CN1688001A

CN1688001A - 纳米磁性微球和纳米磁性免疫微球及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN1688001A
Application number: CN 200510033784
Authority: CN
Inventors: 李富荣; 周汉新; 曹君剑; 齐晖; 任莉莉
Original assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2005-10-26
Anticipated expiration: 2025-03-30
Also published as: CN100573747C

Abstract

本发明公开了一种纳米磁性微球和纳米磁性免疫微球及它们的制备方法(反相微乳液法)和应用，同时还涉及含有这种纳米磁性微球或纳米磁性免疫微球的药物组合物。所述的纳米微球其中以含有胺基的生物可降解的高分子材料化学交联形成高分子包裹层，包裹层内还包含纳米磁性材料，磁性微球的平均粒径大小在20～800nm。而纳米磁性免疫微球，其中以纳米磁性微球为核，表面连接有生物活性物质。所述纳米磁性微球的生成方法，是在反相微乳液中，通过加入纳米磁性材料和高分子物质和交联剂反应而成。本发明的纳米磁性免疫微球在细胞分离、固定化酶、蛋白质的分离、免疫检测、免疫诊断方面具有广泛的用途。

Description

纳米磁性微球和纳米磁性免疫微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药学领域，具体涉及一种纳米磁性微球和纳米磁性免疫微球及它们的制备方法(反相微乳液法)和应用，同时还涉及含有这种纳米磁性微球或纳米磁性免疫微球的药物组合物。

背景技术

自从上个世纪70年代以来，磁性免疫微球迅速地在细胞的分离纯化、微生物分离和检测、检测和分离生物活性物质、细胞毒性等方面得到广泛的推广与应用。磁性高分子微球主要用物理或者化学方法在磁性金属或者氧化物纳米颗粒表面包裹一层高分子聚合物而制备的。这些高分子主要有苯乙烯和含有化学功能基团的单体(丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸钠、马来酸、衣康酸中的一种或者几种)的烯类单体的共聚物；以及一些天然的高分子化合物(明胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、蛋白类、淀粉等)和多糖类物质(壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖等)；半合成的高分子材料多为纤维素衍生物类以及人工合成生物降解材料如(聚乳酸、聚氰基丙烯酸酯、聚乳酸-聚乙二醇嵌段式共聚物、聚合酸酐)等。

在药学和生物学领域，由于涉及的微粒通常都包含一些较大空间体积的生物物质，颗粒平均直径小于1000nm的微粒都可称为纳米微球。

磁性高分子微球的结构主要三种：

核壳式结构，磁性物质做为内核，高分子材料做为壳层；核壳式结构，高分子材料作为壳层，磁性材料作为内核；壳核壳式结构。

磁性高分子微球的制备方法主要有化学沉淀法和包埋法。化学沉淀法是将铁离子和亚铁离子在碱性条件分散于高分子溶液中，通过乳化复合技术，透析、干燥等手段得到生物高分子磁性微球。在沉淀的过程中向溶液中加入生物高分子，生物高分子在Fe₃O₄的表面降低了Fe₃O₄表面自由能阻止了Fe₃O₄晶体的进一步凝聚。中国发明专利申请公开说明书(公开号：CN1376730A；国别：中国；公开日：2002年10月30日)中，公开了用共沉淀法制备琼脂糖微球。化学沉淀法得到的磁性微球一般来说粒径较小，但是磁响应性比较弱，不易形成规整的形状。

包埋法是将磁性粒子分散于高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得到高分子微球。此方法制备的磁性微球所需条件简单，易于进行，得到的磁性微球的粒径比较大、形状难以控制。

除此之外磁性高分子微球还有两种制备方法，单体共聚法和高分子微球磁化法。美国专利(公开号：USP4654267；国别，美国；公开日：1987年3月31日)就公开了一种高分子微球磁化法。首先制备好聚合物高分子微球，在多空的微球的孔内进行化学沉积铁的氧化物制备磁性高分子微球。用这种方法制备高分子微球需要用两步，制备方法复杂难以控制。单体聚合是在单体和适当的结构单元在磁性离子表面进行聚合反应，若加入交联剂可得到交联型高分子微球。发明专利申请公开说明书(公开号：CN 1328064A；国别：中国；公开日：2001年12月26日)公开了一种磁性聚合物纳米微球，其中采用采用苯乙烯单体引发聚合反应，生成高分子化合物。其一般不能用于生物领域。

