CN103730226A

CN103730226A - 一种空心磁性高分子复合微球及其制备方法与应用

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Publication number: CN103730226A
Application number: CN201410003352.2A
Authority: CN
Inventors: 吴尧; 蓝芳; 杨琦; 顾忠伟
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2014-01-06
Filing date: 2014-01-06
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2034-01-06
Also published as: CN103730226B

Abstract

本发明公开了一种空心磁性高分子复合微球，所述复合微球由内到外依次包括：内部空腔、高分子内壳和超顺磁性纳米颗粒外壳，所述超顺磁性纳米颗粒外壳由大量具有超顺磁性的纳米颗粒紧密堆积而成。所述复合微球形状规整，粒径分布窄，且具有高的饱和磁化强度，保存时间长，便于在生物医学领域推广应用，所述复合微球采用改进的水包油型（O/W）乳化溶剂挥发法合成，超顺磁性纳米颗粒不仅作为反应物参与反应，也作为粒子乳化剂来稳定乳化体系，避免了大量的表面活性剂的使用，操作简单，便于推广。

Description

一种空心磁性高分子复合微球及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物材料领域，涉及一种空心磁性高分子复合微球及其制备方法与应用。

技术背景

具有空心结构的磁性高分子复合球因为其独特的性质，近年来备受关注。它们能广泛应用于生物医学领域，包括药物递送，分离蛋白质，磁共振成像等。

空心的磁性高分子复合球通常是通过核模板技术来制备（Chem. Commun. 2012,48,3200-3202）。虽然这种方法可以控制壳层的厚度，但这需要通过蚀刻或煅烧前驱物的核模板来创建空心结构，这一合成步骤相当繁琐。因此，一系列用无模板技术来制备空心磁性复合球的策略被提出：空心的超顺磁性四氧化三铁（Fe₃O₄）/聚苯乙烯复合微球已分别通过反相微乳液聚合（J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 2008,46,3900-3910）和界面聚合成功制备（J. Mater. Chem. 2006,16,4480-4487），但这两种聚合反应都需要厌氧操作。不同于以上方法，乳化溶剂挥发法由于其温和的反应条件以及简单易控的工艺，是近年来制备空心磁性复合微球比较受欢迎的一种方法。空心Fe₃O₄ /聚乳酸-乙醇酸（PLGA）复合微球已通过一个典型的双乳液溶剂挥发法成功合成出来（Biomaterials 2012,33,5854-5864），但是，微球的饱和磁化强度较低，且尺寸不均匀。另外，具有高饱和磁化强度的空心PLGA磁性纳米复合球也通过改进的单一的水包油乳化溶剂挥发法制得（J. Control. Release 2007,119,52-58），但复合球粒径不均匀。用类似的方法，Yang等已制备出粒径均一的空心的阿霉素- PLGA磁性纳米球（J. Mater. Chem. 2007,17.2695-2699），但是此纳米球的饱和磁化强度较低。虽然乳化溶剂挥发法制备空心磁性高分子复合微球具有很大的优势，但仍有进一步改进的空间。在以前的报道中，各种所得的磁性复合球中的磁性纳米粒子是弥散分布在高分子材料中的，高分子材料的降解将导致复合球的坍塌，使得复合微球的保存期限很短，且在一定程度上加大了饱和磁化强度的降低。而且在现有的制备方法中，大量的表面活性剂被用于稳定乳化体系，后处理较繁琐，需将表面活性剂完全洗净，否则残留的表面活性剂将限制其进一步的生物医学应用。因此，设计一种具有新结构的空心磁性高分子复合球，以及使用一种更简便的含少量表面活性剂的方法来制备具有高的饱和磁化强度和良好的磁响应性的均匀的空心磁性高分子复合球将是一个有吸引力的和具有挑战性的工作。

