CN112034159B - 一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途 - Google Patents

一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112034159B
CN112034159B CN202010925008.4A CN202010925008A CN112034159B CN 112034159 B CN112034159 B CN 112034159B CN 202010925008 A CN202010925008 A CN 202010925008A CN 112034159 B CN112034159 B CN 112034159B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
magnetic
buffer
gelatin
crosslinking
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010925008.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112034159A (zh
Inventor
王铎
来祥兵
李重阳
舒芹
张雪娇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Original Assignee
Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd filed Critical Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Priority to CN202010925008.4A priority Critical patent/CN112034159B/zh
Publication of CN112034159A publication Critical patent/CN112034159A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112034159B publication Critical patent/CN112034159B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
    • G01N2446/84—Polymer coating, e.g. gelatin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
    • G01N2446/86—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids the coating being pre-functionalised for attaching immunoreagents, e.g. aminodextran
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途，将氨基磁珠和明胶在二酐类有机酸酐引发剂的作用下反应，获得磁性明胶微球；使用NHS溶液、EDC溶液和AEM将所述磁性明胶微球进行活化，获得马来酰胺化的磁性明胶微球溶液；获得活化抗体溶液；将所述马来酰胺化的磁性明胶微球溶液与所述活化抗体溶液进行偶联反应，获得偶联反应液；将所述偶联反应液进行封闭，后进行磁分离获得固体，将所述固体使用保存缓冲液重悬后，获得凝胶化免疫磁珠；本发明的凝胶化免疫磁珠能够提高抗体的接枝率及保留抗体的活性，该免疫磁珠应用到化学发光免疫分析项目中，从而提高项目的灵敏度及稳定性。

Description

一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途。
背景技术
免疫磁珠是磁性微球与免疫蛋白结合而成的一种功能型复合物。免疫磁珠与目标物进行特异性免疫后，在磁场的作用下，可以从混合溶液分离出目标物。基于上述特性，免疫磁珠作为一种重要组分广泛应用于化学发光免疫分析中。而作为免疫磁珠载体的磁性微球的亲水性能会影响免疫磁珠的抗非特异性吸附性能，同时，其悬浮性能会影响免疫磁珠的稳定性。
明胶是一种链上带有多种活性官能团(-NH2、-COOH、-OH等)的水溶性天然聚合物。明胶肽链上的游离-NH2可通过酰化反应、还原胺化反应等被许多化合物化学修饰，从而提高明胶的凝胶性、亲水性、力学性等。因此可通过明胶上的-NH2修饰将明胶包覆在磁核表面，从而得到具有较好的亲水性和凝胶性能的磁性微球。
对比文件1：公开号为“CN108508195A”，名称为“一种免疫磁珠及其制备方法及应用”公开了一种以戊二醛法合成的有机凝胶型免疫磁珠，该制备方法利用金属-有机凝胶固定蛋白的性质，将抗体与四氧化三铁同时固定于金属-有机凝胶固体系中，该法简单方便，但制备得到的免疫磁珠容易造成抗体自交联，抗体接枝率低，免疫磁珠团聚严重。
