CN109569457A - 亚微米级功能球及其制备方法和应用 - Google Patents

亚微米级功能球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种亚微米级功能球及其制备方法和应用。其中，该制备方法包括以下步骤：采用两亲性大分子通过乳液法包覆功能粒子，然后进行两亲性大分子的交联反应制备得到亚微米级功能球。应用本发明的技术方案，制备方法工艺简单，重复性好，易于实现批量化生产。

Description

亚微米级功能球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及胶体化学及生物技术领域，具体而言，涉及一种亚微米级功能球及其制备方法和应用。
背景技术
功能粒子包括有机荧光染料、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子、稀土荧光复合物和磁性粒子等。其中磁性粒子具有超顺磁性，强磁响应性，无生物毒性，可降解和较强的磁信号等特性，可以在外加磁场作用下实现快速磁分离，具有分离效率高、速度快和能耗低等优点。与细胞、蛋白质、核酸、聚合物和药物分子等偶联或者吸附后还可以作为分离介质、靶向药物载体和体内成像剂等，也在生物医学领域得到了非常广泛的应用。有机荧光染料具有成本优势，获取途径多；量子点、上转换纳米粒子、稀土荧光复合物等粒子的优势是荧光强度高，耐光漂白，色彩纯度高，环境耐受性好，光谱性能优异，但是仍存在转水相后配体不稳定，重金属离子可能泄露，偶联技术受限于表面配体，胶体稳定性差，纯化手段要求高等问题。
微球具有比表面积大、粒径形貌可控、表面可灵活修饰多种官能团等特点，尤其适合于生物医学用载体。将微球和多种功能粒子结合所形成的多功能球兼具两者的特性，在生物标记、生物分离和疾病诊断等领域具有传统材料无法比拟的性能优势。
按照功能粒子和微球的存在形式和组合方式，微球的制备思路主要分为溶胀法、原位合成法、自组装法、膜乳化法和乳液法等。但是这些方法存在包覆功能粒子分布不均匀，容易泄露；制备工艺繁琐，成本高，不容易实现批量化生产等问题。因此，开发一种高效、快捷、简单、低成本、可批量化生产的多功能球的制备方法十分必要。
发明内容
本发明旨在提供一种亚微米级功能球及其制备方法和应用，以解决现有技术中亚微米级功能球制备工艺繁琐的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种亚微米级功能球的制备方法。该制备方法包括以下步骤：采用两亲性大分子通过乳液法包覆功能粒子，然后进行两亲性大分子的交联反应制备得到亚微米级功能球。
进一步地，两亲性大分子为改性明胶、改性蛋白质、脂质体和葡聚糖中的一种或多种。
进一步地，功能粒子选自由有机荧光染料、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子、稀土荧光复合物和磁性粒子组成的组中的一种或多种。
进一步地，两亲性大分子修饰有羧基、氨基、点击化学基团、生物素基团中的一种或多种。
进一步地，乳液法为高速搅拌两亲性大分子形成乳液。
进一步地，交联剂与两亲性大分子的质量比为1:100～1:5。
进一步地，功能粒子与两亲性大分子的质量比为1:0.5～1:20。
进一步地，交联反应的反应时间为1～24小时，反应温度为4～70℃，搅拌转速为100～800rpm。
进一步地，两亲性大分子的交联反应制备得到亚微米级功能球为胶体粒子，胶体粒子粒径在80nm～300nm，而且粒径分布均一。
进一步地，两亲性大分子的修饰为加入至少一种修饰剂反应得到；修饰剂与两亲性大分子的摩尔比为1:1～3000:1。
根据本发明的另一方面，提供了一种亚微米级功能球。该亚微米级功能球具有核壳结构，其中，功能粒子作为核结构，两亲性大分子作为壳结构，功能粒子为光致发光粒子或者磁性粒子。
进一步地，亚微米级功能球的粒径在80～300nm。
根据本发明的又一方面，提供了一种上述亚微米级功能球在生物分子检测中的应用。