发明内容

针对上述问题，发明人通过改进水包油型（O/W）乳化溶剂挥发法合成出一种新颖的空心磁性高分子复合微球，所合成的微球粒径分布窄，且具有高的饱和磁化强度。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种空心磁性高分子复合微球，由内到外依次包括：内部空腔1、高分子内壳2和超顺磁性纳米颗粒外壳3，所述超顺磁性纳米颗粒外壳由大量的具有超顺磁性的纳米颗粒紧密堆积而成。所述高分子为可溶于易挥发的疏水性有机溶剂的疏水性高分子材料，如聚乳酸（PLA）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）和聚乳酸-乙醇酸（PLGA）等，优选PLGA，因为PLGA具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，并且通过美国FDA的认证；超顺磁性的纳米颗粒是Fe₃O₄、Fe₂O₃等常用的亲水性的超顺磁性的纳米颗粒，优选纳米Fe₃O₄。所述复合微球的具体结构如图1所示。所述超顺磁性纳米颗粒紧密堆积形成磁性外壳，一方面有利于形成规则的球形结构，提高微球的磁响应能力，另一方面对高分子内壳形成严密的保护，减缓高分子材料的降解，且即使高分子材料部分降解也不会立即坍塌，有利于复合微球长时间保持其形貌，便于推广应用。

作为可选方式，所述复合微球中表面活性剂的质量百分含量在1%以下。所述复合微球仅含有极少量的表面活性剂，具有良好的生物相容性。

作为可选方式，所述复合微球呈完整的球形，粒径均匀，平均粒径为2-3 μm。形状规整，尺寸均匀的微球便于推广应用，具有良好的磁响应特性，在外加磁场中能迅速响应。

作为可选方式，所述复合微球中超顺磁性纳米颗粒的质量百分含量为60-70%，复合微球的比饱和磁化强度在50 emu /g以上。具有较高的磁含量和饱和磁化强度，对外加磁场敏感。

本发明还提供了一种所述空心磁性高分子复合微球的制备方法，采用改进的水包油型（O/W）乳化溶剂挥发法合成。其具体步骤为：将所述高分子溶于易挥发的疏水性有机溶剂中获得高分子溶液，然后将所述高分子溶液逐滴加入超顺磁性纳米颗粒悬浮液中，所述超顺磁性纳米颗粒中含有质量百分含量为0.5-2%的十二烷基苯磺酸钠（SDBS），具有良好的亲水性；滴加的同时采用匀浆机在6000-7000 rpm的转速下匀浆乳化，乳化时间可以为30-60 min，然后通过机械搅拌，使有机溶剂挥发，产物经水洗和离心后即得到复合微球。在高速搅拌下，有机相乳化形成均匀混合液滴，由于范德瓦尔斯力，憎溶剂交互作用等作用，混合液滴表面涂了多层超顺磁性纳米颗粒。之后,在较低的机械搅拌下, 随着较低沸点的有机溶剂的挥发，空心复合微球的内腔，高分子内壳和超顺磁性纳米颗粒外壳逐渐形成。该方法中所述超顺磁性纳米颗粒中含有极少量的十二烷基苯磺酸钠作为表面活性剂，超顺磁性纳米颗粒不仅作为反应物参与反应，也作为粒子乳化剂来稳定乳化体系，避免了大量的表面活性剂的使用。所述易挥发的疏水性有机溶剂是水包油型（O/W）乳化溶剂挥发法中常用的油相溶剂，如：CH₂Cl₂、氯仿、一二二氯乙烷等，优选CH₂Cl₂。

作为可选方式，离心操作是在1500~4000 rpm的转速下离心40 s~3 min。

作为可选方式，所述超顺磁性纳米颗粒通过Fe²⁺，Fe³⁺与氨水共沉淀合成，可参考文献Chem. Mater. 1996,8,2209-2211记载的方法，并在反应体系中加入一定量的十二烷基苯磺酸钠（SDBS），使得反应体系中铁元素与SDBS的摩尔比为100:1~1000:1，最终所得的超顺磁性纳米颗粒中SDBS所占的质量百分含量为0.5-2%。SDBS的加入增加了超顺磁性纳米颗粒的亲水性。

作为可选方式，所述高分子溶液的浓度为80-120 mg/mL，所述超顺磁性纳米颗粒悬浮液是将所述超顺磁性纳米颗粒以5-12 mg/mL的浓度悬浮在水中。选择该浓度范围内的油相和水相体系更有利于乳化均匀，形成均匀的液滴以获得形状更规整，尺寸更均一的复合微球。

作为可选方式，所述高分子与超顺磁性纳米颗粒的投料质量比为1:2~1:6。在该投料比范围内能够在保证获得形状更规整，尺寸更均一的复合微球的前提下，尽量提高复合微球中磁性纳米颗粒的含量和饱和磁化强度。