因此，如何开发一种抗体自交联少，抗体的接枝率高、抗体的活性高的凝胶化免疫磁珠及其制备方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途，采用二酐类有机酸酐作为引发剂让明胶的游离-NH2与氨基磁珠发生反应，通过明胶上的-NH2修饰将明胶包覆在磁核表面获得磁性明胶微球；使用NHS溶液、EDC溶液和AEM将所述磁性明胶微球进行活化，获得马来酰胺化的磁性明胶微球，将马来酰亚胺化的磁性明胶微球与带有巯基基团的抗体反应，游离巯基可以定向与马来酰亚胺基团发生选择性加成反应，从而实现定向偶联；这种定向偶联方式可以减少抗体自交联，磁珠团聚的同时能够提高抗体的接枝率及保留抗体的活性。
为了实现上述目的，本发明提供了一种凝胶化免疫磁珠的制备方法，所述方法包括：
将氨基磁珠和明胶在二酐类有机酸酐引发剂的作用下反应，获得磁性明胶微球；
使用NHS溶液、EDC溶液和AEM将所述磁性明胶微球进行活化，获得马来酰胺化的磁性明胶微球溶液；
获得活化抗体溶液；
将所述马来酰胺化的磁性明胶微球溶液与所述活化抗体溶液进行偶联反应，获得偶联反应液；
将所述偶联反应液进行封闭，后进行磁分离获得固体，将所述固体使用保存缓冲液重悬后，获得凝胶化免疫磁珠。
进一步地，所述二酐类有机酸酐包括丁烷羧酸二酐、环丁烷四甲酸二酐、环戊烷四羧酸二酐、均苯四甲酸二酐、双环己基-3,4,3',4'-四酸二酐和4,4'-二邻苯二甲酸酐中的一种。
进一步地，所述将氨基磁珠和明胶在二酐类有机酸酐引发剂的作用下反应，获得磁性明胶微球，具体包括：
使用交联缓冲液A将氨基磁珠进行清洗，磁分离后获得沉淀，后使用所述交联缓冲液A将所述沉淀重悬获得氨基磁珠溶液；
将所述氨基磁珠溶液加入明胶混匀获得混合溶液，后所述混合溶液中加入二酐类有机酸酐引发剂进行反应，磁分离后获得磁性明胶微球。
进一步地，所述交联缓冲液A为磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液和硼酸缓冲液中的一种或多种；所述氨基磁珠溶液中氨基磁珠的浓度为0.5％～1.5％；所述明胶的终浓度为1％～4％；所述二酐类有机酸酐引发剂的终浓度为0.001％～0.1％。
进一步地，所述使用NHS溶液、EDC溶液和AEM将所述磁性明胶微球进行活化，获得马来酰胺化的磁性明胶微球溶液，具体包括：
将所述磁性明胶微球分散在交联缓冲液B中，获得磁性明胶微球溶液；
将所述磁性明胶微球溶液加入NHS溶液和EDC溶液，混匀后加入AEM进行活化反应获得活化溶液，将所述活化溶液磁清洗后使用所述交联缓冲液B重悬，获得马来酰胺化的磁性明胶微球溶液。
进一步地，所述NHS溶液和所述EDC溶液的终浓度均为0.01％～0.1％；所述AEM的终浓度为0.01％～1％；所述磁性明胶微球溶液的浓度为0.5％～2％。
进一步地，所述获得活化抗体溶液，包括：
将抗体使用交联缓冲液B稀释至终浓度为0.1％～0.5％，混匀后加入终浓度为0.1％～0.5％Traut’s试剂，获得活化抗体溶液，所述交联缓冲液B为磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液和硼酸缓冲液中的一种或多种。
进一步地，所述马来酰胺化的磁性明胶微球溶液与所述活化抗体溶液的体积比为(8～12)：1。
本发明还提供了所述方法制备得到的凝胶化免疫磁珠。
本发明还提供了所述的凝胶化免疫磁珠在制备化学发光免疫试剂盒中的用途。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法，(1)采用二酐类有机酸酐作为引发剂让明胶的游离-NH2与氨基磁珠发生反应，通过明胶上的-NH2修饰将明胶包覆在磁核表面获得磁性明胶微球，在包覆磁核的同时将引入大量的-COOH基团，这些被引入的-COOH可大幅度提高所述磁性明胶微球的亲水性、力学性；(2)传统的抗体与磁珠的化学接枝方式是EDC活化法及戊二醛法，二者存在抗体自交联，免疫磁珠团聚严重，抗体接枝率低等情况。本发明使用NHS溶液、EDC溶液和AEM将所述磁性明胶微球进行活化，获得马来酰胺化的磁性明胶微球，将马来酰亚胺化的磁性明胶微球与带有巯基基团的抗体反应，游离巯基可以定向与马来酰亚胺基团发生选择性加成反应，从而实现定向偶联；这种定向偶联方式可以减少抗体自交联，能够提高抗体的接枝率及保留抗体的活性。该凝胶化免疫磁珠的亲水性、抗非特异性吸附性能、悬浮性好；将该免疫磁珠应用到化学发光免疫分析项目中，从而提高项目的灵敏度及稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明提供的一种凝胶化免疫磁珠的制备方法的流程图；
图2为二酐类有机酸酐的结构式；
图3为各组别的免疫磁珠悬浮状态图；
