CN104628007B

CN104628007B - 一种介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法

Info

Publication number: CN104628007B
Application number: CN201510060940.4A
Authority: CN
Inventors: 杨洋; 王安河; 李峻柏
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: Beijing Boorino Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2015-02-05
Publication date: 2017-01-25
Anticipated expiration: 2035-02-05
Also published as: CN104628007A

Abstract

本发明提供了一种介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，所述方法为：将氨基功能化的聚缩水甘油醚吸附二氧化硅前驱体，之后水解，再经固液分离，洗涤，干燥获得介孔二氧化硅纳米粒子。所述方法具体为：将正硅酸乙酯与氨基功能化的聚缩水甘油醚溶于有机溶剂中，进行共混吸附；再向其中加入氨水，进行水解反应；最后将反应后的溶液固液分离，洗涤、干燥后，得到介孔二氧化硅纳米粒子。该方法简单，无需表面活性剂，制备成本较低；制备出的介孔二氧化硅纳米粒子粒径在20～50纳米尺寸范围内可控，具有良好的单分散性，粒子内部具有1～2纳米的孔隙，并且具有良好的生物相容性和生物可降解性，可用于负载客体分子，应用于生物医药领域。

Description

一种介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法

技术领域

本发明属于多孔材料的制备技术领域，尤其涉及一种介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法。

背景技术

介孔二氧化硅纳米粒子是指直径为几百纳米，并且内部具有10纳米以内的多孔结构的纳米材料。该纳米粒子以球形为主，也可以是椭圆形、短棒型或空壳结构。该纳米粒子因结构稳定，生物相容性好，并且内部具有丰富的多孔结构，因而常常被用作药物或者其它生物分子的载体应用于生物医药领域。

目前制备介孔二氧化硅纳米粒子通用的方法是蔡强及Victor Lin等人发展起来的表面活性剂介导的溶胶凝胶法，即正硅酸乙酯在高浓度的表面活性剂(如十六烷基三甲基溴化铵)的溶液中通过自组装并水解生成，然后通过高温煅烧或者酸醇混合溶液除去表面活性剂，如CN 1715184公开了一种球形介孔二氧化硅材料的制备方法：利用阳离子表面活性剂为模板，用正硅酸乙酯为硅源，在碱性条件下水解缩合而成。该方法不仅使用大量的表面活性剂而增加成本，而且为了除去表面活性剂而使用苛刻的条件。另外CN 102050454B公开了一种采用模板法合成介孔二氧化硅微球的制备方法，利用两种不同分子量的聚乙二醇(PEG)作为混合模板剂，正硅酸乙酯(TEOS)为硅源，将PEG混合模板剂、TEOS、盐酸和水按一定比例混合，混合溶液在30～60℃恒温水浴中，恒温反应6～20h，将反应产物分离，得到的反应产物经分离、干燥和煅烧后处理工艺，制得介孔球形二氧化硅微球。但是该方法制备的介孔二氧化硅粒径较大，并且处理工艺复杂。

传统方法制备的介孔二氧化硅纳米粒子通常在100纳米以上，作为抗肿瘤药物载体，为了提高其EPR效应，100纳米以下的粒子是更为理想的，这为传统制备二氧化硅纳米粒子的方法提出了更大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非表面活性剂合成的介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，该方法简单，并且制得的二氧化硅纳米粒子具有20～50纳米的超小粒径，该纳米粒子孔径为1～2纳米，内部具有丰富的孔隙结构，具有良好的生物相容性和生物可降解性，能够作为一种抗癌药物载体应用于生物医药领域。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，所述方法为：将氨基功能化的聚缩水甘油醚吸附二氧化硅前驱体，之后水解，再经固液分离，洗涤，干燥获得介孔二氧化硅纳米粒子。

本发明提供的介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法通过二氧化硅前驱体与氨基功能化的聚缩水甘油醚(PG-NH₂)的吸附作用，在水解条件下一锅法合成介孔二氧化硅纳米粒子。本发明提供的介孔二氧化硅纳米粒子的合成方法简单，反应过程中不使用表面活性剂，反应条件温和，成本较低。

