CN105087493A - 联用三种单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种联用三种抗HLA-G、EpCAM和CK8/18的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用。本发明还提供一种乳腺癌肿瘤细胞的分选方法，其制备三种偶联抗体的免疫磁珠联合应用对乳腺癌肿瘤细胞富集率较高，敏感性及可重复性均较好，均可以检出相关的肿瘤细胞。本发明联用三种免疫磁珠(EpCAM，HLA-G，CK8/18)进行肿瘤细胞富集，最大程度上扩大了循环肿瘤细胞的覆盖率，富集率达到80%，此技术是国际首创。特别是抗HLA-G的单克隆抗体磁珠的使用，保证了肿瘤细胞富集的特异性和敏感性。

Description

联用三种单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中应用

技术领域

本发明涉及一种分选肿瘤细胞的方法，特别是涉及一种以应用抗HLA-G抗体为核心的,三种抗HLA-G、EpCAM、CK8/18抗体偶联磁珠,联用三种偶联抗体的免疫磁珠分选乳肿瘤细胞的方法。

背景技术

循环肿瘤细胞在外周血中的数量极少,通常在约1亿个白细胞和500亿个红细胞中仅有数个肿瘤细胞，大约每105～107个单核细胞中才有一个循环肿瘤细胞。因此，为了提高循环肿瘤细胞的检出率,通常需在检测前行循环肿瘤细胞的富集。细胞富集可通过肿瘤细胞的特异性标志物（免疫分离）或细胞形态特征如细胞体积和密度等来实现。

常用的细胞富集技术主要有免疫磁分选、密度梯度离心和细胞过滤等。

1.1密度梯度离心法：是一种基于物理学特性、利用在一定离心力下细胞之间沉降率不同分离细胞的技术。这是实验室一项常用的技术，用于分离单核细胞等。利用这项技术建立的Onclquick(GreinerBio-One,Frickenhausen，Germany)和Ficoll-Hypaque分离法，利用专用的多孔屏障和密度梯度分离液，在一定离心力下分离出肿瘤细胞。这项技术设备简单操作简便，能得到细胞的完整形态，便于进一步鉴别，在部分临床研究中显示出一定的临床意义，但是敏感性和特异性均不高，胖瘤细胞回收率低，限制了其临床应用。

1.2膜过滤法：是利用肿瘤细胞直径与血液细胞的区别，通过一定孔径的膜来过滤细胞而达到分离细胞的目的。同密度梯度离心法不一样，这项技术是利用细胞的形态学特点来富集肿瘤细胞的技术。一般血细胞直径在8-llum之间，而肿瘤细胞相对直径较大（例如乳腺癌细胞直径约30um)，借此区别以分离肿瘤细胞和正常血液细胞。肿瘤细胞与部分血液细胞的差别并没有那么明显，是该技术被人话病的方面，但是它的优势同样明显：更多类型的肿瘤都适合利用大小来区分正常血液细胞而不因表面标志缺失或者肿瘤异质性导致的漏检。第一个采用此法的是ISET(IsolationbySizeofEpithilialTumorcells),该方法设备简单，操作方便，而且细胞表面标记能完整保留；聚集的在一起的肿瘤细胞更容易分离，利于后续的进一步检测。但是，循环中的肿瘤细胞孔径不是均一的，在免疫系统攻击及血液剪切力的作用下往往发生变形，因此膜孔径的大小设定是个难题。有研究认为Sum的孔径分离效果好，但是敏感性受到质疑。在此基础上新发展的ScreenCell分离法，得到的胖瘤细胞除可常规检测外还可用于细胞培养，且有较好的敏感性。

鉴于依照肿瘤细胞大小的分离方法的优势，目前依据细胞大小分离肿瘤细胞的微过滤技术研发成功，初期的实验结果显示其比抗原抗体结合分离法有更高的灵敏性，更方便进行分子检测，下面为相关的专门描述。