本发明还提供了一种所述的空心磁性高分子复合微球的应用，其特征在于，将其作为磁响应性药物载体用于包载药物或用于分离蛋白质或用作核磁共振成像的造影剂。

作为可选方式，将空心磁性高分子复合微球用于吸附并分离蛋白质，其具体方式为，在30℃下将所述空心磁性高分子复合微球与待分离的蛋白溶液混合搅拌，使蛋白质被吸附到复合微球表面，然后在外加磁场的作用下将复合微球从溶液中分离出来，然后在解吸附溶液的作用下使被吸附的蛋白质从空心磁性复合微球表面解吸下来。该方法利用蛋白质表面具有丰富的电荷这一性质，使蛋白质通过静电吸附作用结合到复合微球表面，然后根据蛋白质的等电点调节解吸附溶液的pH值，增加缓冲溶液的离子强度使被吸附的蛋白质从复合微球表面脱离，实现对蛋白质的吸附和分离，也可用于白蛋白，球蛋白，溶菌酶等各种蛋白质的吸附和分离。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

1.本发明所述复合微球形状规整，粒径分布窄，且具有高的饱和磁化强度，复合微球的磁性外壳是由大量的超顺磁性纳米颗粒紧密堆积而得，这样一方面有利于形成规则的球形结构，提高微球的磁响应能力，另一方面对高分子内壳形成严密的保护，减缓高分子材料的降解，且即使高分子材料部分降解也也不会立即坍塌，有利于复合微球长时间保持其形貌，便于推广应用。，更便于推广应用

2.所述制备方法中超顺磁性纳米颗粒不仅作为反应物参与反应，也作为颗粒乳化剂来稳定乳化体系，避免了大量的表面活性剂的使用，操作简单，便于推广。

附图说明：

图1为本发明所述空心磁性高分子复合微球的结构示意图，其中1为内部空腔，2为高分子内壳，3为超顺磁性纳米颗粒外壳，4为十二烷基苯磺酸钠。

图2为本发明所述空心磁性高分子复合微球制备工艺流程图。

图3为本发明实施例3中所得复合微球的形貌和粒径表征图，图中a为常压下干燥的复合微球的SEM照片，其中的放大插图为复合微球外壳的表面形貌的SEM照片，b为复合微球的粒径分布图，c为真空条件下干燥的复合微球的SEM照片，d为复合微球碎片的SEM照片，e为所用Fe₃O₄纳米颗粒的TEM照片。

图4为本发明实施例3中各样品的红外吸收光谱图，其中a代表PLGA，b代表PLGA / Fe₃O₄复合微球，c代表Fe₃O₄纳米颗粒。

图5为本发明实施例3中各样品的X射线衍射图谱，其中a代表Fe₃O₄纳米颗粒，b代表PLGA / Fe₃O₄复合微球，c代表PLGA，图中最下方数字和线条代表Fe₃O₄纳米颗粒的标准衍射图谱。

图6为本发明实施例3中各样品的热重分析（TGA）曲线图，其中a代表Fe₃O₄纳米颗粒，b代表PLGA / Fe₃O₄复合微球，c代表PLGA。

图7为本发明实施例3中各样品的磁滞回线图，其中a代表Fe₃O₄纳米颗粒，b代表PLGA / Fe₃O₄复合微球，插图为PLGA / Fe₃O₄复合微球响应外加磁场的照片。

图8为本发明实施例3中所得复合微球的SEM照片，其中A为制成后及时在室温下常压干燥的PLGA / Fe₃O₄磁性复合微球；B在水中保存四个月后在室温下常压干燥的PLGA / Fe₃O₄磁性复合微球。

图9为本发明实施例3中所得复合微球浓度均为10 mM的不同pH的的缓冲溶液下的Zeta电位图。

图10为本发明实施例7中所述pH值对吸附量的影响的检测结果图。

图11为本发明实施例7中所述孵育时间对吸附量的影响的检测结果图。

图12为本发明实施例7中所述PLGA / Fe₃O₄磁性复合微球的浓度对吸附量的影响的检测结果图。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。以下实施例中所用原料均可以从市场上购得，实施例中所涉及的百分比，如无特殊说明均为重量百分比。

