KR20070028478A - 비응집성 코어/쉘 나노복합 입자 - Google Patents

비응집성 코어/쉘 나노복합 입자 Download PDF

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제임스 에이치. 애데어
사라 엠. 루즈
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마크 케스터
크리스토퍼 시에드르키
윌리암 비. 화이트
에르윈 보글레르
앨런 스나이더
카를로 지. 판타노
로렌스 시노웨이
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Abstract

본 발명은 나노복합 입자를 함유하는 역 미셀 마이크로 에멀션을 제조하는 단계, 마이크로 에멀션을 실란 커플링제로 처리하는 단계, 마이크로 에멀션에 나노복합 입자의 현탁액의 pH를 약 6 내지 7로 유지시키는 산/알코올 용액을 첨가함으로써 마이크로 에멀션을 파괴하여 나노복합 입자의 현탁액을 형성하는 단계, 및 바람직하게는 나노복합 입자의 비응집을 확실하게 하기 위하여 변형된 크기 축출 HPLC 시스템으로 나노복합 입자의 현탁액을 동시에 세척하고 분산시키는 단계들로 이루어지는, 비응집성의 고도로 분산되고 안정한 코어/쉘 나노복합 입자의 합성 방법을 제공한다. 나노복합 입자의 일차 입자 크기는 직경이 약 1 내지 100nm일 수 있으며, 바람직하게는 약 10 내지 50nm, 보다 바람직하게는 약 10 내지 20nm, 가장 바람직하게는 약 20nm의 직경을 가진다.
코어/쉘 나노복합 입자, 나노복합체, 분산제, 크기 축출 HPLC 시스템, 비응집, 실란 커플링제.

Description

비응집성 코어/쉘 나노복합 입자{UNAGGLOMERATED CORE/SHELL NANOCOMPOSITE PARTICLES}
본 발명은 나노복합 입자(nanocomposite particles)에 관한 것이다. 보다 구체적으로 설명하면, 본 발명은 광범위한 용도에 사용될 수 있는 다양한 크기의 안정하고, 잘 분산된 비응집성 코어/쉘 나노 혼성 입자에 관한 것이다.
화학 기술 분야에서 가장 중요한 발달 중 하나는 나노 구조화(nanostructuring)의 발달이다. 나노 구조화된 물질은 거시적 규모에서 독특하고 특징적인 특성을 나타내는 나노-크기 유닛의 어셈블리이다. 그러한 유닛의 크기 범위는 콜로이드 범위 내에 있으며, 개별적인 성질은 원자/분자 및 벌크의 성질과는 상이하다. 그러므로 나노 구조화된 어셈블리의 성질은 구성성분의 콜로이드 특성, 주로 입자 크기, 표면 특성, 입자 간 상호작용 및 입자 간 거리를 다르게 함으로써 조율될 수 있다.
생물의학 용도에 나노입자를 사용하는 것은 오늘날 수많은 연구 그룹의 주요 관심사이다. 나노입자는 생물의학 용도에서, 예를 들면 진단 목적의 생체영상화, 약물 전달, 및 유전자 치료에 유용하게 쓰일 수 있도록 여러 성질들을 가지고 있다. 나노입자는 또한 배양, 조직, 또는 무상 유기체에서 세포를 표지하기 위한 생 체영상화제로서 사용될 수 있다.
현재 생체영상화 용도에 사용되는 나노입자 기술로는 자기 나노입자, 페로플루이드(ferrofluids), 및 퀀텀 도트(quantum dots)(QD)가 있다. 최근에 이르러, 생물학적 표지화를 위해 사용된 QD 부류 (Q-dotsTM으로 시판됨)인 콜로이드 형광 반도체 나노결정, 예컨대 ZnS 쉘-CdSe 코어 나노입자의 개발에 많은 진전이 있었다 (Haugland, R. P. Molecular Probe, 6:320-328, 1998). 연구자들은 현재 생체 내 활용 계획을 개발하고 그런 프로브를 생물학적 분석에 적용하는 과정에 있으며, 나노결정은 기존의 유기 염료와 비교해볼 때 생물학적 표지로서 특별히 유익할 수 있다. 퀀텀 도트는 생체영상화에 적용할 수 있는 범위에서 광범위하게 시험 되어왔다.
반도체 나노결정은 그것의 사용과 관련하여 여러 문제점을 나타내는데, 예를 들면 반도체 나노결정의 용해도, 물리화학적 안정성 및 퀀텀 효율이 그것들이다. 또한 QD 방출은 매우 간헐적이고, 응집은 생체영상화 도구로서의 유효성을 제한할 수 있다. QD와 관련된 다른 문제점으로는 표면 전자 결함과, 표면 산화가 QD 쉘의 분해를 유발하여 독성 금속을 신체 안으로 방출할 수 있음에 따라 발생하는 독물학적 효과, 및 QD의 물리적 특성에 대한 설명을 매우 어렵게 만드는 빈약한 결정성을 들 수 있다. 나아가 생체표지로서의 형광 나노입자의 기본적인 용도는 논의의 여지가 있는데, 왜냐하면 특히 일반적인 환경적 관심이 고도로 독성인 화합물, 예컨대 카드뮴을 생물의학적 진단에 사용하는 것에 관련되어 있기 때문이다. 더욱이 나노 미터 크기의 구조물을 디자인하는 방법과 신규의 전기적, 광학적, 자기적, 수송상의, 광화학적, 전기화학적 및 기계적 특성을 나타내는 새로운 물질을 산출하기 위해 그것들의 형상을 조절하는 방법은 거의 발견되지 않으며, 따라서 잠재적으로 도전해볼 만한 가치가 있다.
나노입자는 또한 약물 전달을 위한 메커니즘으로서의 기능을 할 수 있는데, 그것은 수많은 수불용성 및 불안정한 약물의 활용을 가능하게 한다. 또한 나노입자는 약물 표적화 및 재흡수 가능한 쉘 기술을 토대로 한 방출 연장 용도에 사용될 수 있다. 또한 나노복합체는 유전 물질을 전달하기 위한 유전자 치료법에 사용될 수 있다. 현재 사용되고 있는 나노입자 약물 및 유전자 "담체"로는 중합체 미셀, 리포솜, 저밀도 리포단백질, 중합체 나노스피어, 덴드라이머(dendrimer), 및 친수성 약물-중합체 복합체가 있다.
과거 10년에 걸쳐 나노규모의 복합체 입자의 제조 분야에 광범위한 연구가 수행되어 왔는데, 왜냐하면 전자 공학 및 포토닉스에서 그런 입자가 보여주는 독특한 특성 및 잠재적 응용성 때문이다. 이산화규소(SiO2)-쉘 금속성-코어 구조화된 나노복합 입자가 처음으로 멀배니 등에 의해 (Mulvaney et al. Langmuir, 12:4329-4335, 1996), 그리고 아데어 등에 의해(Adair et al. Materials Sci. & Eng. R., 23:139-242, 1998) 합성되었고 기록되었다. 코어-쉘 구조를 가지는 SiO2 코팅된 나노복합 입자의 대부분은 사용된 합성 방법을 토대로 두 가지 카테고리에 속한다. 멀베니 등에 의해 개발된 접근법은 실리카 쉘의 형성 전에 실란-커플링제 3-아미노 프로필트리에톡시실란 (APS)으로 금속 클러스터 표면을 변형하는 것을 포함하였다. APS는 비트레오포빅(vitreophobic) 금속 클러스터 코어와 SiO2 사이에서 점착 촉진제로서 사용된다. 그러나 현탁액에서 나노복합체에 대한 분산 상태는 멀배니 등 또는 아데어 등에 의해 조사되지 않았다. 아데어 등은 금속성 및 CdS 클러스터를 간단한 가수분해 및 수성 상을 가지는 시클로헥산/이게팔(Igepal)/물의 삼차 시스템에서 테트라에톡시실란(TEOS)의 축합을 통해 SiO2로 코팅하는 데 성공하였다. 이 시스템은 오일 중의 물방울의 한계로 인하여 코어와 쉘 두 가지의 조율가능한 두께와 함께 매우 균일한 실리카-쉘 코팅을 가능하게 한다.
치료제 전달 용도에서 나노입자를 사용하는 데 있어 주요한 제한으로는 나노입자 현탁액의 콜로이드 안정성의 결핍, 응집, 크기 및 형상의 다중분산성, 팽윤, 및 누출이 있다. 다른 문제점으로는 합성과 가공처리 기법의 어려움, 담체 입자 내부의 부적절한 부하, 및 다양한 의학 제제에 대한 적용성의 부족을 들 수 있다. 세척되지 않은 나노현탁액에 존재하는 잔류 선구 물질은 또한 생리학적 시스템에 대한 표적화된 전달 및 독성 효과 두 가지에 대해 모두 유해한 효과를 나타낼 수 있다. 전형적인 화학적 합성 방법에서 나노입자의 분산은 본질적으로 새롭게 제조된 나노입자의 세척과 함께 시작된다. 그러나 나노입자의 세척 및 분산은 인접한 나노입자들 사이의 강력한 반 데르 발스 인력 때문에 도전이 된다. 이런 이유로, 나노입자 현탁액은 통상, 계면활성제 분자에 의해 생성된 강한 척력 전위로 상호작용 힘을 효과적으로 균형을 맞추는 계면활성제의 표면 코팅으로 안정화된다. 그러나 나노입자를 기초로 하고 용도 및 장치에 대해 더 좋은 성능을 이루기 위해서는 계면활성제 분산제를 최소화하는 것이 필요하다. 이것은 계면활성제 첨가제가 후속되는 가공처리 단계로 전달되어 나노입자로부터 조립된 배열의 균일성에 부정적으로 충격을 줄 수 있기 때문이다. 나아가 보호성 계면활성제가 종래의 세척 기법, 예컨대 원심분리로 제거될 때 나노입자는 응집하려는 경향이 나타난다. 응집체의 존재는 또한 입자의 효과적인 수율을 떨어뜨릴 수 있다. 만약 나노미터-크기의 일차 입자가 바람직하다면 통상 크기 순서이거나 더 큰 응집체의 존재를 피해야만 한다. 예를 들어 미국 특허 제 6,548,264호 (Tan, W, et al., 2003, 하기에서 상세하게 설명됨)에 개시된 여과 방법과 같은 나노복합 입자를 제조하기 위한 선행 기술의 종래 방법은 응집체 크기가 약 250nm인 비가역적으로 응집된 나노복합 입자를 초래한다.
나노 의학에서의 현재의 한계점을 고려하면, 조절된 시간-방출, 치료제(들)의 고 부하, 제조의 용이성, 안정성, 및 규모-확대 능력을 가지면서 보편적으로 적용할 수 있는 나노입자가 필요하다. 활성-의학-제제를 전달하기 위해 안정한 비-응집성 콜로이드를 제형하는 것은 다양한 생체영상화 및 치료제에 대해 보편적이고, 제어된, 표적화된, 전신성 전달을 제공함으로써 의학 분야를 변모시키는 잠재력이 있다.