以细胞大小为基础的微芯片过滤：以肿瘤细胞大小为基础建立的富集平台逐渐有了更多的报道，这种方法得到的肿瘤细胞有利于进行下一步的基因和分子的分析。其中一种采用高密度微孔工艺技术大大提高了该方法对循环肿瘤细胞的富集率，以培养细胞加入外周血进行实验发现其对肿瘤细胞的回收率超过90%，并且7.5mL血液标本的分离只需要不到3分钟的时间就能完成。与CellSearch系统比较，在57例转移性前列腺癌、大肠癌、乳腺癌和膀胱癌患者中，该芯片在51例患者中发现肿瘤细胞，而CellSearch系统只在其中26例患者血液标本中为阳性结果，并且芯片回收的循环肿瘤细胞数量是CellSearch系统的5.5倍。有一篇报道_比较了依照大小富集和CellSearch系统富集循环肿瘤细胞效率的实验，结果也是类似的，这些都显示出CellSearch系统的局限性。以大小为基础的微芯片分离技术的富集效率取决于微孔的密度和规律，尽管显示出一定的优势，目前仍没有应该该方法的临床大宗报道。

1.3抗原抗体结合分离法：以抗原抗体结合为基础的循环肿瘤细胞分离方法是目前最常用的方法。利用肿瘤细胞和正常血液细胞表达的不同表面抗原标记，设计不同的抗体与之结合，利用抗原抗体结合的高度特异性和灵敏性，达到区别和富集循环肿瘤细胞的目的（多是将抗体和磁珠结合，在磁场中达到分离的目的）。免疫磁珠法富集法的有效性要比传统方法高很多。和众多富集技术相比，此技术较为成熟，细胞回收率高，文献报道肿瘤细胞回收率约为85%左右。基于磁珠的富集方法从原理上分为两种为免疫阳性富集和阴性富集两种方式。

1.3.1免疫磁珠阳性扑获：

EpCAM(上皮细胞枯附因子）是最常用的免疫磁珠阳性扑获的目标抗原。EpCAM是上皮来源肿瘤最常见的表面标记，EpCAM抗体结合磁珠，与肿瘤细胞表面抗原结合，在磁场中得到分离。但是，基于此原理的分离技术需要肿瘤细胞表面有稳定、丰富的表面标记，否则就容易产生假阴性的结果。据研究，由于转移过程中的上皮间质转化(EMT)、肿瘤细胞的异质性等原因，一些肿瘤细胞表面EpCAM表达减弱或者缺失并且非上皮来源的肿瘤细胞不表达EpCAM，例如黑色素瘤细胞。为了提高该技术的敏感性，可考虑应用联合抗体磁珠来进行扑获。新发展的生物芯片技术，利用EpCAP包被的芯片微槽，可以过滤血液富集肿瘤细胞，提高富集效率约100倍。

正性富集的特点具有较高的富集效率，由于CTCs属于外周血内的稀有细胞，因此能够高效率的回收肿瘤细胞是正性富集的最大优势，其富集的倍数从104到2×105不等。因此正性富集能提高鉴定cTCs的灵敏度。但正性富集仍存在方法学的不足，因其原理是将血液内具有上皮表型的细胞全部回收，富集中使用的主要抗原是EpCAM。但并非只有肿瘤细胞表达EpCAM，血液来源的某些细胞或非恶性上皮细胞表达EpCAM时也会被富集。肿瘤在转移的过程中，部分肿瘤细胞表型发生转化，上皮间皮转化(Epithelialtomesenchymaltransition，EMT)现象，上皮标记抗原EpCAM将表达下调，使磁珠的富集效率降低。此外，肿瘤细胞的特点之一就是异质性，有些CTCs不表达EpCAM，阳性选择可能会导致假阴性的结果。另外，由于肿瘤细胞分离后仍然同磁珠相连，磁珠的质量和数量将影响对其鉴定，但目前由于技术进步，磁珠的体积已降低几十倍，此种影响已不明显。