图4长期稳定性发光值-时间图；其中，图3-图4中的实例组1为本发明的实施例1；实例组2为本发明的实施例2。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种凝胶化免疫磁珠的制备方法，如图2所示，包括：
S1、将氨基磁珠和明胶在二酐类有机酸酐引发剂的作用下反应，获得磁性明胶微球；
S2、使用NHS溶液、EDC溶液和AEM将所述磁性明胶微球进行活化，获得马来酰胺化的磁性明胶微球溶液；
S3、获得活化抗体溶液；
S4、将所述马来酰胺化的磁性明胶微球溶液与所述活化抗体溶液进行偶联反应，获得偶联反应液；
S5、将所述偶联反应液进行封闭，后进行磁分离获得固体，将所述固体使用保存缓冲液重悬后，获得凝胶化免疫磁珠。
本发明提供的一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法，(1)采用二酐类有机酸酐作为引发剂让明胶的游离-NH2与氨基磁珠发生反应，通过明胶上的-NH2修饰将明胶包覆在磁核表面获得磁性明胶微球，在包覆磁核的同时将引入大量的-COOH基团，这些被引入的-COOH可大幅度提高所述磁性明胶微球的亲水性、力学性；(2)传统的抗体与磁珠的化学接枝方式是EDC活化法及戊二醛法，二者存在抗体自交联，免疫磁珠团聚严重，抗体接枝率低等情况。本发明使用NHS溶液、EDC溶液和AEM将所述磁性明胶微球进行活化，获得马来酰胺化的磁性明胶微球，将马来酰亚胺化的磁性明胶微球与带有巯基基团的抗体反应，游离巯基可以定向与马来酰亚胺基团发生选择性加成反应，从而实现定向偶联；这种定向偶联方式可以减少抗体自交联，能够提高抗体的接枝率及保留抗体的活性。该凝胶化免疫磁珠的亲水性、抗非特异性吸附性能、悬浮性好；将该免疫磁珠应用到化学发光免疫分析项目中，从而提高项目的灵敏度及稳定性。
该实施方式中，
所述氨基磁珠为表面含有氨基的聚苯乙烯微球；所述聚苯乙烯微球球粒径介于50nm～500nm之间。
所述NHS溶液：NHS浓度介于1ug/ml至500ug/ml，所述的NHS可以用纯水溶解，也可以用乙醇溶解，也可以用活化溶液溶解；所述NHS溶液优选为ulfo-NHS溶液，由于sulfo-NHS的连接反应效率比NHS要高，另外sulfo-NHS具有负电荷不易造成连接底物(例如蛋白质)聚合。本实施例中采用sulfo-NHS溶液。
所述EDC溶液：EDC浓度介于1ug/ml至500ug/ml，所述的EDC可以用纯水溶解，也可以用HCl溶解，也可以用活化溶液溶解。本实施例中采用EDC·HCl溶液。
所述AEM是一种带有马来酰亚胺基团的试剂。本实施例中AEM购买自Sigma-Aldrich，货号为56951。
所述保存缓冲液：磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液、TRIS缓冲液中的一种或多种，本实施例中选用50mM pH 8.0TRIS缓冲液。所述保存缓冲液中可以含有一定浓度的表面活性剂。所述的表面活性剂一般包括但不限于曲拉通X-100、吐温20、brij-35、OP-10、Tetronic1307等。所述表面活性剂的浓度是0.02％(W/W)-1％(W/W)。复溶溶液中可以含有一定浓度的多羟基化合物，多羟基化合物包括但不限于蔗糖、海藻糖、HPMC、壳聚糖等。所述所述保存缓冲液中还可以含有一定浓度的蛋白，所述蛋白包括但不限于BSA、酪蛋白、明胶、脱脂奶粉等。
所述二酐类有机酸酐包括丁烷羧酸二酐、环丁烷四甲酸二酐、环戊烷四羧酸二酐、均苯四甲酸二酐、双环己基-3,4,3',4'-四酸二酐和4,4'-二邻苯二甲酸酐中的一种。如图3所示。二酐类有机酸酐可以用来作为功能单体合成高分子有机聚合物，但是在磁珠合成包覆方面未见相关报道。本申请人经试验发现：二酐类有机酸酐能让明胶的游离-NH2与氨基磁珠发生反应的引发剂，在包覆磁核的同时将引入大量的-COOH基团。这些被引入的-COOH可大幅度提高磁性微球的亲水性、力学性。
所述步骤S1中，所述将氨基磁珠和明胶在二酐类有机酸酐引发剂的作用下反应，获得磁性明胶微球，具体包括：
使用交联缓冲液A将氨基磁珠进行清洗，磁分离后获得沉淀，后使用所述交联缓冲液A将所述沉淀重悬获得氨基磁珠溶液；
将所述氨基磁珠溶液加入明胶混匀获得混合溶液，后所述混合溶液中加入二酐类有机酸酐引发剂进行反应，磁分离后获得磁性明胶微球。
其中，所述交联缓冲液A为磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液和硼酸缓冲液中的一种或多种；本发明实施例中交联缓冲液A选用100mM pH 8.5硼酸缓冲液。
所述氨基磁珠溶液中氨基磁珠的浓度为0.5％～1.5％；浓度过高容易导致磁珠自交联，浓度过低容易导致磁性明胶微球产率下降。
所述明胶的终浓度为1％～4％；过高导致反应体系粘度过大，容易导致反应不充分等不利影响，过低导致磁珠上明胶包覆不完全，对包覆后的磁性明胶微球的悬浮性及力学性能产生不利影响。
