TWI616534B - 利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之方法及裝置 - Google Patents

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Abstract

一種利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之方法及裝置，利用光介電泳力將血液中標定的腫瘤細胞進行精準地操控及分離，並配合影像的自動辨識，達到高效率與高純度的腫瘤細胞收集。

Description

利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之方法及裝置
本發明係血液循環腫瘤細胞純化分離之方法及裝置，尤指一種利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之方法及裝置，透過現有試劑分離技術進行初步細胞分離，再結合微流體與光介電泳力技術，利用螢光抗體影像進行目標細胞專一性圈選分離，提供100%高純度循環腫瘤細胞分離，供後端進行有效基因分析。
癌症發生率逐年增加，血液中的循環腫瘤細胞在臨床上近年來被證實能夠反應癌症病患之腫瘤情況，同時研究中也指出分析這些循環腫瘤細胞之抗藥性基因，將有助於針對癌症病患進行個人化之抗癌藥物篩選，且分析循環腫瘤細胞基因也有助於藥廠進行新藥開發。
而在習用技術中，不論是透過Ficoll溶液去除大部分紅血球，或是經由磁珠免疫抗體套組捕捉血液中剩餘大部份之白血球，上述雖然均可去除近99%的血球細胞，但仍然會殘餘104-105血球細胞，相較於臨床癌症患7.5ml血液只有數百顆循環腫瘤細胞，其純度可能連1%都不到，對於後端針對循環腫瘤細胞進行基因分析，這些殘餘的血球細胞將會影響基因分析的靈敏度與精確度。
近年來微流體技術的發展，有許多微流體晶片開發設計試圖提高循環腫瘤細胞獲得的純度，雖然有效提高其純度達80-90%，但依然 存在少量血球細胞，對於後端進行高靈敏度次世代基因定序時將會受到干擾，影響臨床分析的正確性。
是以，針對上述所存在的問題點，如何開發一種更具理想實用性之創新結構，實為消費者所殷切企盼，亦係相關業者須努力研發突破之目標及方向。
目前科學研究上分離血液中循環腫瘤細胞的方法種類繁多，不論是透過Ficoll溶液去除紅血球、磁珠免疫抗體套組捕捉白血球，或是微流體晶片利用化學或物理方法去除血球細胞…等等，其最終循環腫瘤細胞純度無法有效達到100%，使得循環腫瘤細胞在非常稀少的情況下(數十顆到數百顆)，進行高靈敏度次世代基因定序分析，將受到其他血球細胞的嚴重干擾，導致基因分析結果不精確或是誤判的情況產生。
本發明所使用之光介電泳係利用光來當作虛擬電極，也就是利用光照射到兩平板電極中的光導材料上，於光圖形周圍產生不均勻的電場分布，並以該不均勻的電場來操控電極化之顆粒體。在實際操作上，使用者利用電腦介面來操作投影機的光投射，即可進行微小顆粒之操作。
藉由上述光介電泳力之原理，應用於本發明係提供利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之方法，至少包括以下步驟：步驟一：於試驗體中取得含有可疑罕見細胞混合之血液；步驟二：添加至少一種辨識罕見細胞之螢光抗體至血液中；步驟三：將染色後的血液 細胞置入光介電泳力晶片進行螢光影像辨識；步驟四：透過光介電泳力光圖形選取表現螢光抗體之循環腫瘤細胞；步驟五：將光介電泳力晶片中所選取的螢光抗體之循環腫瘤細胞專一性分離並進行吸取；步驟六：獲得高純度之循環腫瘤細胞。
步驟一和步驟二之間係去除血液中的紅血球及白血球，去除血液中之紅血球的方法可為物理分離法或化學去除法，去除血液中之白血球的方法係使用CD45雞尾酒磁性抗體套組辨識，並去除有核細胞中所有表現CD45之白血球細胞。
其中，步驟五進行吸取前，將獲得的高純度之循環腫瘤細胞再次利用螢光影像辨識其分離純度，判斷是否有非目標細胞螢光表現；接著再利用螢光影像辨識其是否均是有核細胞，而非獲取偽陽性目標，以達到更進一步檢查及純化循環腫瘤細胞之目的。