1.3.2免疫磁珠阴性分选：与阳性扑获类似，阴性分选也利用的是磁珠分选原理。但是阴性分选与磁珠结合的抗体是结合正常血液细胞表面的抗原，肿瘤细胞表面不表达此类抗原，比如CD45。负性富集的原理是将血液中其它细胞全部除去，而后剩余细胞即为包含CTCs在内全部稀有细胞，再行鉴定。血液中的红细胞被裂解，白细胞结合抗体和磁珠后在磁场中滞留，剩余的是肿瘤细胞和少量的红、白细胞，然后再利用免疫焚光染色识别和计数肿瘤细胞。阴性富集的缺点是回收率不及阳性富集，优点是鉴定的CTCs没有被磁珠标记，在样本处理和富集的过程相对较少受到影响。与阳性扑获相比，阴性分选不受肿瘤细胞表面抗原变化的影响，因此在循环肿瘤细胞表面抗原表达不一致和特异性、敏感性较低的肿瘤中也可以应用，比如黑色素瘤等，且敏感性相对较高，但干扰细胞残留较多。这项技术目前未发展出自动系统，操作较为复杂，人为因素影响相对较大，不过仍然是未来可能的发展方向。

1.3.3CellSearch检测系统

CellSearch系统是目前FDA唯一批准的循环肿瘤细胞富集技术，该系统经过大规模临床验证被批准用于转移性孔腺癌、大肠癌和前列腺癌的预后评价和疗效检测。多项研究证实该系统能有效预测转移性乳腺癌、大肠癌和前列腺癌患者的生存期，更重要的是能在一周期常规治疗后早期预测疗效，因此获得了FDA批准应用于以上几种晚期肿瘤患者。CellSearch系统是一个自动化的循环脾瘤细胞检测系统，其检测稳定性在多个中心得到了验证。该系统采用的是免疫磁珠阳性扑获的原理。

其工作流程为：采用免疫磁珠结合EpCAM抗体在磁场中结合肿瘤细胞,然后再用角蛋白（CK)抗体来检测循环肿瘤细胞，同时还可以测定CD45，以CrCD45_为肿瘤细胞标准，最后给循环肿瘤细胞计数。该系统还可以给出部分细胞形态学的数据如胞核胞浆比，并且可以收集所得到的肿瘤细胞进行人工的鉴定。CellSearch系统完成上述操作一般需要7.5ml的外周血液，如果需要还可以附加检测HER2的表达，但是能力一般。

免疫磁珠以其高度的灵敏性、特异性和快速分离的特点，在循环肿瘤细胞检测中得到了较多的应用。但是该及预后的相关性研究技术最大的缺点在于，由于很多类型的实体瘤中广泛的存在上皮间质转化(EMT)现象，肿瘤细胞在进入循环系统过程中，一些上皮特异性的抗原表达减弱或者消失；同时进入循环系统的肿瘤细胞在人自身免疫力和血液流变力学的作用下，自身出现调亡和抗原表迖减弱，这些都可能导致阳性扑获技术对循环肿瘤细胞的检测能力减弱。因此，对于某些肿瘤，该技术存在一定的局限性。

1.3.4抗原抗体结合为基袖的微芯片技术：有几种微芯片技术被报道用于循环脾瘤细胞检测，最近报道的微芯片即采用表面阵列性排列地包被的EpCAM抗体研究称其回收效率超过60%。该芯片可以同时应用于多种肿瘤循环肿瘤细胞的检测，包括肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和大肠癌等，并在对肺癌的疗效预测实验中得到验证，该技术获得的肿瘤细胞可以进行下一步的EGFR的检测。徵芯片技术需要血流以极慢点速度通过以便使得抗原抗体充分结合，7.5ml血液大约需要l0h。

1.4其它富集技术：

基于微流体技术和细胞大小分离法的新技术也在发展，首先让血液样本通过一定空间的孔道，然后再通过微柱规律排列形成大小间距一定的空间，一定大小以上的细胞得以留存，其它则被分离。利用不同间距的孔径，可以实现不同细胞以及血浆的分离。

