CN105400738B - 一种改进的低频细胞循环分选方法及其分选系统 - Google Patents

一种改进的低频细胞循环分选方法及其分选系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种改进的低频细胞循环分选方法及其分选系统，包括进样室、缓冲液瓶、混合室、磁极平台、回收样品管和控制系统，其采用循环液流设计和双通路分选设计，应用于免疫磁性分选，来提高低频细胞分选能力和分选的样品量，主要有以下优点：可以直接应用于临床大量样品的制备，可分析血样的样品量为0.5ml至200ml；可以同时分选两个样品或者对比样品，也可以同时进行正选和负选；可以进行多次循环分选，适用于低频细胞分选；可以对分离区域的温度进行控制，从而防止血细胞在磁场中被损伤；为了防止与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞粘连成簇，在磁珠脱离磁场前设计了磁场反相功能。

Description

一种改进的低频细胞循环分选方法及其分选系统
技术领域
本发明涉及一种改进的低频细胞循环分选方法及其分选系统。
背景技术
目前国内外的免疫磁性分选细胞技术主要有德国美天旎公司的分离柱分离，加拿大干细胞公司的磁极分离。这些细胞分选技术存在着分选低频细胞(含量低的细胞)的能力差，分选样品量不能满足临床的需求等问题。另外，在磁极分选过程中由于温度问题等，血液细胞容易被损伤及粘连成簇。
发明内容
为了解决这些问题，本发明公开了一种改进的低频细胞循环分选方法，包括如下步骤：
第一步：在控制系统设定分选的流速、磁场强度和分离区温度；
第二步：在进样室中接收临床上采集的血样与磁珠和抗体孵育完成后的血样；
第三步：在混合室中同时接收通过样品泵从进样室流来的血样及通过缓冲液泵流来的缓冲液后，样品与缓冲溶液以一定比例混合后形成混合样；
第四步：分离泵将混合样输送至圆形分离区域，在分离区域中混合样中与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞被磁场吸引滞留在磁场内，没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞从磁场中流出；
第五步：圆形半导体制冷片覆盖在圆形分离区域上方，以对分离区域的温度进行控制防止血细胞在磁场中被损伤；
第六步：没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞直接流入回收样品管；
第七步：然后，通过控制系统将磁场极性反转，防止与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞粘连成簇，之后去掉磁场，用洗脱液洗脱与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞，并收集至回收样品管；
第八步：在装有没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞的回收样品管中加入第二种磁珠和抗体孵育之后形成二次样品，将回流软管通过接口插入此回流样品管底部，控制系统打开回流软管上的回流泵使二次样品回流至混合室中，同时通过缓冲液泵使缓冲液流至混合室中，二次样品与缓冲溶液以一定比例混合后形成二次混合样；
第九步：然后重复上述第四步至第七步即可完成二次分选；
第十步：然后不断重复上述第八步至第九步即可完成多次分选。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法，其中，磁场强度在200-600mT之间可调，分离区温度在25-35℃可调。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的一个实施例中，包括一个进样室、一个缓冲液瓶、一个混合室、磁极平台、回收样品管和控制系统，进样室通过管道与混合室连接，缓冲液瓶通过管道与混合室连接，磁极平台的前部设有一个圆形分离区域，磁极平台的圆形分离区域分布四个可调节的电磁场，圆形分离区域上方覆盖有圆形半导体制冷片，混合室下部的管道“U”形穿过磁极平台的圆形分离区域后连接至回收样品管，回收样品管侧面开有接口，连接至混合室的回流软管通过接口可拆卸插入至回收样品管底部，进样室和混合室之间、缓冲液瓶和混合室之间、混合室下部穿过磁极平台的圆形分离区域的管道上及连接至混合室的回流软管分别设有样品泵、缓冲液泵、分离泵和回流泵，样品泵、缓冲液泵、分离泵、回流泵和电磁铁与控制系统耦合连接。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的上述实施例中，系统可以分选的样品量为0.5ml至50ml。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的另一个实施例中，进样室、缓冲液瓶和混合室为两个，磁极平台的前部设有两个圆形分离区域，每个圆形分离区域上方覆盖有圆形半导体制冷片，磁极平台的每个圆形分离区域分布四个可调节的电磁场，每个混合室下部的管道“U”形穿过磁极平台的其中一个圆形分离区域后连接至回收样品管。