应用本发明的技术方案，制备方法工艺简单，重复性好，易于实现批量化生产。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例1中所得的610nm量子点荧光球(a)透射电镜图片，(b)水合粒径曲线，(c)荧光发射图谱。
图2示出了实施例1中多色量子点微球荧光光谱，激发波长为450nm，从左到右依次为525nm，565nm，585nm，610nm，625nm，655nm。
图3示出了实施例1中多色量子点微球图片：上图为自然光下，下图为紫外灯照射下。从左到右依次为525nm，565nm，585nm，610nm，625nm，655nm。
图4示出了实施例5中所得的磁性羧基球(a)透射电镜图片，(b)磁性粒子磁分离前和(c)磁性粒子磁分离3min图片。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
针对背景技术中记载的，现有技术中亚微米级功能球包覆功能粒子分布不均匀，容易泄露；制备工艺繁琐，成本高，不容易实现批量化生产等问题，本发明提出了下列技术方案。
本发明提供了一种亚微米级功能球的制备方法。该亚微米级功能球为核壳结构，其中核为大量密集分布的功能粒子，如有机荧光染料、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子、稀土荧光复合物和磁性粒子等；壳层为两亲性交联大分子，具有一定的生物相容性，可以选择性地修饰多种官能团，便于后期交联和偶联，实现微球表面多种分子的标记。本发明采用的制备方法工艺简单，重复性好，易于实现批量化生产，将抗原抗体的特异性与微球的超灵敏性结合起来，可用于多种生物检测技术，如免疫层析检测领域，生物标记等。亚微米级指的是大于1nm，但小于1微米的尺寸级别。
在本发明的技术方案中，以两亲性大分子为载体，将大量功能粒子包覆后制成胶体粒子，实现了荧光物质的信号放大或者磁性粒子的磁信号放大，壳层既可稳定功能粒子，降低功能粒子的毒性和泄漏风险，还能提高微球的生物相容性和胶体稳定性，又可在壳层表面修饰多种功能团，实现多种分子的标记。将抗原抗体的特异性与亚微米级功能球的超灵敏性结合起来，可用于多种生物检测技术，如免疫层析检测领域，生物标记等。
另外，在本发明的制备方法中核壳两层相对独立，核层基本为功能材料，从球心到球表面的尺度来看，功能粒子分布均匀；相比之下溶胀法等方法则是通过物理作用扩散进入，必然导致功能材料在球表面含量高，在球心处含量最低，这一点通过图1中a的电镜图片也可以看出。壳层的两亲性大分子则具有一定的厚度，而且交联之后形成致密层结构可以阻止功能粒子的泄露，也保证了该球本身功能特性(如磁强度或者荧光强度)的稳定性。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种亚微米级功能球的制备方法。该制备方法包括以下步骤：采用两亲性大分子通过乳液法包覆功能粒子，然后进行两亲性大分子的交联反应制备得到亚微米级功能球。优选的，两亲性大分子由改性蛋白质、脂质体、改性明胶、改性壳聚糖和葡聚糖中的一种或多种组成，该类物质具有一定的乳化能力和生物相容性。
功能粒子需要具备一定的功能性和稳定性，如荧光、磁性等，包括有机荧光染料、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子、稀土荧光复合物和磁性粒子等。功能粒子位于核，两亲性大分子为壳，可以将功能材料充分包覆起来，既可以防止功能材料泄露、溶出，还可以保护其不受所处环境物质的影响。如果不保护，量子点等功能材料会在酸碱性物质或者高盐浓度物质中被破坏而影响性能。根据实际需要，功能粒子选自由机荧光染料、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子、稀土荧光复合物和磁性粒子组成的组中的一种或多种，即核结构可以使用不同比例混合的磁性粒子和不同种类的荧光物质。
根据本发明一种典型的实施方式，两亲性大分子修饰有羧基、氨基、点击化学基团、生物素基团中的一种或多种，从而提高了亚微米级功能球的功能性，即壳结构也可选择性的修饰大量羧基、氨基、点击化学基团、生物素基团等单一基团或者两种不同比例的不同基团，可以通过一种方法制备多种荧光功能球、磁球或者荧光磁性复合功能球。