本发明所述二氧化硅前驱体为能够水解获得二氧化硅的物质，典型但非限制性的有正硅酸乙酯、正硅酸丙酯或正硅酸异丙酯中的任一种或至少两种的混合物。

优选地，所述二氧化硅前驱体为正硅酸乙酯(TEOS)。

优选地，所述聚缩水甘油醚的氨基功能化程度为5～50％，如6％、10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或48％。

所述氨基功能化程度是指聚缩水甘油醚中被氨基取代的羟基占总羟基的比。

优选地，所述聚缩水甘油醚的重均分子量为3000～20000，如3500、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、12000、13000、15000、17000或19000等。

优选地，所述氨基功能化的聚缩水甘油醚(PG-NH₂)与所述二氧化硅前驱体的质量比为1:0.2～20，如1:0.3、1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16或1:18等。所述质量比不同，制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子的粒径不同，粒径随二氧化硅前驱体与氨基功能化的聚缩水甘油醚质量比的增加而增加，可在100纳米以内的范围调节。

所述吸附为将氨基功能化的聚缩水甘油醚(PG-NH₂)和二氧化硅前驱体溶于溶剂中，进行共混吸附。所述溶剂为甲醇和/或乙醇，所述甲醇和/或乙醇起到溶解所述二氧化硅前驱体与所述氨基功能化的聚缩水甘油醚的作用，其用量根据所述二氧化硅前驱体与所述氨基功能化的聚缩水甘油醚的质量不同而不同，只要能够将所述二氧化硅前驱体与所述氨基功能化的聚缩水甘油醚溶解即可。所述共混吸附在密闭环境中进行，所述共混吸附的温度优选为15～30℃，如16℃、18℃、20℃、22℃、25℃、26℃、27℃、28℃或29℃等，更优选为室温，吸附时间优选为2～48h，如3h、4h、5h、10h、15h、18h、20h、23h、25h、28h、30h、33h、35h、38h、40h、43h或45h等。

所述水解在碱性环境中进行。

优选地，所述水解在氨水调节的碱性环境中进行；所述氨水的体积浓度优选为10～50％，如12％、15％、18％、20％、23％、25％、28％、30％、32％、35％、38％、40％、42％、45％或48％。所述氨水的体积浓度为氨水的体积占反应体系体积的比。所述碱性催化剂的加入有利于二氧化硅前驱体的水解。所述水解时间优选为6～48h，如8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、25h、27h、30h、32h、34h、35h、37h、39h、40h、42h、45h或47h等。

所述吸附和水解过程中，持续进行搅拌，所述搅拌速度为500～2000rpm，如600、800、900、1000、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800或1900等。

所述固液分离方式为离心分离或过滤分离。

另一方面，本发明提供了一种制备介孔二氧化硅的具体方法，包括如下步骤：

(1)将正硅酸乙酯与氨基功能化的聚缩水甘油醚溶于有机溶剂中，进行共混吸附2～48h，得到反应溶液；

(2)向步骤(1)所述反应溶液中加入氨水，至其体积浓度为10～50％，进行水解反应6～48h，得到介孔二氧化硅纳米粒子分散液；

(3)将二氧化硅前驱体分散液固液分离，滤渣经洗涤，干燥后，得到介孔二氧化硅纳米粒子。

优选地，步骤(1)为：将正硅酸乙酯与氨基功能化的聚缩水甘油醚在甲醇溶液中充分混合搅拌至透明澄清的溶液，在密闭容器中搅拌过夜。

优选地，步骤(2)为：将氨水快速滴加到步骤(1)的混合溶液中，并快速搅拌。

优选地，步骤(3)为：将介孔二氧化硅纳米粒子分散液离心分离，并将所得滤渣用乙醇和水分别洗涤三次，干燥得到介孔二氧化硅纳米粒子。

本发明还提供了一种利用如上所述方法制备的介孔二氧化硅纳米粒子，所述二氧化硅纳米粒子的粒径大小为20～50纳米，如22纳米、25纳米、28纳米、30纳米、32纳米、35纳米、38纳米、40纳米、42纳米、45纳米或48纳米等，所述二氧化硅纳米粒子的孔隙为1～2纳米。

本发明还提供了一种装载药物的纳米粒子，所述纳米粒子为利用如上所述方法制备的介孔二氧化硅纳米粒子，所述药物为正电荷的药物分子或负电荷的药物分子。所述纳米粒子在生理盐水中可降解，能够被细胞内吞，具有pH敏感性。