所述二酐类有机酸酐引发剂的终浓度为0.001％～0.1％。二酐类有机酸酐一方面是作为明胶包覆上磁珠发生聚合反应的引发剂，一方面是作为明胶的改性剂，过高会导致磁珠自交联严重；另一方面，引发剂浓度使明胶改性程度高，使得形成后的磁性明胶微球吸水溶胀性能变差，从而对磁性明胶微球的悬浮性能产生不利影响。过低会使明胶改性程度低，容易水解，使得形成后的磁性明胶微球力学性能不够，对稳定性产生不利影响。
所述反应条件为采用常温混匀，为更好的混匀，反应过程中可每隔一段时间超声分散一下，具体地，本发明实施例中采用25℃±5℃漩涡混匀1～3h，反应过程中每隔8～12min超声分散4～6s。
所述步骤S2中，所述使用NHS溶液、EDC溶液和AEM将所述磁性明胶微球进行活化，获得马来酰胺化的磁性明胶微球溶液，具体包括：
将所述磁性明胶微球分散在交联缓冲液B中，获得磁性明胶微球溶液；
将所述磁性明胶微球溶液加入NHS溶液和EDC溶液，混匀后加入AEM进行活化反应获得活化溶液，将所述活化溶液磁清洗后使用所述交联缓冲液B重悬，获得马来酰胺化的磁性明胶微球溶液。
其中，所述NHS溶液和所述EDC溶液的终浓度均为0.01％～0.1％；过高有造成试剂的浪费、改变反应性的pH等不利影响，过低导致活化的羧基基团不够，会对马来酰胺基接枝率不利影响，从而影响后续抗体的接枝率。
所述AEM的终浓度为0.01％～1％；过高有造成试剂的浪费等不利影响，过低会对马来酰胺基接枝率不利影响，从而影响后续抗体的接枝率。
所述磁性明胶微球溶液的浓度为0.5％～2％。过高会使磁珠明胶微球无法充分分散开，会降低马来酰胺基接枝率，过低影响磁珠明胶微球活化反应速率，也会降低马来酰胺基接枝率。
所述步骤S3中，所述获得活化抗体溶液，包括：
将抗体使用交联缓冲液B稀释至终浓度为0.1％～0.5％，混匀后加入终浓度为0.1％～0.5％Traut’s试剂，获得终浓度为0.01％～0.1％的活化抗体溶液，
反应中抗体含量在0.1～0.5％，若抗体含量小，活化反应速率低，活化程度低；若抗体含量大，反应过程中受活化剂影响容易产生沉淀。Traut’s试剂含量在0.01％～0.1％，若含量过小活化反应速率低，活化程度低，若含量过大，容易造成抗体失活。
其中，所述交联缓冲液B为磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液和硼酸缓冲液中的一种或多种。本发明实施例中交联缓冲液B选用100mM pH 7.0HEPES缓冲液。
所述步骤S4中，所述马来酰胺化的磁性明胶微球溶液与所述活化抗体溶液的体积比为(8～12)：1。所述体积比优选为10：1，所述体积比过高容易造成抗体接枝率低，过低造成抗体的浪费。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了所述方法制备得到的凝胶化免疫磁珠，该凝胶化免疫磁珠亲水性、抗非特异性吸附性能、悬浮性好，且抗体自交联少，抗体的接枝率高、抗体的活性高。
根据本发明另一种典型的实施方式，本发明实施例还提供了所述的凝胶化免疫磁珠在制备化学发光免疫试剂盒中的用途，将该免疫磁珠应用到化学发光免疫分析项目中，从而提高项目的灵敏度及稳定性。
将本发明的凝胶化免疫磁珠用于制备化学发光免疫试剂盒时，所述磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，包括R试剂和M试剂；
所述R试剂为提前准备好的的工作液，主要组分为碱性磷酸酶标记的抗体，本实施例为碱性磷酸酶标记的CTNI 1。
所述M试剂为以M缓冲液将本发明得到的凝胶化免疫磁珠稀释成工作液备用。所述M缓冲液：25mM TRIS，0.5g/L甲基纤维素，0.1％PC-300，pH值为8.0。
所述化学发光免疫试剂盒的检测方法如下：
(1)将碱性磷酸酶标记的抗体稀释后混合得到酶结合物工作液(即R试剂)，碱性磷酸酶标记的抗体与稀释液的体积比为1:500～1:5000；以M缓冲液将本发明得到的凝胶化免疫磁珠稀释成工作液(即M试剂)；
(2)将所述酶结合物工作液(即R试剂)、磁微粒偶联抗体溶液(即M试剂)、发光底物、发光清洗液在室温下平衡至少30min，将平衡好的试剂加载至全自动化学发光仪；全自动化学发光仪经过系列操作后得出发光强度值并根据发光强度值与待测抗原的浓度的比例关系计算得到待测血清或血浆中的待测抗原的浓度值。
全自动化学发光仪操作流程如下：
在反应容器中加入20μL校准品或经过分离的待测血清(或血浆)、50μL磁微粒偶联抗体溶液，50ul酶结合物工作液，混匀后37℃反应15min形成磁微粒偶联抗体-抗原-酶标记物抗体复合物，进行磁性分离，吸除上清，向复合物中加入发光清洗液进行洗涤，洗涤后置于磁性分离器中分离并吸除上清，重复洗涤分离3次。向其中加入200uL发光底物液，混匀孵育5min。将容器转入化学发光检测仓，检测发光强度值；根据发光强度值与待测抗原的浓度的比例关系计算得到待测血清或血浆中的待测抗原的浓度值。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的凝胶化免疫磁珠的制备方法进行详细说明。