本發明另外提供一種利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離方法之裝置，至少包括：一晶片本體，包括一第一導電玻璃、一生物相容性膠膜及一第二導電玻璃；該生物相容性膠膜設置於該第一導電玻璃下層，該生物相容性膠膜橫向設置一主要通道，垂直設置一側邊微通道，該主要通道與該側邊微通道交疊區域為一細胞分離區；該第一導電玻璃上層相對應該主要通道兩端分別設置一第一孔洞及一第二孔洞，及該側邊微通道之末端設置一第三孔洞，該第一孔洞上設置一樣本置放槽，該第二孔洞上設置一廢物排出槽，該第三孔洞設置一標的物收集槽；該第二導電玻璃設置於該生物相容性膠膜底部；一控制器，內部設置一光學投影裝置及一影像擷取裝置。
其中，該第一導電玻璃周緣與該主要通道相對應位置設置一第一電極通道，與該側邊微通道相對應位置設置一第二電極通道。
其中，該第二導電玻璃朝向該第一導電玻璃之反向板面塗佈一導光層。
其中，該晶片本體外部係連接設置一液體驅動組件及一訊號產生裝置，且該液體驅動組件與該訊號產生裝置相互連結。
本發明另外提供一種利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離方法之裝置，至少包括：一晶片本體，該晶片本體包括一第一導電玻璃及一第二導電玻璃；該第一導電玻璃與該第二導電玻璃相向設置，且該第一導電玻璃下層或該第二導電玻璃上層橫向設置一主要通道，垂直設置一側邊微通道，該主要通道與該側邊微通道交疊區域為一細胞分離區；該第一導電玻璃上層相對應該主要通道兩端分別設置一第一孔洞及一第二孔洞，及該側邊微通道之末端設置一第三孔洞，該第一孔洞上設置一樣本置放槽，該第二孔洞上設置一廢物排出槽，該第三孔洞設置一標的物收集槽；一控制器，內部設置一光學投影裝置及一影像擷取裝置。
其中，該第一導電玻璃側邊與該主要通道相對應位置設置一第一電極通道，與該側邊微通道相對應位置設置一第二電極通道。
其中，該第二導電玻璃朝向該第一導電玻璃之反向板面塗佈一導光層。
其中，該晶片本體外部係連接設置一液體驅動組件及一訊號產生裝置，且該液體驅動組件與該訊號產生裝置相互連結。
首先，本發明能夠提供100%高純度循環腫瘤細胞樣本；第二，透過本發明可任意標記研究需求所需之螢光抗體，只要影像系統可辨識螢光標記，皆可抓取目標細胞，無論是想研究癌症病患殘餘之白血球、混在循環腫瘤細胞中的癌幹細胞，甚至是具有高度轉移能力之循環腫瘤細胞會表現的細胞表面抗原，皆可藉由螢光抗體辨識標記，提供循環腫瘤細胞研究一個更彈性更精準的分離方法；第三，若能純化分離出這些癌症病患血液中稀少的循環腫瘤細胞，未來將可取代高風險原位癌組織的手術取樣，簡易地抽取病患血液進行癌細胞基因分析，即可得知目前癌症病患之腫瘤情況；最後，本發明所獲得之高純度循環腫瘤細胞，後端將不再受到正常血球細胞之影響，可針對個別病人之循環腫瘤細胞進行高靈敏度次世代基因定序，看其對於抗癌藥物之基因表現反應，或是供藥廠作為開發藥物之依據，此發明大大提升後端進行個人化循環腫瘤細胞基因分析之精確度及靈敏度。
有關本發明所採用之技術、手段及其功效，茲舉較佳實施例並配合圖式詳細說明於後，相信本發明上述之目的、構造及特徵，當可由之得一深入而具體的瞭解。
10‧‧‧第一導電玻璃
12‧‧‧生物相容性膠膜
14‧‧‧第二導電玻璃
141‧‧‧導光層
161‧‧‧第一電極通道
162‧‧‧第二電極通道
18‧‧‧主要通道
20‧‧‧側邊微通道
22‧‧‧細胞分離區
24‧‧‧第一孔洞
26‧‧‧第二孔洞
28‧‧‧第三孔洞
30‧‧‧樣本置放槽
32‧‧‧廢物排出槽
34‧‧‧標的物收集槽
5‧‧‧晶片本體
52‧‧‧液體驅動組件
54‧‧‧訊號產生裝置
60‧‧‧控制器
62‧‧‧光學投影裝置
64‧‧‧影像擷取裝置
第1圖為本發明之流程方塊圖
第2圖為本發明系統架構示意圖
第3圖為本發明第一實施例之光介電泳力晶片立體示意圖
第4圖為本發明第一實施例之光介電泳力晶片立體分解示意圖
第5圖為本發明第二實施例之光介電泳力晶片立體分解示意圖