实施例1 共沉淀法制备超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒

将100mL去离子水加入到250 mL的烧瓶中，向水中持续通入氮气排氧，并加热到50℃，在搅拌条件下加入1000 mg FeCl₂·4H₂O，2448 mg FeCl₃·6H₂O，11 mg SDBS和35 mL NH₄OH，在氮气保护下持续搅拌并升温到80℃下，保温搅拌反应1 h，自然冷却至室温，将黑色的产物用去离子水洗涤沉淀，并通过外加磁场进行磁分离，弃去清液，将沉淀再次用去离子水洗涤沉淀，并通过外加磁场进行磁分离，如此反复洗涤至pH=7，此时Fe₃O₄可很好的分散在水中，形成稳定的超顺磁性纳米颗粒悬浮液。热重分析显示：所得的Fe₃O₄中SDBS的含量约为1%。

通过调整各反应原料的投料比制备出SDBS的含量占0.5-2%的一系列超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒。

实施例2 共沉淀法制备超顺磁性Fe₂O₃纳米颗粒

将100 mL去离子水加入到250 mL的烧瓶中，并加热到50℃，在搅拌条件下加入4000 mg FeCl₃·6H₂O，5.5 mg SDBS和35 mL NH₄OH，持续搅拌并升温到80℃下，保温搅拌反应1 h，自然冷却至室温，将褐色的产物用去离子水洗涤沉淀，并通过外加磁场进行磁分离，弃去清液，将沉淀再次用去离子水洗涤沉淀，并通过外加磁场进行磁分离，如此反复洗涤至pH=7，此时Fe₂O₃可很好的分散在水中，形成稳定的超顺磁性纳米颗粒悬浮液。热重分析显示：所得的Fe₂O₃中SDBS的含量约为0.5%。

通过调整各反应原料的投料比制备出SDBS的含量占0.5-2%的一系列超顺磁性Fe₂O₃纳米颗粒。

实施例3 空心磁性高分子复合微球的制备

按照图2所示的流程，将含有100 mg PLGA的1 mL CH₂Cl₂溶液逐滴加入40 mL的实施例1中制备的Fe₃O₄悬浮液中，所述悬浮液中Fe₃O₄的浓度为10 mg/mL ，Fe₃O₄中SDBS的含量约为1%，；滴加的同时采用匀浆机在6500 rpm下乳化1 h，然后，在室温下以转速800 rpm下机械搅拌使溶剂CH₂Cl₂挥发。所得产品用去离子水冲洗转移至离心管中，以转速1500 rpm离心3 min，弃去上清液，沉淀继续水洗离心，反复水洗离心3次。最终，所合成的PLGA / Fe₃O₄复合微球被分散在水中备用。

将所得复合微球滴加到硅片上，分别在常压和真空条件下进行干燥，表面喷金后采用Hitachi S-4800型扫描电子显微镜（SEM）对所得的复合微球进行表征；采用Image-Pro Plus软件对SEM照片中的至少100颗复合微球的粒径进行统计分析并绘制粒径分布图（图3中b）；将实施例1中所得的Fe₃O₄的稀悬浮液滴加到铜网上，自然干燥，然后用JEM-100CX型透射电子显微镜（TEM）进行观察。结果如图3所示，由图3中a可见复合微球是完整的球形，且大小均一。大量的Fe₃O₄纳米颗粒紧密堆积在复合微球表面形成壳层结构，外壳的Fe₃O₄纳米颗粒大小(图3 a中的放大部分)与Fe₃O₄的初始大小是一致的，大约为10 nm (见图3中e)，从图3中b可见复合微球粒径主要分布在2.3-2.8 μm，其中有85%以上分布在2.4-2.7 μm之间；由真空干燥得到的坍塌的复合微球（图3c）的照片证明所得的复合微球具有空心结构，此外，PLGA/Fe₃O₄复合微球的碎片（图3d）给出了一个能更好地证实所述空心结构存在的可视化的证据。不完整的空心PLGA/Fe₃O₄复合微球由于较软的PLGA内壳的存在使得边缘明显向内卷曲。这些检测结果表明PLGA/Fe₃O₄复合微球大小均一，且是由空心内腔，PLGA内壳和Fe₃O₄外壳构成（如图1所示）。这一独特的空心结构的形成是因为其优良的合成策略。与传统的乳化溶剂挥发的方法相比，本方案所使用的十二烷基苯磺酸钠（SDBS）比以前的报告的要少得多，这就简化了后处理，且利于进一步的生物医学应用。更重要的是，Fe₃O₄纳米颗粒不仅可以是一个反应物,也被用作粒子乳化剂来稳定乳液体系。首先,在高速搅拌下, 由于范德瓦尔斯力，憎溶剂交互作用等反应驱动力，有机相被乳化形成均匀混合液滴，该混合液滴表面裹了多层Fe₃O₄纳米颗粒。之后,在机械搅拌下, 随着较低沸点的CH₂Cl₂的挥发，空心复合微球的内空腔1，PLGA内壳2和Fe₃O₄外壳3逐渐形成。此外，Fe₃O₄外壳是通过大量的Fe₃O₄纳米颗粒紧密堆积形成的多层稳定的Fe₃O₄层，且Fe₃O₄外壳的最内层已经牢固地合并到PLGA内壳中。