实施例1
本实施例化学发光免疫试剂盒包括R试剂和M试剂。
R试剂为提前准备好的的工作液，主要组分为碱性磷酸酶标记CTNI 1。
M试剂制备工艺：以M缓冲液将本发明实施例得到的凝胶化免疫磁珠稀释成工作液备用，具体地：
(1)溶液制备
交联缓冲液A：100mM pH 8.5硼酸缓冲液。
交联缓冲液B：100mM pH 7.0HEPES缓冲液。
活化剂：以DMF(N,N二甲基甲酰胺)配置20mg/ml的引发剂丁烷羧酸二酐；以交联缓冲液B配置50mg/mL的Sulfo-NHS与EDC·HCl；以交联缓冲液B配置40mg/mL的AEM；以交联缓冲液B配置10mg/mL Traut’s试剂。活化剂均需现配现用。
封闭液：10％BSA。
保存缓冲液：50mM pH 8.0TRIS缓冲液。
M缓冲液：25mM TRIS，0.5g/L甲基纤维素，0.1％PC-300，pH值为8.0。
(2)免疫磁珠制备
①以交联缓冲液A置换50mg的氨基磁珠得到5mL 1％(w/v)的氨基磁珠，超声分散1min，向其中加入150mg明胶至明胶含量为3％(w/v)，25℃漩涡至混匀。接着向溶液中缓慢滴入20mg/mL 5uL引发剂丁烷羧酸二酐。25℃反应2h，反应过程中每隔10min超声分散5s。反应完成后，以磁分离器进行分离得到磁性明胶微球。
②将①得到的磁性明胶微球分散至5mL的交联缓冲液B中，向其中加入50mg/mLSulfo-NHS与EDC·HCl各30uL，25℃漩涡混匀0.5h，然后加入40mg/mL 5mL的AEM，25℃漩涡混匀2h,反应过程中每隔10min超声分散5s。反应完成后，以磁分离器进行分离清洗并定容至交联缓冲液B得到5mL 1％的马来酰胺化的磁性明胶微球。
③取1.5mg CTNI-2抗体，以交联缓冲液B稀释至含量为3mg/mL；漩涡混匀后加入5uL10mg/mL Traut’s试剂，25℃漩涡混匀1h，经离心脱盐得到500uL活化的CTNI-2抗体。
④将②得到的马来酰胺化的磁性明胶微球及③得到的活化CTNI-2抗体溶液进行混合，25℃漩涡混匀2h，接着加入137.5uL的10％BSA封闭液25℃漩涡混匀1h,最后以磁分离器进行分离清洗并定容至保存缓冲液得到5mL 1％(w/v)CTNI-2包被的免疫磁珠母液。
(3)M试剂配置
以M缓冲液将(2)得到的1％的CTNI-2包被的免疫磁珠母液稀释成0.1mg/mL的工作液备用。
实施例2
将实施例1中引发剂丁烷羧酸二酐替换为环戊烷四羧酸二酐；抗体更换为NT-proBNP2，其他组分与工艺同实施例1。
对照组1
按照CN108508195A中免疫磁珠合成的方法，抗体更换为CTNI2抗体，其它工艺和组分不变。
对照组2
按照CN108508195A中免疫磁珠合成的方法，抗体更换为NT-proBNP2抗体，其它工艺和组分不变。
试验例1免疫磁珠的评价
1、免疫磁珠抗体接枝率评价
将实施例1-2中免疫磁珠封闭前的上清液测CTNI-2抗体浓度，计算得抗体接枝率，如表1所示。
表1
组别 实施例1 实施例2 对照组1 对照组2
接枝率 95％ 92％ 52％ 58％
由表1可知，将实施例1-2中抗体接枝率达90％以上。表明本发明将马来酰亚胺化的磁性明胶微球与带有巯基基团的抗体反应，游离巯基可以定向与马来酰亚胺基团发生选择性加成反应，从而实现定向偶联；这种定向偶联方式可以减少抗体自交联，能够提高抗体的接枝率。
2、免疫磁珠抗体悬浮性评价
将实施例1、对照组1免疫磁珠母液漩涡混匀后，在室温放置0.5h、3h、24h并记录悬浮状态如图3。
从图3中可以看出实施例1室温放置24h悬浮状态依然较好，这是由于明胶包覆后的免疫磁珠处于吸水溶胀处于弱凝胶化的状态，使免疫磁珠均匀分散在溶液中，提高了免疫磁珠自身的悬浮性，从而可以提高免疫磁珠的稳定性。
试验例2检测试剂盒的评价
实验仪器选择：Lumiray1200全自动化学发光分析仪，检测灵敏度及监测长期稳定性：其中，对照组1、实施例1制备好的试剂，选择CTNI校准品进行定标后检测；对照组2、实施例2制备好的试剂，选择NT-proBNP校准品进行定标后检测。
1、灵敏度评价
(1)对照组1、实施例1试剂盒的灵敏度评价：测定空白样本、cTnI浓度为0.04ug/L、1ug/L的浓度样本，空白样本测定20次，其余样本测定10次，得到光子值均值、信噪比S/N、计算浓度均值、偏差、变异系数，CV小于10％且偏差小于10％能满足使用需求。所测数据见表2；
表2：实施例1对照组1灵敏度评价数据
由表2的数据可知：实例组1测试CTNI空白信号值要低，且功能灵敏度0.04ug/L测值与空白信噪比为9.53，远大于对照组1的2.98。实例组1分析灵敏度0.0076远低于对照组1的0.024。(2)对照组2、实施例2试剂盒的灵敏度评价：测定空白样本、NT-proBNP浓度为128ng/L、3000ng/L、的浓度样本，空白样本测定20次，其余样本测定10次，得到光子值均值、信噪比S/N、计算浓度均值、偏差、变异系数，CV小于10％且偏差小于10％能满足使用需求，所测数据见表3；