微电极阵列技术的引入促生了双向电泳分离技术来富集循环肿瘤细胞。不同特征的细胞会在微电极不同的距离找到自己的位置并聚集不同特征的细胞因为流体力学和导电性的区别得到分离，同时细胞本身的特征得以完整保护。用培养的肿瘤细胞来检验该技术的富集率，发现其回收率超过90%。这些技术的不足之处是其用血量太少，而且必须用相应的等张工作液来稀释，如果按照临床常用的血量来进行实验，其工作液体量可达70ml,而通过速度只有0.5ml/h，液体的稀释过程同样会造成循环肿瘤细胞的丢失。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题提供一种分选乳腺癌肿瘤细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明提出如下技术方案：

联用三种抗HLA-G、EpCAM和CK8/18的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用。

所述肿瘤细胞包括乳腺癌肿瘤细胞、食道癌症、非小细胞肺癌、子宫颈癌、结肠癌、胃癌子宫癌等。

本发明提供一种肿瘤细胞的分选方法，包括以下步骤：

（1）抗HLA-G的单克隆抗体、抗EpCAM的单克隆抗体、抗CK8/18的单克隆抗体分别偶联免疫磁珠得抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠；

（2）将抗HLA-G免疫磁珠，抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠混合后加入到待分选的细胞液中，用免疫磁珠分离方法进行分离，其中抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠混合后的质量百分比分别为55-65%、30-40%、5-15%。

优选的，所述抗EpCAM的单克隆抗体为EBA-1、A-20或C-10，所述抗CK8/18的单克隆抗体为CM-058、M20或A-9，所述抗HLA-G的单克隆抗体为MEM-G/2、MEM-G/9或4H84。

优选的，所述步骤（1）中抗HLA-G的单克隆抗体、EpCAM的单克隆抗体和抗CK8/18的单克隆抗体与免疫磁珠偶联均为抗体过饱合偶联。进一步优选，所述抗HLA-G的单克隆抗体和免疫磁珠之间是抗体饱合偶联，优选用料质量比为300μg抗体:100μg活化磁珠；所述抗EpCAM的单克隆抗体与免疫磁珠偶联的用料质量比为100μg抗体:100μg活化磁珠；所述抗CK8/18的单克隆抗体和免疫磁珠偶联的用料质量比为100μg抗体:100μg活化磁珠。

优选的，所述免疫磁珠的制备：取经活化的磁珠，加入饱合偶联用量的单克隆抗体和PBS，于室温下圆周混合3h，PBS清洗三次，加入甘氨酸混合，封闭剩余的醛基；加入含有BSA的PBS溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，PBS清洗3次，加入PBS缓冲液漩涡震荡，即得到均匀的修饰有一抗的免疫磁珠。

优选的，所述步骤（2）中抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠、抗CK8/18免疫磁珠混合后的质量百分比分别优选60%、30%、10%。

优选的，所述待分选的细胞液与EpCAM免疫磁珠，CK8/18免疫磁珠和HLA-G免疫磁珠混合物的用量体积比是100:(40-80)。

优选的，所述步骤（2）的具体方法是：取待分选的细胞液100μL(细胞数107/m)，分别加入EpCAM免疫磁珠，CK8/18免疫磁珠和HLA-G免疫磁珠的混合物30-50μL，2mg/mL，28℃温箱中孵育30分钟后，在磁力架上利用免疫磁珠磁分离方法，将悬浮液弃之，用适量的0.01MPBS（Ph=7.4）重复洗涤3-4次，将悬浮液弃之，最后每管用100μLPBS重悬磁珠后，使用细胞计数板对肿瘤细胞数进行计数。

本发明还提供一种用于分离肿瘤细胞的抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠、抗CK8/18免疫磁珠的混合物，和一种联用三种混合磁珠富集分离肿瘤细胞的分选试剂盒。

本发明分别以HLA-G，EpCAM，CK8/18三种抗原为细胞分选标志物，提高肿瘤细胞分选的敏感性和特异性。

本发明的优点：

(1)它包括抗EpCAM免疫磁珠、抗CK8/18免疫磁珠、抗HLA-G免疫磁珠的混合物三种磁珠联用捕获细胞，肿瘤细胞广谱性筛选(竞争者仅有EpCAM一种)，敏感性、特异性超同类产品（CELLSEARCH）;