第6圖為本發明第三實施例之光介電泳力晶片立體分解示意圖
附件一：以本發明之方法及裝置實際操作血液循環腫瘤細胞純化分離之分解影像拍攝圖
參閱第1圖，本發明係提供一種利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之方法，至少包括以下步驟：步驟一：於試驗體中取得含有可疑罕見細胞混合之血液；步驟二：添加至少一種辨識罕見細胞之螢光抗體至血液中；步驟三：將染色後的血液細胞置入光介電泳力晶片進行螢光影像辨識；步驟四：透過光介電泳力光圖形選取表現螢光抗體之循環腫瘤細胞；步驟五：將光介電泳力晶片中所選取的螢光抗體之循環腫瘤細胞專一性分離並進行吸取；步驟六：獲得高純度之循環腫瘤細胞。
其中，步驟一和步驟二之間係去除血液中的紅血球及白血球，上述除去血球步驟能增加染色後可疑罕見細胞的收集速度；去除血液中之紅血球的方法可為物理分離法或化學去除法，去除血液中之白血球的方法係使用CD45雞尾酒磁性抗體套組辨識，並去除有核細胞中所有表現CD45之白血球細胞。
其中，步驟五進行吸取前，將獲得的高純度之循環腫瘤細胞再次利用螢光影像辨識其分離純度，判斷是否有非目標細胞螢光表現；接著再利用螢光影像辨識其是否均是有核細胞，而非獲取偽陽性目標，以達到更進一步檢查及純化循環腫瘤細胞之目的。
上述中，去除血液中之紅血球的物理分離法的步驟為：(a)取一可造成細胞密度差異分離之物質至新管子中後再緩慢加入血液，上述物質與血液之體積比為3：4，得到一混合液；(b)以轉速400g離心30分鐘；使該混合液產生分層現象，最上層為血清層，中層為透明溶液層，底層為紅血球層；(c)取出血清層與透明溶液層之間乳白色交界的周圍血液單核球細胞層至一新離心管；(d)利用生理食鹽水沖洗數次；(e)獲得不含紅血球之血液。
其中，上述物質為蔗糖或其他多醣類。
上述中，去除血液中之紅血球的化學去除法係利用滲透壓原理，使血液中無細胞核的紅血球脹破，有細胞核的白血球保留，方法為：(a)配置反應試劑1X紅血球裂解緩衝液(RBC lysis buffer)1000ml，係使用8.26g的氯化銨(NH4Cl)，1.19g的碳酸氫鈉(NaHCO3)，200μL 0.5M pH 8的乙二胺四乙酸(EDTA)並添加1000ml無菌蒸餾水，待溶解後再調整最終pH值為7.3；(b)加入血液與反應試劑，其體積比依序為1：5，並靜置反應10分鐘；(c)接著以轉速400g離心五分鐘，去除上清液；(d)加入10ml磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)沖洗細胞一次，並再次離心400g，5分鐘；(e)最後除去上清液，剩餘的即為白血球與其餘罕見之有核細胞。
其中，步驟二所述之螢光抗體係為螢光接合專一抗體，並將上述抗體收集得到表現微弱或不表現CD45之疑似腫瘤細胞結合，上述螢光接合專一抗體為上皮細胞黏合蛋白、細胞角質蛋白、癌幹細胞表面抗原、表皮生長因子受體、鈣粘蛋白。
上述中，高純度的循環腫瘤細胞可用於癌症的偵測及術後 癒合的治療判斷，更可延伸應用於基因分析、抗藥性測試及藥物測試。
參閱第2~4圖，本發明另外提供一種利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之裝置，至少包括：一晶片本體5，包括一第一導電玻璃10、一生物相容性膠膜12及一第二導電玻璃14；該生物相容性膠膜12設置於該第一導電玻璃10下層，該生物相容性膠膜12橫向設置一主要通道18，垂直設置一側邊微通道20，該主要通道18與該側邊微通道20交疊區域為一細胞分離區22；該第一導電玻璃10上層相對應該主要通道18兩端分別設置一第一孔洞24及一第二孔洞26，及該側邊微通道20之末端設置一第三孔洞28，該第一孔洞24上設置一樣本置放槽30，該第二孔洞26上設置一廢物排出槽32，該第三孔洞28設置一標的物收集槽34；該第二導電玻璃14設置於該生物相容性膠膜12底部；一控制器60，內部設置一光學投影裝置62及一影像擷取裝置64。
其中，該第一導電玻璃10周緣與該主要通道18相對應位置設置一第一電極通道161，與該側邊微通道20相對應位置設置一第二電極通道162。
