CN1967248A - 生物功能化荧光磁性纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物功能化荧光磁性纳米粒子及其制备方法和应用。该粒子具备核壳型结构，包括：内核层中的荧光物质和磁性物质；由荧光通透物质构成的外壳层；和外壳层表面有机官能团的修饰层。通过反相微乳液法可合成具有荧光和磁性双重功能的纳米粒子，继而在其表面进行化学修饰使其成为生物功能化磁性纳米粒子。该纳米粒子可以用于生物标记、生物成像和生物分离等。

Description

生物功能化荧光磁性纳米粒子及其制备方法和应用

技术领域

本发明属纳米材料领域，更具体地，是涉及应用于生物领域的纳米材料。

背景技术

生物功能化材料一直是材料研究学领域的热门领域，在生物功能化材料中，纳米材料自从上个世纪80年代以来由于其特殊的物理化学性质，越来越收到科学家的重视，因而利用纳米技术研究和解决生物领域的重大问题也成为重要的前沿研究领域之一。

有机荧光物质是经典的荧光物质，虽然有机荧光物质由于其固有的性质有其缺点，如荧光效率问题等等，但作为经典的荧光物质相对于目前的无机荧光物质仍有其广泛应用的领域，如应用于流式细胞术，应用于抗体标记等等。

磁性材料的性质早已为大家熟悉，利用磁性材料的有点将其应用于生物领域也早有实践，如利用磁性材料的性质，应用于细胞分离，核磁共振成像等等。

然而将有机荧光材料和磁性材料结合起来作为功能化材料应用于生物领域却没有较多的深入研究。国外有研究将此类型的荧光材料通过化学的方法修饰在纳米材料的表面，然而将荧光物质和纳米材料同时包裹于纳米材料之内却没有相关的报道，更没有将荧光物质和磁性材料同时包裹于纳米粒子之内，再通过纳米粒子的表面功能化，使之可以应用于生物学领域的研究。因而，制备和应用生物功能化的荧光磁性纳米粒子有着重要的研究价值。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明需要解决的技术问题是提供一种生物功能化荧光磁性纳米粒子及其制备方法和应用，以克服现有技术中荧光物质仅修饰于纳米材料表面，无法使纳米材料同时具备生物功能的缺陷。

技术方案

本发明的内容之一是提供一种生物功能化的荧光磁性纳米粒子，具备内核和外壳的核壳型结构，包括如下的结构特点：

(1)内核层中含荧光物质和磁性物质；

(2)外壳层由荧光通透物质构成；

(3)外壳层表面为有机官能团的修饰层。

上述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的一种优选方案为，所说的有机官能团为氨基、羧基或者巯基，或者其组合。

上述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的另一种优选方案为，所说的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明，藻红蛋白或者其组合，较佳地选择异硫氰酸荧光素FITC。

上述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的又一种优选方案为，所说的磁性物质为铁、镍、铁的氧化物或镍铁合金，或者其组合。

所述内核层的内核成分可以含有铁、铁的氧化物、铁与其他金属的合金，较佳地选自铁的氧化物、铁、镍、镍-铁合金、或其组合，更佳地为铁的氧化物。

上述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的另一种优选方案为，所说的外壳层成分为二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈或环氧化合物，或者其组合。

具体地，所述外壳层成分可以是无机包裹层，例如氨基硅烷、巯基硅烷，还可以是有机包裹层，例如糖苷、蛋白质等。无机包裹层优选氨基硅烷，有机包裹层优选糖苷。较佳地，其成分选自二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物、或其组合；更佳地，所述内核层的外壳成分是二氧化硅。

本发明的内容之二是提供一种制备所说的生物功能化荧光磁性纳米粒子的方法，包括如下步骤：

(1)在含有磁性纳米粒子和荧光物质以及外壳层形成剂的微乳液体系中，通过油包水型反相微乳液法，形成核壳型纳米粒子；

(2)使用修饰剂对步骤(1)所说的的核壳型磁性纳米粒子表面进行修饰，得到表面修饰有氨基、羧基或者巯基、或者其组合的生物功能化荧光磁性纳米粒子；

其中，所说的修饰剂为硅烷类修饰剂，优选如[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]、巯基乙酸、巯基丙酸或3-巯基丙基三甲氧基硅烷，或者其组合。