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的上述实施例中，系统可以分选的样品量为0.5ml至100ml。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的另一个实施例中，磁极平台的前部设有四个圆形分离区域，磁极平台的每个圆形分离区域分布四个可调节的电磁场，每个圆形分离区域上方覆盖有圆形半导体制冷片，每个混合室下部的管道“U”形穿过磁极平台的其中两个圆形分离区域后连接至回收样品管。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的上述实施例中，系统可以分选的样品量为0.5ml至200ml。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的实施例中，样品泵、缓冲液泵、分离泵和回流泵均为蠕动泵，管道为弹性管道。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的实施例中，样品泵、缓冲液泵、分离泵和回流泵附近设有电动阀，电动阀与控制系统连接。
有益效果
本发明公开了一种改进的低频细胞循环分选方法及其分选系统，采用循环液流设计和双通路分选设计，应用于免疫磁性分选，来提高低频细胞分选能力和分选的样品量，主要有以下优点：
(1)可以直接应用于临床大量样品的制备，可分析血样的样品量为0.5ml至200ml；
(2)可以同时分选两个样品或者对比样品，也可以同时进行正选和负选；
(3)可以进行多次循环分选，适用于低频细胞分选；
(4)本发明中的圆形半导体制冷片覆盖在圆形分离区域上方，可以对分离区域的温度进行控制，从而防止血细胞在磁场中被损伤；
(5)本发明在没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞直接流入回收样品管后，通过控制系统将磁场极性反转，可以防止与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞粘连成簇。
附图说明
图1是本发明公开的一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的第一个实施例的结构示意图。
图2是本发明公开的一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的第二个实施例的结构示意图。
图3是本发明公开的一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的第三个实施例的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
如图1、图2和图3中所示，本发明公开了一种改进的低频细胞循环分选方法，包括如下步骤：
第一步：在控制系统设定分选的流速、磁场强度和分离区温度；
第二步：在进样室01中接收临床上采集的血样与磁珠和抗体孵育完成后的血样；
第三步：在混合室03中同时接收通过样品泵09从进样室01流来的血样及通过缓冲液泵10流来的缓冲液后，样品与缓冲溶液以一定比例混合后形成混合样；
第四步：分离泵11将混合样输送至圆形分离区域15，在分离区域15中混合样中与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞被磁场吸引滞留在磁场内，没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞从磁场中流出；
第五步：圆形半导体制冷片06覆盖在圆形分离区域15上方，以对分离区域15的温度进行控制防止血细胞在磁场中被损伤；
第六步：没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞直接流入回收样品管；
第七步：然后，通过控制系统将磁场极性反转，防止与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞粘连成簇，之后去掉磁场，用洗脱液洗脱与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞，并收集至回收样品管，并收集至回收样品管08，用标有“+”的回收样品管08收集靶细胞，用标有“-”的回收样品管08收集非靶细胞；
第八步：在装有没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞的回收样品管08中加入第二种磁珠和抗体孵育之后形成二次样品，将回流软管13通过接口14插入此回流样品管08底部，控制系统打开回流软管13上的回流泵12使二次样品回流至混合室03中，同时通过缓冲液泵10使缓冲液流至混合室03中，二次样品与缓冲溶液以一定比例混合后形成二次混合样；
第九步：然后重复上述第四步至第七步即可完成二次分选；