(2)选用HLA-G为分选肿瘤细胞标志物,HLA-G为肿瘤特异的广谱性标志物,联用三种免疫磁珠(EpCAM，HLA-G，CK8/18)进行肿瘤细胞富集，最大程度上扩大了循环肿瘤细胞的覆盖率，分选肿瘤效率更高；

(3)制备的三种免疫磁珠的富集率较高，敏感性及可重复性均较好，可以检出相关的肿瘤细胞。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但不能理解为对本发明的限制。

1、抗EpCAM，CK8/18与HLA-G单克隆抗体

项目中EpCAM和CK8/18的单克隆抗体其中抗EpCAM的单克隆抗体为EBA-1、A-20、C-10，来源公司：圣克鲁斯生物技术公司；抗CK8/18的单克隆抗体为鼠抗人细胞角蛋白8/18单克隆抗体,型号为CM-058，来源公司：上海亿欣生物科技有限公司、M20、A-9，来源公司：圣克鲁斯生物技术公司；HLA-G的单克隆抗体MEM-G/2、MEM-G/9和4H84，来源公司：圣克鲁斯生物技术公司。

2、纳米免疫磁珠制备

纳米免疫磁珠制备包括活化磁珠与单抗的偶联关键步骤。通过优化纳米粒子的粒径和抗体的连接效率，提高纳米免疫磁珠对抗原细胞的吸附效率。

2.1纳米磁珠的选择及修饰

1、活化磁珠的购买：本实施例使用的是美天旎公司、Kisker公司生产的磁珠。

2、磁珠选择50nm活化磁珠。

2.2免疫磁珠与单抗偶联制备

1、抗体偶联：

1)抗体偶联前,抗EpCAM,HLA-G,CK8/18抗体在4℃对PBS,经过三次透析，过夜,储存在PBS中备用,将浓度调整到1mg/ml。

2)所述HLA-G免疫磁珠的制备：

取活化磁珠100μL，1mg/mL，加入300μL1mg/mL的抗HLA-G的单克隆抗体和100μL0.01MPBS（pH=7.4）PBS，在1.5mL微离心管中,于室温下圆周混合3h，PBS清洗三次，加入500μL0.2mol/L甘氨酸混合30min，封闭剩余的醛基；PBS清洗三次;加入含有质量百分比2.5%BSA的PBS溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，PBS清洗3次，加入200μLPBS缓冲液漩涡震荡，即得到浓度为2.0mg/ml(以HLA-G免疫磁珠的质量计)均匀的修饰有一抗的免疫磁珠。

所述抗EpCAM免疫磁珠的制备：

取活化磁珠100μL，1mg/mL，加入100μL1mg/mL的抗EpCAM的单克隆抗体和300μL0.01MPBS（pH=7.4）PBS，于室温下圆周混合3h，PBS清洗三次，加入500μL0.2mol/L甘氨酸混合30min，封闭剩余的醛基；PBS清洗三次;加入含有质量百分比2.5%BSA（牛血清白蛋白）的PBS溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，PBS清洗3次，加入100μLPBS缓冲液漩涡震荡，即得到浓度为2.0mg/ml（以EpCAM免疫磁珠的质量计）均匀的偶联有一抗的免疫磁珠。

所述CK8/18免疫磁珠的制备：

取活化磁珠100μL，1mg/mL，加入100μL1mg/mL的抗CK8/18的单克隆抗体和300μL0.01MPBS（pH=7.4）PBS，于室温下均匀混合3h，PBS清洗三次，加入500μL0.2mol/L甘氨酸混合30min，封闭剩余的醛基；PBS清洗三次;加入含有质量百分比2.5%BSA的PBS溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，PBS清洗3次，加入100μLPBS缓冲液漩涡震荡，即得到浓度为2.0mg/ml（以CK8/18免疫磁珠的质量计）均匀的修饰有一抗的免疫磁珠。