도 1은 본 발명의 역-미셀 합성, 세척 및 수집 접근법의 개략도이다;
도 2는 나노복합 입자 메커니즘을 통한 활성 의학 제제의 세포 내 전달의 개 략도이다;
도 3은 플루오레신/SiO2 나노입자의 형광 방출 스캔을 도시한다;
도 4는 1M 로다민 WT/SiO2 나노복합 입자와 10-5M 로다민 WT 스톡 용액의 형광 방출 타임스캔을 도시한다;
도 5는 나노복합 입자 포토디케이(photodecay) 실험 결과를 도시한다;
도 6A 내지 도 6D는 평활근 세포와 쥐의 방사상 신경절(stellate ganglia)의 상 대비 및 형광 영상을 도시한다. 도 6A와 도 6B는 각각 플루오레신/SiO2 나노입자를 흡수한 배양된 혈관 A7r5 평활근 세포의 상 대비 및 형광 영상을 도시하고; 도 6C와 도 6D는 각각 나노입자를 심장 내로 주사하고 5일 후에 급히 분리한 쥐의 방사상 신경절의 상 영상과 형광 영상이다;
도 7A 내지 도 7E는 쥐 방사상 신경절의 상 대비 및 형광 영상을 도시한다. 도 7A와 도 7B는 각각 0.002%의 10-2M 로다민 B/SiO2 나노입자에 방사상 신경절 (SG)의 뉴런이 시험관 내에서 (15분) 노출된 후의 상 대비 및 형광 영상이고; 도 7C와 도 7D는 각각 0.002%의 10-2M 플루오레신/SiO2 나노입자에 SG 뉴런이 시험관 내에서 (15분) 노출된 후의 상 영상 및 형광 영상이며; 도 7E는 주사 후 7일이 지난 후 SG 뉴런의 플루오레신/SiO2-함유 뉴런의 형광 영상이다;
도 8은 유기 플루오로포어 및 치료 약물을 함유하는 기능화된 나노복합 입자 의 개략도이다;
도 9는 세라미드/Ca10(PO4)6(OH)2 나노입자가 사람 관상동맥 평활근 세포 성장 억제를 유도하는 것을 보여주는 막대 그래프도이다;
도 10은 역 미셀 합성 및 다양한 방법을 사용한 세척으로부터 얻어진 Ag/SiO2 나노복합체 현탁액의 흐름도이다;
도 11은 크기 축출 크로마토그래피를 토대로 한 Ag/SiO2 나노복합체 에탄올/물 현탁액의 세척 및 분산을 위한 HPLC 시스템의 개략적인 장치를 도시한다. UV-비스 검출기 파장은 Ag/SiO2 나노복합체에 대해 405nm에서 설정된다. HPLC 칼럼의 크기는 HR 5/5(5×50mm)이다;
도 12A 내지 도 12C는 나노입자를 세척하고 분산하기 위해 사용된 HPLC 시스템의 개략도이다. 도 12A는 HPLC 시스템이고; 도 12B는 Ag/SiO2 나노입자의 TEM이며; 도 12C는 정지 상의 구형 실리카 비드의 SEM이다;
도 13A와 도 13B는 원심분리로 세척된 Ag/SiO2 나노복합체 현탁액 (R=2, H=100, X=1)을 도시한다. 도 13A는 일차 입자 크기의 TEM 분석을 도시한다. 도 13B는 역학적인 광 산란에 의한 입자 크기 분포를 도시한다;
도 14A와 도 14B는 쏙시렛(Soxhlet) 추출로 세척된 Ag/SiO2 나노복합체 현탁액 (R=2, H=100, X=1)을 도시한다. 도 14A는 일차 입자 크기의 TEM 분석을 도시한다. 도 14B는 역학적인 광 산란에 의한 입자 크기 분포를 도시한다;
도 15A와 도 15B는 침강법으로 세척된 Ag/SiO2 나노복합체 현탁액 (R=2, H=100, X=1)을 도시한다. 도 15A는 일차 입자 크기의 TEM 분석을 도시한다. 도 15B는 역학적인 광 산란에 의한 입자 크기 분포를 도시한다;
도 16A와 도 16B는 여과로 세척된 Ag/SiO2 나노복합체 현탁액 (R=2, H=100, X=1)을 도시한다. 도 16A는 일차 입자 크기의 TEM 분석을 도시한다. 도 16B는 역학적인 광 산란에 의한 입자 크기 분포를 도시한다;
도 17A와 도 17B는 종래 방법으로 세척된 Ag/SiO2 나노복합체 현탁액 (R=2, H=100, X=1)의 형태를 도시한다. 도 17A는 코어-쉘 구조의 TEM 영상을 도시한다. 도 17B는 TEM 영상으로부터 얻어진 입자 크기 분포를 도시한다;
도 18은 HPLC 시스템에서 정지 상으로서 사용된 SiO2 미세구체의 SEM 영상을 도시한다. SiO2 미세구체는 APS로 처리되었다 (0.336mL의 APS, 1.5mL의 저온 아세트산, 7.5mL의 DI 물 및 150mL의 에탄올과 혼합된 90g의 SiO2, 밤새 교반되고 70 ℃에서 건조된다). 표면적은 425m2/g이고, 평균 기공 크기는 6.5nm이다;
도 19는 HPLC 시스템으로 세척된 Ag/SiO2 에탄올/물 현탁액 (R=2, H=100, X=1)의 HPLC 스펙트럼을 도시한다. 스펙트럼은 405nm에서 (Ag 퀀텀 도트의 표면 플라스몬 공명) UV-비스 검출기에 의해 얻어졌다. 세척 용매는 에탄올/물 용액 (부피 비율 7:3)이고, 유속은 2mL/분이다. 스펙트럼을 PEAKFIT®에 의해 탈콘볼루트하였 고(deconvoluted), 피크의 중심 위치는 95.1, 112.2 및 150.7s이다;
도 20A와 도 20B는 HPLC로 세척된 Ag/SiO2 나노복합체 에탄올/물 (7:3 부피) 현탁액의 형태를 도시한다. 도 20A는 나노복합체의 두 가지 현탁액, A와 B이다. 도 20B는 디지털 영상을 도시한다: 현탁액 A, R=2, H=100, X=l, 현탁액, D50=30nm, SD=1.2 nm. B, R=8, H=100, X=1, D50=20.3nm, SD= 1.5 nm. (95% 신뢰도 간격). TEM 영상은 현탁액 A와 B의 분산액의 크기, 코어-쉘 구조 및 상태를 도시한다;
도 21은 HPLC 세척으로 얻어진 Ag/SiO2 나노복합체 (R=2, H=100, X=1) 현탁액의 AFM 영상을 도시한다. 영상은 TAPPING MODETM에 의해 얻어졌다. 샘플은 Ag/SiO2 에탄올/물 현탁액 방울을 새롭게 절단된 운모 기판 위에 놓고 1500rpm에서 30초 동안 스핀 코팅함으로써 제조되었다. 3D 영상은 약 60nm의 응집체 크기를 보여준다;
도 22는 역학적 광 산란(DLS)와 TEM 분석에 의해 측정된 Ag/SiO2 나노복합체 (R=8, H=300, X=1)의 입자 크기 분포를 도시한다. DLS에 대해서는 D50=18.6nm, SD=1.5nm이고, TEM 분석으로부터의 입자 크기는 20.3±1.5nm이다 (30개의 입자가 계수되었다). DLS와 TEM 분석 사이에 밀접한 매치가 주지되는데, AAN은 대략 1이고, 그것은 잘 분산된 현탁액임을 나타낸다;
도 23은 pH와 APS 농도의 함수로서의 Ag/SiO2 나노복합체 (R=2, H=100, X=1) 에탄올/물 현탁액의 제타 전위를 도시한다. APS의 첨가 후 네거티브에서 포지티브 전하로의 전환이 주지된다. 현탁액의 pH는 표준 완충 수용액에 대하여 보정된 센트론(Sentron) pH 계량기를 사용하여 측정되었다. 에러 막대는 95% 신뢰도 간격이다;
도 24는 pH와 APS 농도의 함수로서의 SiO2 미세구체의 제타 전위를 도시한다. SiO2의 평균 크기는 20㎛이고, 표면적은 425m2/g이며, 평균 기공 크기는 6.5nm이다. SiO2 미세구체는 에탄올/물 (7:3 부피) 용액에 분산되었다. 현탁액의 pH는 표준 완충 수용액에 대하여 보정된 센트론(Sentron) pH 계량기를 사용하여 측정되었다. 에러 막대는 95% 신뢰도 간격이다;
도 25는 SiO2 미세구체 표면에 형성된 Ag/SiO2 나노복합체 (R=2, H=100, X=1) 집합의 AFM 영상을 도시한다. APS 표면 코팅만을 Ag/SiO2 나노복합체 (평균 크기 30nm)에 적용하였고, SiO2 미세구체는 추가의 처리 없이 사용하였다 (평균 크기 20 ㎛). 차단된 HPLC 칼럼으로부터의 SiO2 미세구체를 새롭게 절단된 운모 기판 위에 놓았다;
도 26A와 도 26B는 Ag/SiO2 나노복합체 에탄올/물 현탁액 (R=8, H=300, X=1)에 대한 분산 상태에 미치는 pH의 영향을 도시한다; 도 26A는 역학적인 광 산란에 의한 입자 크기 분포를 도시한다. 도 26B는 레이스 모양의 탄소 격자 위에 현탁액 방울을 떨어뜨리고 25 ℃에서 건조시킴으로써 얻는 TEM 영상이다. pH 9.7에서 SiO2 쉘의 분해가 주지되는데, 그것은 2개의 모드 방식의 분포를 유발한다;
도 27A와 도 27B는 유기 코어 물질로서 로다민 B를 함유하는 유기 코어/실리카 쉘 나노복합 입자의 (A) 낮은 및 (B) 높을 때의 크기와 형태를 도시하는 투과형 전자 현미경 (TEM) 영상이다; 그리고
표 1은 SiO2-기초 나노복합 입자의 표면 변형을 위해 사용된 실란 커플링제의 목록을 나타낸다.
Figure 112006098325232-PCT00001
발명의 개요
본 발명은 그것에 한정되는 것은 아니지만 부착된 알킬아민 또는 알킬카르복실산 실란 커플링제와 같은 실란 커플링제를 가지는 안정하고, 비응집성의, 잘 분산된, 활성-의학-제제 코어/쉘 나노복합 입자를 제조하는 방법을 제공한다. 이식 메커니즘의 상세한 논의는 다른 문헌에 설명되어 있다 (Plueddemann, E. P., "Silane coupling agent, " pp 29-48, Plenum Press, NY, 1982; Ung, T. et al., Langmuir, 14:3740-3748, 1998; Chiang, C. H., et al., J. Colloid Interface Sci., 74 (2):396-403, Chiang, C. H. et al., J. Colloid Interface Sci., 86(1):26-34, 1982). 나노복합체의 분산은 바람직하게는 순차적인 세척과 분산 단계를 포함하는 다른 기법 대신에, 나노복합 입자의 세척과 분산이 동시에 이루어지는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용함으로써 이루어진다.
본 발명은 또한 생리적 조건, 즉 등장성 환경하에, 실란 커플링제에 대한 카보디이미드-중재 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 커플링제와 같은 표면 변형에 의해 생체 내에서 사용될 수 있는, 그것들의 분산된 상태를 유지하는 안정하고 분산된 나노복합 입자의 제조 방법을 제공한다. 다른 표면 변형 방법은 덴드라이머, 양친매성 제제, 및 하전된 흡착질, 예컨대 당해 기술분야에 공지되어 있는 것과 같은 시트레이트를 포함한다. 본 발명은 또한 결합제, 예컨대 항체를 부착함으로써 나노복합 입자가 세포내 약물 전달을 위한 특정 부위를 표적화하는 것을 제공한다.
나노복합 입자는 다양한 의학적으로 활성인 물질, 예컨대 유기 플루오로포어 및 치료 약물, 도핑된 내부 실리카, 이산화 티탄 (티타니아), 인산 칼슘 또는 인-규산 칼슘 매트릭스를 포함할 수 있다. 합성 기법은 또한 플루오로포어와 치료적 의학 제제의 조합을 함유하는 나노입자를 제조하기 위해 변형될 수 있다. 나노복합 입자의 콜로이드에 대해 의도된 생물의학 용도는 코어 및 쉘-매트릭스 물질의 선택을 지시한다.
안정하고 잘 분산되며 응집하지 않는 활성-의학-제제 나노입자는 다양한 용도, 예컨대 제한 없이 색소, 형광성 표지화, 잉크, 서방성 제형, 생체영상화, 약물 전달, 유전자 치료법 및 그것들의 조합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 또한 제한 없이, 본 발명의 나노입자는 의학적 진단을 위해, 및 암, 감염성 질병, 당뇨병, 낭포성 섬유증 및 기타 질병 및 장애에 대한 의학적 치료법을 위한 칼슘 침착 트랜스포터(transporter)로서 사용될 수 있다.
형광성 나노복합 입자는 영상화 및 색소 용도에 대해 특히 매력적인 것으로 만드는 여러 성질들, 예를 들면 방출 피크의 정확한 조율가능성, 전통적인 유기 플루오로포어에 비해 연장된 형광 반감기, 무시할 수 있을 정도의 광표백성, 및 생체적합성의 장점을 가지는 자체-퀀칭(self-quenching)을 가지고 있다. 또한 나노 과립 형광 방출은 간헐적이지 않다. 나노입자 내에서, 염료 분자와 환경 사이의 직접적인 접촉은 피하게 되는데, 그 결과 아마도 대부분의 유력한 광자의 흡수, 따라서 여기 광자의 손상 때문에 플루오로포어의 광분해가 사라진다. 그 결과로서, 나노복합 입자는 도 3 내지 도 5에 도시된 것과 같이 전통적인 유기 플루오로포어 또는 퀀텀 도트에 비해 연장된 형광 수명을 나타낸다.
나노복합 입자는 도 6 내지 도 9에 도시된 바와 같이 다공성이 조절된 금속 산화물 쉘 및/또는 분해될 때 고통받는 부분 바로 옆에 치료제를 방출하는 가용성 외부 쉘/코팅 중 어느 하나에 치료제가 캡슐화된 것을 토대로 한 약물 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 쉘-매트릭스 물질에 의해 제공된 치료제의 보호는 매우 수불용성이거나 생리 용액에서 불안정한 약물의 전달을 가능하게 한다. 나아가 쉘-매트릭스 물질의 분해 역학은 연장된 기간 동안 표적 부위에서 치료제를 지속적으로 방출하기 위하여 처리될 수 있다.
나노복합 현탁액은 또한 약물, 이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 세라미드, AZT, 및 도부타민을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 인슐린은 또한 인산 칼슘 또는 인-규산 칼슘과 같은 가용성 쉘 물질에 캡슐화될 수 있다. 표면은 변형되어 생리학적 막, 예컨대 위장관, 혈액-뇌 장벽, 및 세포막을 나노복합 입자가 가로지르는 것이 가능해진다. 표적화되고 시간이 조절된 방출은 인슐린과 같은 치료제를 코어-쉘 나노입자로부터 전달하기 위해 사용될 수 있다.
나노복합체는 또한 유전자 치료법에서 치료 DNA를 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 나노복합 입자는 캡슐화 및 개선된 흡수를 통하여 표적 세포에 유전 물질의 증가된 안정성을 제공할 수 있다. 또한 나노입자는 전사적으로 활성 형태로 유전적 치료제를 전달할 수 있는 한편, 약 200nm 이하의 작은 크기를 유지한다.
나노입자 표면 화학 및 분산이 증강된 작은 입자 크기는 나노복합 입자의 유효성에 기여한다. 수립된 작은 크기는 동물 모델 또는 신체의 세망내피계(RES)에 의한 포획으로부터 빠져나오는 것이 가능하므로, 나노입자가 장 벽(intestinal wall) 및 혈액-뇌 장벽과 같은 막을 가로지름으로써 생물학적 시스템에서 기능을 하는 것이 가능해진다. 작은 나노복합 입자들은 수많은 생물학적 장벽을 통화할 수 있고 그로써 고농도의 치료제가 표적 부위에 전달되는 것이 가능하다. 또한 분산된 나노복합 입자는 치료제를 직접 신체의 표적화된 세포 또는 조직에 전달하기 위해 쉽게 기능화될 수 있다. 응집은 상기 모든 생물의학적 용도뿐만 아니라 생물의학적 이외의 용도까지도 방해한다.
나노복합 입자의 합성은 물, 계면활성제 및 용매, 예컨대 시클로헥산을 포함하는 역 미셀 시스템을 사용하여 이루어진다. 그 결과의 나노복합체의 크기는 물-계면활성제 비율에 좌우되는데, 물-계면활성제 비율이 높으면 더 큰 나노복합체가 형성된다. 그러므로 본 발명은 직경이 약 1.0 내지 100nm, 바람직하게는 생물학적 세포막을 가로지르기에 충분한 크기인, 직경이 약 1 내지 20 nm인 나노복합 입자의 합성을 제공한다. 그러나 아래에서 규정되는 바와 같이, 합성에 의해 얻어진 일차 입자 크기는 현탁액에 실제로 사용할 수 있는 크기의 입자가 아니다. 지금까지 역 미셀로 제조된 나노복합 입자들은 응집되었다. 응집은 합성 후 나노입자에 대한 세척과 수집 조작시 발생한다. 그러므로 일차 나노입자만을 단독으로 합성하는 것은 잘 분산된 현탁액을 제공하는 데는 불충분하다.
