JP2018028457A - 目的粒子の回収方法および回収装置 - Google Patents
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Abstract
Description
目的粒子を含む溶液を、当該目的粒子を保持可能な凹部を複数設けた粒子保持手段に導入する工程と、
前記凹部に前記目的粒子を保持させる工程とを含む、目的粒子の回収方法であって、
粒子保持手段に設ける凹部は、連通部を介して隣接した凹部と連通しており、
前記連通部は、溶液中に含まれる目的粒子は保持できない一方、溶液中に含まれる当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能であり、
凹部に目的粒子を保持させる工程を、誘電泳動力を用いて行なう、
前記回収方法である。
溶液中に含まれる目的粒子を保持可能な凹部を複数設け、当該凹部は連通部を介して隣接した凹部と連通しており、当該連通部は前記目的粒子は保持できない一方、当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能な、粒子保持手段と、
前記目的粒子および前記夾雑粒子を保持させるための誘電泳動力を発生させる手段と、
を備えた、目的粒子の回収装置である。
前記凹部の大きさは、回収対象である目的粒子の大きさや形状に応じ適宜選択すればよいが、前記凹部の大きさを前記目的粒子が一つだけ保持可能な大きさとすると、その後の目的粒子の形態学的分析(例えば、高速フーリエ変換)、組織型分析、核酸分析、タンパク質分析などの解析が容易に行なえる点で好ましい。例えば目的粒子がCTC(直径:10から25μm)の場合は、前記凹部を直径25μmから30μmの粒子が一つだけ保持可能な大きさとすると好ましい。
貫通部111aを有した平板上の遮光部材111と、貫通部112aを有した平板上の絶縁体112から構成される凹部壁面部材110と、
凹部壁面部材110の上部に密着して設けた、導入口121、排出口122および貫通部123を有した平板上のスペーサ120と、
凹部壁面部材110の下部およびスペーサ120の上部を密着して挟むよう設けた電極131・132と、
電極131・132同士を接続する導線140と、
電極131・132に信号を印加する信号発生器150と、
を備えている。遮光部材111が有する貫通部111aと絶縁体112が有する貫通部112aとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通部の位置が一致するよう遮光部材111および絶縁体112を設けている。貫通部111a、貫通部112aおよび遮光部材111の下部に密着して設けた電極131により凹部161が構成され、導入口121から目的粒子200を含む液体を導入すると、貫通部123を通じて凹部161へ目的粒子200が導入される。電極132はスペーサ120上部に密着して設けており、導入口121から導入した、粒子を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお凹部161に保持した粒子の回収を容易にするため、電極132はスペーサ120から取り外し可能な構造となっている。
(1)一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がN−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量5000のポリエチレングリコール(mPEG−NHS)と、ウシ血清アルブミン(BSA)(300mg、0.3mmol)とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液(0.1M、15mL)に溶解後、当該溶液を室温で3時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したBSA(PEG−BSA)を調製した。なお調製する際、mPEG−NHSとBSAとのモル比(mPEG−NHS/BSA)を2となるようにした。調製後、分画分子量10000の透析膜を用いて、純水への溶液置換を3日間行なった。
(2)イミダゾリジニル尿素2g、分子量6000のポリエチレングリコール(PEG)2g、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)100mg、および塩化ナトリウム600mgを、超純水100mLに溶解し、得られた溶液を安定化剤として用いた。
(3)インフォームドコンセントを得た健常人から血液をEDTA−2K採血管(VP−DK050K、テルモ社製)に3mL採血後、前記採血管に(2)で調製した安定化剤3mLを添加し、得られた溶液を保存処理した希釈血液試料とした。
(4)保存処理した希釈血液試料を室温で10分放置し、75μLの白血球・赤血球結合剤(RosetteSep、StemCell Technologies社製)を添加した後、チューブ内で密度1.086g/mLの密度勾配溶液上に重層し、室温で2000×gで10分間遠心した。
(5)遠心後、目的粒子の位置する画分を含む溶液を50mL容量の容器に回収した。
(6)回収後数分以内に0.9%(w/v)塩化アンモニウムと0.1%(w/v)炭酸水素カリウムとを含む溶血液で30mLまでメスアップ後、300×gで10分間、室温で遠心分離した。当該操作により上清に混入した赤血球が破壊され、分離回収した粒子の観察が良好になる。
(7)遠心後の上清を除去した後、粒子ペレットを、(1)に記載の方法で調製したPEG−BSA(BSAとして0.1%(w/v))および300mMマンニトールを含む溶液30mLで再懸濁した。
(8)再懸濁液を300×gで5分間、室温で遠心分離後、上清を除去し、再度、粒子ペレットを、PEG−BSA(BSAとして0.1%(w/v))および300mMマンニトールを含む溶液30mLで再懸濁した。当該操作は、血液成分を除去し、目的粒子(本実施例ではCTCなどの腫瘍細胞(直径:10から25μm))を濃縮するための操作である。