磁性高分子微球的特点：

1.表面效应和体积效应：表面效应是指超细微粒的表面原子数与总原子数之比随着粒径变小而急剧增大，其表面能大大增加。表面原子的生长环境和结合能与内部原子不同，具有很大的化学活性，这是由于表面原子的周围缺少相邻的原子而具有不饱和性，易于其他原子结合而稳定下来。可见表面效应是一种影响化学特性的因素。体积效应是由于超细微粒包含的原子数减少而使带电能级加大，会使物质的一些物质性质因能级间歇的连续而发生异常。上述两种效应可具体反映在比表面激增，离子的稳定性大大提高。

2.磁效应：微球具有超顺磁性是磁性高分子微球应用的非常关键的因素。具有磁性可使生物高分子微球在外加磁场作用下方便的进行分离和磁性导向。当磁性四氧化三铁晶体直径小于30nm时，具有超顺磁性，即在磁场中有较强的磁性，没有磁场时磁性很快消失。从而生物高分子磁性微球能够在磁场中不被永久磁化。为了制得超顺磁性的磁性微球，美国专利公开了(公开号：USP4554088国别：美国；公开日：1985年9月19日)用硅烷聚合物包裹在超顺磁性的铁氧化物表面制得超顺磁性得磁性高分子微球。美国专利(公开号：USP5395688；国别：美国；公开日：1995年3月7日)也公开了用超顺磁性的金属氧化物聚合体混合层包裹有机聚合物核，来制备超顺磁性的磁性高分子微球。

3.功能基特性：生物高分子有多种反应活性功能基团，如-OH、-COOH、-NH₂可连接具有生物活性的物质，如单抗、免疫蛋白、生物酶等。

纳米磁粉制备磁性高分子微球解决了用其他材料制备出来的磁性高分子微球磁性不够强、负载能力差的缺点，用反相乳液法以碳包铁纳米颗粒和壳聚糖为材料制备出磁性壳聚糖复合微球。壳聚糖的结构见下图：

由于壳聚糖的化学性质稳定，耐热性好，特别是分子中存在胺基，既易于与酶共价结合，又可络合金属离子使酶免受金属离子的抑制。壳聚糖还具有良好的机械性能，而又易于通过接枝而改性，再加上来源丰富，成本低廉，制备简单是一种很有开发利用前景的载体材料。由于其表面的丰富的胺基和羟基，交联活化非常方便，有很高蛋白质的吸附容量。并且壳聚糖有良好的生物官能性、生物相容性和血液相容性，对细胞组织不产生毒性影响，无溶血效应，无热源性在医药学领域应用有很重要的意义。

发明内容

为了克服上述技术的缺点，本发明的目的是公开了一种纳米磁性微球和纳米磁性免疫微球，同时还公开了这种纳米磁性微球的制备方法以及纳米磁性免疫微球的制备方法、纳米磁性微球和纳米磁性免疫微球的应用。本发明所提供的纳米磁性微球和纳米磁性免疫微球是可生物降解的，并且具有亲水性的纳米磁性高分子微球。

其具体的技术方案如下：

一种纳米磁性微球，其中以含有胺基的生物可降解的高分子材料化学交联形成高分子包裹层，包裹层内还包含纳米磁性材料，磁性微球的平均粒径大小在20-800nm。较好的其中所述的平均粒径100-800nm，较好的平均粒径300-700nm，更好的平均粒径为400-600nm。更好的平均粒径为450-550nm。最好的平均粒径为480-520nm，此时，纳米磁性微球的粒径分布范围在200-800nm。所述的以含有胺基的生物可降解的高分子材料选自壳聚糖、明胶、白蛋白或聚丙稀酰胺一种或其组合，其含量占整个微球重量的50-95％，较好的是75-92％(w/w)(w/w代表质量百分比，俗称重量比，本文中未特别说明部分的百分含量都是指质量百分比)。所得到的高分子包裹层可以是多种材料的复合体。

所述的包裹层内的纳米磁性材料为纳米碳包铁粉末、纳米纯铁粉末、纳米四氧化三铁粉末、纳米三氧化二铁粉末、纳米钴粉末、纳米镍粉末、纳米钴氧化物、纳米镍氧化物、纳米钴镍氧化物之一或其组合，其含量占整个微球重量的5-30％(w/w)，较好地为10-20％。所述的纳米磁性材料平均粒径为0.1-300纳米，较好的为1-100纳米，更好的为1-50纳米。然而，在实际的制作过程中，纯净的铁粉或其它单质粉末容易与水或溶液反应，使反应的产率大为下降。