表3：实施例2对照组2灵敏度评价数据
由表3的数据可知：实例组2测试NT-proBNP空白信号值也较低，且功能灵敏度128ng/L测值与空白信噪比为27.19，远大于对照组2的10.29。其分析灵敏度3.84远低于对照组2的34.94。
表2和表3的数据均表明：由于明胶包覆的凝胶化免疫珠，增强了自身的亲水性，提高了抗非特异性吸附能力，同时还提高了试剂反应过程中的免疫反应速度，从而提高了试剂盒的灵敏度。
2、长期稳定性评价
(1)对照组1、实施例1试剂盒的长期稳定性评价：将对照组1和实施例1免疫磁珠母液在4℃放置1天、7天、14天、30天、90天、180天、360天进行测定，测定cTnI浓度1ug/L的发光值，测定10次，将得到的数据绘制发光值-时间图4。
(2)对照组2、实施例2试剂盒的长期稳定性评价：将对照组1和实施例1免疫磁珠母液在4℃放置1天、7天、14天、30天、90天、180天、360天进行测定，测定NT-proBNP浓度3000ng/L的发光值，测定10次，将得到的数据绘制发光值-时间图4。
由图4可以得出，实例组1和实例组2，4℃放置360天，其信号保留率仍在90％以上，较对照组1、对照组2信号保留率高10％左右。
综上所述，运用本发明的技术所制备的凝胶化免疫磁珠，其具有良好的亲水性及抗非特异性吸附能力，同时还具有较好的悬浮性，将其应用到化学发光免疫分析CTNI及NT-proBNP项目测试中，大大提高了项目的灵敏度及稳定性。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种凝胶化免疫磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）溶液制备
交联缓冲液A：100mM pH 8.5硼酸缓冲液；
交联缓冲液B：100mM pH 7.0 HEPES缓冲液；
活化剂：以DMF配置20mg/ml的引发剂丁烷羧酸二酐；以交联缓冲液B配置50mg/mL的Sulfo-NHS与EDC·HCl；以交联缓冲液B配置40mg/mL的AEM；以交联缓冲液B配置10mg/mLTraut’s试剂，活化剂均需现配现用；
封闭液：10%BSA；
保存缓冲液：50mM pH 8.0 TRIS缓冲液；
M缓冲液：25mM TRIS，0.5g/L甲基纤维素，0.1%PC-300，pH值为8.0；
（2）免疫磁珠制备
①以交联缓冲液A置换50mg的氨基磁珠得到5mL、w/v为1%的氨基磁珠，超声分散1min，向其中加入150mg明胶至明胶w/v含量为3%，25℃漩涡至混匀，接着向溶液中缓慢滴入20mg/mL 5μL引发剂丁烷羧酸二酐，25℃反应2h，反应过程中每隔10min超声分散5s，反应完成后，以磁分离器进行分离得到磁性明胶微球；
②将①得到的磁性明胶微球分散至5mL的交联缓冲液B中，向其中加入50mg/mL Sulfo-NHS与EDC·HCl各30μL，25℃漩涡混匀0.5h，然后加入40mg/mL 5mL的AEM，25℃漩涡混匀2h,反应过程中每隔10min超声分散5s，反应完成后，以磁分离器进行分离清洗并定容至交联缓冲液B得到5mL 1%的马来酰胺化的磁性明胶微球；
③取1.5mg CTNI-2抗体，以交联缓冲液B稀释至含量为3mg/mL；漩涡混匀后加入5μL10mg/mL Traut’s试剂，25℃漩涡混匀1h，经离心脱盐得到500μL活化的CTNI-2抗体；
④将②得到的马来酰胺化的磁性明胶微球及③得到的活化CTNI-2抗体溶液进行混合，25℃漩涡混匀2h，接着加入137.5μL的10%BSA封闭液25℃漩涡混匀1h,最后以磁分离器进行分离清洗并定容至保存缓冲液得到5mL、w/v为1%的CTNI-2包被的免疫磁珠母液；
（3）M试剂配置
以M缓冲液将步骤（2）得到的1%的CTNI-2包被的免疫磁珠母液稀释成0.1mg/mL的工作液备用。
2.一种凝胶化免疫磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）溶液制备
交联缓冲液A：100mM pH 8.5硼酸缓冲液；
交联缓冲液B：100mM pH 7.0 HEPES缓冲液；
活化剂：以DMF配置20mg/ml的引发剂环戊烷四羧酸二酐；以交联缓冲液B配置50mg/mL的Sulfo-NHS与EDC·HCl；以交联缓冲液B配置40mg/mL的AEM；以交联缓冲液B配置10mg/mLTraut’s试剂，活化剂均需现配现用；
封闭液：10%BSA；
保存缓冲液：50mM pH 8.0 TRIS缓冲液；
M缓冲液：25mM TRIS，0.5g/L甲基纤维素，0.1%PC-300，pH值为8.0；
（2）免疫磁珠制备