바람직한 실시예 들의 설명
본 발명은 먼저 응집되지 않고, 고도로 분산되며, 안정한 코어/쉘 나노복합 입자의 합성 방법을 제공한다. 바람직하게는 나노복합 입자는 그 위에 부착된 분산제, 예컨대 알킬아민 또는 알킬카르복실산 실란 커플링제를 가지거나, 또는 분산제는 특히 칼슘-기초 나노입자의 합성에서 시트레이트, 옥살레이트, 숙시네이트 및 포스포네이트로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 나노복합 입자의 분산은 나노복합 입자를 동시에 세척하고 분산시키기 위해 크기 축출 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템을 사용함으로써 이루어진다.
본 발명은 또한 카보디이미드-중재 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 커플링제와 같은 표면 변형에 의해 생리적 조건, 즉 등장성 환경하에서 생체 내에서 사용하기 위한, 응집되지 않고, 잘 분산되며, 안정한 나노복합 입자 현탁액의 제조를 제공한다.
본 발명은 나아가 쉘이 생체 내에서 재흡수가능하거나 생체 내 분해 가능하도록 만드는 유기 및/또는 무기 코어 위에 인산 칼슘 및 인-규산 칼슘 쉘과 같은 칼슘-기초 쉘의 형성을 제공한다. 밑에 놓이는 쉘은 다공성이거나 조밀할 수 있다.
본 발명은 또한 결합제, 예컨대 항체 및 다른 기능성 기, 이를테면 광범위한 기능성을 가진 아민, 카르복실레이트 및 합성 중합체를 부착함으로써, 나노입자가 세포 내 약물 전달을 위한 특정 부위와 같이 전달 용도에 사용되는 것이 가능해지는 결합제 부착을 제공한다. 또한 다른 부분, 예를 들면 제한 없이 유기 기, 금속, 효소, 매크로분자 또는 플라스미드가 나노복합 입자 표면에 첨가될 수 있다. 예를 들어 나노복합 입자는 표적 물질, 예컨대 암세포에 결합하는 폴레이트에 의해 둘러싸여 있는 시간 방출 쉘 안에 캡슐화되어 있는 화학치료 약물을 함유할 수 있다. 표적 물질은 또한 세포 및/또는 세포의 핵 안에 들어갈 수 있고, 그런 다음 그 안에서 방출되는 단백질, 효소, DNA, RNA 및 다른 화합물을 운반하기 위해 사용될 수 있다.
잘 분산된 나노복합 입자의 제조는 계면활성제, 소수성 용매, 수성-기초 코어 선구 물질, 예컨대 수성-기초 활성-의학-제제 선구 물질, 형광 분자, 색소, 금속 또는 다른 원하는 코어 물질을 포함하는 역 미셀 시스템을 사용하고, 바람직하게는 크기 축출 HPLC 시스템 (도 1, 11 및 12)을 사용하는 세척 및 분산 방법을 사용하는 본 발명의 방법에 따라 이루어진다. 그 결과 생성되는 일차 나노복합 입자의 크기는 물-계면활성제 비율에 좌우되며, 물-계면활성제 비율이 높을수록 생성되는 나노복합체는 더 커진다. 특히 일차 나노복합 입자의 크기는 계면활성제에 대한 물의 몰 비율, 쉘 선구 물질에 대한 물의 몰 비율, 및 실리카 쉘 입자의 경우에는 쉘 선구 물질에 대한 염기의 몰 비율을 포함하는 처리과정 매개변수의 조작을 통하여 변형될 수 있다. 그러므로 본 발명은 약 1.0 내지 100nm, 바람직하게는 약 1 내지 20nm, 가장 바람직하게는 약 10 내지 20nm의 직경을 가지는 나노복합체의 합성을 제공한다. 예를 들어 직경이 대략 10nm인 구형 SiO2 나노복합 입자는 R=[물]/[계면활성제]=2이고, H=[물]/[TEOS]=100이며, X=[NH4OH]/[TEOS]=1이 시클로헥산/물/Igepal® CO-520 시스템에 적용될 때 합성될 수 있다. 직경이 약 20nm 이하인 나노복합 입자는 혈액-뇌 장벽을 포함하여 생물학적 세포막을 충분히 가로지를 만큼 작은 것으로 여겨진다.
본원에서 사용되는 용어 "나노크기(nanosize)"는 입자가 약 100nm보다 작은 평균 치수를 가지고 벌크 상과 정상적으로 관련되지 않는 특성, 예컨대 퀀텀 광학 효과를 나타내는 것을 수반하는 특수한 하위분할 상태를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "나노복합 입자(nanocomposite particles)", "나노복합체(nanocomposites)" 및 "나노입자(nanoparticles)"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "응집(agglomeration)"은 물리적 힘 (반 데르 발스, 소수성) 또는 정전기력을 통하여 현탁액에서 집합체 (과립 하위유닛으로 구성되는 점착성 덩어리)의 형성을 말한다. 그 결과의 구조는 "응집체(agglomerate)"로 불린다.
본원에서 사용되는 용어, "응집"의 반대어인 "비응집성(unagglomeration)"은 현탁액에 집합체가 분산되어 있는 상태를 말한다.
본원에서 사용되는 "집합체(aggregate)"는 과립 하위유닛으로 구성되는 점착성 덩어리를 말한다.
본원에서 사용되는 "일차 입자(primary particles)"라는 표현은 과립 시스템에서 확인가능한 가장 작은 하위분할을 말한다. 일차 입자는 또한 집합체의 하위유닛일 수 있다.
본 발명의 방법을 따라 사용될 수 있는 계면활성제의 실례로는 제한 없이, 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐 에테르 (이게팔® CO-520); 소수성 용매 및 또한 저분자량 소수성 용매, 예컨대 유-중-수, 역 미셀을 형성하는 에탄올과 같은 용매를 가질 수 있는 수성 용액과 조합된 계면활성제를 예로 들 수 있다.
쉘 선구 물질의 실례로는, 제한 없이, SiO2, TiO2, ZnO, Fe2O3, ZrO2, NiO 및 GeO2, Sn, Pg, Ag 및 Au, 테트라에톡시실란 (TEOS), 티타늄(IV) 이소프로폭시드, CaPOx, CaCO3, 또는 일반식 Cax(PO4)3(OH)z(SiO2)a (식에서 x, y, z 및 a는 0부터 더 큰 수까지 달라질 수 있다)의 인-규산 칼슘이 있다.
또한 코어 물질은 약물 제제, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 도부타민, AZT, 항생물질, 및 세라미드를 함유할 수 있고, 따라서 감염성 미생물, 암 또는 다른 외래 물질에 대해 사용될 수 있다. 또한 코어 물질은 제한 없이 폴리비닐 알코올, 폴리메틸 메타크릴산, 및 2-히드록시에틸 메타크릴산과 같은 물질을 토대로 탈수된 하이드로겔로 구성될 수 있다. 나아가 코어 물질은 인산 칼슘 코팅과 함께 실리카를 포함할 수 있다. 인산 칼슘 쉘/실리카 코어 물질은 시트레이트와 같은 제제를 사용하여 생리적 pH 값 (pH 6.5 내지 7.4)에서 잘 분산될 수 있으며, 따라서 나노입자는 치아의 상아질에 현탁액 중의 잘 분산된 나노입자가 전달될 때 상아질 세관에 칼슘 및 포스페이트의 방출을 통해 치아 민감성에 대한 치료제로서 사용되는 것이 가능해진다.
또한 나노복합 입자의 쉘 선구 물질은 폴리비닐 알코올, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 2-히드록실에틸 메타크릴레이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포독성제를 함유할 수 있고, 따라서 감염성 미생물, 암 또는 다른 외래 물질에 대한 표적으로서 사용된다. 나아가 쉘 선구 물질은 시트레이트로 안정화된 인산 칼슘을 포함하는 실리카 쉘 코팅으로 구성될 수 있고, 따라서 나노입자가 치아의 상아질에 나노입자가 전달될 때 상아질 세관에 칼슘 방출을 통해 치아 민감성에 대한 치료제로서 사용되는 것이 가능하다.
수성 코어 선구 물질의 실례로는, 제한 없이 Au, Ag, Co, Ni, Cu 및 Pt와 같은 금속; CdS와 같은 반도체; 유기 색소; 유기 염료; 유기 플루오로포어, 예컨대 플루오레신의 나트륨 염; 로다민 123; 로다민 WT; 로다민 B 및 로다민 B 유도체, 예컨대 로다민 123, 플루오레신, 플루오레신 유도체 및 루시페린; 및/또는 활성-의학-제제, 예컨대 상기에서 설명된 것과 같은 것들을 포함하는 치료제가 있다.
치료제의 실례로는, 제한 없이 세포에 치료적 DNA 또는 RNA (또는 어떠한 핵산)의 전달을 위해 유전자 치료법에 사용될 수 있는 유전자 치료제가 있다. 본 발명의 나노복합 입자는 캡슐화 및 개선된 표적 세포 안으로의 흡수 (도 2)를 통하여 유전 물질의 증가된 안정성을 제공한다. 또한 나노복합 입자는 전사적으로 활성 형태로 유전자 치료제를 전달할 수 있는 한편, 100nm 이하의 작은 직경 크기를 유지한다.
플루오레신 및 플루오레신 유도체의 실례로는, 제한 없이 BDCECF; BCECF-AM; 칼시엔-AM; 5,(6)-카르복시-2',7'-디클로로플루오레신; 5,(6)-카르복시-2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트 N-숙신이미딜 에스테르; 5,(6)-카르복시에오신; 5,(6)-카르복시에오신 디아세테이트; 5,(6)-카르복시플루오레신; 5-카르복시플루오레신; 6-카르복시플루오레신; 5,(6)-카르복시플루오레신 아세테이트; 5,(6)-카르복시플루오레신 아세테이트 N-숙신이미딜 에스테르; 5,(6)-카르복시플루오레신 N-숙신이미딜 에스테르; 5(6)-카르복시플루오레신 옥타데실 에스테르; 5,(6)-카르복시나프토플루오레신 디아세테이트; 에오신-5-이소티오시아네이트; 에오신-5-이소티오시아네이트 디아세테이트; 플루오레신-5(6)-카르복시아미도카프로산; 플루오레신-5(6)-카르복시아미도카프로산 N-숙신이미딜 에스테르; 플루오레신 이소티오시아네이트; 플루오레신 이소티오시아네이트 이성체 1; 플루오레신 이소티오시아네이트 이성체 2; 플루오레신 이소티오시아네이트 디아세테이트; 플루오레신 옥타데실 에스테르; 플루오레신 나트륨 염; 나프토플루오레신; 나프토플루오레신 디아세테이트; 또는 N-옥타데실-N'-(5-플루오레시닐)티오우레아 (F18)이 있다.
로다민 및 로다민 유도체의 실례로는, 제한 없이 5,(6)카르복시테트라메틸로다민; 5-카르복시테트라메틸로다민 N-숙신이미딜 에스테르; 6-카르복시테트라메틸로다민 N-숙신이미딜 에스테르; 5,(6)-카르복시테트라메틸로다민 N-숙신이미딜 에스테르; 5,(6)-카르복시-X-로다민; 디히드로로다민 123; 디히드로로다민 6G; 리사민 로다민; 로다민 110 클로라이드; 로다민 123, 로다민 B 히드라지드; 로다민 B; 및 로다민 WT가 있다.
유기 색소 및 염료의 실례로는, 제한 없이 헤마토포르피린 염료, 예컨대 7,12-비스(1-히드록시에틸)-3,8,13,17-테트라메틸-21H,23H-포르핀-2- 및 18-디프로판산, 및 시아닌 염료 및 유도체, 예컨대 인도시아닌 그린; 인도닌 블루; R-피코에리트린(PE), PE-Cy 5; PE-Cy 5.5; PE-텍사스 레드; PE-Cy 7; Cy 3 NHS 에스테르; Cy 3 말레이미드 및 히드라지드; Cy 3B NHS 에스테르; Cy 3.5 NHS 에스테르; Cy 3 아미다이트; Cy 5 NHS 에스테르; Cy-5-; Cy 5 아미다이트; Cy 5.5; Cy-5.5 NHS 에스테르; Cy 5.5 아넥신 V; Cy 7; Cy 7 NHS 에스테르; Cy 7Q NHS 에스테르; 알로피코시아닌(APC); APC-Cy 7; APC Cy 5.5; 요오드화 프로피듐 (PI); 크리스탈 바이올렛 락톤; 페턴트 블루 VF; 브릴리언트 블루 G; 또는 케스케이드 블루 아세틸 아지드가 있다.
본 발명의 방법에 따라 나노복합 입자에 첨가될 수 있는 실란 커플링제의 실례로는, 제한 없이 3-아미노프로필트리메톡시실란 (APS)(pH 윈도우 2.0~9.0; SiO2의 표면을 변형하기 위해 광범위하게 사용된다); 3-아미노프로필실세스퀴옥산 (pH 윈도우 2.0~6.5; 실리카 입자와 Ag 나노입자 사이의 점착 촉진제); 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 (GPS)(pH 윈도우<9.0; SiO2 나노입자를 변형하기 위해 사용됨); 트리메톡시실릴프로필-디에틸렌트리아민 (DETA)(최적 pH 6.8; SiO2 나노입자의 표면 코팅을 위해 사용됨); 또는 3-트리메톡시실릴프로필숙신산 무수물 (pH 윈도우>8.0; 실리카 표면에 네거티브 전하를 제공하기 위해 사용됨)이 있다.
또한 알킬카르복실산 실란 커플링제가 나노복합 입자에 첨가될 수 있는데, 예를 들면 아미드-결합 카르복실기 (pH 윈도우<7.0; 개방 단부 탄소 나노관을 기능화하기 위해 사용됨)가 있다.
나아가 카보디이미드-중재 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 커플링제와 같은 표면 변형이 동물 또는 사람의 생체 내에서 나노복합 입자를 사용하기 위하여 실란 커플링제에 첨가될 수 있다. 덴드라이머 표면 변형이 또한 생리적 환경에서 나노복합 입자의 사용을 촉진하기 위하여 사용될 수 있다.
또한 추가로 결합제, 예컨대 항체가 부착될 수 있어서 나노복합 입자가 세포내 약물 및 핵산 전달을 위해 특정 부위를 표적화하는 것이 가능해진다.