本发明还提供了一种如上所述装载药物的纳米粒子的用途，所述装载药物的纳米粒子用作抗癌药物载体或细胞标记。本发明提供的介孔二氧化硅纳米粒子由于分散性好，具有丰富的纳米孔隙，并具有良好的生物相容性和生物可降解性，可分别吸附不同电荷性质的药物分子并在弱酸环境中释放出来，可作为抗癌药物载体或细胞标记等应用于生物医药领域。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法简单：介孔二氧化硅纳米粒子由二氧化硅前驱体与PG-NH₂分子在碱性水解条件下通过一锅法制备，反应产物通过简单的离心洗涤方法，避免了传统制备方法中复杂苛刻的除模板的步骤；

(2)本发明提供的介孔二氧化硅纳米粒子粒径控制在100纳米以内，并可通过控制二氧化硅前驱体和PG-NH₂的质量比有效地调控，该粒径尺寸更适合作为纳米药物载体进行抗肿瘤治疗；

(3)本发明提供的介孔二氧化硅纳米粒子由具有良好生物兼容性的PG分子掺杂，因而该粒子也表现出良好的生物兼容性并具备生物可降解性。

附图说明

图1是本发明提供的介孔二氧化硅纳米粒子合成过程示意图；

图2是实施例1制备的粒径为50纳米的介孔二氧化硅纳米粒子的扫描显微镜图像(a)和透射电镜图像(b)；

图3是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子的透射电子显微镜图像(a)、N元素分布分析(b)及Si元素分布分析(c)；

图4是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子装载抗癌药物阿霉素后在不同pH值条件下的缓冲溶液中的释放曲线：■为在pH＝5.0的MES中的释放曲线；▲为在pH＝7.2的PBS中的释放曲线；

图5是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子在生理盐水中37℃条件下不同时间段的降解行为以及不同时间段降解后的透射电镜图片；

图6是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子装载抗癌药物阿霉素后与肿瘤细胞Hela作用3小时后的激光共聚焦扫描图像；

图7是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子装载与阿霉素相反电荷的染料Rosebengal后在不同缓冲溶液中的释放曲线：■为在pH＝5.0的MES中的释放曲线；▲为在pH＝7.2的PBS中的释放曲线；

图8是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子装载不同剂量的抗癌药物阿霉素前后对肿瘤细胞Hela的细胞毒性研究；

图9是不同原料配比条件下(PG-NH₂:TEOS，重量比)制备的介孔二氧化硅纳米粒子透射电镜图片：A)0:8，B)1:0.8，C)1:4，D)1:8，E)1:16，F)1:16(反应溶剂为条件E的4倍)。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

本领域技术人员应该明了，所述实施例仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

图1是本发明提供的介孔二氧化硅纳米粒子合成示意图。所述合成步骤为：

(1)TEOS与PG-NH₂在甲醇溶液中共混吸附；

(2)将氨水溶液加入(1)的混合溶液中，进行水解反应，得到介孔二氧化硅分散液；

(3)将介孔二氧化硅分散液离心分离，再洗涤、干燥得到介孔二氧化硅纳米粒子。

实施例1

制备介孔二氧化硅纳米粒子：

(1)吸附：取氨基功能化的PG甲醇溶液600μL(PG重均分子量约1万，氨基功能化程度30％，其甲醇溶液浓度20mg/mL)，再加入2mL甲醇及100μLTEOS(控制PG-NH₂与TEOS的质量比为1:8)，在室温密闭容器中1000rpm的搅拌条件下共同搅拌12小时，得到反应溶液。

(2)水解：向上述反应溶液中快速加入1.5mL氨水和1.5mL水，在1800rpm的搅拌条件下反应6小时，得到介孔二氧化硅纳米粒子分散液；

(3)后处理：用高速离心机离心分离步骤(2)得到的介孔二氧化硅纳米粒子分散液，并分别用甲醇和水洗涤3次，干燥，得到介孔二氧化硅纳米粒子。

结构表征与性能测试：

利用扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)和透射电子显微镜(Philips Tecnai G2F20UT)对实施例1制得的介孔二氧化硅纳米粒子进行微观结构分析(样品事先经过真空干燥)，测试结果如图2(图2是本实施例制备的介孔二氧化硅纳米粒子的扫描显微镜图像和透射电镜图像)所示；从图2中可以看出，制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子具有50纳米左右超小粒径，且其内部具有丰富的多孔结构。