(9)(8)で上清を除去した粒子懸濁液を、図1および図2に示す粒子回収装置100に導入し、信号発生器150から電極131・132へ交流電圧(電圧20Vpp、周波数1MHz、矩形波)を3分間印加することで粒子回収装置100が有する凹部161に粒子を保持させた。図1および図2に示す粒子回収装置100に備える粒子保持手段は図3に示す粒子保持手段160を用いた。具体的には、上面形状(平面図における形状)が一辺が30μmの正方形を45度回転したひし形であり深さが40μmである凹部161を上下左右50μmの間隔(中心間距離)で格子状に配置し、当該ひし形の頂点同士が連通するよう幅10μm、深さ40μmの連通部162を設けた。また粒子回収装置100に備えるスペーサー120の厚さは1mmとした。
(10)粒子が保持された凹部数を計測し、全体の凹部数で除することで凹部への粒子の導入率を算出した。なお本実施例で用いた血液試料は健常人由来の試料であり、目的粒子である腫瘍細胞(CTC)は含まれていない。従って、本実施例で凹部に保持された粒子は目的粒子以外の夾雑粒子(具体的には、前記(4)から(8)に示す前処理操作を行なっても残存する、白血球(直径:大半は6から15μm)、赤血球(直径:7から8μm)、血小板(直径:1から4μm)、小胞、細胞デブリといった血液試料中に含まれる夾雑細胞)であり、算出した導入率は夾雑粒子の凹部への混入率となる。
実施例1(9)において、交流電圧を印加しない他は、実施例1と同様な方法で、(夾雑)粒子が保持された凹部数を計測し、全体の凹部数で除することで凹部への粒子の導入率(夾雑粒子の混入率)を算出した。
実施例1(9)において、粒子保持手段を連通部を設けない手段(具体的には、図3に示す粒子保持手段160のうち連通部162を除いた手段)とした他は、実施例1と同様な方法で、(夾雑)粒子が保持された凹部数を計測し、全体の凹部数で除することで凹部への粒子の導入率(夾雑粒子の混入率)を算出した。
(1)目的粒子としてヒト乳がん細胞(SKBR3)を、5%CO2環境下、10%FBS(Fetal bovine serum)を含むRPMI−1640培地を用いて37℃で24から96時間培養後、0.25%トリプシン/1mM EDTAを用いて培地から剥離し、チューブに回収した。回収後、1000rpmで5分間遠心した。
(2)(1)のSKBR3細胞数が約100から150個となる様に調整後、実施例1(2)の安定化剤を等量添加し、得られた溶液を保存処理した目的粒子懸濁液とした。
(3)保存処理した目的粒子懸濁液を室温で10分放置し、1000rpmで5分間、室温で遠心分離後、上清を除去し、粒子ペレットを、実施例1(1)のPEG−BSA(BSAとして0.1%(w/v))および300mMマンニトールを含む溶液1mLで再懸濁した。
(4)(3)で上清を除去した粒子懸濁液を用いる他は、実施例1(9)と同様の方法で粒子回収装置に導入した。
(5)PEG−BSA(BSAとして0.1%(w/v))および300mMマンニトールを含む溶液を、図1および図2に示す粒子回収装置100(粒子保持手段140は図3に示す手段を使用)へ2回導入した。
(6)凹部に保持されたSKBR3細胞数を計測し、粒子保持装置へ導入した目的粒子懸濁液中に含まれるSKBR3細胞数で除することで、凹部へのSKBR3細胞(目的粒子)の保持率を算出した。
(1)実施例2(5)において、粒子回収装置100に備える粒子保持手段160を連通部を設けない手段(具体的には、図3に示す粒子保持手段160のうち連通部162を除いた手段)とした他は、実施例2と同様な方法で、凹部に保持されたSKBR3細胞数を計測し、粒子保持装置へ導入した目的粒子懸濁液中に含まれるSKBR3細胞数で除することで、凹部へのSKBR3細胞(目的粒子)の保持率を算出した。
110:凹部壁面部材
111:遮光部材
112:絶縁体
111a、112a:貫通部
120:スペーサ
121:導入口
122:排出口
123:貫通部
131、132:電極
140:導線
150:信号発生器
160:粒子保持手段
161:凹部
162:連通部
200:目的粒子
Claims (6)
- 目的粒子を含む溶液を、当該目的粒子を保持可能な凹部を複数設けた粒子保持手段に導入する工程と、
前記凹部に前記目的粒子を保持させる工程とを含む、目的粒子の回収方法であって、
粒子保持手段に設ける凹部は、連通部を介して隣接した凹部と連通しており、
前記連通部は、溶液中に含まれる目的粒子は保持できない一方、溶液中に含まれる当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能であり、
前記凹部に目的粒子を保持させる工程を、誘電泳動力を用いて行なう、
前記回収方法。 - 粒子保持手段に設ける凹部の上面形状が多角形であり、連通部を当該多角形の頂点のうちの少なくとも一つと隣接した凹部における当該多角形の頂点のうちの少なくとも一つとが連通するよう設けた、請求項1に記載の目的粒子の回収方法。
- 目的粒子を含む溶液が血液試料であり、目的粒子が腫瘍細胞であり、夾雑粒子が白血球、赤血球、血小板、小胞、細胞デブリから選ばれるいずれか1つ以上である、請求項1または2に記載の目的粒子の回収方法。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の方法で回収した目的粒子を、当該目的粒子が有する特徴に基づき検出する、目的粒子の検出方法。
- 請求項4に記載の方法で検出した目的粒子を、当該目的粒子を採取する手段で取得する、目的粒子の取得方法。
- 溶液中に含まれる目的粒子を保持可能な凹部を複数設け、当該凹部は連通部を介して隣接した凹部と連通しており、当該連通部は前記目的粒子は保持できない一方、当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能な、粒子保持手段と、
前記目的粒子および前記夾雑粒子を保持させるための誘電泳動力を発生させる手段と、を備えた、目的粒子の回収装置。
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