나노입자의 성공적인 분산 정도, 즉 비응집화는 특정 나노복합체 현탁액에 대하여 평균 응집체 수(AAN)를 계산함으로써 평가될 수 있다 (V.A. Hackley and Chiara F. Ferraris, "The use of nomenclature in dispersion science and technology, " Special Publ. 960-3, National Institute of Standards and Technology, U. S. Department of Commerce, pp. 7-8, August 2001, Superintendent of Documents, U. S. Government Printing Office, Mail Stop SSOP, Washington, DC, 20402-0001). AAN은 응집체 내에 함유된 일차 입자들의 평균 수로서 규정된다. 그것은 투과형 전자 현미경 (TEM) 특성확인을 통하여 측정된 현미경 입자 크기에 대한 유사-전기 광 산란 (QELS)을 통하여 측정된 중간 입자 부피의 비율로서 계산될 수 있다. 특히, AAN은 예를 들면 역학적 광 산란, 침강 또는 전자 조운 민감화 기법에 의해 측정된 바와 같이, 중간 입자 크기의 BET 가스 흡착 방법에 의해 제공된 평균 등가 구형 부피 (VBET)에 대한 비율로부터 계산된다. 즉
Figure 112006098325232-PCT00002
이다.
식에서 V50은 중간 직경으로부터 계산된 등가 구형 부피이고, D50은 ㎛이며, SSA는 m2/g으로 표시되는 비표면적이고, ρ는 g/cm3으로 표시되는 입자 밀도이다. 본 발명자들의 경험을 토대로, 10 이하의 AAN이 잘 분산된 현탁액이고; 10 이상 내지 30의 AAN은 중간 정도로 분산된 현탁액이며, 30 이상의 AAN은 분산이 잘 되지 않은 현탁액이다. 이런 불일치는 때로 나노복합 입자 각각을 둘러싸고 있는 이중 전기 층의 QELS 측정으로 인한 QELS 및 TEM에 의해 제공된 입자 크기에서 관찰될 수 있지만, 나노복합 콜로이드 현탁액의 QELS 특성확인을 위한 표준 프로토콜은, 이중층 민감성으로 인한 유체 역학적 반경 효과를 최소화하기 위한 발명자들에 의해 개발되었다. 도 20 내지 22에서 볼 수 있는 것과 같이, 본 발명의 기법은 AAN이 10 미만인 나노복합 입자 현탁액의 실제 제조를 가능하게 한다.
본 발명의 한 구체예에서, 로다민 B/SiO2 및 플루오레신/SiO2 나노복합체가, 생물공학적 용도에서 전통적인 유기 염료를 사용할 때 부딪치는 다양한 기능상의 한계들을 피할 수 있는 본 발명의 방법에 따라 합성된다. 예를 들어 그것들은 퀀텀 크기 효과로 인해 강력한 크기-의존성 방출 스펙트럼을 나타낸다 (각각 도 3 및 도 4). 나아가 나노입자들은 실제로 흡수에 대한 역치보다 높은 연속적인 여기 스펙트럼을 가진다. 그 결과로서 나노복합 입자들은 생물학적 전자 추적 기법에서 예외적인 발광 프로브로서 사용될 수 있다. 실제로, 로다민 B/SiO2와 플루오레신/SiO2 나노입자는 많은 영역에서 기존의 유기 크로모포어를 능가한다. 예를 들어 로다민 B/SiO2와 플루오레신/SiO2 나노입자는 높은 퀀텀 수율과 광분해에 대한 큰 내성을 가진다 (도 5). 또한 나노복합 입자로부터의 광루미네선스는 유기 염료에 대해 부딪치는 농도와 동등한 농도에서 검출될 수 있고, 그러므로 생체 적합성이라는 추가의 장점과 함께 종래의 형광 방법의 사용을 가능하게 한다. 그러므로 본 발명의 나노복합 입자는 현재 의학 기법들의 부적절성을 완화시킬 수 있다. 예를 들어 본 발명의 형광 나노입자의 한 용도는 살아있는 세포, 예컨대 평활근 세포 (도 6A,B) 또는 뉴런 (도 6C, D 및 7A 내지 E)의 내부를 조명하는 것이다. 유기 염료를 사용하는 살아있는 세포 염색은 광범위하게 실시되고는 있지만, 세포는 다량의 염료 분자로 포화되어야 할 필요가 있거나, 그렇지 않으면 염색은 궁극적으로 광물리학적 분해로 인해 세포를 표백하게 된다. 로다민 123/SiO2 및 플루오레신/SiO2 나노입자는 그것들이 실리카 쉘에 의해 제공된 형광 코어의 보호로 인해 광분해에 대한 큰 내성이 있기 때문에 이 문제를 해결할 수 있다. 이론에 구속되는 일 없이, 무기 쉘은 나노입자 형광의 유지의 원인이 되고, 그것은 최소 여러 달 이상 지속되는 것으로 여겨진다. 나아가 본 발명의 방법을 따라 합성된 나노복합 입자는 도 3에서 알 수 있는 것과 같이 억제된 및/또는 크게 감소된 광표백을 나타낼 뿐 아니라 약 6개월 이상의 수명을 갖는다.
또한 나노복합 입자는 화학적 분석에서 "트레이서 불릿"으로서 사용될 수 있다. 예를 들어 나노복합 입자는 신체 전체를 통하여 순환하고 물로 팽윤될 수 있는, 인산 칼슘으로 캡슐화된 데시케이트된(dessicsted) 하이드로겔을 함유할 수 있다. 직경이 약 20nm인 나노복합 입자는 신장의 바우만 캡슐의 사구체 세포와 같은 세포막을 통과할 수 있다. 그러므로 그것들은 뇨로 분비될 수 있으며, 그런 후에 함량이 분석될 수 있다.
본 발명의 나노복합 입자는 정상적으로는 순환계를 통하여 운반될 수 없는 소수성 치료 약물의 전신적 전달을 위해 사용될 수 있다 (도 8). 나아가 직경이 20nm 내외인 나노복합 입자는 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있기 때문에 약물의 중추신경계 안으로의 직접적인 전달이 이루어질 수 있다. 다공성 실리카 코팅 또는 인산 칼슘으로 구성된 나노복합 입자는 인슐린과 같은 호르몬을 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다. 그런 나노복합 입자는 장 루멘의 융모양 돌기를 통과할 수 있지만 세관의 사구체 세포를 통과하지는 못한다. 그러므로 나노복합 입자는 인슐린 방출에 대한 피드백 메커니즘을 제공할 수 있으며, 그 메커니즘에서 글루코스 대사의 결과로서 생성된 피루브산염은 나노입자의 인산 칼슘 쉘에 결합하여 나노입자로부터 인슐린 방출을 촉진한다. 나아가 나노복합 입자는 췌장 세포에 대하여 특이하게 표적화될 수 있으며, 그런 다음 췌장 내에서 인슐린을 방출한다.
본 발명의 나노복합 입자에 대한 또 다른 용도는 생체내무기화(biomineralization)을 유도하기 위한 제제로서 인산 칼슘 (CP) 또는 인-규산 칼슘 (CPS)-코팅된 실리칼 입자의 사용을 포함한다. 예를 들어 CP 또는 CPS 쉘-실리카 코어 입자의 사용은 노출된 상아질 세관에 통합시키기 위한 치약에 사용될 수 있는데, 그것은 생체 내 무기화를 유도하고 세관의 폐쇄를 촉진함으로써 치아의 과민성을 완화시킨다.
재흡수성 쉘 나노복합 입자에 대한 용도의 다른 실례로는 도부타민, AIDS 치료에 사용된 3'-아지도-3'-데옥시티미딘 (AZT), 및 암에 대한 치료제로서 또는 특이한 세포 또는 조직에 대한 전신적인 또는 표적화된 전달을 위한 관상 평활근 세포 성장을 억제하기 위한 화학치료제로서 사용된 세라미드와 같은 약물의 통합을 포함한다 (도 9).
본 발명의 형광 나노입자에 대한 다른 용도로는, 제한 없이 모세관 흐름을 조사하기 위한 형광 전자추적; 신경 세포 연관성의 규정; 갭 결합을 통한 염료 전환 연구; 및 다른 물 운반 연구뿐만 아니라 부패성 처리 시스템의 추적을 위한 사용이 있다.
본 발명의 다른 구체예에서 유-중-수 합성 프로토콜을 사용하여 현탁액 중의 나노복합 입자를 제조하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 나노복합 입자를 함유하는 역 미셀 마이크로 에멀션을 제조하는 단계, 역 미셀 마이크로 에멀션을 실란 커플링제로 처리하는 단계, 산/알코올 용액, 예컨대 아세트산/에탄올을 약 6 내지 8의 원하는 pH에서 유지된 마이크로 에멀션에 첨가함으로써 마이크로 에멀션을 파괴하여 나노복합 입자의 현탁액을 형성하는 단계, 그리고 나노복합 입자의 현탁액을 동시에 세척하고 분산시키는 단계로 이루어진다. 역 미셀은 양친매성 계면활성제, 예컨대 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐에테르 (Igepal® CO-520으로서 시판됨), 소수성 용매, 예컨대 시클로헥산, 및 수성 기초 용액 (필요에 따라 존재하는 친수성 유기 공-용매가 있거나 없음)을, 25 ℃에서 안정한 균일성, 유-중-수, 역 미셀이 생성되기에 충분한 시간 동안 교반하면서 혼합함으로써 제조된다. 전형적인 교반 시간은 5분 내지 24시간이며, 바람직한 시간은 30분이다. 필요하다면, 특히 실리카 및 티타니아 쉘 물질의 경우, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 NH4OH 또는 수산화 테트라에틸암모늄을 포함하는 염기가 첨가되고, 그 결과 생성되는 현탁액은 추가로 2분 내지 24시간 동안 교반된다. 나노복합 물질에 대한 최적 숙성 시간은 쉘 물질에 따라 좌우된다. 실리카 및 티타니아 쉘 나노복합체에 대해서는 24시간이 바람직하고; 나노복합 입자에 대한 인산 칼슘, 인-규산 칼슘, 및 다른 칼슘-기초 분산 방법은 비가역적인 응집을 방지하기 위하여 바람직하게는 2분이 지난 후 시작되어야 한다. 그런 다음 APS와 같은 분산제가 현탁액에 첨가되어 나노입자의 표면 전하가 변형된다. 마이크로 에멀션은 역 미셀을 파괴하여 적당한 균질 용액을 형성하는 용액으로 신속하게 교반함으로써 파괴된다. 바람직한 파괴 용액은 아세트산과 에탄올로 구성된다. 수용액은 본 발명의 시클로헥산/Igepal® CO-520/물 시스템의 마이크로 에멀션을 파괴하기 위하여 효과적으로 사용될 수 없는 것으로 측정되었다.
본 발명의 추가의 구체예에서 티타니아 나노복합 입자를 합성하기 위한 방법이 제공되는데, 그 방법은 계면활성제, 예컨대 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐에테르 (Igepal® CO-520), 소수성 용매, 예컨대 시클로헥산, 및 수성 선구 물질로 구성되는 혼합물을 실온에서 형성함으로써 역 미셀 마이크로 에멀션을 제조하는 단계, 그 혼합물을 바람직하게는 약 30분 동안 교반하는 단계, 염기를 첨가하여 현탁액을 형성하는 단계, 현탁액을 15분 동안 교반하는 단계, 그리고 쉘 선구 물질 티타늄(IV) 이소프로폭시드 (TIPO)를 첨가하는 단계로 이루어진다. 미셀의 완전한 숙성은 TIPO를 첨가하고 약 24시간 후에 발생한다. 실란 커플링제 또는 간단한 흡수제, 예컨대 시트레이트 용액은 현탁액에 첨가되어 아세트산/에탄올 용액으로 마이크로 에멀션이 파괴되기 전에 나노입자 표면 전하가 변형된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 활성-의학-제제 코어와 Ca10(PO4)6(OH)2 쉘로 구성된 인산 칼슘 나노복합 입자의 합성 방법이 제공되는데, 그 방법에서는 두 개의 별개의 마이크로 에멀션이 Igepal® CO-520, 시클로헥산 및 마이크로 에멀션에 대한 기초로서 작용하는 선구 물질을 함유하는 수용액으로 제조된다. 염화 칼슘 2수화물과 2수소화인산 나트륨은 인산 칼슘 쉘에 대한 선구 물질로서 작용한다. 메타규산 나트륨이 첨가되어 선택된 시스템에서 핵화가 유도된다. 특히 각각 특정 양의 Igepal® CO-520, 시클로헥산 및 수성 선구 물질 용액을 함유하는 2개의 마이크로 에멀션이 주변 온도에서 신속하게 혼합됨으로써 제조된다. 마이크로 에멀션은 약 5분 동안 혼합된다. 마이크로 에멀션 #2가 마이크로 에멀션 #1에 한 방울씩 첨가된다. 미셀은 약 2분 동안 숙성하도록 방치된다. 실란 커플링제 또는 시트레이트 용액 형태의 분산제가 현탁액에 첨가되어 나노입자 표면 전하가 변형된다.
본 발명의 추가의 구체예에서 활성-의학-제제 코어와 Ca10(PO4)6(OH)2 쉘로 구성된 인-규산 칼슘 (CPS) 입자의 합성 방법이 제공되는데, 그 방법에서는 두 개의 별개의 마이크로 에멀션이 Igepal® CO-520, 시클로헥산 및 마이크로 에멀션에 대한 기초로서 작용하는 선구 물질을 함유하는 수용액으로 제조된다. 염화 칼슘 2수화물과 2수소화인산 나트륨은 인산 칼슘 쉘에 대한 선구 물질로서 작용한다. 메타규산 나트륨이 첨가되어 선택된 시스템에서 핵화가 유도된다. 특히 각각 특정 양의 Igepal® CO-520, 시클로헥산 및 수성 선구 물질 용액을 함유하는 2개의 마이크로 에멀션이 주변 온도에서 신속하게 혼합됨으로써 제조된다. 마이크로 에멀션은 약 5분 동안 혼합된다. 마이크로 에멀션 #2가 마이크로 에멀션 #1에 한 방울씩 첨가된다. 미셀은 약 5분 동안 숙성하도록 방치된 후, NH4OH와 TEOS가 첨가된다. 그런 다음 실란 커플링제가 현탁액에 첨가되어 표면 전하가 변형된다. 마이크로 에멀션은 50mL의 0.02M 아세트산/에탄올 용액과 함께 신속하게 교반되면서 파괴된다. 마이크로 에멀션은 아세트산/에탄올 용액과 함께 신속하게 교반되면서 파괴된다.