其中，該第二導電玻璃14朝向該第一導電玻璃10之反向板面塗佈具導光性之一導光層141，使該第二導電玻璃14具有導光特性。
其中，該晶片本體5外部係連接設置一液體驅動組件52及一訊號產生裝置54，且該液體驅動組件52與該訊號產生裝置54相互連結。
參閱第2、5、6圖，本發明另一實施例為利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離方法之裝置，至少包括：一晶片本體5，該晶片本體5包括一第一導電玻璃10及一第二導電玻璃14；該第一導電玻璃10與該第二導電玻璃14相向設置，且該第一導電玻璃10下層或該第二導電玻璃14上層橫向設置一主要通道18，垂直設置一側邊微通道20，該主要通道18與該側邊微通道20交疊區域為一細胞分離區22；該第一導電玻璃10上層相對應該主要通道18兩端分別設置一第一孔洞24及一第二孔洞26，及該側邊微通道20之末端設置一第三孔洞28，該第一孔洞24上設置一樣本置放槽30，該第二孔洞26上設置一廢物排出槽32，該第三孔洞28設置一標的物收集槽34；一控制器60，內部設置一光學投影裝置62及一影像擷取裝置64。
其中，該第一導電玻璃10側邊與該主要通道18相對應位置設置一第一電極通道161，與該側邊微通道20相對應位置設置一第二電極通道162。
其中，該第二導電玻璃14朝向該第一導電玻璃10之反向板面塗佈一導光層141。
其中，該晶片本體5外部係連接設置一液體驅動組件52及一訊號產生裝置54，且該液體驅動組件52與該訊號產生裝置54相互連結。
操作時，該第一導電玻璃10若為正極，則該第一電極通道161及該第二電極通道162同樣為正極，該第二導電玻璃14則為 負極；相反地，若該第一導電玻璃10為負極，該第二導電玻璃14則為正極。
詳細實施流程參閱附件1，首先從受試癌症病患中取得血液，透過目前現有的技術先將大部分的紅血球及白血球去除，接著將剩餘的血液細胞藉由市售免疫螢光抗體進行染色，將染色後的血液細胞添加至樣本置放槽，接著(I)從流動的細胞懸浮液中，使用者藉由螢光影像辨識找尋螢光標記之目標循環腫瘤細胞；(II)當具有螢光標記之目標循環腫瘤細胞於細胞隔離區出現時，會先使細胞懸浮液體暫停流動，待收集完成後再使細胞懸浮液體繼續流動；(III)辨識目標循環腫瘤細胞及非目標循環腫瘤細胞(白血球)；(IV)確定標記之細胞有細胞核，而非偽陽性螢光標記或是雜質非專一性標記；(V)利用光介電泳力圈選固定目標細胞；(VI)利用光介電泳力掃除非目標細胞(白血球)，使其存放至廢物排出槽；(VII)利用光介電泳力將圈選固定之目標細胞移至標的物收集槽；(VIII)目標循環腫瘤細胞在標的物收集槽中；(IX)利用光介電泳力將目標細胞往下收集至下端；最後，(X)利用螢光影像辨識其分離純度，判斷是否有非目標細胞螢光表現；(XI)再透過螢光影像辨識其是否均是有核細胞，而非獲取偽陽性目標；(XII)等待將其抽取供後端分析。
上述中，總操作時間為20分鐘，以2.5ul/min流速操作(10分鐘流動，10分鐘靜止操作)，操作細胞體積30ul，總細胞數約104。
歸納上述說明，藉由本發明上述方法及結構設計，可有效克服習知發明所面臨的缺失，進一步具有上述眾多的優點及實用價值，因 此本發明為一創意極佳之發明創作，且在相同的技術領域中未見相同或近似的產品創作或公開使用，故本發明已符合發明專利有關「新穎性」與「進步性」之要件，乃依法提出申請；惟，熟悉此技術之人士當可在不脫離本發明之精神與原則下對本發明進行變更與修改，而該等變更與修改，應皆涵蓋於如下申請專利範圍所界定之範疇中。

Claims (10)