①以交联缓冲液A置换50mg的氨基磁珠得到5mL、w/v为1%的氨基磁珠，超声分散1min，向其中加入150mg明胶至明胶w/v含量为3%，25℃漩涡至混匀，接着向溶液中缓慢滴入20mg/mL、5μL引发剂环戊烷四羧酸二酐，25℃反应2h，反应过程中每隔10min超声分散5s，反应完成后，以磁分离器进行分离得到磁性明胶微球；
②将①得到的磁性明胶微球分散至5mL的交联缓冲液B中，向其中加入50mg/mL Sulfo-NHS与EDC·HCl各30μL，25℃漩涡混匀0.5h，然后加入40mg/mL、5mL的AEM，25℃漩涡混匀2h,反应过程中每隔10min超声分散5s，反应完成后，以磁分离器进行分离清洗并定容至交联缓冲液B得到5mL 1%的马来酰胺化的磁性明胶微球；
③取1.5mgNT-proBNP2抗体，以交联缓冲液B稀释至含量为3mg/mL；漩涡混匀后加入5μL、10mg/mL Traut’s试剂，25℃漩涡混匀1h，经离心脱盐得到500μL活化的NT-proBNP2抗体；
④将②得到的马来酰胺化的磁性明胶微球及③得到的活化NT-proBNP2抗体溶液进行混合，25℃漩涡混匀2h，接着加入137.5μL的10%BSA封闭液25℃漩涡混匀1h,最后以磁分离器进行分离清洗并定容至保存缓冲液得到5mL、w/v为1%的NT-proBNP2包被的免疫磁珠母液；
（3）M试剂配置
以M缓冲液将步骤（2）得到的1%的NT-proBNP2包被的免疫磁珠母液稀释成0.1mg/mL的工作液备用。
3.一种权利要求1-2任一项所述方法制备得到的凝胶化免疫磁珠。
4.权利要求3所述的凝胶化免疫磁珠在制备化学发光免疫试剂盒中的用途。
CN202010925008.4A 2020-09-06 2020-09-06 一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途 Active CN112034159B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010925008.4A CN112034159B (zh) 2020-09-06 2020-09-06 一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010925008.4A CN112034159B (zh) 2020-09-06 2020-09-06 一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112034159A CN112034159A (zh) 2020-12-04
CN112034159B true CN112034159B (zh) 2023-08-29

Family

ID=73590746

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010925008.4A Active CN112034159B (zh) 2020-09-06 2020-09-06 一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112034159B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114280311A (zh) * 2021-11-10 2022-04-05 宏葵生物（中国）股份有限公司 一种氨基末端b型利钠肽前体的纳米磁微粒化学发光检测试剂盒制备方法及检测应用
CN114384239B (zh) * 2021-12-09 2022-10-18 深圳君和生物科技有限公司 免疫磁珠的保存体系以及免疫磁珠体系

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0709680A1 (en) * 1993-07-08 1996-05-01 FUJIREBIO Inc. Magnetic particles with gelatin and immunoassay using the same
CN1379687A (zh) * 1999-09-14 2002-11-13 生物医学阿佩则系统有限公司 具有生化活性的磁性毫微粒、其制备方法和应用
CN1688001A (zh) * 2005-03-30 2005-10-26 深圳市人民医院 纳米磁性微球和纳米磁性免疫微球及其制备方法和应用
CN101220090A (zh) * 2007-01-09 2008-07-16 上海百瑞吉生物医药有限公司 明胶多重改性衍生物及其交联材料
CN101745353A (zh) * 2010-02-12 2010-06-23 上海交通大学 用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球及其制备和应用方法
CN102617810A (zh) * 2012-02-27 2012-08-01 重庆医科大学 用两端带羧基的直链亲水聚合物包被纳米磁芯制备微纳米磁性材料的方法及其应用