본 발명의 방법은 또한 나노복합 입자를 동시에 세척하고 분산하는 방법을 포함하는데, 그 방법은 약 1㎛ 내지 약 100㎛, 바람직하게는 약 20㎛의 직경을 가지는 구형 실리카 비드로 충전된 대략 5×50mm의 HPLC 칼럼을 포함하는 크기-축출 HPLC 시스템을 사용하는 것을 포함한다. pH가 특정 나노과립 시스템으로 조정되어 있는 탈수된 에탄올이 HPLC를 통하여 펌핑됨으로써 나노입자 현탁액이 유입되기 전에 칼럼 팩킹이 젖게 된다. 그런 다음 나노입자 현탁액이 HPLC 시스템 안으로, 약 1mL/분 내지 약 100mL/분, 바람직하게는 약 1mL/분의 유속으로, 실란 커플링제로 처리된 미세구체를 포함할 수 있는 정지 상을 통하여 펌핑된다. HPLC 충전된 칼럼 유출구(out-flow)는 UV 흡광도 또는 형광의 변화를 측정하기 위하여 검출기에 연결된다. 검출기는 칼럼이 나노입자로 완전히 채워질 때를 모니터하고 구별한다. 그런 다음 입자는 용출되고, 약 250v/o 물 이하, 바람직하게는 약 70v/o 물의 에탄올/증류수 용액을 사용하여 재분산된다.
세척은 잔류하는 선구 물질과 과잉 활성-의학-제제들을 제거하면서도 나노입자 분산 상태를 유지하는 것을 포함한다. 세척된 입자는 투과형 전자 현미경 (TEM) 및 콰지-탄성 광 산란 (QELS)과 같은 기법을 간섭하는 잔류 유기물의 부재로 인해 보다쉽고 정확하게 특성확인된다. 생물학적 용도에 대해 나노입자를 세척하는 것은 계면활성제와 다른 유기 물질이 유해한 독물학적 효과를 가지기 때문에 중요한 단계이다. 분산 개략도는 나노입자 현탁액에 보호-분산 이론을 적용하는 것을 포함한다. 나노복합 입자의 분산은 나노복합 입자를 동시에 세척하고 분산하기 위한 크기-축출 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용함으로써 한층 더 증강된다.
본 발명에서 교시되는 크기-축출 HPLC 시스템 및 방법으로 침강, 원심분리 또는 쏙시렛 추출과 같은 다른 입자 회수 기법보다 월등한 비응집성의 안정한 나노복합 입자 현탁액이 생성된다. HPLC 세척 과정은 복합 액체의 분리를 위해 사용된 분석 기법의 변형이다. 그러므로 HPLC 세척 방법은 계면활성제, 잔류하는 선구 물질, 및 캡슐화되지 않은 활성-의학-제제의 자동 제거를 가능하게 한다. 폐-함유 담체 용액으로부터 나노입자를 분리하는 것은 이동상과 정지상의 상호작용의 차이로 인해 이루어진다.
HPLC 세척 및 분산 과정은 이동상 및 정지상의 표면 변형, 현탁액 pH, 용출용액 조성, 유속 및 칼럼 크기를 포함하는 변수들에 의해 영향을 받는다. 전형적으로 약 10 내지 20w/o 고체 부하 사이의 나노복합 입자 현탁액이 음향 방법에 의해 측정되는바 HPLC 세척 후에 얻어진다 (Anton Paar, DMA 35N, Graz, Austria).
본 발명을 하기 실시예로 보다 더 구체적으로 설명하는데, 실시예는 단지 예시 목적이며, 그 이유는 많은 변형과 변화가 당업자들에게 명백해질 것이기 때문이다.
실시예 1 - 4가지 종래 기법에 비교하여 HPLC 를 사용한 Ag / SiO 2 나노복합 입자의 합성 및 분산
1. 재료 및 방법
합성
Ag/SiO2 나노복합 입자를 합성하기 위해 사용한 방법은 리 등에 의해 이미 설명되었다 (Li, T. et al., Langmuir, 15[13]:4328-4334, 1999). 관련된 모든 화학제품은 받은 그대로 사용하였다. 비이온성 계면활성제 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐 에테르 (Igepal CO-520), 시클로헥산, 은 질산염, 테트라에톡시실란 (TEOS), 실란 커플링제 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APS), 히드라진 및 NH4OH (28~30%)는 모두 알드리히사 (Aldrich Chemicals Co., Milwaukee, WI)로부터 구입하였다. 탈수된 에탄올 (200 proof, Pharmacia Products, Inc., Brookfield, CT)과 저온 아세트산 (J. T. Baker Chemicals)은 추가의 정제 없이 사용하였다. 모든 수성 스톡 용액을 탈이온수 (비전도성 = 0.4×10-7S/m)로 제조하였다.
합성을 간단히 설명하면, 10ml의 시클로헥산과 4ml의 Igepal CO-520을 혼합한 후, 일정량의 0.01M AgNO3 수용액을 R 비율에 따라 격렬한 교반 하에 첨가함으로써 역 미셀을 형성하였다. Ag+ 이온을 히드라진 방울을 마이크로 에멀션에 첨가함으로써 금속 Ag로 환원하였다. 적절한 양의 TEOS를 첨가하여 H 비율을 토대로 금속 클러스터를 코팅하고, NH4OH 수용액 방울을 촉매로서 도입하여 알칼리성 pH 범위에서 TEOS의 가수분해를 확실하게 하였다. 마이크로 에멀션을 밀봉하고 SiO2 코팅을 완료하기 위하여 교반 하에 24시간 동안 놓아두었다. 그런 다음 Ag/SiO2 나노복합 입자를 함유하는 역 미셀 마이크로 에멀션을 APS-에탄올 용액으로 처리하였다. Ag/SiO2 나노복합 입자의 표면은 APS의 표면 그래프팅(grafting)으로 인해 약 7.0보다 아래의 pH에서 양으로 하전되었다 (~ 30mV). 마이크로 에멀션을 pH를 7.0 아래로 유지하기 위하여 격렬하게 교반하면서 50ml의 0.02M 아세트산/에탄올 스톡 용액으로 파괴하였다. 현탁액을 추가로 HPLC 세척 기법을 사용하여 에탄올로 처리하였다. 4가지 다른 종래 기법, 원심분리, 쏙시렛 추출, 침강 및 여과를 또한 사용하여 HPLC 기법의 유효성을 나노복합 입자의 분산의 관점에서 비교하였다. 전체 과정은 도 10에 도시한다. 계면활성제 Ipagel CO-520의 잔류 농도를 UV-비스 스펙트럼에 의해 모니터하였다. 비어-램버트 법칙을 사용하여 Ipagel CO-520에 대한 보정 곡선을, 농도 함수로서 280nm에서의 흡광도를 측정함으로써 제작하였다.
HPLC 를 사용한 세척
Ag/SiO2 나노복합 입자를 함유하는 역 미셀 마이크로 에멀션을, 먼저 APS-에탄올 용액 (1w/o, 15mL의 무수 에탄올과 혼합된 15g의 APS, 0.15mL의 저온 아세트산 및 0.75μL의 DI 물)으로 처리하였다. Ag/SiO2 나노복합 입자의 표면은 APS의 표면 그래프팅으로 인해 약 7.0보다 아래의 pH에서 양으로 하전되었다 (~ 30mV). 마이크로 에멀션을 pH를 7.0 아래로 유지하기 위하여 격렬하게 교반하면서 50ml의 0.02M 아세트산/에탄올 스톡 용액으로 파괴하였다. 그런 다음 현탁액을 HPLC 시스템 (Waters Delta Preparation 3000 HPLC 시스템, Milford, MA) 안으로 펌핑하였다. 빈 HR 5/5 칼럼을 아머샴사 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터 구입하였다. 칼럼을 20㎛의 APS-처리된 구형 실리카 비드 (Stellar Phases, Inc., PA)로 2mL/분의 유속으로 충전하였다. 칼럼의 끝을 Ag 퀀텀 도트 코어의 표면 플라스몬 피크의 파장인 405nm의 파장에서 설치하여 놓은 UV-비스 스펙트럼 검출기와 연결하였다. 탈수된 에탄올을 HPLC 시스템을 통하여 세척 용매로서 펌핑하고, 나노복합체를 에탄올-물 용액 (부피 비율 7:3)을 사용하여 수집하였다. 분획 수집기를 활용하여 전체 세척 과정 중에 HPLC 칼럼으로부터 용출물을 수집하였다. HPLC 시스템에 대한 형태의 밑그림은 도 11에 도시한다. HPLC 시스템의 개략도는 도 12A에 도시되어 있고, 그것은 Ag/SiO2 나노입자의 투과형 전자 현미경 (TEM) (도 12B)과 정지상에서의 구형 실리카 비드의 주사형 전자 현미경 (SEM) (도 12C)을 포함한다.
특성확인
Ag/SiO2 나노복합 현탁액의 제타 전위를 역학적 광 산란 원리를 토대로 제타 PALS 분석기에 의해 측정하였다 (Brookhaven Instruments Co., NY). pH를 0.1M의 HNO2와 0.1M의 KOH 수용액에 의해 조정하였다. Ag/SiO2 현탁액의 형태와 분산성을 먼저 원자력 현미경 (AFM) (MultiMode, Digital Instruments)을 사용하여 탭핑 모드로 조사하였다. AFM 실험에 대한 샘플을 새롭게 절단된 운모 기판 위에 Ag/SiO2 현탁액의 방울을 떨어뜨리고, 기판을 1500rpm에서 30초 동안 스핀 코팅하였다. 영상 분석을 고-용해도 투과형 전자 현미경 (HRTEM) (HF 2000, Hitachi, Japan and JEOL 201 OF, Tokyo, Japan) 상에서 수행하였다. 새롭게 제조된 현탁액 방울을 구리 격자 위에 지지된 탄소 필름 위에 첨가하고 밤새 진공 오븐에서 건조시켰다. 최 신식 Malvern Nanosizer (Malvern Instruments, UK)를 사용하여 Ag/SiO2 현탁액에 대한 분산 상태를 측정하였다. 받은 그대로의 SiO2 미세구체의 형태를 주사형 전자 현미경 (SEM, Hitachi S-3000H, Japan)에 의해 얻었다. SiO2 미세구체의 표면 구조를 세척 및 분산 주기 후에 AFM에 의해 조사하였다. 모든 pH 측정을 표준 완충 수용액에 대하여 보정된 Sentron pH 계측기 (Argus IP 65 ISFET probe, Sentron, Inc., WA)를 사용하여 수행하였다.
2. 결과 및 논의
4가지 종래 기법을 사용한 Ag / SiO 2 나노복합 입자의 분산 및 형태
(a) 원심분리
원심분리에 의해 세척되고 재분산된 Ag/SiO2 나노입자에 대한 분산 상태를 도 11A와 B에 도시한다. R=2, H=100 및 X=1인 샘플에 대하여 TEM에 의한 일차 입자 크기는 30±1.2nm였다 (도 11A). 역학 광 산란에 의해 측정된 포괄적인 입자 크기 분포는 233nm였다 (도 11B). 아데어 등에 의해 개발된 평균 응집체 수 (AAN) 개념을 사용하여 (Adair et al., Advances in Ceramics, 111, pp 142-156, The American Ceramic Society, OH, 1984), Ag/Si02 현탁액의 AAN을, 현미경 크기(TEM)에 대한 광 산란 크기 (DLS)의 부피 비율을 택함으로써 계산하였다. 원심분리 프로토콜에 대해서, AAN은 468인 것으로 평가되었으며, 그것은 현탁액이 상당히 응집되었음을 나타낸다. 이것은 TEM 관찰과도 일치하였다.
(b) 쏙시렛 추출
쏙시렛 추출은 연속적인 방식으로 물질을 세척하고 추출하는 경로를 제공하는데, 그것은 세척 용매의 효율을 개선한다. Ag/SiO2 나노복합체를 쏙시렛 추출기로 세척하고 수집하였다. 세척 용매를 그것의 비등점으로 가열하였고, 용매 저장기로부터 증발시킨 후, 제조된 대로의 Ag/SiO2 나노복합체를 함유한 씸블(thimble)로 축합하였고, 마지막으로 저장기로 역행하게 하였다. 세척 주기는 약 40분 동안 지속된다. 도 4A와 B는 쏙시렛 추출기로 세척된 Ag/SiO2 나노복합체의 입자 크기 분포뿐 아니라 TEM 영상을 도시한다. AAN은 약 106인 것으로 측정되었고, 그것을 TEM 분석에 의해 확인하였다 (도 12A). Ag/SiO2 나노복합체의 일부는 10nm보다 작은 입자 크기를 나타냈고, 그것은 세척하는 중에 SiO2 쉘의 분해에 의해 유발되었을 것이다 (도 12B).
(c) 침강
Ag/SiO2 나노복합체를 APS 코팅 후에 침강법으로 세척하였다. TEM으로부터의 입자 크기와 비교하여 (도 13A), AAN은 921인 것으로 평가되었다. 비록 AAN이 원심분리의 그것과 매우 관련이 있지만, 분산은 나노복합체 응집을 제거하기 위하여 여과를 사용함으로써 한층 더 개선될 수 있다. 그러나 이 세척 과정은 통상 프로토콜이 적은 설비를 필요로 하는 경우라도 시간-소모적이다. 나노복합체 현탁액은 광 산란 분석에 따라 일차 모드는 25nm 주위에서, 그리고 이차 모드는 2㎛에서 볼 수 있는 2-모드 방식의 분포를 증명하였다 (도 13B).
(d) 여과
여과 세척 방법은 문헌의 방법을 따른다 (Tan, W. et al., 미국 특허 제 6,548,264호, 2003, "Coated Nanoparticles" and Zhao, X. et al., Adv. Mater., 16:173-176, 2004). 마이크로 에멀션을 파괴하고 아세톤으로 응고시킨 후, 나노복합체를 여과하고 (2㎛ 필터, Millipore, Bedford, MA) 아세톤과 에탄올로 3회 세척하였다. 탄 등의 프로토콜은 나노복합체 현탁액의 pH 수준을 pH 7 아래로, 바람직하게는 응집을 방지하는 데 필요한 약 pH 6 내지 7 사이로 조절하지 않는다. 그러므로 탄 등의 프로토콜은 도 14A에서 알 수 있는 것과 같이 나노복합체 입자의 비가역적인 응집을 유발하였다. 그 결과의 입자 크기 분포는 역학적 광 산란에 의해 측정된바 2-모드 방식이었고 (도 14B), 응집 크기는 약 250nm였다. Ag/SiO2 나노복합체 에탄올 현탁액에 대한 AAN은 약 318이었다. 응집은 대부분 아세톤에 의해 유도된 응고 때문에 일어난 것으로 보이며, 그것으로 나노복합체 접촉 및 성장이 가능해졌다.