利用透射电子显微镜(Philips Tecnai G2 F20UT)对实施例1制得的介孔二氧化硅纳米粒子进行元素分布分析，测试结果如图3(图3是本实施例制备的介孔二氧化硅纳米粒子的透射电子显微镜图像及其元素分布分析图)所示，从图中可以明显看到来自二氧化硅的硅元素分布，以及来自氨基化PG分子的氮元素分布。

图4是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子装载抗癌药物阿霉素后在不同pH值条件下的缓冲溶液中的释放曲线：其中2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液pH值是5.0，磷酸盐(PBS)缓冲液pH值是7.2，药物装载率为0.238mg盐酸阿霉素(DOX)/mg SiO₂；可见药物分子在弱酸性条件下会从介孔二氧化硅纳米粒子中更快的释放出来，表明该载药粒子具有一定的pH敏感性。

图5是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子在生理盐水中37℃条件下不同时间段的降解行为以及不同时间段降解后的透射电镜(Philips Tecnai G2 F20UT)图片，表明37℃条件下，低浓度的该粒子溶液(本实验为0.1mg/mL)在PBS中结构逐渐破坏，具有一定的降解行为。

图6是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子装载有抗癌药物阿霉素的后介孔二氧化硅纳米粒子与肿瘤细胞Hela作用3小时后的激光共聚焦(Olympus FV1000)扫描图像。实验条件为：细胞在35mm培养皿达到对数生长期后，加入50μL分散在PBS中的SiO₂-DOX溶液(1mg/mL，DOX装载量为0.18mg DOX/mg SiO₂)，培养3小时后，细胞分别用Hoechst 33342和Alexa 488WGA染色，得到细胞核的图像(A)、细胞膜的图像(B)、SiO₂-DOX在细胞内的分布(C)及ABC的叠加图像(D)。表明该材料很容易被细胞内吞，将抗癌药物载入到肿瘤内部。

图7是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子装载负电荷的染料Rose bengal(RB)后在不同缓冲溶液中的释放曲线，药物装载率为0.16mg RB/mg SiO₂，其他实验条件同装载DOX的SiO₂在PBS或MES的释放条件。表明该纳米粒子不仅可以吸附正电荷的阿霉素，也可以吸附负电荷的药物分子，并表现出相似的释放行为。

图8是实施例1制备的介孔二氧化硅纳米粒子装载不同剂量的抗癌药物阿霉素前后对肿瘤细胞Hela的细胞毒性研究。实验条件为：Hela细胞在96孔培养板中达到对数生长期后，每四个孔分为1组，按组分别加入10、30、60、90、120μL DOX-SiO₂分散液(1mg/mL，DOX装载率为0.12mg DOX/mg SiO₂)；10、30、60、90、120μL SiO₂分散液(1mg/mL)及10ul DOX溶液(1mg/mL)加样后的细胞24小时后用MTT法测试细胞毒性。与空白对照组相比未装载抗癌药物的介孔二氧化硅纳米粒子具有很好的细胞相容性，而装载阿霉素后该粒子对Hela细胞表现出明显的细胞毒性，在抗肿瘤治疗方面具有潜在的应用价值。