第十步：然后不断重复上述第八步至第九步即可完成多次分选。
本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法，其中，磁场强度在200-600mT之间可调，分离区温度在25-35℃可调。
图1为本发明公开的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的第一个实施例的结构示意图，如图所示，该系统包括一个进样室01、一个缓冲液瓶02、一个混合室03、磁极平台04、回收样品管08和控制系统(图中未示出)，进样室01通过管道与混合室03连接，缓冲液瓶02通过管道与混合室03连接，磁极平台04的前部设有一个圆形分离区域15，磁极平台04的圆形分离区域15分布四个可调节的电磁场05，四个可调节的电磁场05分为两对，其中每对电磁铁相对设置，圆形分离区域15上方覆盖有圆形半导体制冷片06，圆形半导体制冷片06是通过连接件07安装在圆形分离区域15上方附近的磁极平台04并且是可以打开的，混合室03下部的管道“U”形穿过磁极平台04的圆形分离区域15后连接至回收样品管08，当管道“U”形穿过磁极平台04的圆形分离区域15经过四个可调节的电磁场05时，管道从每对可调节的电磁场相对的位置穿过，回收样品管08侧面开有接口14，连接至混合室03的回流软管13通过接口14可拆卸插入至回收样品管08底部，进样室01和混合室03之间、缓冲液瓶02和混合室03之间、混合室03下部穿过磁极平台04的圆形分离区域15的管道上及连接至混合室03的回流软管13分别设有样品泵09、缓冲液泵10、分离泵11和回流泵12，样品泵09、缓冲液泵10、分离泵11、回流泵12和电磁铁05与控制系统耦合连接，控制系统可以控制样品泵09、缓冲液泵10、分离泵11、回流泵12和电磁铁05的开启和关闭，并可以控制电磁铁05磁性的大小。
图1中所示的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的上述实施例中，系统可以分选的样品量为0.5ml至50ml。
图2为本发明公开的一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的第二个实施例的结构示意图，如图所示，进样室01、缓冲液瓶02和混合室03还可以为两个，磁极平台04的前部设有两个圆形分离区域15，每个圆形分离区域15上方覆盖有圆形半导体制冷片06，磁极平台04的每个圆形分离区域15分布四个可调节的电磁场05，并且四个可调节的电磁场05分为两对，其中每对电磁铁相对设置，每个混合室03下部的管道“U”形穿过磁极平台04的其中一个圆形分离区域15后连接至回收样品管08，并当管道“U”形穿过磁极平台04的其中一个圆形分离区域15经过四个可调节的电磁场05时，管道从每对可调节的电磁场相对的位置穿过。
图2中所示的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的上述实施例中，系统可以分选的样品量为0.5ml至100ml。
图3为本发明公开的一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的第三个实施例的结构示意图，如图所示，进样室01、缓冲液瓶02和混合室03还可以为两个，磁极平台04的前部还可以设有四个圆形分离区域15，磁极平台04的每个圆形分离区域15分布四个可调节的电磁场05，并且四个可调节的电磁场05分为两对，其中每对电磁铁相对设置，每个圆形分离区域15上方覆盖有圆形半导体制冷片06，每个混合室03下部的管道“U”形穿过磁极平台04的其中两个圆形分离区域15后连接至回收样品管08，并当管道“U”形穿过磁极平台04的其中两个圆形分离区域15经过八个可调节的电磁场05时，管道从每对可调节的电磁场相对的位置穿过。
图3中所示的上述一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的上述实施例中，系统可以分选的样品量为0.5ml至200ml。
图1、图2和图3中所示的一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的实施例中，样品泵09、缓冲液泵10、分离泵11和回流泵12均为蠕动泵，管道为弹性管道，蠕动泵可以按照一定频率挤压管道，因此样品可以在管道中流动，控制系统可以控制蠕动泵的开启和关闭，并可以控制蠕动泵挤压管道的频率。
图1、图2和图3中所示的一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统的实施例中，样品泵09、缓冲液泵10、分离泵11和回流泵12附近设有电动阀(图中未示出)，电动阀与控制系统连接，这样控制系统通过控制电动阀的开关更好地控制分选系统中样品的流动。