采用PE spectrometer型傅里叶转换红外光谱仪（FTIR）分别检测本实施例中所使用的PLGA、Fe₃O₄和最终所得的复合微球在500-4000 cm^-1波数范围内的红外吸收光谱，检测步长为4 cm^-1。结果如图4所示，复合微球的吸收峰是两种反应物吸收峰的组合，说明通过该方法成功将PLGA和Fe₃O₄进行了复合。

采用X' Pert Pro MPD型X射线衍射（XRD）仪分别检测本实施例中所使用的PLGA、Fe₃O₄和最终所得的复合微球的X射线衍射图谱，结果如图5所示，复合微球与Fe₃O₄的衍射峰均与标准Fe₃O₄的出峰位置一致，这是由于复合微球中的结晶态物质主要为形成外层的Fe₃O₄纳米颗粒。

采用STA 449 C Jupiter型热重分析（TGA）仪分别检测了本实施例中所使用的PLGA、Fe₃O₄和最终所得的复合微球在氮气保护下从35℃升温到700℃的重量损失。结果如图6所示，通过热重分析数据计算得出所得复合微球中Fe₃O₄的质量百分含量（磁含量）约为68%。

采用Model BHV-525型振动样品磁强计（VSM）分别检测了本实施例中所使用的Fe₃O₄和最终所得的复合微球在-18000到18000 Oe范围内的磁滞回线。结果如图7所示，Fe₃O₄和复合微球的磁滞回线均经过原点，无剩磁和矫顽力，说明Fe₃O₄和复合微球都具有超顺磁性。所述复合微球的饱和磁化强度为58 emu/g。

为了考察PLGA/Fe₃O₄复合微球的稳定性能，采用Hitachi S-4800型扫描电子显微镜对在水中储存了4个月后的PLGA/Fe₃O₄复合微球的形貌进行了表征（具体方法如前所述），结果如图8所示，在室温下，在水中储存了4个月的PLGA/Fe₃O₄复合微球仍然保持最初的形貌。其实，复合微球内部的PLGA可能已经降解了，但是可能由于Fe₃O₄外壳具有足够大的强度，阻止了PLGA的降解产物泄漏出来，所以该复合微球将能够保持良好的形貌和均一的尺寸很长一段时间。此外, 随着时间的推移，F e₃O₄外壳可能已被氧化，但这对保持良好的形貌影响很小。

采用Zetasizer Nano ZS90型Zeta电位检测仪测试了复合微球在不同pH值下的zeta电位，结果如图9所示，复合微球在不同pH值下的zeta电位都小于-20 mV，这揭示了所合成的复合微球相当稳定，尤其是在碱性介质中。这种现象可能是由于独特的多层Fe₃O₄外壳造成的。另外，因为在pH=8时外壳的Fe₃O₄纳米颗粒有一个零电荷点，所以当pH值低于7-8时，zeta电位大大降低。