优选的，两亲性大分子的交联反应所用的交联剂为京尼平或者戊二醛，这两种交联剂交联效果好，成本低廉易得，不会带来副反应且易去除。
在本发明一种典型的实施方式中，交联剂与两亲性大分子的质量比为1:100～1:5，从而保证两亲性大分子的充分交联。不同种类功能粒子在实现其应用目标时所需要的最低负载量有所不同，所以功能粒子与两亲性大分子的质量比可以在1:0.5～1:20的范围内波动；交联反应时间则与交联温度成反相关关系：交联温度高，反应时间短，交联温度低，反应时间长；搅拌速度则根据反应液体积而定，以反应液能够充分搅动且不产生泡沫和飞溅的液滴为标准；优选的，交联反应的反应时间为1～24小时，反应温度为4～70℃，搅拌转速为100～800rpm。除了搅拌的手段之外，其他能形成乳液的方式也可。
两亲性大分子的交联反应制备得到亚微米级功能球为胶体粒子，优选的，胶体粒子粒径在80nm～300nm，而且粒径分布均一。换句话说，胶体粒子就是最终产物，交联后，可以是离心清洗后的粒子。粒径分布均一指检测粒径时的参数：粒径多分散系数(PDI)，该值小于0.1时粒径比较均一。粒径均一主要是通过制备工艺优化实现的，包括控制两亲性大分子与功能材料配比，及高速搅拌时间，交联剂用量，离心转数和清洗次数等。
优选的，两亲性大分子采用氯乙酸或丁二酸酐修饰为羧基，采用乙二胺修饰为氨基，采用点击活化试剂修饰为点击基团，或采用生物素活化试剂修饰为生物素基团；氯乙酸、丁二酸酐修饰、乙二胺、点击活化试剂或生物素活化试剂与两亲性大分子的摩尔比为1:1～3000:1。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种亚微米级功能球。该亚微米级功能球采用上述任一种制备方法制备得到。该亚微米级功能球具有核壳结构，其中，功能粒子作为核结构，交联反应后的两亲性大分子作为壳结构。
在一些实施例中，亚微米级功能球的粒径在80～300nm。优选的，亚微米级功能球的PDI小于0.1。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述亚微米级功能球在酶联免疫吸附、侧向免疫层析、细胞成像、流式细胞术和蛋白印迹中的应用。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
适量改性明胶在水中溶解，加入一定量的氯乙酸(改性明胶:氯乙酸摩尔比＝1:4.5)，在室温下搅拌反应5h，反应过程中保持溶液pH＝9。反应后取500ml的大分子溶液(5mg/ml)，将适量油溶性量子点(PL＝610nm，OD约为100)加入其中，开始高速搅拌(2000rpm)形成乳液。然后将乳液倒入三口烧瓶中，开启磁力搅拌，通入氮气，保证交联反应在氮气下进行，并加入2.5g交联剂戊二醛溶液(50％aq)，交联反应控制在8h左右。交联后的乳液使用超纯水高速离心清洗三次，最终所得胶体粒子分散在超纯水中即可得目标产物，即羧基量子点荧光球。
本发明所述的量子点由纳晶科技股份有限公司合成，主要为油溶性核壳结构量子点CdSe/ZnS，PL＝610nm。。
最终产物使用JEOL JEM-2200FS场发射透射电子显微镜在200kV的加速电压下观察形貌和粒径。使用Malvern公司ZS90型号的粒径仪及配套标准样品池，对微球样品进行流体力学直径(DH)，多分散系数(PDI)和表面电势(ZP)的表征。使用Shimadzu RF-5301PC荧光分光光度计，测定产品荧光强度并标定浓度。由图1中a可知该羧基量子点球中包覆大量量子点(根据统计计算结果为680-950个)，而且量子点均匀分布；图1中b为动态光散射测试所得的羧基量子点球的水合直径图谱，该水合直径峰型分布窄而均匀，峰值为126.7nm；图1中c为羧基量子点球的荧光发射图谱，显示了该球中包覆的量子点的荧光性能优异，发射光谱窄而对称，荧光效率高等。通过加入不同发射波长的量子点原料，发射波长如525nm，565nm，585nm，610nm，625nm和655nm等，则可以制得不同发射波长的量子点球。由图2、3可知，这些产物可以通过单一光源激发，实现多项目联合检测。
实施例2