实施例2

制备介孔二氧化硅纳米粒子的方法与实施例1相同，不同点在于，TEOS的加入量为10μL，控制PG-NH₂与TEOS的质量比为1:0.8。

实施例3

制备介孔二氧化硅纳米粒子的方法与实施例1相同，不同点在于，TEOS的加入量为50μL，控制PG-NH₂与TEOS的质量比为1:4。

实施例4

制备介孔二氧化硅纳米粒子的方法与实施例1相同，不同点在于，TEOS的加入量为200μL，控制PG-NH₂与TEOS的质量比为1:16。

实施例5

制备介孔二氧化硅纳米粒子的方法与实施例4相同，不同点在于，反应溶剂的体积为实施例4中溶剂体积的四倍。

实施例6

制备介孔二氧化硅纳米粒子的方法与实施例1相同，不同点在于，步骤(1)中不加入PG-NH₂。

利用透射电子显微镜(Philips Tecnai G2F20UT)对实施例1～6制得的介孔二氧化硅纳米粒子进行结构表征如图9所示。图9是不同原料配比条件(PG-NH₂:TEOS，重量比w/w)下制备的介孔二氧化硅纳米粒子的透射电子显微镜图片：A)0:8，B)1:0.8，C)1:4，D)1:8，E)1:16，F)1:16(反应溶剂为条件E的4倍)。从图中可以看出，不添加PG-NH₂制得的介孔二氧化硅粒径较大，PG-NH₂与TEOS一锅法制备的介孔二氧化硅粒径在20～50纳米之间，并且更改PG-NH₂与TEOS的质量比可在一定范围内调控粒子的形态及粒径。

实施例7

制备介孔二氧化硅纳米粒子：

(1)吸附：取氨基功能化的PG甲醇溶液600μL(PG重均分子量约3000，氨基功能化程度50％，其甲醇溶液浓度20mg/mL)，再加入2mL甲醇及25μLTEOS(控制PG-NH₂与TEOS的质量比为1:0.2)，在15℃密闭容器中500rpm搅拌2小时，得到反应溶液。

(2)水解：向上述反应溶液中快速加入1.5mL氨水和10.9mL水，在500rpm搅拌条件下反应24小时，得到介孔二氧化硅纳米粒子分散液；

(3)后处理：用高速离心机离心分离步骤(2)得到的介孔二氧化硅纳米粒子分散液，并分别用甲醇和水洗涤3次，干燥，得到粒径为50纳米，孔径为1纳米的介孔二氧化硅纳米粒子。

实施例8

制备介孔二氧化硅纳米粒子：

(1)吸附：取氨基功能化的PG甲醇溶液600μL(PG重均分子量约2万，氨基功能化程度5％，其甲醇溶液浓度20mg/mL)，再加入2mL甲醇及250μL TEOS(控制PG-NH₂与TEOS的质量比为1:20)，在30℃密闭容器中2000rpm搅拌48小时，得到反应溶液。

(2)水解：向上述反应溶液中快速加入4.3mL氨水和1.5mL水，在2000rpm搅拌条件下反应48小时，得到介孔二氧化硅纳米粒子分散液；

(3)后处理：用高速离心机离心分离步骤(2)得到的介孔二氧化硅纳米粒子分散液，并分别用甲醇和水洗涤3次，干燥，得到粒径为20纳米，孔径为2纳米的介孔二氧化硅纳米粒子。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述方法为：将氨基功能化的聚缩水甘油醚吸附二氧化硅前驱体，之后在碱性环境中水解，再经固液分离，洗涤，干燥获得介孔二氧化硅纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二氧化硅前驱体为正硅酸乙酯。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基功能化的聚缩水甘油醚为氨基功能化程度为5～50％的聚缩水甘油醚。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基功能化的聚缩水甘油醚与所述二氧化硅前驱体的质量比为1:0.2～20。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚缩水甘油醚的重均分子量为3000～20000。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸附为将氨基功能化的聚缩水甘油醚和二氧化硅前驱体溶于溶剂中，进行共混吸附。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇和/或乙醇。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述共混吸附在密闭环境中进行。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述共混吸附的温度为15～30℃，时间为2～48h。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水解在氨水调节的碱性环境中进行。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述氨水的体积浓度为10～50％。

12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水解的时间为6～48h。

13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸附和水解过程中，持续进行搅拌，所述搅拌速度为500～2000rpm。

14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固液分离方式为离心分离或过滤分离。

15.根据权利要求1-14之一所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

16.一种利用权利要求1-14之一所述的方法制备的介孔二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述二氧化硅纳米粒子的粒径大小为20～50纳米，孔径大小为1～2纳米。

17.一种装载药物的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子为权利要求16所述的介孔二氧化硅纳米粒子，所述药物为正电荷的药物分子或负电荷的药物分子。

18.根据权利要求17所述的装载药物的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子在生理盐水中可降解，能够被细胞内吞，具有pH敏感性。

19.一种根据权利要求17所述的装载药物的纳米粒子的用途，其特征在于，所述装载药物的纳米粒子用作抗癌药物载体或细胞标记。