도 15A와 B는 4가지 종래 세척 프로토콜을 사용하여 유-중-수 역 미셀 합성으로부터 유도된 Ag/SiO2 나노복합체의 형태를 도시한다. 시클로헥산/Igepal/물 역 미셀 시스템 중의 나노복합체의 형성 메커니즘 및 화학적 역학은 이미 전에 상세하게 논의된 바 있다 (Arriagada, F. J. et al., J. Colloid Interface Sci., 211:210-220, 1999; Colloids and Surfaces A, 154:311-326, 1999; J. Colloid Interface Sci., 218:68-76, 1999). 합성된 대로의 나노복합 입자를 세척하고 수집하기 위해 사용된 종래 방법들은 TEM 영상으로 명확하게 예시된 것처럼, 입자들 간의 반 데르 발스 힘에 의해 유도된 응집을 방지할 수 없었다 (도 15A).
역 미셀 합성으로부터 생성된 나노복합체의 크기 및 형상은 계면활성제에 대한 물의 몰 비율 R과 TEOS에 대한 물의 비율 H에 좌우된다. Ag/SiO2 나노복합체의 성장에 대한 일반적 동향은 은 코어 직경이 R에 비례하는 한편, 실리카 쉘 두께는 H가 증가함에 따라 감소한다는 것이다. R=2, H=100, 및 X=1일 때 ([NH4OH]대[TEOS]), 역 미셀 합성을 통해 얻어진 Ag/SiO2 나노복합체의 직경은 약 30±1.2nm였고, 은 퀀텀 도트는 약 5±0.6nm 였다 (95% 신뢰도 간격). 그 때에 SiO2 층 두께는 약 12nm일 것이다 (도 15B).
나노복합체가 합성되는 동안 응집에 대한 형성 단계는 확인되지 않았다. 그러나 역 미셀에 포획된 나노복합 입자는 계면활성제의 보호층 때문에 응집하지 않는 것으로 알려져 있으며, 따라서 계면활성제 층을 세척하는 것은 응집을 유도하는 것으로 여겨진다. 그러므로 비응집성 나노복합 입자를 합성하기 위해서는 나노복합체를 동시에 세척하고 분산시키는 것이 중요하면서 필요하다.
HPLC 를 사용한 Ag / SiO 2 나노복합체의 분산 및 형태
크기 축출 HPLC 시스템을 사용하여 나노복합 입자를 동시에 세척하고 분산시킴으로써 잘 분산된 Ag/SiO2 현탁액을 제조하였다. 도 16은 HPLC 시스템에서 정지상 으로서 사용된 실리카 미세구체의 형태를 도시한다. 실리카 입자는 균일한 구로서, 평균 입자 크기가 20㎛이며, 기공 크기는 65Å이었다 (표면적 425m2/g). 57%의 랜덤 팩킹 밀도는 실리카 미세구체가 HPLC 칼럼에서 건조-팩킹될 때 얻어졌다. 이것으로 43% 정도로 높은 칼럼 다공성이 생성되었고, 그것으로 HPLC가 작동되는 동안 나노복합체가 이동하여 다중 미소-채널이 형성될 수 있었다. 실리카 미세구체를 APS로 처리하여 양의 전하를 생성하였고, 그것은 양으로 하전된 Ag/SiO2 나노복합체가 정지상 실리카의 표면에 달라붙는 것을 방지하며, 이것은 HPLC 프로토콜에서 중요한 단계이다.
도 17에 도시된 스펙트럼은 HPLC 칼럼 내부의 Ag/SiO2 세척 과정을 보여주는 것이다. HPLC 칼럼으로부터 Ag/SiO2의 용출은 추출 용매 (에탄올/물, 7:3의 부피 비)가 2mL/분의 속도로 펌핑될 때 약 3분이 걸렸다. 스펙트럼 세기는 Ag/SiO2 나노복합 입자가 검출기를 통과하는 개시 지점에서 상당히 증가하였고, 안정한 현탁액을 HPLC 단부에서 연속적으로 수집하였다. HPLC 스펙트럼은 높은 세기를 가지는 상대적으로 좁은 밴드인 것으로 나타났고 (HPLC 검출 구성 때문에 전압으로서 기록됨), 세척 주기 범위에서 관찰되는 2차 숄더가 보이며, 그것으로 잘 세척된 Ag/SiO2 현탁액을 수집하는 기초가 되었다. PEAKFIT®에 의한 스펙트럼의 탈콘볼루션(deconvolution)은 3개의 별개의 피크를 생성하였고 (3 피크의 면적 비율은 1.1:1.8:1이었고, 피크의 중심 위치는 95.1s, 112.2s, 및 150.7s였다), 그것은 개 별적인 Ag/SiO2 나노복합 입자와 그것들의 집합체 (이중체, 삼중체, 등)에 대한 HPLC 칼럼의 용해도에 상응할 것이다. 이것은 Ag/SiO2 나노복합 입자의 농도가 비어-램버트 법칙을 매우 강력하게 토대로 한 것임을 시사하였다.
전체 세척 과정은 약 3분의 실제 용출 수집 시간을 포함하여 약 45분이 걸렸다. 이것은 원심분리나 침강법과 같은 종래의 세척 과정보다 훨씬 더 효과적이다. 스펙트럼 프로필은 대부분의 Ag/SiO2 나노복합 입자가 일정한 속도로 HPLC 칼럼을 따라 이동하였고, 그로써 나노복합 입자가 계속해서 간질 채널 내부로 이동하는 것이 가능해짐으로써 나노복합체가 집합하여 정지상의 SiO2 미세구체 표면에 침착되는 기회가 감소하는 것을 시사하였다. 그러나 스펙트럼의 비대칭적 프로필은 크기가 작은 입자일수록 더 큰 입자와 비교하여 용출하는데 더 많은 시간이 걸리는 경향이 있다는 크로마토그래피 원리에 의해 규정되는 바와 같이, 소수의 Ag/SiO2 나노복합 입자가 입자 크기의 변동으로 인해 칼럼을 통과하는 데 더 긴 시간을 필요로 한다는 것을 나타냈다. 이것은 약간의 이중체, 삼중체 또는 그것보다 더 큰 클러스터가 세척 과정 중에 개별적인 Ag/SiO2 나노복합 입자와 함께 형성된다는 것을 나타낼 것이다.
도 18A와 B는 HPLC 방법에 의해 세척된 Ag/SiO2 나노복합 입자의 형태를 도시한다. 도 18A는 Ag/SiO2 나노복합 입자의 2개의 현탁액이다. 도 18B는 Ag/SiO2 나 노복합 입자의 디지털 영상이다. 200에서 600nm의 UV-비스 분석에 따르면, Ag/SiO2 나노복합 입자는 기기적 검출 범위 내에서는, Igepal CO-520에 대한 특징적인 280nm 흡수 밴드가 확인되지 않았기 때문에 계면활성제가 없는 것으로 나타났다. 제타 전위, +30mV는 분명하게, HPLC 세척 후에라도 APS로 강력한 표면 그래프팅이 있음을 나타낸다. Ag/SiO2 나노복합 입자의 평균 크기는 TEM에 의해 측정된바 HPLC 세척 전과 동일하게, Ag 코어는 5±0.6nm로, 평균 직경은 약 30±1.2nm로 (R=2, H=100, X=1) 유지되었다. HPLC 세척 후에 R=8, H=100 및 X=1에 대해 20.3±1.5nm의 평균 크기가 관찰되었다. 개별적인 나노복합체와 함께, 2, 3, 또는 4개의 입자들에 의해 형성된 나노규모의 클러스터가 HRTEM에서 관찰되었다. 다행스럽게도, 연속적인 입자-간 연결에 의한 집합은 발견되지 않았다. 이것은 HPLC 방법이 나노복합체 집합을, 간질 채널을 통해 나노복합체가 침투하는 것을 가능하게 하는 크기로 파괴한다는 것을 의미한다.
새롭게 절단된 운모 기판 위에 스핀-코팅된 Ag/SiO2 에탄올/물 현탁액 (R=2, H=100, X=1)의 AFM 영상은 도 19에 도시한다. 1500rpm의 스핀 속도에서 나노복합 입자는 운모의 표면에 여기저기 분포하였다. 추가의 분석으로 평균 입자 크기는 약 60nm이며, 그것은 만약 HRTEM에서 30nm의 입자 크기를 일차 유닛으로서 택하게 되는 경우 약 2의 AAN을 유도하였다. 나아가 HPLC로 처리된 Ag/SiO2 현탁액은 한 달의 기간에 걸쳐 침강 시험에 의해 실험적으로 확인된바 매우 안정한 것으로 나타났다.
Ag/SiO2 에탄올/물 현탁액의 분산 상태를 역학적 광 산란 방법에 의해 측정하였다. Ag/SiO2 나노복합 입자의 유체역학 크기 분포는 도 20에 도시한다 (R=8, H=300, X=1). Ag/SiO2 나노복합 입자에 대하여 18.6±1.5nm의 포괄적인 평균 크기를 매우 좁은 단일방식 분포와 함께 볼 수 있었다. 광 산란 결과는 TEM에 의해 측정된 입자 크기 (20.3±1.5nm)와 매우 잘 일치하였다. HPLC-세척된 샘플의 AAN은 약 1.0이었다. 이것은 Ag/SiO2 나노복합 입자가 에탄올/물 공용매에 HPLC 세척 후에도 잘 분산되어 있음을 의미하는데, 왜냐하면 광 산란이 콜로이드 현탁액에 대한 포괄적인 분산 상태를 나타내는 데 보다 더 정확하기 때문이다. 역학적 광 산란 데이터와 TEM 크기 분석 사이의 일치는 유체역학적 효과가 압축되었고, 그것은 제조된 그대로의 현탁액에 일정량의 이온이 존재하는 것을 반영한다는 것을 나타낸다.
APS 그래프팅
실란 커플링제는 실리카-기초 나노입자의 표면을 변형하기 위해 자주 사용된다. 표 I은 많은 용도에 대해 활용되는 실란 커플링제의 몇 가지를 요약한 것이다. APS는 가장 흔히 사용되는 실란 커플링제 중 하나이다. APS 표면 그래프팅의 유효성을 도 21에 예시한다. APS 코팅이 없는 Ag/SiO2 나노복합 입자는 pH가 에탄올/물 용액에서 pH 2보다 높을 때 약한 음의 전하를 나타냈다. 제타 전위 곡선은 평평해졌으며 pH가 7.0 이상이 되었을 때 고원(plateau)에 도달하는데, 피크 값은 약 -30mV였다. 그러나 APS-그래프트된 Ag/SiO2 나노복합 입자는 상대적으로 높은 표면 전하를 얻었으며, 네거티브에서 포지티브로 전환되었다. pH 7.0 아래의 산성 영역에서, APS-코팅된 Ag/SiO2 나노복합 입자는 30mV 정도로 높은 제타 전위를 나타냈으며, 유의할만한 APS 농도 효과는 관찰되지 않았다. 대조적으로 SiO2 미세구체는 APS 농도가 1.5w/o에 도달하였을 때 주지할만한 제타 전위의 증가를 나타냈다 (도 22). 대부분 그런 것처럼, 이것은 SiO2 미세구체의 큰 표면적 및 다공성 성질 때문이다. 그래프트 메커니즘에 대한 상세한 논의는 다른 곳에서도 찾아볼 수 있다 (Plueddemann, E. P., "Silane coupling agent, " pp 29-48, Plenum Press, NY, 1982; Ung, T. et al., Langmuir, 14: 3740-3748, 1998; Chiang, C. H. et al., J. Colloid Interface Sci., 74 (2):396-403, Chiang, C. H. et al. , J. Colloid Interface Sci., 86(1):26-34, 1982). 주요 반응은 다음과 같이 설명되었다:
3Si-OH (표면)+NH2C3H6Si(OC2H5)3 → (Si-O3)-SiC3H6NH2+3C2H5OH
이 반응은 Ag/SiO2 나노복합 입자의 표면에 있는 실란기가 실록산기로 대체되고, 에탄올은 Si-O 결합 형성의 결과로서 방출되었음을 의미한다. 7.0 아래의 pH에서 아민 기 꼬리가 용매를 향하여 양자가 첨가되는 이런 형태는 매우 바람직한 것이었다. 그 결과로서 APS로부터의 우세한 양으로 하전된 아민 기 때문에 양의 전하가 산성 pH 범위에서 쉽게 이루어진다. 제타 전위 측정은 처리된 샘플에 대한 표면 전하가 언제나 7.0 아래의 pH에서 포지티브였음을 나타냈다. pH 6 아래로의 pH의 추가의 감소는 제타 전위를 약 +30mV의 고원 값으로 빠르게 증가시켰고, 그것은 제안 된 이론적 설명을 지지한다.