适量改性蛋白质和葡聚糖在水中溶解，加入一定量的乙二胺(改性蛋白质:乙二胺摩尔比＝1:10)，在室温下搅拌反应24h。反应后取200ml的大分子溶液(15mg/ml)，将适量荧光染料加入其中，开始高速搅拌(2000rpm)形成乳液。然后将乳液倒入三口烧瓶中，开启磁力搅拌，通入氮气，保证交联反应在氮气下进行，并加入3g交联剂戊二醛溶液(50％aq)，交联反应控制在8h左右。交联后的乳液使用超纯水高速离心清洗三次，最终所得胶体粒子分散在超纯水中即可得目标产物，即氨基荧光球。
最终产物使用JEOL JEM-2200FS场发射透射电子显微镜在200kV的加速电压下观察形貌和粒径。使用Malvern公司ZS90型号的粒径仪及配套标准样品池，对微球样品进行流体力学直径(DH)，多分散系数(PDI)和表面电势(ZP)的表征。使用Shimadzu RF-5301PC荧光分光光度计，测定产品荧光强度并标定浓度。结果类似于实施例1。
实施例3
适量脂质体和葡聚糖在水中溶解，加入一定量的生物素活化试剂(脂质体:生物素活化试剂质量比＝1:8)，在室温下搅拌反应6h。反应后取50ml的大分子溶液(15mg/ml)，将适量铕和β-二酮类荧光复合物加入其中，开始高速搅拌(2000rpm)形成乳液。然后将乳液倒入三口烧瓶中，开启磁力搅拌，通入氮气，保证交联反应在氮气下进行，并加入0.75g交联剂戊二醛溶液(50％aq)，交联反应控制在8h左右。交联后的乳液使用超纯水高速离心清洗三次，最终所得胶体粒子分散在超纯水中即可得目标产物，即生物素稀土荧光球。
最终产物使用JEOL JEM-2200FS场发射透射电子显微镜在200kV的加速电压下观察形貌和粒径。使用Malvern公司ZS90型号的粒径仪及配套标准样品池，对微球样品进行流体力学直径(DH)，多分散系数(PDI)和表面电势(ZP)的表征。使用Shimadzu RF-5301PC荧光分光光度计，测定产品荧光强度并标定浓度。结果类似于实施例1。
实施例4
适量明胶在水中溶解，加入一定量的点击活化试剂(明胶:点击活化试剂摩尔比＝1:5)，在室温下搅拌反应4h。反应后取100ml的大分子溶液(20mg/ml)，将适量上转换纳米粒子加入其中，开始高速搅拌(2000rpm)形成乳液。然后将乳液倒入三口烧瓶中，开启磁力搅拌，通入氮气，保证交联反应在氮气下进行，并加入2g交联剂戊二醛溶液(50％aq)，交联反应控制在8h左右。交联后的乳液使用超纯水高速离心清洗三次，最终所得胶体粒子分散在超纯水中即可得目标产物，即点击上转换荧光球。
最终产物使用JEOL JEM-2200FS场发射透射电子显微镜在200kV的加速电压下观察形貌和粒径。使用Malvern公司ZS90型号的粒径仪及配套标准样品池，对微球样品进行流体力学直径(DH)，多分散系数(PDI)和表面电势(ZP)的表征。使用Shimadzu RF-5301PC荧光分光光度计，测定产品荧光强度并标定浓度。结果类似于实施例1。
实施例5
适量改性蛋白质和葡聚糖在水中溶解，加入一定量的氯乙酸(改性蛋白质:氯乙酸摩尔比＝1:8)，在室温下搅拌反应3h，反应过程中保持溶液pH＝9。反应后取500ml的大分子溶液(10mg/ml)，将适量磁性粒子(50mg/ml，15nm)一起加入其中，开始高速搅拌(2000rpm)形成乳液。然后将乳液倒入三口烧瓶中，开启磁力搅拌，通入氮气，保证交联反应在氮气下进行，并加入5g交联剂戊二醛溶液(50％aq)，交联反应控制在8h左右。交联后的乳液使用超纯水高速离心清洗三次，最终所得胶体粒子分散在超纯水中即可得目标产物，即磁性羧基球。由图4可知，该磁性羧基球中包覆有大量磁性粒子，可以有效提升磁性羧基球的磁响应性。
本发明所述的磁性粒子由纳晶科技股份有限公司合成，为15nm油溶性Fe3O4纳米粒子。
最终产物使用用JEOL JEM-2200FS场发射透射电子显微镜在200kV的加速电压下观察形貌和粒径。使用Malvern公司ZS90型号的粒径仪及配套标准样品池，对微球样品进行流体力学直径(DH)，多分散系数(PDI)和表面电势(ZP)的表征。
表1示出了实施例1-5制备的不同亚微米级功能球的水合粒径和表面电势数据。
表1