  1. 一種利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之方法，至少包括以下步驟：步驟一：於試驗體中取得含有可疑罕見細胞混合之血液，接著去除血液中的紅血球及白血球；步驟二：添加至少一種辨識罕見細胞之螢光抗體至血液中；步驟三：將染色後的血液細胞置入光介電泳力晶片進行螢光影像辨識；步驟四：透過光介電泳力光圖形選取表現螢光抗體之循環腫瘤細胞；步驟五：將光介電泳力晶片中所選取的螢光抗體之循環腫瘤細胞專一性分離並進行吸取；步驟六：獲得高純度之循環腫瘤細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之方法，其中，步驟五進行吸取前，將獲得的高純度之循環腫瘤細胞再次利用螢光影像辨識其分離純度，判斷是否有非目標細胞螢光表現；接著再利用螢光影像辨識其是否均是有核細胞，而非獲取偽陽性目標，以達到更進一步檢查及純化循環腫瘤細胞之目的。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離之方法，其中，步驟二所述之螢光抗體係為螢光接合專一抗體，並將收集得到表現微弱或不表現CD45之疑似腫瘤細胞結合，上述螢光接合專一抗體為上皮細胞黏合蛋白、細胞角質蛋白、癌幹細胞表面抗原、表皮生長因子受體、鈣粘蛋白。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤 細胞純化分離之方法，其中，高純度的循環腫瘤細胞可用於癌症的偵測及術後癒合的治療判斷，更可延伸應用於基因分析、抗藥性測試及藥物測試。
  5. 一種如請求項1所述利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離方法之裝置，至少包括：一晶片本體，包括一第一導電玻璃、一生物相容性膠膜及一第二導電玻璃；該生物相容性膠膜設置於該第一導電玻璃下層，該生物相容性膠膜橫向設置一主要通道，垂直設置一側邊微通道，該主要通道與該側邊微通道交疊區域為一細胞分離區，該第一導電玻璃周緣與該主要通道相對應位置設置一第一電極通道，與該側邊微通道相對應位置設置一第二電極通道；該第一導電玻璃上層相對應該主要通道兩端分別設置一第一孔洞及一第二孔洞，及該側邊微通道之末端設置一第三孔洞，該第一孔洞上設置一樣本置放槽，該第二孔洞上設置一廢物排出槽，該第三孔洞設置一標的物收集槽；該第二導電玻璃設置於該生物相容性膠膜底部；一控制器，內部設置一光學投影裝置及一影像擷取裝置。
  6. 如請求項5所述利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離方法之裝置，其中，該第二導電玻璃朝向該第一導電玻璃之反向板面塗佈一導光層。
  7. 如請求項5所述利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離 方法之裝置，其中，該晶片本體外部係連接設置一液體驅動組件及一訊號產生裝置，且該液體驅動組件與該訊號產生裝置相互連結。
  8. 一種如請求項1所述利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離方法之裝置，至少包括：一晶片本體，該晶片本體包括一第一導電玻璃及一第二導電玻璃；該第一導電玻璃與該第二導電玻璃相向設置，且該第一導電玻璃下層或該第二導電玻璃上層橫向設置一主要通道，垂直設置一側邊微通道，該主要通道與該側邊微通道交疊區域為一細胞分離區，該第一導電玻璃側邊與該主要通道相對應位置設置一第一電極通道，與該側邊微通道相對應位置設置一第二電極通道；該第一導電玻璃上層相對應該主要通道兩端分別設置一第一孔洞及一第二孔洞，及該側邊微通道之末端設置一第三孔洞，該第一孔洞上設置一樣本置放槽，該第二孔洞上設置一廢物排出槽，該第三孔洞設置一標的物收集槽；一控制器，內部設置一光學投影裝置及一影像擷取裝置。
  9. 如請求項8所述利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離方法之裝置，其中，該第二導電玻璃朝向該第一導電玻璃之反向板面塗佈一導光層。
  10. 如請求項8所述利用非接觸式與自動辨識的血液循環腫瘤細胞純化分離方法之裝置，其中，該晶片本體外部係連接設置一液體驅動組件及一訊號產生裝置，且該液體驅動組件與該訊號產生裝置相互連結。
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