APS로 Ag/SiO2 나노복합 입자와 SiO2 미세구체 두 가지를 표면 그래프팅하는 것의 중요성은 도 15에 도시하는데, 이 도면은 HPLC 세척 후에 미처리된 SiO2 나노복합체의 AFM 영상을 도시한다. HPLC 칼럼을 APS로 Ag/SiO2의 표면을 그래프팅하기 전에 세척 과정에서 쉽게 차단하였다. 이것은 만약 도 23에 도시된 표면 형태가 고려된다면 설명될 수 있다. 실리카 미세구체의 3차원 개관은 이미 매끄러운 표면이 Ag/SiO2 나노복합 입자와의 상호작용 때문에 상당히 손상을 입었음을 나타냈다. HPLC 세척 전의 실리카 미세구체의 형태는 균일한 구형이었고 SEM (도 16) 및 AFM 관찰에 따르면 표면 조도는 매우 낮았다. 그러나 표면은 HPLC 세척 과정 중에 손상을 입었고, Ag/SiO2 나노복합 입자의 응집체가 큰 실리카 미세구체의 표면에 부착되었다. 실리카 미세구체에 붙어있는 집합체들 중 하나는 약 0.5㎛ 직경이었고, 따라서 만약 일차 입자 크기가 약 30nm라면 최소한 150개의 개별적인 나노복합 입자로 구성된 것이다. 비록 SiO2 미세구체 표면 상의 Ag/SiO2 나노복합 입자의 집합에 대한 정확한 메커니즘이 잘 밝혀지진 않았지만, APS-그래프트된 Ag/SiO2 나노복합 입자와 음으로 하전된 구형 SiO2 미세구체 사이의 컬럼빅(columbic) 상호작용은 응집체 발달에 중요한 역할을 한다. HPLC 세척이 약산성 pH 범위 (pH 5.0~7.0)에서 진행됨에 따라 나노복합체는 APS 코팅 때문에 양의 전하를 얻는 반면, SiO2 미세구체 는 이 pH 범위에서 음으로 하전된다. 두 개의 반대로 하전된 나노복합체는 상호 간에 접근하고, 집합 성향은 정전기적 인력 때문에 증가된다. 이것이 아마도 HPLC 칼럼의 차단을 유도하고, 그로써 초기 세척 및 수집 시도가 실패하게 된 메커니즘일 것이다. 그러므로 동일한 표면 그래프팅을 Ag/SiO2 나노복합 입자에 대해 적용했던 것처럼 SiO2 미세구체에 적용하여 표면 전위를 조절하고, 그로써 나노복합체 응집을 제거하였다. 이 프로토콜은 크기 축출 크로마토그래피를 토대로 한 Ag/SiO2 나노복합 입자의 HPLC 세척에서 결정적인 단계인 것으로 증명되었다. 에탄올/물 용매 중에서 Ag/SiO2 나노복합 입자의 안정한 현탁액을, 이 프로토콜이 정확하게 수행되었을 때 일상적으로 합성하였다. 나노복합 입자를 합성하기 위한 선행 기술 방법, 예컨대 상기에서 설명된 것과 같은 탄 등에 의해 사용된 방법들은 실란 커플링제, 나노복합체의 에탄올/물 용매로의 희석, 및 크기 축출 HPLC 또는 침강 및 여과 시스템의 중요한 특징을 사용하지 않았다.
세척 용매
이동상 및 정지상에 대한 분산제로 나노복합 입자를 표면 변형시키는 것과 함께, 적절한 추출 용매의 선택 또한 HPLC 세척 프로토콜의 성공적인 실행을 위해 중요하다. 세척 용액의 선택은 응집을 방지하기 위해서는 중요한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어 Ag/SiO2 나노복합 입자는 DI 물, 순수한 무수 에탄올, 이소프로판올 및 아세톤 용매가 사용되었을 때에는 HPLC 칼럼의 윗부분에서 클러스터인 채로 유지된 다. 바람직한 에탄올/물 공-용매 (에탄올:물=7:3 부피)를 그 안에 펌핑하였을 때 클러스터는 아래쪽으로 이동하기 시작하였고, 궁극적으로는 잘 분산된 나노입자로서 칼럼으로부터 용출되었다.
현탁액 pH
현탁액 pH에 대한 조절은 잘 분산된 나노복합 입자 분산액을 제조할 때 중요한 매개변수이다. 도 24A는 역학적 광 산란에 의한 입자 크기 분포를 도시한다. 도 24B에 도시된 것처럼, 2.8의 pH에서, Ag/SiO2 나노복합체 현탁액은 TEM 및 역학적 광 산란 분석을 토대로 볼 때 상당항 응집체가 있었고, AAN은 2모드 방식 입자 크기 분포로 인해 약 15였다. pH 9.7로 측정된 알칼리성 범위에서 SiO2 쉘의 분해는 Ag 금속 코어 접촉 및 작은 입자 크기의 형성을 유도한다. 빈약하게 분산된 현탁액의 AAN은 0.2였고, 그것은 나노복합체 구조가 손상되었음을 나타낸다. AAN이 1인 잘 분산된 Ag/SiO2 나노복합체 현탁액은 pH가 pH 6.0 정도로 조정될 때 얻어졌다. 이 샘플의 역학적 광 산란 데이터는 입자 크기 분포가 단일방식이며, 그것은 TEM 분석과 일치하는 것을 시사한다. 상응하는 AAN은 약 1이었으며, 그것은 약 6.0의 pH에서 잘 분산된 현탁액임을 나타낸다.
칼럼 길이
HPLC 세척의 효율에 영향을 주는 다른 매개변수는 HPLC 칼럼의 크기이다. 크기가 큰 칼럼의 경우에는 더 많은 양의 세척 용매와 시간이 필요하다. 특정 크기 치수가 상이한 3가지 유형의 HPLC 칼럼을 연구하였다. 칼럼 HR 16 (16×500mm)과 HR 10/10 (10×100mm)은 Ag/SiO2 나노복합 입자를 용출하기에는 너무 길었고, 짧은 칼럼인 HR 5/5 (5×50mm)가 Ag/SiO2 나노복합체 분산액에는 적당한 것으로 증명되었다. 크기 R0인 나노복합체에 대해 허용되는 총 기공 부피(V)는 다음과 같이 표시된다:
Figure 112006098325232-PCT00003
식에서 Rp는 기공 반경이고, L은 칼럼 길이이다. Ag/SiO2 나노복합 입자에 대해서, L>>R0인 조건을 만족하고 총 부피 V는 L에 비례한다. 그러므로 칼럼 길이 L이 길수록 세척 시간은 길어진다.
3. 결론
실란 커플링제, APS는 Ag/SiO2 나노복합 입자와 효과적으로 반응하고, 그로써 Ag/SiO2 나노복합 입자의 표면 전하를 증가시킴으로써 Ag/SiO2 나노복합 입자가 HPLC가 작동하는 동안 양으로 하전된 구형 SiO2 정지상 매트릭스를 통하여 확산되는 것을 보장한다. 이 원리를 토대로 한 크기 축출 크로마토그래피는 실리카 미세구체 상의 Ag/SiO2 나노복합 입자의 응집 및 침착을 제거하였다. 그러므로 이 HPLC 방법에 의해 생성된 융출물 분산액은 제타 전위가 약 +30mV인 우수한 균일성 및 안정성을 증명하였다. 그 결과의 에탄올/물 현탁액은 현미경 장치에 대한 콜로이드 화학-기초 "상향식" 나노규모 어셈블리에 대한 이상적인 선구 물질이다. 가공처리 매개 변수, 예컨대 이동상 및 정지상 두 가지의 표면 변형, 용매, 현탁액 pH 및 칼럼 크기는 HPLC 분산 프로토콜에 매우 중요하다. 별개의 과정으로, 이 접근법은 계면활성제가 없는 분산이 주요 관심인 경우의 유사한 많은 나노과립 시스템에도 확대될 수 있다.
실시예 2 - 로다민 B/ SiO 2 나노복합 입자, AAN =1
유-중-수 합성 방법을 사용하는 나노복합 입자 합성을 수행하기 위하여, 폴리옥시에틸렌(5)논페닐 에테르 (Igepal® CO-520), 시클로헥산, 테트라에톡시실란 (TEOS), 3-아미노프로필트리메톡시실란(APS), 수산화 암모늄, 및 아세트산을 알드리히사 (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)로부터 구입하였다. 마이크로 에멀션 합성 과정에 사용한 모든 화학제품은 받은 그대로 사용하였다. 사용한 수성 스톡 용액은 탈이온수 (DI)(비전도성=0.4×10-7S/m)로 제조하였다. 다양한 유기 플루오로포어 염료를 플루오레신의 나트륨 염, 로다민 123, 로다민 B, 인도시아닌 그린, (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), 로다민 WT (Presto Dye Chem Co., Philadelphia, PA), 캐스케이드 블루 아세틸 아지드 (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR), Cy 3 아미다이트, 및 Cy 5 아미다이트 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 포함하는 나노복합 입자에 캡슐화할 수 있다.
역 미셀 마이크로 에멀션을 형성하기 위하여 4mL의 Igepal® CO-520, 10mL의 시클로헥산 및 0.325mL의 10-2M 로다민 B 용액을 밀봉된 팔콘 컵에서 실온에서 조합 하였다. 그런 다음 용액을 적당한 속도에서 30분 동안 교반하였다. 다음에 0.05mL의 NH4OH를 첨가하고, 그 현탁액을 15분 동안 교반하였다. 계속해서 0.08mL의 TEOS를 첨가하였다. 미셀을 약 24시간 동안 숙성하도록 놓아둔 후, 0013mL의 실란 커플링제 APS를 첨가하였다. 마이크로 에멀션은 50mL의 0.02M 아세트산/에탄올 용액과 함께 신속하게 교반할 때 파괴되었다.
나노복합 로다민 B/SiO2 현탁액의 분산 상태를 평균 응집체 수 (AAN) 접근법을 사용하여 분석하였다. 샘플 매개변수는 R=4, H=100, X=1이었다. QELS 특성확인으로 입자 크기 D50은 32.0nm이고 표준 편차는 6.9nm이며, 신뢰도는 95% 간격임을 알 수 있었다. TEM에 의한 특성확인으로는 25nm±5nm의 입자 크기를 얻었다 (30개 입자를 계수하였다). 로다민 B/SiO2 나노현탁액에 대한 AAN은 1이었다. 그러므로 현탁액은 잘 분산된 것으로 분류할 수 있다. 도 27A와 B는 2가지 상이한 비율에서 유기 코어 물질이 로다민 B인 유기 코어/실리카 쉘 나노복합 입자의 TEM 영상을 도시한다.
실시예 3 - 인산 칼슘 나노복합 입자의 합성
인산 칼슘 쉘 나노복합 입자의 합성은 2가지 별도의 마이크로 에멀션의 제조를 포함한다. 비이온성 계면활성제, 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐 에테르 (Igepal® CO-520, Aldrich Chemical Co.), 시클로헥산 (Aldrich Chemical Co.) 및 증류수는 마이크로 에멀션의 기초로서 작용한다. 계면활성제를 추가의 정제 없이 사용하였 다. 그 결과의 나노입자의 크기는 계면활성제에 대한 물의 비율을 달리해가면서 조절하였다 (R=[물]/[계면활성제]). 염화 칼슘 탈수화물 (CaCl2, 99+%, Aldrich Chemical Co.)과 수소화인산 나트륨 (Na2HPO4, 99+%, Aldrich Chemical Co.)은 인산 칼슘 쉘의 선구 물질로서 작용한다. 메타규산 나트륨 (SiO2, 44-47%), 테트라에톡시실란 (TEOS, 99%), 및 수산화 암모늄 (NH4OH)(29%)(모두 Fisher Scientific 제품)은 받은 그대로 사용하였다.
각각 2mL의 Igepal, 5mL의 시클로헥산 및 치료제/약물/유기 형광 물질을 함유하고 있는 탈이온수 또는 메타규산 나트륨을 함유하고 있는 탈이온수로 구성된 총 10mL 부피의 2개의 마이크로 에멀션을 주변 온도에서 제조하였다. 마이크로 에멀션을 신속하게 혼합하였다. 일단 용액이 외관상 균일하게 보이면 선구 물질을 첨가하고, 대략 15분 동안 보관하였다. 그런 다음 마이크로 에멀션을 서서히, 그리고 연속적으로 분리 깔때기를 사용하여 조합하였다. 실란 커플링제 또는 시트레이트 용액 형태의 분산제를 현탁액에 첨가하여 입자 표면 전하를 변형하였다. 마이크로 에멀션을 산/알코올 용액을 사용하여 파괴하고, HPLC를 사용하여 세척하고 분산시켰다. 칼슘 포스페이트 실리케이트 나노복합 입자를 실시예 2와 3을 조합함으로써 합성할 수 있다. 먼저, 실시예 2에서 설명한 것처럼 코어-SiO2 쉘 나노복합 입자를, 쉘이 1 내지 3nm 두께가 되도록 하는 방식으로 합성할 수 있다. 그런 다음 입자를 실시예 3의 선구 마이크로 에멀션 중 하나에 통합하고 그에 따라 처리할 수 있다.
실시예 4 - 로다민 WT/ Ca 10 ( PO 4 ) 6 (OH) 2 나노복합 입자, AAN =1
모든 물질은 실시예 2에서 설명한 것처럼 받았고, 제조하였다.
각각이 Igepal® CO-520, 시클로헥산 및 수성 선구 물질 용액을 함유하는 2개의 별도의 마이크로 에멀션을, 성분들을 밀봉된 팔콘 컵에서 주변 온도에서 신속하게 혼합함으로써 제조하였다. 마이크로 에멀션 #1은 4mL의 Igepal® CO-520, 10mL의 시클로헥산, 1.2mL의 10-2M 염화 칼슘 용액, 및 1mL의 10-3M 로다민 WT 용액으로 구성되었다. 마이크로 에멀션 #2는 mL의 Igepal® CO-520, 10mL의 시클로헥산, 1.2mL의 6×10-3M 2수소화인산 나트륨 용액, 및 1mL의 탈이온수 중의 500ppm의 메타규산 나트륨으로 구성되었다. 2개의 마이크로 에멀션을 모두 5분 동안 혼합하였다. 그런 다음 마이크로 에멀션 #2를 마이크로 에멀션 #1에 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 한 방울씩 서서히 첨가하였다. 미셀을 2분 동안 숙성되도록 방치하였다. 실란 커플링제, 트리메톡시실릴프로필-디에틸렌트리아민 (DETA)을 현탁액에 첨가하여 나노입자 표면 전하를 변형하였다. 그런 다음 마이크로 에멀션을 50mL의 0.02M 아세트산/에탄올 용액과 함께 빠르게 교반하면서 즉시 파괴하였다.
로다민 WT/Ca10(PO4)6(OH)2 현탁액의 분산 상태를 평균 응집체 수 (AAN) 접근법을 사용하여 분석하였다. 샘플 매개변수는 R=11, H=100, X=1이었다. QELS 특성확인으로 입자 크기 D50은 67.0nm였다. TEM에 의한 특성확인으로는 60nm±10nm의 입자 크기를 얻었다. 로다민 WT/Ca10(PO4)6(OH)2 나노현탁액에 대한 AAN은 1이었다. 그러므로 현탁액은 잘 분산된 것으로 분류할 수 있다.
당업자들은 본 발명의 광범위한 개념으로부터 벗어나는 일 없이 상기에서 설명된 구체예들에 변화가 이루어질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러므로 본 발명은 개시된 특정 구체예에 한정되는 것이 아니라, 첨부되는 특허청구의 범위에 의해 규정되는 바와 같이 본 발명의 사상 및 범주 내에 있는 변형을 포함하는 것으로 의도된다는 것이 인지된다.
본 발명은 카보디이미드-중재 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 커플링제와 같은 표면 변형에 의해 생리적 조건, 즉 등장성 환경하에서 생체 내에서 사용하기 위한, 비응집성의 잘 분산되고, 안정한 나노복합 입자 현탁액 제제를 제공함으로써 의학적 진단을 위해, 및 암, 감염성 질병, 당뇨병, 낭포성 섬유증 및 기타 질병 및 장애에 대한 의학적 치료법을 위한 칼슘 침착 트랜스포터(transporter)로서 사용될 수 있다.

Claims (40)

  1. 현탁액 중의 비응집성 분산된 코어/쉘 나노복합 입자를 제조하는 방법으로서,
    나노복합 입자를 함유하는 역 미셀 마이크로 에멀션을 제조하는 단계;
    역 미셀 마이크로 에멀션을 분산제로 처리하는 단계;
    마이크로 에멀션에 파괴제를 첨가함으로써 마이크로 에멀션을 파괴하여 나노복합 입자의 현탁액을 형성하는 단계; 및
    나노복합 입자의 현탁액을 세척하고 분산시키는 단계들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 산/알코올 용액이 약 5 내지 9의 pH에서 나노복합 입자의 현탁액을 유지하고, 추가로 상기 파괴제가 산성화된 알코올 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 파괴제가 아세트산/에탄올 용액이고, 상기 분산제가 시트레이트, 옥살레이트, 숙시네이트 및 포스포네이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 계면활성제, 용매 및 수성 코어 선구 물질의 혼합물을 실 온에서 형성함으로써 역 미셀 마이크로 에멀션을 제조하는 단계;
    그 혼합물을 약 2분 내지 24시간 동안 교반하는 단계;
    염기를 첨가하여 현탁액을 형성하는 단계;
    그 현탁액을 약 2분 내지 24시간 동안 교반하는 단계;
    실리카 또는 티타니아 쉘 선구 물질을 첨가하는 단계; 및
    마이크로 에멀션을 약 24시간 동안 숙성시키는 추가의 단계들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐 에테르 (Igepal® CO-520)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 용매는 시클로헥산인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 수성 코어 선구 물질이 Au, Ag, Co, Ni, Cu, CdS; Pt, 유기 색소, 유기 염료, 유기 플루오로포어, 예컨대 플루오레신의 나트륨 염, 로다민, 로다민 유도체, 플루오레신, 플루오레신 유도체, 루시페린 및 하나 또는 둘 이상의 약물 제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 약물 제제가 전사적으로 활성 형태로 세포에 핵산을 전달하는 유전자 치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 플루오레신 및 플루오레신 유도체는 BDCECF; BCECF-AM; 칼시엔-AM; 5,(6)-카르복시-2',7'-디클로로플루오레신; 5,(6)-카르복시-2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트 N-숙신이미딜 에스테르; 5,(6)-카르복시에오신; 5,(6)-카르복시에오신 디아세테이트; 5,(6)-카르복시플루오레신; 5-카르복시플루오레신; 6-카르복시플루오레신; 5,(6)-카르복시플루오레신 아세테이트; 5,(6)-카르복시플루오레신 아세테이트 N-숙신이미딜 에스테르; 5,(6)-카르복시플루오레신 N-숙신이미딜 에스테르; 5(6)-카르복시플루오레신 옥타데실 에스테르; 5,(6)-카르복시나프토플루오레신 디아세테이트; 에오신-5-이소티오시아네이트; 에오신-5-이소티오시아네이트 디아세테이트; 플루오레신-5(6)-카르복시아미도카프로산; 플루오레신-5(6)-카르복시아미도카프로산 N-숙신이미딜 에스테르; 플루오레신 이소티오시아네이트; 플루오레신 이소티오시아네이트 이성체 1; 플루오레신 이소티오시아네이트 이성체 2; 플루오레신 이소티오시아네이트 디아세테이트; 플루오레신 옥타데실 에스테르; 플루오레신 나트륨 염; 나프토플루오레신; 나프토플루오레신 디아세테이트; 또는 N-옥타데실-N'-(5-플루오레시닐)티오우레아 (F18)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 로다민 및 로다민 유도체는 5,(6)카르복시테트라메틸로다민; 5-카르복시테트라메틸로다민 N-숙신이미딜 에스테르; 6-카르복시테트라메 틸로다민 N-숙신이미딜 에스테르; 5,(6)-카르복시테트라메틸로다민 N-숙신이미딜 에스테르; 5,(6)-카르복시-X-로다민; 디히드로로다민 123; 디히드로로다민 6G; 리사민 로다민; 로다민 110 클로라이드; 로다민 123, 로다민 B 히드라지드; 로다민 B; 및 로다민 WT로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 유기 색소 및 염료는 헤마토포르피린 염료, 예컨대 7,12-비스(1-히드록시에틸)-3,8,13,17-테트라메틸-21H,23H-포르핀-2- 및 18-디프로판산, 및 시아닌 염료 및 유도체, 예컨대 인도시아닌 그린; 인도닌 블루; R-피코에리트린(PE), PE-Cy 5; PE-Cy 5.5; PE-텍사스 레드; PE-Cy 7; Cy 3 NHS 에스테르; Cy 3 말레이미드 및 히드라지드; Cy 3B NHS 에스테르; Cy 3.5 NHS 에스테르; Cy 3 아미다이트; Cy 5 NHS 에스테르; Cy-5; Cy 5 아미다이트; Cy 5.5; Cy-5.5 NHS 에스테르; Cy 5.5 아넥신 V; Cy 7; Cy 7 NHS 에스테르; Cy 7Q NHS 에스테르; 알로피코시아닌(APC); APC-Cy 7; APC Cy 5.5; 요오드화 프로피듐 (PI); 크리스탈 바이올렛 락톤; 페턴트 블루 VF; 브릴리언트 블루 G; 또는 케스케이드 블루 아세틸 아지드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 4항에 있어서, 상기 쉘 선구 물질은 SiO2, TiO2, ZnO, Fe2O3, ZrO2, NiO 및 GeO2, Sn, Pb, Ag 및 Au, CaPOx CaCO3, 테트라에톡시실란 (TEOS), 티탄(IV) 이소프로폭시드, 및 일반식 Cax(PO4)y(OH)z(SiO2)a로 표시되는 인-규산 칼슘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 선구 물질은 테트라옥시실란 (TEOS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 선구 물질은 티탄(IV) 이소프로폭시드(TIPO)인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 x, y, z, 및 a가 0부터 더 큰 값까지 달라질 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 분산제는 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필실세스퀴옥산, 3-글리시독시프로필트리메톡시실란, 트리메톡시실릴프로필디에틸렌트리아민, 3-트리메톡시실릴프로필숙신산 무수물 및 아미드-결합 카르복실 기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 실란 커플링제인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 실란 커플링제는 3-아미노프로필트리메톡시실란인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 나노복합 입자의 코어가 폴리비닐 알코올, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 2-히드록시에틸 메타크릴레이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이드로겔 물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 방법이 추가로 나노복합 입자를 동물 또는 사람의 생체 내에서 사용하기 위하여 상기 분산제에 표면 변형제를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 표면 변형제가 결합제인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 결합제가 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 4항에 있어서, 상기 방법이 추가로 유기 기, 금속, 효소, 매크로분자 및 플라스미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 부분을 상기 쉘 선구 물질에 부착하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 4항에 있어서, 상기 나노복합 입자의 직경이 계면활성제에 대한 수성 상의 몰 비율, 쉘 선구 물질에 대한 수성 상의 몰 비율, 및 쉘 선구 물질에 대한 염기의 몰 비율을 조정함으로써 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 나노복합 입자를 세척하고 분산시키기 위하여 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 구형 실리카 비드로 팩킹된 HPLC 칼럼으로 구성된 크기-축출 HPLC 시스템을 사용하는 단계;
    HPLC 칼럼을 통하여 파괴제를 펌핑하는 단계;
    약 1ml/분 내지 약 100ml/분의 유속으로 정지 상을 통하여 HPLC 칼럼 안으로 나노복합체 현탁액을 펌핑하는 단계;
    칼럼이 나노입자로 완전히 채워질 때를 측정하기 위하여 HPLC 팩킹 칼럼의 유출구에 연결된 검출기로 UV 흡광도 또는 형광의 변화를 측정하는 단계; 및
    나노입자를 물과 혼합할 수 있는 약 250 이하의 부피% 용액의 유기 용매와 물의 용액으로 용출하고 재분산시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 구형 실리카 비드의 직경이 약 20㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 물과 혼합할 수 있는 유기 용매와 물 용액이 약 70 부피% 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24항에 있어서, 상기 HPLC 칼럼의 길이가 약 5×50mm인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 24항에 있어서, 상기 정지 상이 분산제로 처리된 미세구체로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1항에 있어서, 상기 나노복합 입자가 약 1 내지 100nm 직경의 일차 입자 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1항에 있어서, 상기 나노복합 입자가 약 10 내지 20nm 직경의 일차 입자 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1항에 있어서, 상기 나노복합 입자가 약 20nm 직경의 일차 입자 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 비응집성의 분산된 코어/쉘 나노복합 입자의 합성 방법으로서,
    (i) 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐 에테르 (Igepal® CO-520), 시클로헥산 및 수성 활성-의학-제제 선구 물질로 구성되는 혼합물을 실온에서 형성하는 단계;
    (ii) 혼합물을 약 30분 동안 교반하는 단계;
    (iii) NH4OH를 첨가하여 현탁액을 형성하는 단계;
    (iv) 약 15분 동안 현탁액을 교반하는 단계;
    (v) 쉘 선구 물질을 첨가하는 단계; 및
    (vi) 약 24시간 동안 마이크로 에멀션을 숙성시키는 단계로 이루어지는 역 미셀 마이크로 에멀션을 제조하는 단계;
    상기 역 미셀 마이크로 에멀션을 3-아미노프로필트리메톡시실란으로 처리하는 단계;
    현탁액을 약 6과 7 사이의 pH에서 유지시키는 아세트산/에탄올 용액을 마이크로 에멀션에 첨가함으로써 마이크로 에멀션을 파괴하여 나노복합 입자의 현탁액을 형성하는 단계; 및
    (i) 약 20μM 직경의 구형 실리카 비드로 HPLC 칼럼을 팩킹하는 단계;
    (ii) HPLC 칼럼을 통하여 에탄올을 펌핑하는 단계;
    (iii) 약 1ml/분의 유속으로 정지 상을 통하여 HPLC 칼럼 안에 나노입자 현탁액을 펌핑하는 단계;
    (iv) 칼럼이 나노입자로 완전히 채워질 때를 측정하기 위하여 HPLC 팩킹된 칼럼의 유출구에 연결된 검출기로 UV 흡광도 또는 형광의 변화를 측정하는 단계; 및
    (v) 약 70v/o 물 이하의 에탄올/물 용액으로 나노입자를 용출하고 재분산시키는 단계로 이루어지는 크기-축출 HPLC 시스템을 사용하여 나노복합 입자의 현탁액을 세척하고 분산시키는 단계들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 계면활성제, 용매, pH가 6 내지 8로 조정된 일정량의 수성 코어 선구 물질, 및 Ca++ 형태의 칼슘을 함유하는 첫 번째 혼합물을 형성하는 단계; 계면활성제, 용매, pH가 6 내지 8로 조정된 일정량의 수성 코어 선구 물질, 및 PO4 -- 형태의 인 및 임의의 SiO3 --를 함유하는 두 번째 혼합물을 형성하는 단계; 그리고 상기 첫 번째 혼합물과 두 번째 혼합물을 함께 혼합하여 약 2분 동안 숙성시키는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 수성 코어 선구 물질의 pH는 pH 7.4로 조정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐 에테르 (Igepal® CO-520)인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 33항에 있어서, 상기 용매는 시클로헥산인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 33항에 있어서, 상기 수성 코어 선구 물질은 Au, Ag, Co, Ni, Cu, CdS; Pt, 유기 색소, 유기 염료, 유기 플루오로포어, 예컨대 플루오레신의 나트륨 염, 로다민, 로다민 유도체, 플루오레신, 플루오레신 유도체, 루시페린 및 하나 또는 둘 이상의 약물 제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 약물 제제는 전사적으로 활성 형태로 핵산을 세포에 전달하는 유전자 치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 33항에 있어서, 상기 나노복합 입자의 직경은 계면활성제에 대한 수성 상의 몰 비율, 쉘 선구 물질에 대한 수성 상의 몰 비율, 및 쉘 선구 물질에 대한 염기의 몰 비율을 조정함으로써 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 비응집성의 분산된 코어/쉘 나노복합 입자를 합성하는 방법으로서,
    (i) 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐 에테르 (Igepal® CO-520), 시클로헥산, 약물 제제 선구 물질 및 Ca++로 구성된 첫 번째 혼합물을 실온에서 형성하는 단계;
    (ii) 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐 에테르 (Igepal® CO-520), 시클로헥산, 약물 제제 선구 물질 및 PO4 --와 임의로 SiO2 -로 구성된 두 번째 혼합물을 형성하는 단계; 및
    (iii) 상기 첫 번째와 두 번째 혼합물을 혼합하여 약 2분 동안 숙성시키는 단계로 이루어지는 역 미셀 마이크로 에멀션을 제조하는 단계;
    상기 역 미셀 마이크로 에멀션을 3-아미노프로필트리메톡시실란으로 처리하는 단계;
    현탁액을 약 6과 7 사이의 pH에서 유지시키는 아세트산/에탄올 용액을 마이 크로 에멀션에 첨가함으로써 마이크로 에멀션을 파괴하여 나노복합 입자의 현탁액을 형성하는 단계; 및
    (i) 약 20μM 직경의 구형 실리카 비드로 HPLC 칼럼을 팩킹하는 단계;
    (ii) HPLC 칼럼을 통하여 에탄올을 펌핑하는 단계;
    (iii) 약 1ml/분의 유속으로 정지 상을 통하여 HPLC 칼럼 안에 나노입자 현탁액을 펌핑하는 단계;
    (iv) 칼럼이 나노입자로 완전히 채워질 때를 측정하기 위하여 HPLC 팩킹된 칼럼의 유출구에 연결된 검출기로 UV 흡광도 또는 형광의 변화를 측정하는 단계; 및
    (v) 약 70v/o 물 이하의 에탄올/물 용액으로 나노입자를 용출하고 재분산시키는 단계로 이루어지는 크기-축출 HPLC 시스템을 사용하여 나노복합 입자의 현탁액을 세척하고 분산시키는 단계들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
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