3、联用三种混合免疫磁珠富集肿瘤细胞试验

使用本实施例步骤2.2制备的三种抗免疫磁珠用于人工培养的肿瘤细胞系细胞,进行肿瘤细胞收集;人工培养的肿瘤细胞与健康人血液混合制备人工样品，与三种纳米免疫磁珠(抗EpCAM的单克隆抗体，抗HLA-G的单克隆抗体，抗CK8/18的单克隆抗体)混合，对人工样品和未偶联的洗脱样品进行细胞计数，计算富集效率。联用三种免疫磁珠进行肿瘤细胞富集，最大程度上扩大了肿瘤细胞的覆盖率。

试验方法：

1、制备循环肿瘤细胞样品：

1)实验室培养来自ATCC的6种肿瘤细胞系细胞:乳腺癌症(MCF-7),食道癌(EC109),非小细胞肺癌(A549),子宫颈癌(Hela),胃癌(NCI-N87),结肠癌(HT29),制备107/mL(104/ul)培养的各种肿瘤细胞样本;取各种肿瘤细胞,100μL,加入1.5mL离心管中,每种细胞为三管;

2)取5μL上述制备好的各种肿瘤细胞与5mL健康人血液混合,形成肿瘤细胞在外周血中人工样本,肿瘤细胞数:104/mL血液。每种细胞制备三管;

3)将适量混合免疫磁珠,加入100μL肿瘤细胞样品中混匀,孵育,然后使用德国美天泥公司的LS柱和强磁场磁力分离器,进行分离,PBS清洗,然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于100μLPBS,进行细胞计数，使用细胞计数板对富集的细胞进行检测，统计肿瘤细胞占富集前细胞总数的比例,计算免疫磁珠富集肿瘤细胞效率。

4)将适量混合免疫磁珠,加入1mL人工肿瘤细胞血液样品中,在磁场中进行分离,PBS清洗,然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于1mLPBS;取5μL样品,滴加于载玻片上,多聚甲醛固定等IF准备,使用BD公司的抗CK8/18/19-FICT,进行孵育，使用流式细胞仪对富集的细胞进行检测，肿瘤细胞-荧光标记CK8/18鉴定有效性。在荧光倒置显微镜下进行计数，统计回收肿瘤细胞占富集前细胞总数的比例,计算免疫磁珠富集血液样品中肿瘤细胞效率。

2、三种不同抗体偶联免疫磁珠混合比例的确定：三种免疫磁珠混合体积比例设定为:1)60%抗HLA-G磁珠+30%抗EPCAM磁珠+10%抗CK8/18磁珠；2)30%抗HLA-G磁珠+60%抗EPCAM磁珠+10%抗CK8/18磁珠；3)50%抗HLA-G磁珠+50%抗EPCAM磁珠。

3、混合免疫磁珠分选不同癌组织循环肿瘤细胞：将制备好的六种不同人工肿瘤样本各三份体积为100μL的分别加入混合免疫磁珠50μL（2mg/ml），28℃温箱中分别孵育30min后，在磁力架上利用免疫磁珠磁分离方法，将将悬浮液弃之，用适量的0.01MPBS（pH=7.4）重复洗涤2-3次，将悬浮液弃之，最后每管用100μLPBS重悬磁珠后，荧光显微镜对肿瘤细胞进行计数，计算免疫磁珠富集血液样品中肿瘤细胞效率。

4、混合免疫磁珠最佳用量确定：取5份MCF-7人工肿瘤样本，每份100μL，分别加入混合免疫磁珠（比例为HLA-G磁珠60%,EPCAM磁珠30%,CK8/18磁珠10%）20、40、60、80、100μL，28℃温箱中孵育30min后，在磁力架上利用免疫磁珠磁分离方法，将悬浮液弃之，用适量的0.01MPBS（Ph=7.4）重复洗涤2-3次，将悬浮液弃之，最后每管用100μLPBS重悬磁珠后，荧光显微镜对肿瘤细胞进行计数，计算免疫磁珠富集血液样品中肿瘤细胞效率。

试验结果：

1、三种不同抗体偶联免疫磁珠混合比例的确定

由表1和表2可知，混合磁珠对不同的肿瘤细胞的富集效果差异不大，联用三种免疫磁珠(EpCAM，HLA-G，CK8/18)进行肿瘤细胞富集，最大程度上扩大了肿瘤细胞的覆盖率，富集率可达到90%以上，此技术是国际首创。可重复性较好，可以回收相关的肿瘤细胞。

按照60%抗HLA-G磁珠:30%抗EPCAM磁珠:10%抗CK8/18磁珠比例混合富集时，对不同肿瘤细胞在外周血中富集效果较好，均达到90%以上。最终确定抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠、抗CK8/18免疫磁珠混合比例优选60%、30%、10%。

表1不同比例混合免疫磁珠富集人工样本肿瘤细胞比较

注：抗EpCAM的单克隆抗体为EBA-1、A-20或C-10，所述抗CK8/18的单克隆抗体为CM-058、M20或A-9，所述抗HLA-G的单克隆抗体为MEM-G/2、MEM-G/9或4H84。

表2不同免疫磁珠对肿瘤细胞富集敏感性对比

2、混合免疫磁珠用量确定

见表3经测试，肿瘤样品与混合免疫磁珠体积比为100μL(107/ml):40μL(2mg/mL)时，富集效果较好且不会造成磁珠浪费。

表3纳米磁珠用量与肿瘤细胞富集率的关系

混合免疫磁珠用量/μL	肿瘤细胞富集率
		20	59%
40	80%
		60	88%
80	91%
		100	95%

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.联用三种抗HLA-G、EpCAM和CK8/18的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括乳腺癌肿瘤细胞、食道癌症、非小细胞肺癌、子宫癌、结肠癌、胃癌等。

3.一种肿瘤细胞的分选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）抗HLA-G的单克隆抗体、抗EpCAM的单克隆抗体、抗CK8/18的单克隆抗体分别偶联免疫磁珠得抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠；

（2）将抗HLA-G免疫磁珠，抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠混合后加入到待分选的细胞液中，用免疫磁珠分离方法进行分离，其中抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠混合后的质量百分比分别为55-65%、30-40%、5-15%。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗EpCAM的单克隆抗体为EBA-1、A-20或C-10，所述抗CK8/18的单克隆抗体为CM-058、M20或A-9，所述抗HLA-G的单克隆抗体为MEM-G/2、MEM-G/9或4H84。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中抗HLA-G的单克隆抗体、EpCAM的单克隆抗体和抗CK8/18的单克隆抗体与免疫磁珠偶联均为抗体过饱合偶联。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗HLA-G的单克隆抗体和免疫磁珠之间用料质量比为300μg抗体:100μg活化磁珠；所述抗EpCAM的单克隆抗体与免疫磁珠偶联的用料质量比为100μg抗体:100μg活化磁珠；所述抗CK8/18的单克隆抗体和免疫磁珠偶联的用料质量比为100μg抗体:100μg活化磁珠。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠的制备：取经活化的磁珠，加入饱合偶联用量的单克隆抗体和PBS，于室温下圆周混合3h，PBS清洗三次，加入甘氨酸混合，封闭剩余的醛基；加入含有BSA的PBS溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，PBS清洗3次，加入PBS缓冲液漩涡震荡，即得到均匀的修饰有一抗的免疫磁珠。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠、抗CK8/18免疫磁珠混合后的质量百分比分别优选60%、30%、10%。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待分选的细胞液与EpCAM免疫磁珠，CK8/18免疫磁珠和HLA-G免疫磁珠混合物的用量体积比是100:(40-80)。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体方法是：取待分选的细胞液100μL(细胞数10^7/m)，分别加入EpCAM免疫磁珠，CK8/18免疫磁珠和HLA-G免疫磁珠的混合物30-50μL，2mg/mL，28℃温箱中孵育30分钟后，在磁力架上利用免疫磁珠磁分离方法，将悬浮液弃之，用适量的0.01MPBS（Ph=7.4）重复洗涤3-4次，将悬浮液弃之，最后每管用100μLPBS重悬磁珠后，使用细胞计数板对肿瘤细胞数进行计数。