表1的5组数据说明该方法可以制备出具有不同功能材料、不同表面官能团的胶体粒子。粒径范围在80-300nm之间，其中实施例5的磁性粒子粒径稍大，主要是为了提升其磁性物质负载量，提高其磁响应性和磁分离能力；PDI介于0.05-0.15之间，表明粒子有较好的均一性；实施例2中氨基微球的表面电势大于30mV，其余都小于-25mV，这一参数证明了功能粒子自身的胶体稳定性，在4℃条件下可以储存1年以上而不发生聚集和沉淀，同时也说明该实施例中产品外壳表面具有丰富的相应官能团。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
1)解决了现有技术中功能微球信噪比低，稳定性差，制备工艺繁琐，成本高，不容易实现批量化生产等问题；
2)所需原料简单、廉价易得，制备方法简单，重复性好，可大规模生产；
3)可以通过一种方法制备多种荧光功能球、磁球或者荧光磁性复合功能球；
4)该亚微米级功能球尺寸分布窄，具有优异的胶体稳定性和荧光稳定性；
5)该亚微米级功能球表面化学性质可通过多样化修饰，获得多种表面反应性官能团。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改、替换和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种亚微米级功能球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用两亲性大分子通过乳液法包覆功能粒子，然后进行所述两亲性大分子的交联反应制备得到所述亚微米级功能球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述两亲性大分子为选自由改性明胶、改性蛋白质、脂质体和葡聚糖组成的组中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述功能粒子选自由有机荧光染料、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子、稀土荧光复合物和磁性粒子组成的组中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述两亲性大分子修饰有羧基、氨基、点击化学基团、生物素基团中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乳液法为高速搅拌所述两亲性大分子形成乳液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述两亲性大分子的交联反应中采用的交联剂与所述两亲性大分子的质量比为1:100～1:5。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述功能粒子与所述两亲性大分子的质量比为1:0.5～1:20。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联反应的反应时间为1～24小时，反应温度为4～70℃，搅拌转速为100～800rpm。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述两亲性大分子的交联反应制备得到所述亚微米级功能球为胶体粒子，所述胶体粒子粒径在80nm～300nm，而且粒径分布均一。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述两亲性大分子的修饰为加入至少一种修饰剂反应得到；所述修饰剂与所述两亲性大分子的摩尔比为1:1～3000:1。
11.一种亚微米级功能球，其特征在于，所述亚微米级功能球具有核壳结构，其中，功能粒子作为核结构，两亲性大分子作为壳结构，所述功能粒子为光致发光粒子或者磁性粒子。
12.根据权利要求11所述的亚微米级功能球，其特征在于，所述亚微米级功能球的粒径在80～300nm。
13.一种如权利要求11或12所述的亚微米级功能球在生物分子检测中的应用。
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