实施例4 空心磁性高分子复合微球的制备

将含有120 mg PLGA的1 mL 氯仿（CHCl₃）溶液逐滴加入40 mL的实施例2中制备的Fe₂O₃悬浮液中，所述悬浮液中Fe₂O₃的浓度为5 mg/mL， Fe₂O₃中SDBS的含量约为0.5%；滴加的同时采用匀浆机在在7000 rpm下乳化45 min，然后，在室温下，以转速1000 rpm下机械搅拌使溶剂CHCl₃挥发。所得产品用去离子水冲洗转移至离心管中，以转速4000 rpm离心40 s，弃去上清液，沉淀继续水洗离心，反复水洗离心3次。最终，所合成的PLGA/Fe₂O₃复合微球被分散在水中备用。

所得复合微球与实施例3中所述复合微球具有相同的空心结构，所得复合微球的粒径主要分布在2.0-2.4 μm范围内，磁含量约为60%，饱和磁化强度为50 emu/g

实施例5 空心磁性高分子复合微球的制备

将含有80 mg PLGA的1 mL 一二二氯乙烷溶液逐滴加入40 mL的实施例1中制备的Fe₃O₄悬浮液中，所述悬浮液中Fe₃O₄的浓度为12 mg/mL，Fe₃O₄中SDBS的含量约为2%；滴加的同时采用匀浆机在在6000 rpm下乳化30 min，然后，在室温下，以转速1000 rpm下机械搅拌使溶剂一二二氯乙烷挥发。所得产品用去离子水冲洗转移至离心管中，以转速2000 rpm离心2 min，弃去上清液，沉淀继续水洗离心，反复水洗离心3次。最终，所合成的PLGA/Fe₃O₄复合微球被分散在水中备用。

所得复合微球与实施例3中所述复合微球具有相同的空心结构，所得复合微球的粒径主要分布在2.6-3.0 μm范围内，磁含量约为70%，饱和磁化强度为60 emu/g

实施例6

在实施例3中，将PLGA分别换成聚乳酸（PLA）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）制备出四种复合微球，采用与实施例3中相同的分析测试手段证实，所述的四种空心微球与实施例3中所得的PLGA / Fe₃O₄复合微球具有相同的空心结构。

实施例7 溶菌酶吸附研究

将溶菌酶溶解在pH=6-12的浓度为10 mM的缓冲液中（pH=6为六次甲基四胺缓冲液，pH=7、8为磷酸钠缓冲液；pH=9为氯化铵缓冲液；pH=10，11和12为碳酸钠缓冲液），将实施例3中所得的空心磁性高分子复合微球（1-10mg）加入到5mL 0.5mg mL^-1的溶菌酶溶液中，在30℃下搅拌0.5-36 h后，在外加磁场下，将PLGA/ Fe₃O₄复合微球从溶菌酶溶液中移出。未被吸附的溶菌酶的浓度可通过测量残余的溶菌酶溶液样品在280 nm的紫外可见光谱估算出来。溶菌酶的吸附量可从以下方程估算出来：

q = (C _o - C) V _o /W

q是微球的平衡吸附量(mg/g)；C _o和C分别是蛋白的初始浓度和平衡浓度(mg/mL);V _o是水相的体积(mL);W是磁性复合微球的重量(g).

通过在30℃下，在20mM磷酸盐缓冲液（解吸附溶液）中搅拌24 h后，溶菌酶可从空心磁性复合微球表面解吸下来。然后通过比浊法溶菌酶试剂盒来测定溶菌酶的活性。

pH值对溶菌酶的吸附量的影响（实验条件：孵育时间：24 h；温度：30°C；PLGA / Fe₃O₄磁性复合微球的浓度：1mg/mL）。结果如图10所示，随着pH值从5增加到10，PLGA/Fe₃O₄复合微球的表面上的溶菌酶分子间的静电斥力逐渐减弱。同时，溶菌酶和微球之间的静电吸引力也被削弱。然而，静电斥力发挥主导作用，从而导致了溶菌酶的吸附量在这个pH值范围内增加。当pH值从10增加到11时，此时比较接近溶菌酶的等电点（pI= 11），溶菌酶吸附量达最大值（497 mg/g），这主要是由于在等电点附近溶菌酶分子之间的静电斥力相对较弱。随着pH值增大到高于等电点时，静电排斥力开始增加，从而导致溶菌酶吸附量减少。