比较好的方式，所述的纳米磁性材料为纳米碳包铁粉末。所述的纳米碳包铁粉末平均粒径为0.1-300纳米，较好的平均粒径为1-100纳米，更好的为5-40纳米，更好的为20-30纳米，最好为25nm，此时该粉末的粒径大小在20-60nm之间，最大不超过60nm。最好采用深圳市尊业纳米材料有限公司生产的碳包铁粉末，具有较好的效果。此时粒径的大小，会严重影响最终形成的纳米磁性微球的稳定性。粒径太大，最终形成的纳米磁性微球将不能稳定的形成胶体溶液。外边所包覆几纳米后的碳膜，磁响应性好，性质稳定，不易被氧化。

最终，纳米磁性微球的组成在于包括下述物质：

纳米磁性材料 5-30％(w/w)；

高分子材料 50-95％(w/w)。

其它杂质为余量，纳米磁性微球的粒径分布范围在100-800纳米(不是平均粒径)。

较佳的，本产品的组成在于包括下述物质：

纳米碳包铁 10-20％(w/w)；

壳聚糖 75-92％(w/w)。

所述的其他杂质，主要指反应中遗留的反应物，如水、交联剂、有机溶剂等等，其含量为痕量。由于反应的不完善，其他杂质含量也可以增多。

一种纳米磁性免疫微球，其中以上述的纳米磁性微球为核，表面连接有生物活性物质。所述的生物活性物质，主要指蛋白质和核酸之一或组合，更主要指蛋白质。一般说来，蛋白质的吸附量随着蛋白质溶液的浓度的增加而增加。其吸附量可达到0-70毫克蛋白质/克纳米磁性微球。

关于纳米磁性微球中磁粉的含量，较好的，可采用原子吸收分光光度法测定。具体步骤可以是：准确称取20mg的纳米磁性微球，先后加入浓盐酸和浓硝酸溶解，稀释后，原子吸收光谱测定含量。然后根据所测铁的含量在折算出碳包铁粉末或四氧化三铁的量(如果采用纳米纯铁粉末，无需折算)。具体的取用量可根据实际情况变动。

纳米磁性微球的磁性性能实验测定，较好的采用透光率法。具体步骤可以如下：取10mg的阿霉素磁性微球超声分散在20ml蒸馏水中，取上清液。在1T的磁场中，2.5cm距离内，测定随时间变化的透光率。具体的取用量可根据实际情况变动。

有关检测方法的参考文章，为邱广亮，李咏兰，邱广明等，《肺靶向顺铂磁性白蛋白微球的制备及性质》，中国医药工业杂志，2001，32(12)：544-546页。

一种纳米磁性微球的制备方法(本发明所述的纳米磁性微球采用反相微乳液方法一步合成)，其包括以下步骤：

(1)形成微乳液：将含有胺基的生物可降解的高分子材料、纳米磁性材料，交联剂分散在酸性或中性的水溶液中，并加入由乳化剂和有机溶剂组成的体系，混合(或混合均匀)至成为反相微乳液，其中乳化剂占整个体系重量的5-45％(w/w)，酸性或中性的水溶液的量占整个体系重量的1-10％(w/w)，高分子材料占整个体系重量的0.01-0.2％(w/w)，交联剂的用量占整个体系重量的0.03-0.3％(w/w)，纳米磁性材料占整个体系重量的0.03-0.2％(w/w)，其余为有机溶剂；

较好的比例为，其中乳化剂占整个体系重量的10-30％，酸性或中性的水溶液的量占整个体系重量的2-8％，高分子材料占整个体系重量的0.05-0.15％，交联剂的用量占整个体系重量的0.05-0.15％，纳米磁性材料占整个体系重量的0.05-0.15％，其余为溶剂；

(2)固化反应：将步骤(1)所制得的反相乳液在室温下，不断混合(或混合均匀)0.1-5小时。较好的，所述的混合采用超声搅拌，也就是搅拌的时候辅助有超声波。

需要注意的是，所述乳化剂、高分子材料、交联剂、纳米磁性材料都是指以其本身作为计算基准的含量，而酸性或中性的水溶液的含量是以“酸性或中性的水溶液”为计算的基准，而不是以其中的溶质作为计算的基准。例如醋酸水溶液，是以“醋酸水溶液”作为计算的基准，而不是以“醋酸”作为计算的基准。而如果交联剂采用戊二醛，通常戊二醛是以水溶液的形态存在，这时，计算含量的基准仍以“戊二醛”为准，而不是以“戊二醛溶液”。

对于形成能够顺利进行反应的微乳液这一步骤，其关键的调控因素在于控制好不同时间内高分子材料与交联剂的加入比例与加入量，使之能够平顺的反应，在每一个油包水的微相上形成需要的纳米磁性微球。较好的方案是高分子材料壳聚糖溶液(可以是水溶液或醋酸溶液)浓度为0.5～1％，交联剂戊二醛水溶液的浓度在5-20％。这种情况下，有利于固化时间控制在0.1-5小时。

其中(1)所述的将含有胺基的生物可降解的高分子材料，纳米磁性材料，交联剂分散在酸性或中性的水溶液中，并滴入由乳化剂和有机溶剂组成的微乳体系，混合均匀至成为反相微乳液，比较好的方式可主要采用(包括)下列具体步骤：

i.把含有胺基的生物可降解的高分子材料溶于酸性或中性的水溶液中，形成初步的高分子溶液。在此步骤中，较好的选择，其醋酸溶液或水溶液的浓度在0.5-1％(w/w，代表质量比)。

ii.然后加入磁粉，混合均匀，形成匀相体系。较好的混合方法是采用超声搅拌。

iii.在加入部分稀释的交联剂，混合成均匀的磁性高分子混悬液。由于已加入部分交联剂，此时磁性高分子混悬液放置的时间不能过久，例如在30min以内为宜。

iv.将乳化剂和溶剂混合均匀，然后将上述的磁性高分子混悬液滴入乳化剂和溶剂的混合液中，形成均匀的反相乳液体系。

v.在加入剩余的大部分交联剂，不断混合均匀，较好的混合方法是采用超声搅拌。

需要说明的是，其中(1)所述形成微乳液仍然可以采用除上述方法以外的其他具体步骤来实现，而上述具体步骤是一种较佳的方式。

此时，经过固化反应，溶液中已形成纳米磁性微球，通常，为了进一步制备成品，还包括以下步骤：

(3)清洗；

(4)对清洗之后的纳米磁性微球进行干燥。

由于考虑到产品是用作医学检测，公知的，一般采用乙醇或其他易挥发的溶剂，进行磁性分离清洗。经过清洗所制得的产品，已具备基本使用功能。然而，由于在实际的使用过程中，对纳米磁性微球的量需要有一个准确的确定，并且，清洗之后的产品容易结块，而且含有很多杂质。因此，需要对清洗之后的纳米磁性微球进行干燥。较好的，采用冷冻干燥。

上述方法中的酸性或中性的水溶液中选自醋酸水溶液、水、盐酸水溶液、硫酸水溶液之一或其组合。其中所述的酸性或中性的水溶液中选自醋酸水溶液，一般说来，醋酸水溶液的浓度在3-6％(w/w)，w/w代表质量(重量)比。

其中所述方法的含有胺基的生物可降解的高分子材料选自壳聚糖、明胶、白蛋白或聚丙稀酰胺一种或其组合。较好的，其中所述的高分子材料采用壳聚糖。具体使用中，较好的是选用浓度为0.5-1％(w/w)的壳聚糖水溶液或壳聚糖醋酸水溶液，最好壳聚糖用2-8％的醋酸水溶液溶解。如果采用明胶、白蛋白或聚丙烯酰胺时，用水溶解较好。

其中所述的纳米磁性材料为纳米碳包铁粉末、纳米纯铁粉末、纳米四氧化三铁粉末、纳米三氧化二铁粉末、纳米钴粉末、纳米镍粉末、纳米钴氧化物、纳米镍氧化物、纳米钴镍氧化物之一或其组合，其平均粒径为1-100纳米。其中所述的纳米磁性材料较好的为纳米碳包铁粉末。所述的纳米碳包铁粉末较好的平均粒径为1-100纳米，更好的为20-60纳米。更好的为20-30纳米。最好为25nm，此时该粉末的粒径大小范围在20～60nm之间，最大不超过60nm。此时粒径的大小，会严重影响最终形成的磁性纳米微球的稳定性。粒径太大，最终形成的微球将不能稳定的形成胶体溶液。外边包覆几纳米后的碳膜，磁相应性好，性质稳定，不易被氧化。原料中采用更小的纳米磁性材料，则有利于形成更小的纳米磁性物微球。

所述方法中所用的交联剂选自戊二醛或三聚磷酸钠。一般来说，戊二醛是以水溶液的形态存在。而较好的，采用交联剂为浓度在5-20％(w/w)戊二醛水溶液(由市售戊二醛稀释而得)。

上述方法中的所提到的混合，较好的为超声搅拌方式。所述的超声搅拌，就是为超声波和搅拌同时进行。

上述方法中的乳化剂为气溶胶OT，所述的有机溶剂为长链脂肪烷烃或者芳香烃。较好的，所述的有机溶剂是甲苯。所述的混合为超声搅拌。

所述的方法中，固化的时间控制在0.5～5h内为好。时间太长，对于实际生产而言无意义。本发明中，反应的时间超过2h，固化效果为好。

一种上述纳米磁性免疫微球的制作方法，其包括以下步骤：

1)上述纳米磁性微球的制作步骤(也就是先制成纳米磁性微球，可以是直接生成的纳米磁性微球，也可以是清洗干燥后的纳米磁性微球)。

2)吸附生物活性物质，制成纳米免疫微球。

较好的，上述的步骤(1)之后还进一步包括活化的步骤，具体为：在纳米磁性微球制作好之后，将磁性微球用活化剂活化，然后吸附生物活性物质。

另外，一种情况下将固化反应后的纳米磁性微球直接用活化剂活化，然后吸附生物高分子，制成磁性免疫微球。较好的方式是采用清洗干燥后的微球，用活化剂活化，然后吸附生物活性物质，制成免疫微球。

关于活化的步骤，也可以省略。但采用活化，可以获得更好的纳米免疫微球。其中所述的活化剂为戊二醛。活化剂是为了在磁性微球上形成更多的基团更好的与蛋白质的氨基相联。所述的生物活性物质，主要指蛋白质和核酸之一或组合，更主要指蛋白质。

公知的，需要对吸附蛋白质后的磁性免疫微球进行磁性分离清洗，具体可参见文中上述的纳米磁性微球的清洗。一般纳米磁性免疫微球制成之后也无须干燥。

本发明还公开了一种用于免疫检测的试剂组合物，其中含有检测有效量的上述的纳米磁性微球和药学上可接受的载体，或者含有检测有效量的上述的纳米磁性免疫微球和药学上可接受的载体。所属的载体，主要指PBS(磷酸盐缓冲液)、防腐剂等等。

本发明还公开所述的纳米磁性免疫微球，在细胞分离、固定化酶、蛋白质的分离、免疫检测、免疫诊断方面的应用。

目前，国际上磁性高分子微球主要侧重于疏水高分子组成的微米级微球。比较而言，本发明用反相微乳液交联制备的纳米磁性微球具有以下特点：(1)用本方法中较好的实施条件下制备的磁性高分子微球粒径范围在100-800nm；磁性高分子微球的平均粒径可在500nm左右。(2)微球的粒径可以由乳化剂的用量和油相的选择来控制；(3)由于本发明的纳米磁性微球由亲水性的可生物降解材料组成，因此本发明产品具有良好的亲水性。同时，相对于过去的产品(参见发明专利申请公开说明书，公开号：CN 1328064A；国别：中国；公开日：2001年12月26日，公开了一种磁性聚合物纳米微球，其中采用采用苯乙烯单体引发聚合反应，生成高分子化合物)，由于本产品的高分子层中是采用交联反应制得，远远超过苯乙烯单体引发聚合所形成的包裹层中的活性基团，能够更好的吸附蛋白质，同时又具有良好的生物相容性，可用于医学和生物领域。(4)制备方法简单，重现性好。(5)纳米磁性微球的磁响应性好，表面平整。

附图说明

图1是实施例1中的纳米碳包铁纳米颗粒和纳米磁性壳聚糖微球对比透射电镜图。

图2是实施例1的纳米磁性壳聚糖微球磁沉降曲线图。

图3是实施例1的活化后的纳米磁性壳聚糖微球的蛋白吸附曲线图。

具体实施方式

实施利1：取30mg碳包铁纳米磁粉(深圳市尊业纳米材料有限公司生产，型号为JY-FeC，平均粒径为25nm，最大粒径为60nm)，50mg壳聚糖(济南海得贝海洋生物工程公司提供，脱乙酰度＞95.7％)溶于5mlHAC(6％)中，超声混匀，滴入0.5ml，15％的戊二醛水溶液。然后，将上述混悬液超声和搅拌条件下，逐滴滴入(10min之内)预先配置好的甲苯溶液，也就是20gAOT溶于50ml甲苯中(所述的AOT，为气溶胶OT，分子式为C₂₀H₃₇NaO₇S，分子量为444.56，由上海巨枫化学科技有限公司采购，嘉善巨枫化工厂生产，皂价为220-225)。继续超声搅拌15min，4小时后，停止搅拌，磁性分离清洗用乙醇和水各洗涤3遍，真空干燥备用。参见图1，左边是是碳包铁纳米颗粒透射电镜照片，图中的对比显示比例为100nm；右边是纳米磁性壳聚糖微球透射电镜照片，图中的对比显示比例为1μm(微米)；对比可以看出，所制备的纳米壳聚糖磁性微球的粒径范围在200-800nm，分散性好，高分子包裹均匀，微球中铁含量为12.6％，碳含量为3.2％，其余为高分子含量。其磁沉降曲线如图2(曲线1为微球悬浮液在重力场中的沉降曲线，曲线2为微球悬浮液在0.42T磁场中的沉降曲线)。在0.42T的磁场中，纳米磁性微球稀的悬浮液，吸光度很快就达到85％以上，而在重力场中40min之内吸光度几乎没有改变。活化以后的纳米磁性微球的蛋白质吸附曲线3如图3。从图中可以看出，纳米磁性微球相比较于公知的产品，具有更好的蛋白质吸附性能。

注意，以下实施例未提及部分与实施例1相同。

实施利2：取20mg碳包铁纳米磁粉，75mg壳聚糖溶于5mlHAC(2％)中，超声混匀，滴入0.5ml，10％的戊二醛水溶液.然后，将上述混悬液超声和搅拌条件下，逐滴滴入(10min之内)预先配置好的甲苯溶液(20gAOT溶于50ml甲苯中)。继续超声搅拌15min，4小时后，停止搅拌，磁性分离清洗用乙醇和水各洗涤3遍，真空干燥备用。

实施利3：取30mg纯铁纳米磁粉，100mg壳聚糖溶于10mlHAC(3％)中，超声混匀，滴入1ml，20％的戊二醛水溶液.然后，将上述混悬液超声和搅拌条件下，逐滴滴入(10min之内)预先配置好的甲苯溶液(35gAOT溶于100ml甲苯中)。继续超声搅拌15min，4小时后，停止搅拌，磁性分离清洗用乙醇和水各洗涤3遍，真空干燥备用。

实施利4：取15mgFe₃O₄纳米磁粉，50mg明胶溶于5ml水中，超声混匀，滴入0.5ml，12.5％的戊二醛水溶液.然后，将上述混悬液超声和搅拌条件下，逐滴滴入(10min之内)预先配置好的甲苯溶液(20gAOT溶于50ml甲苯中)。继续超声搅拌15min，4小时后，停止搅拌，磁性分离清洗用乙醇和水各洗涤3遍，真空干燥备用。

实施利5：取37.5mg碳包铁纳米磁粉，75mg壳聚糖溶于5mlHAC(6％)中，超声混匀，滴入0.5ml，20％的戊二醛水溶液.然后，将上述混悬液超声和搅拌条件下，逐滴滴入(10min之内)预先配置好的甲苯溶液(15gAOT溶于50ml甲苯中)。继续超声搅拌15min，3-4小时后，停止搅拌，磁性分离清洗用乙醇和水各洗涤3遍，真空干燥备用。

本发明可用其它的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在与本发明权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种纳米磁性微球，其中以含有胺基的生物可降解的高分子材料为包裹层，包裹层内还包含纳米磁性材料，纳米磁性微球的平均粒径大小在20～800nm。

2.根据权利要求1所述的纳米磁性微球，其中所述的平均粒径为100-800nm。

3.根据权利要求2所述的纳米磁性微球，其中所述的平均粒径为400-600nm。

4.根据权利要求1-3任一所述的纳米磁性微球，其中所述的含有胺基的生物可降解高分子材料选自壳聚糖、明胶、白蛋白或聚丙稀酰胺一种或其组合，其含量占整个微球重量的50-95％(w/w)。

5.根据权利要求4述的纳米磁性微球，其中所述的包裹层内的纳米磁性材料为纳米碳包铁粉末、纳米纯铁粉末、纳米四氧化三铁粉末、纳米三氧化二铁粉末、纳米钴粉末、纳米镍粉末、纳米钴氧化物、纳米镍氧化物、纳米钴镍氧化物之一或其组合，其含量占整个微球重量的5-30％(w/w)。

6.一种纳米磁性免疫微球，其中以权利要求1-5任一所述的纳米磁性微球为核，表面连接有生物活性物质。

7.根据权利要求6所述纳米磁性免疫微球，其中所述的生物活性物质为蛋白质、核酸之一或组合。

8.一种权利要求1-7任一所述的纳米磁性微球的制备方法，其包括以下步骤：

(1)形成微乳液：将含有胺基的生物可降解的高分子材料、纳米磁性材料，交联剂分散在酸性或中性的水溶液中，并加入由乳化剂和有机溶剂组成的体系，混合至成为反相微乳液，其中乳化剂占整个体系重量的5～30％，酸性或中性的水溶液的量占整个体系重量的2-8％，高分子材料占整个体系重量的0.001-0.1％，交联剂的用量占整个体系重量的0.05-0.3％，纳米磁性材料占整个体系重量的0.04-0.2％，其余为有机溶剂；

(2)固化反应：将步骤(1)所制得的反相微乳液在室温下，不断混合0.1-5小时。

9.根据权利要求8所述制备方法，其进一步包括以下步骤：

(3)清洗；

(4)对清洗之后的磁性微球进行干燥。

10.根据权利要求8或9所述制备方法，其中所述的在酸性或中性的水溶液中选自醋酸水溶液、水、盐酸水溶液、硫酸水溶液之一或其组合。

11.根据权利要求10所述制备方法，其中所述的酸性或中性的水溶液中选自醋酸水溶液，醋酸水溶液的浓度在3～6％。

12.根据权利要求8或9所述的制备方法，其中所述的含有胺基的生物可降解的高分子材料选自壳聚糖、明胶、白蛋白或聚丙稀酰胺一种或其组合。

13.根据权利要求12所述的的制备方法，其中所述的高分子材料是壳聚糖。

14.根据权利要求8或9所述的制备方法，其中所述的纳米磁性材料为纳米碳包铁粉末、纳米纯铁粉末、纳米四氧化三铁粉末、纳米三氧化二铁粉末、纳米钴粉末、纳米镍粉末、纳米钴氧化物、纳米镍氧化物、纳米钴镍氧化物之一或其组合，其平均粒径为1-100纳米。

15.根据权利14要求所述的制备方法，其中所述的纳米磁性材料为纳米碳包铁粉末。

16.根据权利要求8或9所述的制备方法，其中所述的交联剂是戊二醛或三聚磷酸钠。

17.根据权利要求8或9所述的制备方法，其中所述的乳化剂为气溶胶OT，所述的有机溶剂为长链脂肪烷烃或者芳香烃。

18.根据权利要求17所述的制备方法，其中所述的有机溶剂是甲苯。

19.根据权利要求8或9所述的制备方法，其中所述的混合为超声搅拌。

20.一种权利要求6所述纳米磁性免疫微球的制备方法，其依次包括以下步骤：

1)权利要求8-19任一所述的制作纳米磁性微球的步骤；

2)用活化剂活化；

3)吸附生物活性物质；或

1)权利要求8-19任一所述的制作纳米磁性微球的步骤；

2)吸附生物活性物质。

21.根据权利要求20所述的制备方法，其中所述的活化剂为戊二醛，所述的生物活性物质为蛋白质或核酸之一或组合。

22.一种用于检测的药物组合物，其中含有检测有效量的权利要求1-5任一所述的纳米磁性微球和药学上可接受的载体，或者含有检测有效量的权利要求6所述的纳米磁性免疫微球和药学上可接受的载体。

23.一种权利要求6或7任一所述的纳米磁性免疫微球在细胞分离、固定化酶、蛋白质的分离、免疫检测、免疫诊断方面的应用。