对于选定的外壳成分，可根据现有技术选用合适的外壳层形成剂。例如当外壳成分为二氧化硅时，可选用正硅酸乙酯或其它合适的外壳层形成剂。

上述的生物功能化荧光磁性纳米粒子制备方法的一种优选方案为，所说的微乳液体系中含有TritonX-100、正己醇、环己烷按，其体积比为1∶1～3∶4～6。

本发明的内容之二是提供上述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的应用，所说的有机化官能团通过化学键与核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸或者其衍生物结合。

上述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的另一种应用为，所说的有机化官能团与动植物细胞或者亚细胞结构或者病毒颗粒结合。

有益效果

1、本发明的生物功能化荧光磁性纳米粒子与现有技术中荧光物质仅修饰于纳米材料表面相比，可以使纳米材料不但具备磁性能够方便地进行分离、以及具备荧光标记能够方便地指示的性能之外，还具备有机官能团，通过化学键与核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸或者其衍生物结合，乃至与动植物细胞或者亚细胞结构或者病毒颗粒结合的生物应用功能。

2、本发明的生物功能化荧光磁性纳米粒子其外壳层采用二氧化硅、琼脂糖等无毒、具有生物相容性的材料，使应用于生物化学领域成为可能。

3、本发明的制备方法采用成本低廉的有机荧光物质、磁性材料、外壳形成剂等，使得实际大规模生产具有可行性。

4、采用纳米颗粒包裹荧光物质、磁性物质和生物功能基团，可以有效的发挥纳米材料的表面积优势，提高生物反应的效率、加快反应时间，同时减小反应体系的总量，使得进行微量检测和微量反应简便易行。

5、生物功能化的纳米粒子对于纳米水平上的生物材料的理化性质的研究提供了基础，同时进一步提供了扩大应用的可能性。

6、在本发明的纳米粒子上连接核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗体、多肽、动植物细胞、亚细胞结构、病毒、细菌等等，可以广泛应用于各类疾病的检测和治疗。

如本文所用，术语“反相微乳液法”指微乳液法是利用两种互补相溶的溶剂在表面活性剂的作用下形成一个均匀的乳液，从乳液中析出固体，这样可使成核、成长、聚结和团聚等过程局限在一个微小的球形液滴内，从而形成球形颗粒。微乳液通常由表面活性剂、助表面活性剂(通常为醇类)、油(通常为碳氢化合物)和水(或电解质的水溶液)组成的透明的各向同性的热力学稳定性体系。其中反相微乳液是指油包水(W/O)型乳液，即水相分散在油相而形成微小的不连续的“水池”，其大小可控制在几十到几百个埃之间。纳米粒子的微乳液制备方法正是利用微乳液的“水池”作为“微反应器”，从而达到控制纳米粒子的粒径和形状。

如本文所用，术语“官能团”指在化合物中决定化合物性质的原子和原子团叫做官能团。在本文中如在荧光磁性纳米粒子表面修饰的氨基，羧基以及巯基都是官能团。

附图说明

图1是二氧化硅包裹的荧光磁性纳米粒子的透射电子显微镜照片。从图中可以看出，包裹了荧光物质和磁性纳米材料的粒子具有很规则的形态，具有较好的单分散性，表明二氧化硅已经很好的将磁性材料和荧光物质包裹于其中。

图2是二氧化硅包裹的荧光磁性纳米粒子的荧光显微镜照片。图中可以看出，包裹荧光物质纳米粒子具有很好的荧光性质，同时也进一步证明二氧化硅已经成功地将荧光物质包裹于其中。

图3是表面氨基功能化的荧光磁性纳米粒子的红外图谱。从图谱中可以看出，氨基的红外峰在图谱中显示出来，表明氨基官能团已经成功地修饰在纳米粒子的表面。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：化工产品手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，异硫氰酸荧光素、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、巯基乙酸、巯基丙酸、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明，藻红蛋白3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)购自Sigma公司。

实施例一

磁性纳米粒子的内核层的制备方法

采用改进的化学共沉淀制备磁性粒子的内核层，具体方法如下：用二次蒸馏水分别配制FeSO₄·7H₂O和FeCl₃·6H₂O的混合溶液及NaOH溶液。在铁盐的混合溶液中Fe²⁺离子的浓度为0.1～0.2mol/L，Fe³⁺离子的浓度为0.1～0.3mol/L，NaOH溶液的浓度为2～3mol/L。在剧烈搅拌下将体积为混合盐溶液体积一半的NaOH溶液缓慢地滴加到混合盐溶液中。将所得到的固体沉淀在40℃～60℃陈化12h，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在40℃～80℃的条件下干燥24h，在玛瑙研钵中研磨后即得产物。

实施例二

核壳型荧光磁性纳米粒子的制备方法一

将TritonX-100、正己醇、环己烷按1∶2∶5的比例均匀混合，形成透明稳定的微乳液体系。将上述微乳液体系置于超声波中处理30～60分钟，向其中加入荧光物质异硫氰酸荧光素FITC 0.5mg，再向其中加入0.5g的γ-Fe₂O₃，用超声波处理6分钟后取出上层液倒入三颈烧瓶中，搅拌30分钟使之均匀。取1mL一定浓度的浓氨水用2mL二次蒸馏水稀释，30分钟后将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌30分钟使氨水均匀分散在微乳液中。1小时后，向微乳液中滴加1～3mL的正硅酸乙酯，同时不断地搅拌10小时，并将体系的温度保持在15～30℃之间。向体系中加入丙酮使粒子沉淀，或者将体系静置过夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。在真空的条件下干燥粒子样品。从图1中我们可以看出二氧化硅已经很好地将荧光物质和磁性纳米粒子包裹在其中。

实施例三

核壳型荧光磁性纳米粒子的制备方法二

将异丙醇和水按照5∶1的比例均匀混合，超声5min。称取0.1-0.8mg的荧光物质异硫氰酸荧光素FITC、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、或者藻红蛋白之中的一种，配置成水溶液。再称量约1.0g的γ-Fe₂O₃加入到上述配制的溶液体系中，超声处理10min。取上层清夜倒入三颈烧瓶中，不断搅拌使其保持分散状态。取1mL一定浓度的浓氨水，将其缓慢加入到不断搅拌的溶液体系中。接着取1～3mL的正硅酸乙酯，同样将其缓慢加入到不断搅拌的溶液体系中。体系在室温的条件下反应3-5个小时。将反应产物倒出，用二次蒸馏水洗涤粒子3-5次。清洗后的粒子在20-50℃的温度下真空干燥5小时，收集粒子备用。从图1中我们可以看出二氧化硅已经很好地将荧光物质和磁性纳米粒子包裹在其中。

实施例四

生物功能化荧光磁性纳米粒子的制备一

取20mg实施例2或3中制得的荧光磁性纳米粒子，加入30-50mL的甲醇和丙三醇按5∶3比例组成的混合液中，用超声波处理20～60分钟；称取1-3mLAEAPS[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在60℃的条件下反应5小时，然后取出粒子并用甲醇清洗3次，接着在40～80℃真空干燥2小时，收集粒子得到表面修饰有氨基的生物功能化的荧光磁性纳米粒子。从图3的红外表征图谱中可以看出，氨基已经被修饰到磁性纳米粒子的表面。

实施例五

生物功能化荧光磁性纳米粒子的制备二

取实施例2或3中制得的荧光磁性纳米粒子加入到乙酸乙醇缓冲液中(pH＝4.5)，超声混和均匀；同时，将一定量3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)加入到另一乙酸乙醇缓冲液中。混合上述两种溶液，在25℃的情况下反应1h后，取出粒子，用乙酸乙醇的缓冲液(pH＝4.5)清洗三次后，在60℃时真空干燥2h，收集表粒子得到表明修饰有巯基的生物功能化荧光磁性纳米粒子。

实施例六

生物功能化荧光磁性纳米粒子的制备三

取实施例2或3中制得的荧光磁性纳米粒子加入到组成为乙酸乙醇的缓冲溶液中(pH＝4.5)，超声混合均匀；3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)加入到同样的缓冲溶液中。将两种缓冲溶液混合，在一定的温度条件下反应2-4个小时，磁性分离粒子，用同样的缓冲溶液洗涤三次后，在60℃下真空干燥，收集粒子。

将收集的粒子分散于同样的缓冲溶液中，向溶液体系中加入巯基乙酸，将溶液分散均匀，体系在常温下反应2-4个小时后，磁性收集粒子，洗涤数遍后真空干燥，得到表面修饰羧基的生物功能化的荧光磁性纳米粒子。

实施例七

生物功能化磁性纳米粒子的生物应用之一

取1-3mg如实施例4制备的表面修饰氨基的生物功能化荧光磁性纳米粒子，加入到pH为7.0-8.0的磷酸盐缓冲体系中，加入用量为50-200μL交联剂(戊二醛)，形成混合溶液。所述的混合溶液用超声波处理10-30分钟。然后用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次。

取约3微克的单克隆抗体，加入到含约2mL的上述粒子的混合溶液中。在2-10℃的反应温度下反应3小时，从而将抗体上的氨基与外壳层上的氨基在固定剂的作用下进行反应，使抗体通过Schiff Bond(席夫键)直接连接于外壳层。反应结束后，磁性分离出所述的粒子，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。这样得到的修饰有单克隆抗体的荧光磁性纳米粒子置于磷酸盐缓冲液中保存，可以用于生物学中的细菌细胞分离和实时监测。

实施例八

生物功能化磁性纳米粒子的生物应用二

取一定量已修饰好过硫键的寡聚脱氧核苷酸oligoDNA片断，加入到500μL的NaHCO₃和Na₂CO₃的缓冲液(pH＝8.5)中，混合均匀；取少量的上述实施例5中制备的表面修饰巯基的荧光磁性纳米粒子加入到上述寡聚脱氧核苷酸溶液中，均匀分散，在一定湿度，25℃的情况下反应24h。分离清洗粒子并在50℃的条件下真空干燥10h，得到oligoDNA修饰的荧光磁性纳米粒子，该功能化的荧光磁性纳米粒子可以用于目标DNA的分离和DNA杂交过程的实时监测。

实施例九

生物功能化磁性纳米粒子的生物应用三

取一定量上述实施例6中制备的已修饰好羧基的生物功能化荧光磁性纳米粒子，加入到pH为7.0-8.0的磷酸盐缓冲体系中，形成混合溶液。所述的混合溶液用超声波处理10-30分钟。

取约10微克量的烟草花叶病毒颗粒，加入到含约2mL的上述粒子的混合溶液中。在2-10℃的反应温度下反应3小时，从而将病毒外壳上的氨基与外壳层上的羧基在固定剂的作用下进行反应，并直接连接于外壳层。反应结束后，磁性分离出所述的粒子，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。这样得到的连接有烟草花叶病毒的荧光磁性纳米粒子置于磷酸盐缓冲液中保存，可以用于植物病毒学中的病毒感染示踪和实时监测。

Claims (10)

1.一种生物功能化荧光磁性纳米粒子，具备内核和外壳的核壳型结构，包括如下的结构特点：

(1)内核层中含荧光物质和磁性物质；

(2)外壳层由荧光通透物质构成；

(3)外壳层表面为有机官能团的修饰层。

2.根据权利要求1所述的生物功能化荧光磁性纳米粒子，其特征在于，所说的有机官能团为氨基、羧基或者巯基，或者其组合。

3.根据权利要求1所述的生物功能化荧光磁性纳米粒子，其特征在于，所说的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、或藻红蛋白，或者其组合。

4.根据权利要求1所述的生物功能化荧光磁性纳米粒子，其特征在于，所说的磁性物质为铁、镍、铁的氧化物或镍铁合金，或者其组合。

5.根据权利要求1所述的生物功能化荧光磁性纳米粒子，其特征在于，所说的外壳层成分为二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈或环氧化合物，或者其组合。

6.一种制备权利要求1所述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的方法，包括如下步骤：

(1)在含有磁性纳米粒子和荧光物质以及外壳层形成剂的微乳液体系中，通过油包水型反相微乳液法，形成核壳型纳米粒子；

(2)使用修饰剂对步骤(1)所说的核壳型磁性纳米粒子表面进行修饰，得到表面修饰有氨基、羧基或者巯基、或者其组合的生物功能化荧光磁性纳米粒子；

其中，所说的修饰剂为硅烷类修饰剂。

7.根据权利要求6所述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，所说的硅烷类修饰剂为[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]、巯基乙酸、巯基丙酸或3-巯基丙基三甲氧基硅烷，或者其组合。

8.根据权利要求6所述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，所说的微乳液体系中含有TritonX-100、正己醇、环己烷按，其体积比为1∶1～3∶4～6。

9.权利要求1所述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的应用，其特征在于，所说的有机化官能团通过化学键与核酸、蛋白质、核苷酸、氨基酸或者其衍生物结合。

10.权利要求1所述的生物功能化荧光磁性纳米粒子的应用，其特征在于，所说的有机化官能团与动植物细胞或者亚细胞结构或者病毒颗粒结合。

Images