图2和图3中所示的一种改进的低频细胞循环分选系统的实施例中，可以同时分选两个样品，因为从图2和图3中可以得出采用了双通路分选设计，因此也可以同时进行正选或负选，所谓正选是指在阳性的分离过程中，磁珠上包被能够结合靶细胞表面抗原的特异性基团，靶细胞在与配套试剂混合的同时被磁珠标记，磁场作用与混合液，使靶细胞单独被截留在两个磁场中间的管道内，未被标记的细胞从系统中流出后，磁场磁力消失，靶细胞得到释放，最终收集到容器中。所谓负选是指，在损耗大时可采用阴性分离，非靶细胞被磁珠标记，在磁场打开时，可使靶细胞流出并收集。
以上所述，仅是本发明较佳的实施方式，并非对本发明的技术方案做任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例做任何简单修改，形式变化和修饰，均落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种改进的低频细胞循环分选方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
第一步：在控制系统设定分选的流速、磁场强度和分离区温度；
第二步：在进样室中接收临床上采集的血样与磁珠和抗体孵育完成后的血样；
第三步：在混合室中同时接收通过样品泵从进样室流来的血样及通过缓冲液泵流来的缓冲液后，样品与缓冲溶液以一定比例混合后形成混合样；
第四步：分离泵将混合样输送至圆形分离区域，在分离区域中混合样中与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞被磁场吸引滞留在磁场内，没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞从磁场中流出；
第五步：圆形半导体制冷片覆盖在圆形分离区域上方，以对分离区域的温度进行控制防止血细胞在磁场中被损伤；
第六步：没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞直接流入回收样品管；
第七步：然后，通过控制系统将磁场极性反转，防止与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞粘连成簇，之后去掉磁场，用洗脱液洗脱与磁珠连接的靶细胞/非靶细胞，并收集至回收样品管；
第八步：在装有没有连接磁珠的非靶细胞/靶细胞的回收样品管中加入第二种磁珠和抗体孵育之后形成二次样品，将回流软管通过接口插入此回流样品管底部，控制系统打开回流软管上的回流泵使二次样品回流至混合室中，同时通过缓冲液泵使缓冲液流至混合室中，二次样品与缓冲溶液以一定比例混合后形成二次混合样；
第九步：然后重复上述第四步至第七步即可完成二次分选；
第十步：然后不断重复上述第八步至第九步即可完成多次分选；
其中，所述进样室、缓冲液瓶和所述混合室为两个，磁极平台的前部设有两个圆形分离区域，每个圆形分离区域上方覆盖有圆形半导体制冷片，磁极平台的每个圆形分离区域分布四个可调节的电磁场，每个混合室下部的管道“U”形穿过磁极平台的其中一个圆形分离区域后连接至所述回收样品管。
2.根据权利要求1所述的一种改进的低频细胞循环分选方法，其特征在于：所述磁场强度在200-600mT之间可调，所述分离区温度在25-35℃可调。
3.根据权利要求2所述的一种改进的低频细胞循环分选方法的分选系统，其特征在于：所述分选系统包括一个进样室、一个缓冲液瓶、一个混合室、磁极平台、回收样品管和控制系统，所述进样室通过管道与所述混合室连接，所述缓冲液瓶通过管道与所述混合室连接，所述磁极平台的前部设有一个圆形分离区域，所述磁极平台的圆形分离区域分布四个可调节的电磁场，所述圆形分离区域上方覆盖有圆形半导体制冷片，所述混合室下部的管道“U”形穿过所述磁极平台的圆形分离区域后连接至所述回收样品管，所述回收样品管侧面开有接口，连接至混合室的回流软管通过接口可拆卸插入至回收样品管底部，所述进样室和混合室之间、缓冲液瓶和混合室之间、混合室下部穿过所述磁极平台的圆形分离区域的管道上及连接至混合室的回流软管分别设有样品泵、缓冲液泵、分离泵和回流泵，所述样品泵、所述缓冲液泵、所述分离泵、所述回流泵和电磁铁与所述控制系统耦合连接；其中，所述进样室、所述缓冲液瓶和所述混合室为两个，所述磁极平台的前部设有两个圆形分离区域，每个圆形分离区域上方覆盖有圆形半导体制冷片，所述磁极平台的每个圆形分离区域分布四个可调节的电磁场，所述每个混合室下部的管道“U”形穿过所述磁极平台的其中一个圆形分离区域后连接至所述回收样品管。
4.如权利要求3所述的分选系统，其特征在于：所述磁极平台的前部设有四个圆形分离区域，所述磁极平台的每个圆形分离区域分布四个可调节的电磁场，每个圆形分离区域上方覆盖有圆形半导体制冷片，所述每个混合室下部的管道“U”形穿过所述磁极平台的其中两个圆形分离区域后连接至所述回收样品管。
5.根据权利要求3中所述的分选系统，其特征在于：所述样品泵、所述缓冲液泵、所述分离泵和所述回流泵均为蠕动泵，所述管道为弹性管道。
6.根据权利要求5中所述的分选系统，其特征在于：所述样品泵、所述缓冲液泵、所述分离泵和所述回流泵附近设有电动阀，所述电动阀与控制系统连接。
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