳液；
5)、反应完毕后将上述反相微乳液转速调整为200-250rpm，降温至35-40℃，滴加8mL含15％质量分数的十六烷基三甲基氯化铵的水溶液，反应10min，加入5mL质量分数为25％的氨水，滴加6mL正硅酸四乙酯，滴加完毕后反应5hr，制备得包硅磁性琼脂糖微球的反相微乳反应液；
6)、向上述体系滴加3mLN-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷，滴加完毕后反应4hr，迅速降温至15℃，将磁性琼脂糖微球迅速冷却固化，加入异丙醇，在转速为400-500rpm进行破乳15min，磁性分离后用去离子水和乙醇反复清洗三次，在50℃的真空干燥箱中干燥过夜得到高悬浮氨基修饰磁性微球，磁性微球粒径为10-20μm，饱和磁化强度为27.4emu·g-1。
实施例3
本实施例提供一种高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，包括：
步骤1)、15mL司盘60分散于350mL正庚烷与正辛烷的混合溶液，正庚烷与正辛烷的体积比为1:1，并将此混合液升温至80℃，保持上述温度机械搅拌，转速控制在300-400rpm，得到油相；
步骤2)、称取600mg琼脂糖粉末溶解到100mL去离子水中，加热到85℃，机械搅拌，转速控制在700-800rpm，配制成透明琼脂糖凝胶液，标记为水相A；
步骤3)、称取1.2g磁性四氧化三铁(400-500nm，饱和磁化强度为86.6emu·g-1)分散至30mL去离子水中，加入200mg的十二烷基硫酸钠，超声分散5-20min，标记为水相B，然后加入到上述水相A中，机械搅拌，转速调整为600-700rpm，并将此混合液升温至90℃，反应30min，制备得水相C；
步骤4)、将水相C逐滴滴加至油相，滴加速度控制在3-4滴/秒，滴加完毕后，将反应液转速调整为500-600rpm，并保持在80℃下反应60min，制备得反相微乳液；
5)、反应完毕后将上述反相微乳液转速调整为300-400rpm，降温至35-40℃，滴加10mL含20％质量分数的十六烷基三甲基氯化铵的水溶液，反应10min，加入6mL质量分数为25％的氨水，滴加8mL正硅酸四乙酯，滴加完毕后反应6hr，制备得包硅磁性琼脂糖微球的反相微乳反应液；
6)、向上述体系滴加4mLN-氨乙基-3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷，滴加完毕后反应3hr，迅速降温至10℃，将磁性琼脂糖微球迅速冷却固化，加入丙酮，在转速为500-600rpm进行破乳15min，磁性分离后用去离子水和乙醇反复清洗三次，在50℃的真空干燥箱中干燥过夜得到高悬浮氨基修饰磁性微球，磁性微球粒径为25-35μm，饱和磁化强度为26.3emu·g-1。
实施例4
本实施例与实施例1相同，区别是在步骤3)中，水相B中还包含有酒石酸钠，且酒石酸钠占去离子水的质量百分比为0.01～0.02％。酒石酸钠在这里的作用并非是表面活性剂，它的作用有两点：1)作为相转移试剂，增加水相和油相结合时的混匀速率，从而提高反应效率；2)作为缓释剂，控制四氧化三铁与琼脂糖结合的速率，从而提高每个四氧化三铁单体的反应参与效率，抑制四氧化三铁之间的团聚或粘黏。本实施例制得的高悬浮氨基修饰磁性微球，磁性微球粒径为5-10μm，饱和磁化强度为35.4-36.1emu·g-1。
在图1中，四氧化三铁的饱和磁化强度要比本案制得的磁性微球要高一些，(磁性越强，则饱和磁化强度要高)这是因为包覆了很厚的琼脂糖层的原因。其次，磁性微球最后的饱和磁化强度大于25emu·g-1，说明最终产物依然具有较强的磁性响应，可以满足磁性快速分离的技术要求。图2说明本案制得的磁性微球之间没有黏连现象。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1)将乳化剂分散于有机溶剂中，得到油相；
步骤2)将琼脂糖粉末在60～95℃下溶解于去离子水中，得到水相A；
步骤3)将四氧化三铁分散至包含有表面活性剂的去离子水中，得到水相B；将所述水相B加入到水相A中，在70～95℃下机械搅拌反应10～60min，搅拌转速为500～1200rpm，制得水相C；
步骤4)将水相C滴加至油相中，并在70～95℃下机械搅拌反应10～120min，搅拌转速为500～1500rpm，制备得到反相微乳液；
步骤5)将步骤4)的转速调整为200～600rpm，并降温至35～45℃，滴加含10～20wt％十六烷基三甲基氯化铵的水溶液，反应10～20min，随后加入25wt％的氨水和正硅酸四乙酯，继续反应4～8hr，制得包硅磁性琼脂糖微球的反相微乳反应液；
步骤6)向所述反相微乳反应液中滴加PSA硅烷化试剂，以在包硅磁性琼脂糖微球表面修饰上N-丙基乙二胺基，滴加完毕后继续反应3～6hr，随后迅速降温至10～20℃，将包硅磁性琼脂糖微球迅速冷却固化，加入破乳剂，机械搅拌10～20min，在200～600rpm的转速下进行破乳，待磁性分离后即得到高悬浮氨基修饰磁性微球。
2.如权利要求1所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述乳化剂占有机溶剂的体积百分比为0.5～12％；所述乳化剂选自司盘20、司盘40、司盘60、司盘80、司盘85中的任意一种或多种；所述有机溶剂选自液体石蜡、正庚烷、正辛烷、90～120℃沸程的石油醚中的任意一种或多种。
3.如权利要求1所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述琼脂糖粉末占去离子水的质量百分比为0.1～4％。
4.如权利要求1所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述四氧化三铁的粒径为80～500nm。
5.如权利要求1所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述表面活性剂选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的任意一种或多种；所述表面活性剂占去离子水的质量百分比为0.001～0.4％；所述四氧化三铁占去离子水的质量百分比为1～10％；所述水相A与水相B的体积比为10：1～8。
6.如权利要求1所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，所述水相C滴加至油相的滴加速度为0.5～4滴/秒，水相C与油相的体积比为1：1.5～15。
7.如权利要求1所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，在步骤5)中，十六烷基三甲基氯化铵的水溶液占水相C的体积百分比为0.4～4％，氨水占水相C的体积百分比为0.3～3％，正硅酸四乙酯占水相C的体积百分比为0.8～5％。
8.如权利要求1所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，在步骤6)中，PSA硅烷化试剂占水相C的体积百分比为0.5～3％，PSA硅烷化试剂选自N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基二甲基甲氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基二甲基甲氧基硅烷或其组合。
9.如权利要求1所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，在步骤6)中，所述破乳剂选自乙醇、异丙醇、丙酮或其组合。
10.如权利要求1所述的高悬浮氨基修饰磁性微球的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述水相B中还包含有酒石酸钠，所述酒石酸钠占去离子水的质量百分比为0.01～0.02％。
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