孵育时间对溶菌酶的吸附量的影响（实验条件：pH值：11；温度：30°C；PLGA / Fe₃O₄磁性复合微球的浓度：1mg/mL）。结果如图11所示，随着孵育时间的增加，溶菌酶的吸附量也显著增加。当孵育时间达到24 h时，溶菌酶的吸附量达到饱和。进一步延长孵育时间也不能明显地增加溶菌酶的吸附量，这是因为复合微球的表面已覆盖了大量的溶菌酶，从而阻碍其进一步吸附。这些结果显示24 h的孵育时间就足以完成溶菌酶吸附。

复合微球的浓度对溶菌酶吸附的影响（实验条件：孵育时间：24h；温度：30°C；pH值：11），结果如图12所示，随着PLGA/ Fe₃O₄复合微球的浓度从0.2 mg/mL增加到1.0 mg/mL，溶菌酶的吸附量都相对较高。然而, 当PLGA/ Fe₃O₄复合微球的浓度超过1.0 mg/mL后，溶菌酶的吸附量减少，这可能是因为浓度太高，微球大量聚集从而减少了微球与溶菌酶分子相互作用的机会。

此外，通过活性测定得到溶菌酶的活性保留率为89％，这表明吸附过程并没有显著降低酶的活性。另外，由于复合微球的高饱和磁化强度和良好的磁响应性，吸附了溶菌酶的PLGA/Fe₃O₄复合微球在外部磁场（约200mT）的作用下能快速完成分离（约5 s）。

总之，在溶菌酶的等电点的pH下，复合微球能够高效的吸附溶菌酶，其吸附量可高达497 mg/g，且酶活性保留率为89%。

还通过实验证实，所述蛋白分离方法在25-35℃的温度范围内均可有效实现蛋白质的吸附和分离，且对白蛋白，球蛋白等其他蛋白也能实现有效的分离。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种空心磁性高分子复合微球，其特征在于，所述复合微球由内到外依次包括：内部空腔、高分子内壳和超顺磁性纳米颗粒外壳，所述超顺磁性纳米颗粒外壳由大量具有超顺磁性的纳米颗粒紧密堆积而成。

2.根据权利要求1所述的空心磁性高分子复合微球，其特征在于，所述复合微球中表面活性剂的质量百分含量在1%以下。

3.根据权利要求1所述的空心磁性高分子复合微球，其特征在于，所述复合微球呈完整的球形，粒径均匀，平均粒径为2-3 μm。

4.根据权利要求1所述的空心磁性高分子复合微球，其特征在于，所述复合微球中超顺磁性纳米颗粒的质量百分含量为60-70%，复合微球的饱和磁化强度在50 emu/g以上。

5.一种如权利要求1所述复合微球的制备方法，其特征在于，采用改进的水包油型（O/W）乳化溶剂挥发法合成，其具体步骤为：将所述高分子溶于易挥发的疏水性有机溶剂中获得高分子溶液，然后将所述高分子溶液逐滴加入超顺磁性纳米颗粒悬浮液中，所述超顺磁性纳米颗粒中含有质量百分含量为0.5-2%的十二烷基苯磺酸钠（SDBS），具有良好的亲水性；滴加的同时采用匀浆机在6000-7000 rpm的转速下匀浆乳化，然后通过机械搅拌，使有机溶剂挥发，产物经水洗和离心后即得到复合微球。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超顺磁性纳米颗粒通过Fe²⁺，Fe³⁺与氨水共沉淀合成，并在反应体系中加入一定量的十二烷基苯磺酸钠(SDBS)。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述高分子溶液的浓度为80-120 mg/mL，所述超顺磁性纳米颗粒悬浮液是将所述超顺磁性纳米颗粒以5-12 mg/mL的浓度悬浮在水中。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述高分子与超顺磁性纳米颗粒的投料质量比为1:2~1:6。

9.一种权利要求1所述的空心磁性高分子复合微球的应用，其特征在于，将其作为磁响应性药物载体用于包载药物或用于分离蛋白质或用作核磁共振成像的造影剂。

10.一种权利要求1所述的空心磁性高分子复合微球的应用，其特征在于，将其用于吸附并分离蛋白质，其具体方式为，将所述空心磁性高分子复合微球与待分离的蛋白溶液混合搅拌，使蛋白质被吸附到复合微球表面，然后在外加磁场的作用下将复合微球从溶液中分离出来，然后在解吸附溶液的作用下使被吸附的蛋白质从空心磁性复合微球表面解吸下来。