CN107764992A (zh) * 2017-10-16 2018-03-06 南京诺唯赞医疗科技有限公司 一种微球与抗体的定向偶联方法及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0709680A1 (en) * 1993-07-08 1996-05-01 FUJIREBIO Inc. Magnetic particles with gelatin and immunoassay using the same
CN1379687A (zh) * 1999-09-14 2002-11-13 生物医学阿佩则系统有限公司 具有生化活性的磁性毫微粒、其制备方法和应用
CN1688001A (zh) * 2005-03-30 2005-10-26 深圳市人民医院 纳米磁性微球和纳米磁性免疫微球及其制备方法和应用
CN101220090A (zh) * 2007-01-09 2008-07-16 上海百瑞吉生物医药有限公司 明胶多重改性衍生物及其交联材料
CN101745353A (zh) * 2010-02-12 2010-06-23 上海交通大学 用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球及其制备和应用方法
CN102617810A (zh) * 2012-02-27 2012-08-01 重庆医科大学 用两端带羧基的直链亲水聚合物包被纳米磁芯制备微纳米磁性材料的方法及其应用
CN107764992A (zh) * 2017-10-16 2018-03-06 南京诺唯赞医疗科技有限公司 一种微球与抗体的定向偶联方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112034159A (zh) 2020-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112034159B (zh) 一种凝胶化免疫磁珠及其制备方法与用途
CN111562372B (zh) 一种检测肌酸激酶同工酶ck-mb的胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CN104614535A (zh) 甲状腺微粒体抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
CN112051403A (zh) C反应蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用
CN102483409A (zh) 检出对象的检出方法和定量方法
WO2011129357A1 (ja) 標識化プローブ－水溶性担体複合体
US6964872B2 (en) Immunoassay method
CN110346560B (zh) 一种多酶信号颗粒及其制备方法与应用
CN109239348B (zh) 胃泌素释放肽前体检测试剂盒用抗体及试剂盒
CN114152740A (zh) 一种酶促化学发光试剂盒、制备方法及检测方法
JP2013532821A (ja) イムノアッセイにおける試薬の反応性を制御するためのコカップリング
CN113671171A (zh) 信号放大量子点荧光免疫探针及其制备方法和应用
CN112763703A (zh) 一种免疫磁珠及其制备方法和应用
CN112578119A (zh) 一种甲氧基肾上腺素发光免疫检测试剂盒
CN116338171B (zh) 一种免洗均相检测方法
CN111879921A (zh) 一种偶联抗体的荧光微球及其制备方法与用途
CN112924666A (zh) 固体支持物包被产物及其制备方法、应用和产品
CN112710842B (zh) hsCRP检测试剂盒和hsCRP的检测方法
CN113866157A (zh) 聚乙烯亚胺类化合物在发光法体外诊断试剂中的应用
CN114414795B (zh) 一种微球的制造方法及应用
CN117929721B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶抗体测定试剂盒及其制备方法
CN112858671B (zh) 制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法
CN114113591B (zh) 一种灵敏检测大肠杆菌o157:h7的酶联免疫方法
CN113419069B (zh) 一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒和方法
CN114624442B (zh) 一种基于适配体信号放大的化学发光检测癌胚抗原试剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant