JP2015087382A

JP2015087382A - 血液検体の処理方法

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Publication number: JP2015087382A
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Inventors: 英紀 ▲高▼木; Hideki Takagi
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Filing date: 2014-09-11
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Abstract

【課題】フィルターのろ過面積を抑えつつ、変形して抜けやすい稀少細胞や小さな稀少細胞の回収率を向上することができ、生きたまま前記細胞を回収できる血液検体処理方法の提供。
【解決手段】一態様において、短軸直径が３．０μｍ以上１５μｍ以下で、長軸直径が、前記短軸直径に対し１．１倍〜３倍の楕円形、又は、該楕円を含み該楕円と該楕円の長軸をはさむ少なくとも２点で接する形状の孔を、少なくとも２００個／ｍｍ²〜４００００個／ｍｍ²の孔密度で含むフィルターを用い、前記フィルターの孔に対して６μｌ／孔以下の容量の血液検体をフィルター処理して稀少細胞を分離又は検出することを含む、血液検体中の稀少細胞を分離又は検出する方法に関する。
【選択図】なし

Description

本開示は、血液検体の処理方法、血液検体中の稀少細胞を分離する方法、血中循環腫瘍細胞の数測定又は分析方法、及びそれらに用いられるフィルターならびに稀少細胞捕捉装置に関する。

血液の細胞成分は、主に赤血球、白血球、血小板であるが、血液中にこれら以外の細胞が存在することがある。その一例として、血中循環腫瘍細胞／ＣＴＣ（Circulating Tumor Cell）が挙げられる。がんの転移はがん細胞が血管やリンパ管を通って体内の他の部位に運ばれて増殖することにより起こると考えられている。そして、血液中のＣＴＣ数と、がんの転移の可能性及び予後に関係があることが報告されており、がん（特に乳がんなどの転移性のがん）の診断、予後診断、及び治療効果の予測又は判定の指標とするために、血液中のＣＴＣ数の計数、ＣＴＣの核酸を測定することが知られており、その分離・濃縮について様々な手法が提案・研究されている（非特許文献１〜１６、特許文献１〜４など）。

特許第５０８６２４１号特開２０１１−１６３８３０号公報特開２０１３−１７４２９号公報特表２０１０−５３０２３４号公報

EFRAT DOTAN, STEVEN J. COHEN, KATHERINE R.ALPAUGH, NEAL J. MEROPOL. Evolving Evidence and Future Challenges. The oncologist 2009;14;1070-1082 Martin VM, Siewert C, Scharl A, Harms T, Heinze R, Ohl S, Radbruch A, Miltenyi S, Schmitz J. Immunomagnetic enrichment of disseminated epithelial tumor cells from peripheral blood by MACS. Exp Hematol. 1998 Mar;26(3):252-64. L. Yang, J.C. Lang, P. Balasubramanian, K. R. Jatana, D. Schuller, et al. Optimization of an Enrichment Process for Circulating Tumor Cells From the Blood of Head and Neck Cancer Patients Through Depletion of Normal Cells. Biotechnol Bioeng; 102(2): 521-534 (2009) Ralf Gertler, Robert Rosenberg, Katrin Fuehrer, Michael Dahm, Hjalmar Nekarda, Joerg Ruediger Siewert Detection of Circulating Tumor Cells in Blood Using an Optimized Density Gradient Centrifugation Recent Results in Cancer Research Volume 162, 2003, pp 149-155 M. K. Baker, K. Mikhitarian, W. Osta, et al. Molecular detection of breast cancer cells in the peripheral blood of advanced-stage breast cancer patients using multimarker real-time reverse transcription-polymerase chain reaction and a novel porous barrier density gradient centrifugation technology. Clin Cancer Res; 9: 4865-4871 (2003) Rostagno P, Moll JL, Bisconte JC, Caldani C. Detection of rare circulating breast cancer cells by filtration cytometry and identification by DNA conten t: sensitivity in an experimental model. Anticancer Res. 1997,17, 2481-2485 G. Vona, A. Sabile, M. Louha, et al. Isolation by size of epithelial tumor cells : a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am J Pathol; 156: 57-63 (2000) F. Farace, C. Massard, N. Vimond, F. Drusch, et al. A direct comparison of CellSearch and ISET for circulating tumour-cell detection in patients with metastatic carcinomas. Br J Cancer; 105(6): 847-853 (2011) S. Zheng, H. Lin, J. Q. Liu, et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. J Chromatogr A; 1162: 154-61 (2007) H. K. Lin, S. Zheng, A. J. Williams, et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin Cancer Res; 16(20): 5011-5018 (2010) Hosokawa M, Hayata T, Fukuda Y, Arakaki Ai, et al. Anal. Chem., 2010, 82 (15), pp 6629-6635 Size-Selective Microcavity Array for Rapid and Efficient Detection of Circulating Tumor Cells S. Zheng, H. K. Lin, B. Lu. 3D microfilter device for viable circulating tumor cell (CTC) enrichment from blood. Biomed Microdevices; 13: 203-213 (2011) Frank A.W. Coumans., Guus van Dalum., Markus Beck, Leon W.M.M. Terstappen* Filter Characteristics Influencing Circulating Tumor Cell Enrichment from Whole Blood, April 2013 | Volume 8 | Issue 4 | e61770 Sunyoung Park, Richard R. Ang, Simon P. Duffy, Jenny Bazov, Kim N. Chi, Peter C. Black, Hongshen Ma, Morphological differences between circulating tumor cells from prostate cancer patients and cultured prostate cancer cells, January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e85264 Jochen Guck,Stefan Schinkinger,Bryan Lincoln,Falk Wottawah,Susanne Ebert、Maren Romeyke,Dominik Lenz,Harold M. Erickson,Revathi Ananthakrishnan,*Daniel Mitchell,Josef Ka¨s, Optical Deformability as an Inherent Cell Marker for Testing Malignant Transformation and Metastatic Competence, Biophysical Journal Volume 88 May 2005 3689？3698 Wenwei Xu, Roman Mezencev, Byungkyu Kim, Lijuan Wang,John McDonald, Todd Sulchek, October 2012 | Volume 7 | Issue 10 | e46609 Cell Stiffness Is a Biomarker of the Metastatic Potential of Ovarian Cancer Cells

従来、血液およびＣＴＣに関して、赤血球、白血球が圧倒的に多いことが、血液中に極めて少ないレベルでしか見出されない細胞の検出又は取得を困難にしている。例えば、現在、ＦＤＡで認可されているセルサーチシステムは、がん細胞の表面マーカーとしてＥｐＣＡＭ抗体を利用しているが、ＥｐＣＡＭやサイトケラチン（ＣＫ）をほとんど、又は全く発現していない腫瘍細胞も報告されているため、抗原の発現量に依存するアフィニティーを用いた方法では、捕捉できるがん細胞に限界がある。現在、米国のＦＤＡで認可されているセルサーチシステムは、ＣＴＣを得るのに固定化と抗体を用いて分離・濃縮を実施している。しかしＣＴＣの表面抗原の発現量に依存しているため、捕捉できない細胞もある。このため、実際に血液中に流れていても、捕捉できないＣＴＣが多くあり、感度が低い。そこで、抗体に依存せずＣＴＣを分離できる方法が望まれる。

非特許文献６―８に記載の方法は、主にがん細胞のサイズが一般的に血球より大きい細胞であることと、また白血球が自身より小さな孔を通過できるなどの、血球が柔軟に変形できる性質を利用した分離である。しかしながら、フィルターの孔が均一でないため、各穴が結合したものが発生し、穴が大きくなり、がん細胞が抜けてしまい捕捉率が低い課題が存在する。

一方、近年、新規のＣＴＣを捕捉するフィルターは、トラックエッチメンブレンフィルター（ポリカーボネート製フィルター；ＰＣフィルター）ではなく、均一な孔を達成することで、プラスチックや金属の材料で捕捉率の向上を達成したとの報告されており、セルサーチシステムより高い捕捉率が得られることが開示されている。特許文献１は、血液中のＣＴＣの分離、検出技術として、パリレンの素材を用いて均一な孔を作製したフィルターメンブレンでＣＴＣを分離することを開示する。また、特許文献２は、サイズ選択マイクロキャビティアレイ（金属フィルター）を用いてろ過面積１００μｍ²のフィルター（孔の直径がφ１０μｍで、孔数１０，０００個）で血液１ｍｌからＣＴＣを分離し、また孔をφ８μｍにすることでφ１０μｍで抜けてしまうサイズの小さい小型のがん細胞を捕捉できることを開示する。（なお、表面特性が異なるプラスチックと金属が同様に高捕捉率の結果を得ていることは、ろ過原理が孔の穴より大きい細胞をフィルター上で捕捉することに依る。つまり、このように孔の大きさが、濾過による細胞捕捉の効率を左右する最も大きな要因として働くため、他の材料においても同様な効果が期待できる。）

また、最近では、小型のＣＴＣ（平均７．９７μｍ）も存在することが、報告されている〔非特許文献１３−１４〕、孔径のφ５μｍのサイズで、血液１ｍｌを通過させるのに少なくとも１０万個の孔をもつ開口率１０％以下のフィルターが提案されており、小型ＣＴＣも捕捉できることが望まれる。

さらに、変形能の高い癌細胞もおり〔非特許文献１４−１５〕、転移など悪性度の高いがん細胞の可能性が高く、変形能が高いがん細胞も捕捉できれば、ＣＴＣの遺伝子等の解析も進み、治療の向上につながる可能性がある。

ＣＴＣは、医療の発展に非常に有望な細胞であるが、前述のとおり血液１０ｍｌ中で数個しかいないといわれている。１０ｍｌ中にＣＴＣが２個しかいない場合、ポワソン分布によれば、１ｍｌの血液の処理だけでは、ＣＴＣが１個以上の存在する確率が約２０％程度である。このため漏れなく捕捉できたしても最高２０％の検出率しか期待できないが、血液を多く処理できた場合、８ｍｌでは１個以上のＣＴＣが存在する確率は約９０％近くになる。このため、より多くの血液を適切に処理できるフィルターが望まれる。

ここで、前記文献のフィルターに関し、１０μｍを超えた孔においては、直径１０μｍ程度の孔では細胞サイズが当該孔径よりも小さいために抜けてしまうような小型の細胞を捕捉することができないという問題がある。すなわち、例えば、所定のサイズの細胞を補足したい場合、通常、フィルターの孔の直径を、その所定のサイズよりも小さくすることを対策として想定できる。しかし、実際に試してみると、単純に孔を小さくした場合、血球も捕捉されやすくなるため、フィルター孔径が小さくなるほど目詰まりやすく流れにくくなり、ろ過時間も長くなる。そこで、これを解決すべくろ過の際にフィルターに適用する圧（ろ過圧）を高めて迅速な処理をしようとすれば、今度は細胞がフィルターから抜け落ちてしまう、又は、孔接触時にダメージを与える可能性が高くなる、等の問題が生じる。

例えば、小さながん細胞を捕捉する方法として、血液を溶血させて、血球数を減らした上で、直径２５ｍｍ（面積４９０ｍｍ²）で孔径が短軸直径５μｍ×長軸直径５μｍ以下という小さな孔を有するフィルターを使用する方法が開示されている〔特許文献３〕。しかし、前記文献には、トータル１ｍｌの希釈血液を孔径０．４μｍの濾紙状フィルターで濾過して、白血球を回収した例が記載されているが、トータル１ｍｌを超える量の血液を濾過して目的細胞（この例では白血球）を適切に回収できる見込みは低いと思われる。ましてや、血液中の存在頻度がかなり低い場合（例えば、１０ｍｌの血液に数個程度など）もあるＣＴＣ等の稀少細胞を検出したい場合には、文献記載の血液量程度では捕捉効率が低く、より多くの血液をフィルターに流す必要がある。このため、仮に前記文献記載の方法を採用すると、フィルター面積を拡大させる必要が生じ、検出に必要な試薬コストの増大、洗浄液量の増加や廃液量の増大を招き、操作プロセスも煩雑になる。

すなわち、孔を単に小さくする解決法のみによれば、多くの血液を処理できず、フィルターの目詰まり回避のため、ろ過面積（フィルターにおいて液体を濾過できる面積のこと）やフィルターにおける孔の数（孔数）を増やす必要があり、結果、デバイスの嵩が増加し、使用する標識試薬（一般的に高価である）が増加して、コストが高くなる。また孔密度が増えることでフィルターの強度も劣化し、孔間のピッチが小さくなることでメンブレンの耐久性も低下する。こうして低下した耐久性をあげるためにメンブレンの膜厚を増せば、血液を流すのに必要な圧力も増さざるを得ず、細胞にかかる負荷も増大し、さらなる目詰まりも生じやすくなる。また、目的細胞以外が多く残存して解析を困難にする問題も伴う。

一方、変形しやすい細胞を捕捉するためには、フィルターを挟む上下の圧力差ΔＰ₂を小さくして、細胞がフィルターの孔を抜けにくくすることが考えられる。ハーゲン・ポワズイユの法則の式によれば、Ｑを流量、ηを粘性、Ｌを膜厚、ｄを孔半径と置くと、フィルターのひとつの真円孔の上下で生じる圧力差（ΔＰ）は、Δｐ＝８ηＬ／πｄ⁴×Ｑとなり、同流量において、フィルターの孔径をφ８ｕｍからφ９μｍやφ１０ｕｍにすると、圧力差（ΔＰ）は、約０．６倍や約０．４倍になり、捕捉増大が期待できる。しかし孔を１０μｍより大きくすれば、変形しやすい細胞を捕捉できるようになっても、サイズの小さいがん細胞の捕捉可能性が低下する。また、単位時間あたりに流れる液体の量（流量）を小さくし、フィルター孔にかかる負荷を緩和することで、捕捉率を向上させる対策が考えられるが、実際に試してみると、変形能の高い細胞では、捕捉率が低下する場合があることが分かった。

ここで、粘弾性の違いでがん細胞と白血球とを分離する技術が開示されている〔特許文献４〕。この文献に記載の発明は、白血球は変形して自身の孔よりも小さい孔を抜けることができる一方で、がん細胞は血球に比べ変形しにくいため、自身より小さい孔を容易には通り抜けないことを利用している。この文献によれば、血球よりも目的細胞が硬い場合には、分離が容易となる。しかし実際には、直径１０μｍ以上もの細胞サイズでありながら、直径５μｍ〜６．５μｍの円形のフィルター孔を容易に通り抜けてしまうほどに変形能の高いがん細胞も存在する。このようながん細胞がフィルターを通り抜けてしまわないよう前記特許文献３に記載の方法のように、孔を小さくすることが対策として考えられるが、前述の問題を生じる。さらに興味深いことには、実際に、発明者の実験により、１ｍｌという少量の血液では高い捕捉を達成できた同じ条件で、変形能の高い細胞において、血液検体の処理量に応じて捕捉率が悪くなる結果が認められた。

ところで、このような場合に捕捉率を向上させるために、前もって血液にパラホルムアルデヒドなどの固定化液を加えて細胞を硬くして分離する方法が考えられる（例えば、非特許文献７−８、１０）。しかし、このような方法では、血液を希釈して粒子密度を薄くし、かつろ過面積を大きくするなど、目詰まりしにくくする対策が別途必要となり、煩雑さを増す。また白血球も固定化によってフィルターを通り抜けにくくなるため、この対策としてフィルター孔のサイズを拡大する必要があり、変形しやすいがん細胞を捕捉しようとすれば、小さいがん細胞が抜けてしまうという結果となる。又、このような固定化法によれば、血液のろ過処理の際、詰まりが生じないよう高い圧力をかける必要があるが、目的の細胞がフィルターを抜けたり、目的の細胞を破壊してしまう問題も生じる。すなわち、固定化法による場合、単に孔を小さくすることはできず、孔あたりろ過面積あたりの血液処理量の低下、圧の増大、廃液量の増加や劇物使用の問題がある。そして、生きたまま細胞を捕捉・解析することができない。

以上のように、従来の方法ではフィルターのろ過サイズや枚数を抑制しつつ、固定化することなく多くの血液を処理し、１０μｍの孔径では抜けてしまうがん細胞や、直径φ５μｍ〜６．５μｍの円形の孔では変形して抜けてしまうようながん細胞を、生きたまま捕捉することは、達成困難である。

本開示は、一又は複数の実施形態において、血液検体中に稀少細胞が存在する場合に、メンブレンフィルターにおける、孔の形状および面積ならびに孔数を適宜の値に設定したフィルターを使用すること、又は、孔の形状および面積ならびに孔数から孔あたりの血液容量を決めることで、１０μｍの孔径では、細胞サイズが当該孔径より小さいために孔を通り抜けてしまう小型の稀少細胞や、孔あたり血液検体処理量が１４ｎｌ以上で孔あたり５ｎｌ／ｍｉｎ〜２０ｎｌ／ｍｉｎで全血を送液した際にφ５μｍ〜６．５μｍの真円孔では抜けてしまう変形しやすい稀少細胞の捕捉率を向上することができ、フィルターにおける検体濾過に使用する部分の面積（フィルターのろ過面積）を抑制しつつ、生きたまま前記細胞を捕捉できる血液検体の迅速で簡便な処理方法を提供する。

ここで、前記孔数の設定は、以下の式１に従い、その適切な範囲を決定することができる。
式１：「孔数（個）＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１７０〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１０
一方、適切な全合計孔面積は、以下の式２に従い、その範囲を決定することができる。
式２：全合計孔面積（ｕｍ²）＝トータル血液検体処理量（ｎｌ）／３．４（ｎｌ／ｕｍ²）〜トータル血液検体処理量（ｎｌ）／０．２（ｎｌ／ｕｍ²）」

本開示は、また、その他の一又は複数の実施形態において、血液検体中に稀少細胞が存在する場合に、稀少細胞の捕捉率を向上できる血液検体の処理方法を提供する。

本開示は、一又は複数の実施形態において、短軸直径が３．０μｍ以上１５μｍ以下で、長軸直径が、前記短軸直径に対し１．１倍〜３倍の楕円形、又は、該楕円を含み該楕円と該楕円の長軸の両端を含む少なくとも２点で接する形状の孔を、少なくとも２００個／ｍｍ²〜４００００個／ｍｍ²の孔密度で含むフィルターを用い、以下（１）または（２）を特徴として含む、血液検体中の稀少細胞を分離又は検出する方法に関する。：
（１）「式１：孔数（個）＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１７０〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１０」式で得られる孔数、又は、「式２：全合計孔面積＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／３．４（ｎｌ／ｕｍ²）〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／０．２（ｎｌ／ｕｍ²）」の式で得られる孔面積をもつフィルターを使用すること；又は
（２）前記フィルターの孔に対するフィルター処理容量が血液に換算して１０〜１７０ｎｌ／孔以下の容量となるように血液検体をフィルター処理して稀少細胞を分離又は検出すること。

本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、前記稀少細胞が、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である、前記血液検体中の稀少細胞を分離又は検出する方法に関する。

本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、前記稀少細胞について、放射性物質を利用した検出方法、発光現象を利用した検出方法、色素を用いた検出方法、磁性を利用した検出方法、電気的検出方法、光学的検出方法、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される検出方法に付随する標識方法を用いて標識すること含む、前記血液検体中の稀少細胞を分離又は検出する方法に関する。

本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、前記血液検体中の稀少細胞を分離又は検出する方法で稀少細胞を分離又は検出した後、該細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することを含む、血液検体中の稀少細胞の分析方法に関する。

本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、短軸直径が３．０μｍ以上１５μｍ以下で、長軸直径が、前記短軸直径に対し１．１倍〜３倍の楕円形、又は、該楕円と該楕円の長軸の両端を含む少なくとも２点で接する形状の孔を、少なくとも２００個／ｍｍ²〜４００００個／ｍｍ²の孔密度で含むフィルターに関する。

本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、供給口と排出口、及び前記供給口と前記排出口を連通する流路が形成され、前記流路の一部に相当する位置に、前記フィルターとフィルター保持部を含む分離部を有することを特徴とする、検体中に含まれる稀少細胞を捕捉するための稀少細胞捕捉装置に関する。

本開示によれば、一又は複数の実施形態において、ろ過面積を抑えつつ、変形し易く抜けやすいがん細胞やサイズの小さながん細胞を生きたまま捕捉できる。また、本開示によれば、一又は複数の実施形態において、血液検体中に稀少細胞が存在する場合に、稀少細胞の捕捉率を向上できる。

図１は、フィルターの写真を示す。図２は、稀少細胞捕捉装置の概要を示す。図３は、孔面積の違いによる細胞の捕捉率への影響を示す。図４は、孔あたりの血液検体のフィルター容量の違いによる細胞の捕捉率への影響を示す。図５は、血液量処理量が多くなるとフィルター種類や細胞の種類によらず捕捉率が低下する傾向を示す。図６は、送液条件の違いによる細胞の捕捉率への影響を示す。図７は、孔あたりの血液量とフィルターの種類、孔密度、材質における変形細胞の捕捉率を示す。図８は、孔あたり108nlの各がん細胞の捕捉率を示す。図９は、孔の径を説明する概略図である。

循環腫瘍細胞（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＣｅｌｌ：ＣＴＣ）等の血液中の稀少細胞の分析は、今後さらに盛んに行われることが予想され、より簡便でロスの少ない方法が求められている。１０ｍｌの血液中には、通常、赤血球が数百億個、白血球は数千万個が含まれているが、ＣＴＣは、０〜数千個程度である。したがって、ＣＴＣをそのまま解析するには技術的課題が多く、例えば、濃縮分離などの処理が必要となる。そのため、血液の中から、より効率的及び／又は簡便にＣＴＣを濃縮分離する技術の開発が期待されている。

本開示は、一又は複数の実施形態において、血液検体をフィルター処理する際に、フィルターの孔の形状及び大きさを調節すること、および、「孔数（個）＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１７０〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１０、又は全合計孔面積（ｕｍ²）＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／３．４（ｎｌ／ｕｍ²）〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／０．２（ｎｌ／ｕｍ²）」の式で得られる孔数をもつフィルターを使用すること又は、フィルターの孔に対して通過させる血液検体の容量を、「トータル血液検体処理容量（ｎｌ）＝全合計孔面積（ｕｍ²）×０．２（ｎｌ／ｕｍ²）／〜全合計孔面積（ｕｍ²）×３．４（ｎｌ／ｕｍ²）」により調節することで、血液検体中に含まれうる稀少細胞（サイズが比較的小さい細胞や変形しやすい細胞を含む）を生きたまま捕捉できる知見に基づく。

すなわち、本開示は、一態様において、血液検体の処理方法であって、前記試料をフィルター処理することを含む方法（以下、「本開示にかかる処理方法」ともいう）に関する。

［血液検体］
本開示において、「血液検体」とは、本開示にかかる処理方法を適用されうる、血液を構成する成分を含有する試料を意味し、血液、赤血球成分を含む血液由来物、血液又は血液由来物が混在する体液や尿、及び、これらから調製された試料等が挙げられる。本開示において、フィルターの孔１個あたりに通過させる血液検体の容量は、人体から採血された血液、すなわち、１ｕｌあたり、１０００〜２００００個の白血球細胞を含む血液を基準とする。よって、希釈した血液検体を使用する場合、当該希釈血液検体を白血球数に基づき希釈前の血液検体容量に換算できる。すなわち、たとえば、１０倍希釈の血液検体を処理する場合、「Ｘ」μｌ／孔の容量の前記希釈血液検体を処理することは、「Ｘ／１０」μｌ／孔の容量の前記希釈血液検体を処理することに相当する。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、前記生体としては、ヒト又はヒト以外の動物（例えば、哺乳類）が挙げられる。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって赤血球成分を含むもの又はそれらの希釈／濃縮物が挙げられ、例えば、血漿が除かれた血球画分や、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理し、赤血球の成分を除去した試料又は溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球、特定の画分などを含む。これらのなかでも、限定されない一又は複数の実施形態においては、簡便かつ迅速な処理の観点及び血液中の稀少細胞に対するダメージ抑制の観点から、前記血液を含む試料としては血液又は血球成分を含む血液由来の血球が好ましい。

［稀少細胞］
本開示において、血液中又は血液検体中に含まれうる「稀少細胞」とは、ヒト又はヒト以外の動物の血液中に含まれ得る細胞成分（赤血球、白血球、及び血小板）以外の細胞をいい、腫瘍細胞及び／又はがん細胞を含む。一般に血液中に循環する腫瘍細胞やがん細胞をＣＴＣという。血液中の稀少細胞数としては、検体にもよるが血液１０ｍｌ中に数個から数十個、多くて数百〜千個含まれている場合がある。「稀少細胞」は、一又は複数の実施形態において、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である。

血液検体中に存在する稀少細胞及び／又はＣＴＣには、直径φ１０ｕｍ程度で捕捉できる大型の細胞、前記の孔サイズ（直径φ１０μｍ程度の孔では孔から抜けてしまう小型の細胞、又は、直径φ５μｍ〜６．５μｍの孔サイズの孔あたり５ｎｌ／ｍｉｎ〜２０ｎｌ／ｍｉｎで全血を送液した際に変形して孔から抜けてしまう、変形しやすい細胞が、含まれうる。本発明は、一又は複数の実施形態において、血液検体中に含まれうる変形しやすい大きな稀少細胞と大きさの小さい稀少細胞の一方又は双方を、所定のフィルターを用いて分離及び／又は捕捉できる処理方法に関する。

［フィルター容量］
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理において、フィルターの孔数、又は、フィルター容量（すなわち、フィルターを通過させる血液検体の量：トータル血液検体処理容量と記載する）は、「孔数（個）＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１７０〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１０」、又は「全合計孔面積（ｕｍ²）＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／３．４（ｎｌ／ｕｍ²）〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／０．２（ｎｌ／ｕｍ²）」によって規定できる。一又は複数の実施形態において、稀少細胞の捕捉率を維持する観点から、フィルター容量は、フィルターの孔１個あたりに対して０．００５μＬ／孔以上、０．０１μｌ／孔以上、０．０１４μｌ以上、０．０１５μｌ／孔以上、０．０２μｌ／孔以上である。また、フィルター容量は、一又は複数の実施形態において、一度に多くの検体を処理する観点、フィルターのろ過面積を抑える観点、及びフィルターを詰らせることなく細胞を変形し易い細胞や小さな細胞を捕捉する観点から、１μｌ／孔以下、０．２μｌ／孔以下、０．１７０μｌ／孔以下、０．１６３μｌ／孔以下、０．１０８μｌ／孔以下、又は、０．０５４μｌ／孔、０．０２８μｌ／孔、０．０１４μＬ／孔以下である。ここで、フィルターは多数の孔を含むところ、フィルターの孔１個あたりの血液検体の量は、当該フィルターに対して処理する血液検体の量をフィルターの孔の個数で割った平均値を意味する。発明者は、フィルター容量を調節することで、変形しやすい細胞を取得することが可能となることを見出した。

本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理において、フィルター容量は、一又は複数の実施形態において、「トータル血液検体処理容量（ｎｌ）＝孔数（個）×１０〜孔数（個）×１７０、又はトータル血液検体処理容量（ｎｌ）＝全合計孔面積（ｕｍ²）×０．２（ｎｌ／ｕｍ²）〜全合計孔面積（ｕｍ²）×３．４（ｎｌ／ｕｍ²）」によって規定できる。５ｍｍ²〜１００００ｍｍ²のろ過面積に対して、０．０７ｍｌ以上、０．２５ｍｌ以上、０．５ｍｌ以上、１ｍｌ以上、１ｍｌより多い量、２ｍｌ以上、３ｍｌ以上、又は、４ｍｌ以上である。また、フィルター容量は、一又は複数の実施形態において、稀少細胞の捕捉率を維持する点から、５ｍｍ²〜１００００ｍｍ²のろ過面積に対して、６Ｌ以下、４Ｌ以下、２Ｌ以下、４００ｍｌ以下、２００ｍｌ以下、１００ｍｌ以下、８０ｍｌ以下、５０ｍｌ以下、３０ｍｌ以下、２５ｍｌ以下、１２ｍｌ以下、１１ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、９ｍｌ以下、８ｍｌ以下である。或いは、フィルター容量は、一又は複数の実施形態において、一度に多くの試料を処理する観点、変形しやすい細胞を捕捉する観点及び稀少細胞の捕捉率を維持する点から、１５ｍｍ²〜２００ｍｍ²のろ過面積に対して、０．２ｍｌより多く１３０ｍｌ、０．８ｍｌ〜９０ｍｌ、０．８ｍｌ〜６０ｍｌ、２ｍｌ〜５０ｍｌ、２ｍｌ〜４０ｍｌである。

［フィルターの孔］
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理に使用するフィルターの孔の形状は、特に限定されず、一又は複数の実施形態において、円形、楕円形、矩形、対称多角形、非対称多角形、不規則な形状、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される形状である。フィルターの孔の形状は、稀少細胞の捕捉率を向上する観点から、一又は複数の実施形態において、短軸直径の長さが３．０μｍ以上１５μｍ以下で長軸直径の長さが前記短軸直径に対し１．１倍〜３倍の楕円形、又は、該楕円を含み該楕円と該楕円の長軸をはさむ少なくとも２点で接する形状である。「楕円を含み該楕円と該楕円の長軸の両端を含む少なくとも２点で接する形状」は、一又は複数の実施形態において、楕円様の形状であって、該楕円に該楕円の長軸の両端を含む少なくとも２点で外接する円形、矩形、対称多角形、非対称多角形、不規則な形状、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される形状が挙げられる。なお、本開示において、孔の長径又は長軸直径とは、一又は複数の実施形態において、孔を楕円としたときの長軸の長さをいい、孔の短径又は短軸直径とは、一又は複数の実施形態において、孔を楕円としたときの短軸の長さをいう。孔の長径と短径が同じときは、孔は円又は円のような形状といえる。本開示において特に言及がない場合、「φａｘｂ」は、孔が、長径がａμｍ短径がｂμｍである楕円であることを示し、「φｃ」は、孔が直径ｃμｍの円であることを示す（図９）。

フィルターの孔における楕円の短軸直径は、サイズの小さい稀少細胞の捕捉率を向上させる観点から、一又は複数の実施形態において、３．０μｍ以上、４．０μｍ以上又は５．０μｍ以上であり、同様の観点から、１５．０μｍ以下、８．０μｍ以下、８．０μｍ未満、７．５μｍ以下、７．０μｍ以下又は６．５μｍ以下である。ここで、サイズの小さい稀少細胞は、一又は複数の実施形態において、直径約１０μｍの真円孔では抜けてしまう大きさの小型の稀少細胞が挙げられる。

フィルターの孔における楕円の長軸直径は、サイズが大きく変形しやすい稀少細胞の捕捉率を向上させる観点及びフィルター容量を増加させる観点から、一又は複数の実施形態において、前記短軸直径に対し１．１倍〜３倍、１．２倍〜２．８倍、１．３倍〜２．６倍である。本開示は、一又は複数の実施形態において、楕円の短軸直径を上記の範囲とし、かつ、楕円の長軸直径を上記の範囲とした場合に、フィルター容量を調整することで稀少細胞の捕捉率が向上するという驚くべき効果に基づく。すなわち、楕円の短軸直径を上記の範囲とすることで、大きさの小さい稀少細胞の捕捉率を維持し、かつ、長軸方向に楕円を伸ばしてフィルター容量を調整することで、変形しやすい稀少細胞の捕捉率を向上できる。

本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理に使用するフィルターは、一又は複数の実施形態において、前述の規定に合わない孔を、フィルター処理に影響を及ぼさない範囲で有してもよい。或いは、該フィルターは、一又は複数の実施形態において、ほぼ均一な孔を有するフィルターである。

［メンブレンフィルター］
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理に使用するフィルターは、一又は複数の実施形態において、メンブレンフィルターである。該メンブレンフィルターは、大きさの小さい稀少細胞の捕捉率を維持する観点、また、変形しやすい稀少細胞の捕捉率を向上する観点、およびろ過面積抑制の観点から、一又は複数の実施形態において、上述した短軸直径及び長軸直径の範囲の楕円形、又は、該楕円を含み該楕円と該楕円の長軸をはさむ少なくとも２点で接する形状の孔を有する。該メンブレンフィルターの孔１個の面積は、サイズの小さい稀少細胞の捕捉率を維持する観点、変形しやすい稀少細胞の捕捉率を向上する観点、およびろ過面積抑制の観点から、一又は複数の実施形態において、１５μｍ²〜２５０μｍ²、２０μｍ²〜１５０μｍ²又は３０μｍ²〜１００μｍ²、４０μｍ²〜８０μｍ²である。

該メンブレンフィルターにおける前記孔の孔数は、処理する血液検体容量から「孔数（個）＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１７０〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１０、又は、全合計孔面積＝トータル血液検体処理容量／３．４ｎｌ〜トータル血液検体処理容量／０．２ｎｌ／ｕｍ²」によって定められる。特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、試料が通過する領域において、孔あたりの血液量に応じて適宜設定できる。
血液０．１ｍｌを処理するのであれば、６００個以上、より望ましくは、９００個以上、１２００個以上、１、８００個以上、１ｍｌであれば、６，０００個以上、より望ましくは、９，０００個以上、１０、０００個以上、１２，０００個以上、１８，０００個以上、５ｍｌ以上を処理するのであれば、２９，４００個以上、より望ましくは、４６，０００個以上、９２，０００個以上、１７８，０００個以上あればよい。１０ｍｌを処理するのであれば、６１，０００個以上、より望ましくは、９２，０００個以上、１２０，０００個以上、１８５，０００個以上、３５７，５００個以上あればよい。１００ｍｌを処理するのであれば、６１０，０００個以上、より望ましくは、９２０，０００個以上、１２００，０００個以上、１，８５０，０００個以上である。血液中に存在する稀少細胞の存在する確率から適宜選べばよい。１ｍｌ以下を処理する場合は、８割以上を捕捉できるほうが望ましく、１ｍｌ以上に血液量が増える場合は、８０％〜５０％以上の捕捉率が得られる孔数を設定すればよい。

大きさの小さい稀少細胞の捕捉率を維持する観点、また、変形しやすい稀少細胞の回収率を向上する観点、およびろ過面積抑制の観点から、該メンブレンフィルターにおける前記孔の孔数は、一又は複数の実施形態において、１ｍｍ²あたりの孔が３００個〜４００００個、３００個〜７０００個、５００個〜４０００個、７００個〜４０００個、８００個〜３９９９個、９００個〜３９００個、１０００個〜３９００個の孔密度である。また、該メンブレンフィルターの厚みは、一又は複数の実施形態において、１〜１００μｍ、１〜５０μｍ、１〜３０μｍ又好ましくは１〜２０μｍであり、より好ましくは１〜１０μｍである。

メンブレンフィルターの孔の形状、孔数、孔密度、面積は、例えば、光学顕微鏡、レーザー顕微鏡、電子顕微鏡によって測定でき、具体的には実施例の方法で測定できる。例えば、レーザー顕微鏡を用い、対物レンズ倍率１０〜１００倍にて孔の大きさを測定することが可能である。

本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理に使用するメンブレンフィルターの種類としては、一又は複数の実施形態において、シート状の材料に、実質的に均一な貫通孔が開いたフィルターが望ましく、素材の種類は問わない。たとえば、ポリカーボネート（ＰＣ）、パリレンメンブレンフィルター、ニッケル（Ｎｉ）などの金属フィルター等が挙げられる。またフィルター上での細胞を観察する際は、観察する際に使用する色素や蛍光染色などに応じてプラスチックや金属、ガラス素材を選択することが望ましく、これらの組合せから成るものであってもよい。

［フィルタリング条件］
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理は、一又は複数の実施形態において、上述したフィルターを流路内に組み込み、流路に血液を導入することによりＣＴＣを捕捉することができる。特に規定はないが送液可能な駆動力があればよい。たとえば流路への血液の導入には、流路の入り口方向からの加圧を用いる方法、流路の出口方向からの減圧を用いる方法、シリンジポンプやぺリスタルティックポンプを使用する方法等が例示できる。流路への血液の導入のため、例えば、フィルターの孔あたり、５μｍ／ｍｉｎ〜６００μｍ／ｍｉｎの流速（０．２５ｎｌ／ｍｉｎ〜３０ｎｌ／ｍｉｎの流量）で血液検体を送液することで、従来例と比較して短時間で適切に、稀少細胞を捕捉することが可能である。

上記血液検体の送液条件は、好ましくは、５μｍ／ｍｉｎ〜６００μｍ／ｍｉｎの流速（０．２５ｎｌ／ｍｉｎ〜３０ｎｌ／ｍｉｎの流量）であり、より好ましくは１０μｍ／ｍｉｎ〜４８０μｍ／ｍｉｎの流速（０．５ｎｌ／ｍｉｎ〜２４ｎＬ／ｍｉｎの流量）であり、さらに好ましくは２０μｍ／ｍｉｎ〜３６０μｍ／ｍｉｎの流速（１ｎｌ／ｍｉｎ〜１８ｎＬ／ｍｉｎの流量）、より好ましくは、２０μｍ／ｍｉｎ〜１２０μｍ／ｍｉｎの流速（１ｎｌ／ｍｉｎ〜７ｎＬ／ｍｉｎの流量）である。
フィルターデバイスおよび流路全体の系にかける圧力差（系の入口から出口までの圧力差）（ΔＰ₁）は、とくに制限はされないが、好ましくは、３．７ｋｐａ以下、より好ましくは２．６ｋｐａ以下であり、さらに好ましくは１．３ｋｐａ以下である。

上記血液検体の送液条件は、フィルターを境に上下で生じる圧力差（ΔＰ₂）については、１１０Ｐａ以下、好ましくは、１００Ｐａ以下であり、より好ましくは７０Ｐａ以下であり、又は５０Ｐａ以下であり、さらに好ましくは３０Ｐａ以下、１５ｐａ以下である。算出方法としては、Ｑ：全孔合算平均流量、ｄ：半径、Ｌ：孔の流路長、η：送液する液体の粘性、π：円周率Ｎ₀：孔数として、真円では、ΔＰ₂＝Ｑｘ８ηＬ／（πｄ⁴ｘＮ₀）で求められ、各孔の形状に基づいて公知の計算方法で得られる。血液は非ニュートン性液体であり、また同じ圧力差であっても、Ｈｃｔの違いによる粘性によって平均流速が変わる。このため平均流速は一定範の囲をもつ。全血を使用する際の圧力差のΔＰ₂設定においては、便宜上η＝４．５ｍＰａ・Ｓの値を用いて、計算上前記記載のΔＰ₂の値に入るように送液や圧力の設定をすればよい。希釈等で血液検体のヘマトクリット値（Ｈｃｔ）が２０未満の場合、η＝１〜２ｍＰａ・Ｓの値を用いて計算上前記記載の値に入るようにすれば設定すればよい。もしくは血漿やヘマトクリット（Ｈｃｔ）による粘性影響が小さくなくなるまで希釈する場合（たとえば全血を４〜１０倍希釈する場合）は、その希釈液の粘性に合わせて計算し送液してもよい。シリンジポンプ等を用いて定流量送液をする場合は、前記ΔＰ₂に入るように送液すればよい。このような送液条件は、当業者に周知の一定の圧で送液可能な機構や、一定流量で送液可能な機構を用いて実現できる。

［血液成分含有試料中の稀少細胞の分離又は検出方法］
本開示にかかる処理方法におけるフィルター処理を行うことにより、血液成分含有試料をろ過した後のフィルター上に、稀少細胞（もし存在すれば）が残ることとなり、稀少細胞が分離又は検出できる。したがって、本開示は、その他の態様において、本開示にかかる処理方法で血液検体を処理して稀少細胞を分離又は検出することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞を分離又は検出する方法に関する。

［血液中の稀少細胞に対する標識処理］
本開示にかかる処理方法において、血液中の稀少細胞に対する標識処理を処理後に分離しても並行しても、分離後に行ってもよい。稀少細胞の標識は、上述した本開示にかかる分離又は検出方法、及び、後述するＣＴＣ数測定方法に有用であり、また、分離後の稀少細胞の分析に有用となりうる。したがって、本開示にかかる処理方法は、一又は複数の実施形態において、標識処理を含む。また、稀少細胞の標識は、後述するＣＴＣ数測定方法に有用であり、また、分離後の稀少細胞の分析に有用となりうる。したがって、本開示にかかる分離又は検出方法は、一又は複数の実施形態において、標識処理を含む。

前記標識処理は、例えば、公知の標識試薬を稀少細胞に接触することにより行うことができ、典型的には、前記標識試薬を血液検体と混合することにより行うことができる。前記標識としては、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、放射性標識、蛍光色素標識、色素染色又は標識、磁気的標識、電荷的標識、及びこれらの組み合わせが挙げられ、それぞれに適した標識試薬により行うことができる。

すなわち、前記標識処理は、前記稀少細胞について、放射性物質を利用した検出方法、発光現象を利用した検出方法、色素を用いた検出方法、磁性を利用した検出方法、電気的検出方法、光学的検出方法、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される検出方法に付随する標識方法を用いて行うことができる。

本開示における処理方法において、稀少細胞の分離又は検出は、また、前記フィルターの変化を電気的、重量的、光学的に検出することでも達成できる。

［血液成分含有試料中の稀少細胞の分析方法］
本開示は、その他の態様において、本開示にかかる分離又は検出方法で稀少細胞を分離又は検出した後、該細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することを含む、血液成分含有試料中の稀少細胞の分析方法に関しうる。すなわち、本開示によれば、細胞を生きたまま捕捉できるため、本開示にかかる分離又は検出方法で稀少細胞を分離又は検出した後、該細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することが可能である。

［ＣＴＣ数測定方法］
血液中のＣＴＣ数と、がんの転移や予後に関係することが報告されており、がんの診断、予後診断、及び治療効果の予測又は判定の指標とするために研究が進められ、血中ＣＴＣ数を測定することが知られている。本開示にかかる処理方法及び／又は本開示にかかる分離又は検出方法によれば、稀少細胞であるＣＴＣへのダメージを抑制して分離することができる。またＣＴＣの核酸を測定してもよい。したがって、本開示はその他の態様において、血液検体を本開示にかかる処理方法で処理して稀少細胞を分離又は検出すること、及び／又は、本開示にかかる分離又は検出方法により前記血液検体からＣＴＣを分離することを含む、前記血液検体中のＣＴＣ数の測定方法に関する。なお、ＣＴＣ数の計測又はＣＴＣの核酸の測定は、例えば、適切な標識処理をした後にフローサイトメトリーにより分離と同時に行ってもよし、分離した細胞を顕微鏡下で観察して計測してもよい。また、がん細胞の形態学的、ＤＮＡやＲＮＡの量の点から、蛍光値から測定してもよい。

［フィルター］
本開示は、さらにその他の態様において、本開示にかかる処理方法、本開示にかかる分離又は検出方法、及び／又は本開示にかかるＣＴＣ数測定方法に用いるフィルターであって、短軸直径が３．０μｍ以上１５μｍ以下で、長軸直径が、前記短軸直径に対し１．１倍〜３倍の楕円形、又は、該楕円を含み該楕円と該楕円の長軸をはさむ少なくとも２点で接する形状の孔を、少なくとも２００個／ｍｍ²〜４００００個／ｍｍ²の孔密度で含むに関する。本開示にかかるフィルターの孔の形状等は、上述した本開示にかかる処理方法に用いられるフィルターと同様である。

［稀少細胞捕捉装置］
本開示は、さらにその他の態様において、検体中に含まれる稀少細胞を捕捉するための稀少細胞捕捉装置に関する。本開示にかかる稀少細胞捕捉装置は、一又は複数の実施形態において、供給口と排出口、及び前記供給口と前記排出口を連通する流路が形成され、前記流路の一部に相当する位置に、本開示にかかるフィルターを保持するフィルター保持部を含む分離部を有する。本開示にかかる稀少細胞捕捉装置によれば、本開示にかかるフィルターを用いて本開示にかかる血液検体の処理方法を行うことができる。

以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。

表１及び図１に示すフィルターと送液条件を用いて、血液検体の処理方法を実施した。

各種孔径について、長軸直径側、短軸直径側ピッチそれぞれを設計し、フィルターを作製した。またプラスチック素材のフィルターは、ポリカーボネート材質のΦ５μｍ孔やΦ８μｍ孔のトラックエッチメンブレンを用いた（ワットマン社）。フィルターの孔径の特定は、バブルポイント法や水銀圧入法を用いた細孔径分布評価装置による測定や蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡、電子顕微鏡などの光学顕微鏡を用い、公知の測定方法によって測定できる。具体的には顕微鏡を用いて直接カウントするか、面積あたりの孔数をもとめ、使用するろ過面積分を計算して求めた。

（がん細胞の調製方法）
常法に従い、シャーレに培養したヒト乳腺上皮癌（細胞株名ＭＣＦ−７）、ヒト結腸腺癌（細胞株名ＳＷ６２０）、ヒト前立腺癌（細胞株名ＰＣ３−９）、ヒト肺胞上皮癌（細胞株名ＮＣＩ−Ｈ３５８）、ヒト胃癌細胞（細胞株名ＭＫＮ−７）、肉腫（ＨＴ−１０８０）の培地上清を除去後、ＰＢＳ（−）で洗浄して、さらに上清を除去後、トリプシン（インビトロジェン社）処理（３７℃、３分）を行った。これに血清入り培地を加えて１５ｍｌ遠沈管に回収した。これを遠心機（ＣＲ２０Ｆ：日立）で遠心し、上清を除去した。これを再度血清入り培地に懸濁して回収した。なお、浮遊系であるヒト胃癌細胞株（細胞株名ＳＮＵ−１）と結腸腺癌細胞株（細胞株名ＳＮＵ−Ｃ１）は、トリプシン処理を行うことなく、１５ｍｌ遠沈管に回収した。またヒト結腸腺癌（細胞株ｃｏｌｏ３２０ＤＭ）は、浮遊細胞と一部接着している細胞があるため、浮遊している細胞は、１５ｍｌ遠沈管に回収し、接着している細胞は、他の接着細胞と同様にトリプシン処理後、同遠沈管に回収した。これを遠心後、血清入り培地を添加し懸濁し回収した。

（細胞数の調製）
がん細胞試料として、予め染色した胃がん、乳がん、大腸がん、前立腺がん、肺がん、肉腫由来のＳＮＵ−１、ＭＫＮ−７、ＭＣＦ−７、ＳＷ６２０、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ、ＳＮＵ―Ｃ１、ＰＣ３−９、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＨＴ−１０８０、を任意の数たとえば、０．５ｘ１０⁵Ｃｅｌｌｓ／ｍｌや１×１０⁵Ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製して使用した。ＳＮＵ−１細胞は、直径８μｍの孔に対し、他の細胞懸濁液に比べ、容易に抜けやすい細胞であったため、これを変形して抜けやすい細胞のモデルとした。ＳＷ６２０は上記細胞の中で最も小さい細胞であるため、小さい細胞のモデルとした。また、細胞の変形性については、トラックエッチメンブレン（ＰＣポリカーボネート φ８ｕｍ円／ろ過径φ１０ｍｍ）を用い、各細胞について孔数よりも多い過剰の細胞懸濁液を添加して目詰まりをさせ、フィルター下部にある廃液側流路が連通する密閉ボトルを陰圧にした際、目詰まりが解消して勢いよく流れ始めたとき、相対的に圧力が低い細胞を変形性の高い細胞として選んだ（表２）。

（稀少細胞捕捉処理）
図２に示す稀少細胞捕捉装置を用いて、細胞分離実験を行った。
前記稀少細胞捕捉装置は、検体や洗浄液、染色液等をフィルターに供給するための供給口１と排出口２、及び前記供給口と前記排出口を連通する流路３が形成され、前記流路３の一部に相当する位置に、フィルター４とフィルター４を保持するフィルターホルダー５を含む分離部を有する。詳しくは、フィルター４を支持部（ベース）６に設置し、Ｏリング７をフィルター４の上面に載せ、カバー８を載せて分離部を固定し、表に示す孔を有するフィルターデバイスを作製した。本例では、ろ過面積が、５ｍｍ²〜８０ｍｍ²の複数のフィルターを使用した。このデバイスの上部に接続部、および液の切り替えが可能な三方活栓を取り付け、サフィード延長チューブ（テルモ社製）で流路を形成した。流路３のフィルター４と反対側の端部側に供給口１が位置し、供給口１とフィルター４の間には、（一定の圧で送液可能な機構又は一定流量で送液可能な機構としての）加圧手段９を形成し、ろ過にかかる圧力、またはシリンジポンプで引いて一定になるよう、送液条件を設定した。廃液側は、サフィードと内径２ｍｍのチューブを連結し、末端を排出口２とした。

（送液条件の設定）
流路から廃液出口までをＰＢＳ（−）（組成：１Ｌ蒸留水中、塩化ナトリウム８０００ｍｇ、塩化カリウム２００ｍｇ、リン酸一水素ナトリウム（無水）１１５０ｍｇおよびリン酸二水素カリウム（無水）２００ｍｇを含有）で充填し、血液のろ過の際については、フィルターの孔数から孔あたり３０ｎｌ／ｍｉｎ以下（６００μｍ／ｍｉｎ以下）になるように圧力、又はシリンジポンプで設定した。なお、血液からがん細胞を分離後の流路の洗浄については、ＰＢＳ（−）１０００μＬ／ｍｉｎ（孔あたり１４ｎｌ／ｍｉｎ）程度になるように設定した。直径８μｍ、楕円９．８ｘ６．５μｍの孔を用いて設定した場合と流量の関係は〔表７〕の結果になった。この結果から、系全体のろ過圧を１．３ｋＰａ±０．１、又は孔あたりの血液量が１０８ｎｌの場合の孔あたりの流量が４〜７ｎｌ／ｍｉｎとなるように流量を設定したろ過条件を基本とした。各フィルターとの比較においては、前記基本条件で行い同じ圧を設定した。孔数によって条件は適宜設定される。

（検体処理の実施）
採血管（ＥＤＴＡ−２Ｋ）に採血した血液（白血球含有数３０００〜１００００／ｕｌ）の一部をシリンジにいれ、その後、任意の濃度のがん細胞懸濁液１０μＬをシリンジ中の血液中に添加後、残りの血液を加えて混合し、血液検体を調製した。この血液検体を稀少細胞捕捉装置の供給口に供給し、加圧手段により、孔あたりに必要な送液条件になるように以下の表４で示す圧力で血液検体の濾過を行った。濾過終了後、ＰＢＳ（−）を用いた洗浄を行い、ゆっくりと分離部の上で接続されている三方弁と接続部を取りはずし、フィルター上部にガラススライドをゆっくり乗せて、観察面を作製した。これを蛍光顕微鏡に設置し、フィルター上に残っている蛍光染色されたがん細胞を計数した。なお、本実施例の処理にて回収したがん細胞は回収後、培養できた。

上記処理において、がん細胞の染色は、次のように行った。すなわち、調製したがん細胞を培養液から回収した後、遠心機（ＣＲ２０Ｆ／日立製）で１５００ｒｐｍ、室温（２４℃）、３分間遠心した。上清を除去し、ＰＢＳ（−）を添加して細胞を懸濁する。このＰＢＳ（−）に懸濁した細胞を蛍光染色する。染色試薬としてＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（インビトロジェン）を使用した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（インビトロジェン）は生細胞の細胞膜も通過することができる試薬で、細胞内物質と反応し、蛍光物質に変換される。
ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒを１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させ、反応時の濃度を最終濃度０．５〜０．２５μＭになるように使用する。ＰＢＳ（−）中で３０〜４０分反応させた。各がん細胞に使用した染色試薬はグリーン、オレンジ、ブルーの蛍光を発するセルトラッカー（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎＣＭＦＤＡ）、（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅＣＭＲＡ）、（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＢｌｕｅＣＭＦ２ＨＣ）で適宜染色した。

また、がん細胞の回収率の算出は、がん細胞懸濁液を血液に添加しフィルター分離後、フィルター表面にある予め蛍光染色しているがん細胞をカウントした。また別途、血液に添加した量と同量の前記がん細胞懸濁液をマイクロプレートウェルに添加し、蛍光顕微鏡でがん細胞数をカウントした。マイクロプレートウェル内の細胞数を分母とし、フィルター上に残ったものを分子として計算し捕捉率を算出した。

（フィルター上での細胞染色と活性）
ＰＣ３細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒで事前に染色しなかったこと以外は上記の通り、血液からＰＣ３を分離後、供給路側からＰＢＳで調製した１ｍＭ５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を添加し、反応させ、フィルター上のＰＣ３細胞内の酵素の活性を用いたＡＬＡの代謝によるプロトポルフィリンＩＸ変換と蓄積のよる蛍光染色を行った。これ以外にＣＤ４５等の抗体で白血球の染色、生きた細胞でも染色可能なヘキストによる核染色を行った。結果８１％のＰＣ３がプロトポルフィリンＩＸ由来の蛍光発光が観察され、活性を確認できた。これはがん細胞ではクエン酸回路で使用されるヘムの合成代謝経路において、代謝が抑制され、ヘムに代謝される直前のプロトポルフィリンＩＸ（赤色蛍光物質）が生成されると考えられている。この方法を利用して、プロトポルフィリンＩＸの前駆物質である５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）をがん細胞に添加することによって、赤色蛍光物質であるプロトポルフィリンＩＸを蓄積させ、がん細胞特異的に蛍光検出する事が出来ることが知られている。

稀少細胞捕捉処理の結果を表３〜９に示す。

表３〜７から、本開示のフィルターにおいて、単に孔を小さくするのではなく、孔形状、一定の孔面積と孔あたりの血液量、孔あたりの血液流量を制御して本開示のフィルター容量で血液検体を処理した場合に、小サイズの小さな細胞や変形しやすい細胞を生きたまま取得できることが分かる。また表８から、ろ過面積の違い、孔密度やの違い、孔数の違い、血液検体量が異なっても、変形しやすい細胞の捕捉効果を得られることは驚きである。
孔数の違い、孔密度の違い、ろ過面積の違い、血液処理量の違いのデータは、表８に記載。

実施例１：
以下の本実施例により、同じ孔数、同じろ過面積をもつフィルターで血液検体容量が孔あたり１４ｎｌ（トータル血液検体処理容１ｍｌ）を処理した場合、１０μｍを抜ける小型の細胞は、孔の形状に依らず細胞より小さい孔であれば全般的に回収率が高い一方、変形しやすいがん細胞は、孔が小さい場合、回収率が悪くなった。トータル血液検体処理容量１ｍｌでの各孔の捕捉性能を比較したデータを表３及び図３に示した。以下の表のとおり、変形しやすいがん細胞については、孔の面積が小さい場合、真円でも楕円でも捕捉率が著しく落ちることが確認され、さらに孔φ４μｍでは血液検体容量を孔あたり１４ｎｌとした場合のトータル血液検体処理容量まで達せず目詰まり（閉塞）を生じることがわかった。すなわち、孔面積が小さい場合、特に、変形しやすい細胞の捕捉率に悪影響を及ぼし、これに対し長軸を伸ばすことで捕捉率の改善が見られ、単に孔小さくするだけは、変形しやすい細胞における捕捉率の問題を解決できないことがわかる。さらに前記文献で記載されているとおり、φ１０μｍや１１μｍで抜けてしまうような小型がん細胞もφ１２．７μｍｘ５μｍの楕円のように短径側を短くすることで捕捉できることがわかる。少なくとも３３ｕｍ²以上の孔面積であれば、真円でも楕円であっても変形しやすい細胞は高い捕捉率が得られる。

実施例２：
本フィルターの血液検体処理量を検討した。同じろ過面積で多くの血液を処理できれば、そうでない場合（従来）と比較して、用いるフィルターのろ過面積を抑制でき、装置における濾過処理部の嵩を抑制でき、また、コストメリットがある。１ｍｌの血液で捕捉率のよかったφ８、φ９．８ｘ６．５、φ１２．７ｘ５のフィルターについて２５ｍｌまでのＳＷ６２０細胞とＳＮＵ−１細胞の捕捉率の平均データを表４、表５、プロットした図を図４に示す。驚いたことに、本フィルターにおいては、ろ過面積が２０ｍｍ²において、血液２５ｍｌ（ろ過時間５０〜７０ｍｉｎ）まで目詰まり（閉塞）することなく処理でき、小型のがん細胞は、高い捕捉率を維持することができた（表４）またφ５μｍのフィルターは目詰まりを生じた。

ＳＷ６２０細胞は血液量の影響が少なく捕捉性能を維持しているが、比較的変形しやすいがん細胞であるＳＮＵ−１においては、血液の量が増えるほど捕捉率の低下が認められた（表５）。孔あたりの血液検体処理量を考慮せず、細胞の大きさだけで血液からフィルター処理しようとすると、変形しやすいがん細胞を含んだ血液では捕捉性能が得られない。すなわち、我々は稀少細胞の捕捉において、目詰まり（閉塞）を生じなくても、孔数に対する血液検体処理量には、適切な量があることを見出した。血液検体処理量と捕捉率の観点から孔あたり１０ｎｌ〜１７０ｎｌとなるよう血液検体処理量と孔数を適宜設定すれば、変形しやすい細胞について高い捕捉率が得られることを見出した。各孔のフィルターの捕捉率および、プロット図を図４に示す。なお、血液が多くなると捕捉率が減る傾向は、程度はあれ細胞の種類やフィルターの種類に依らず認められた（表６、図５）。

実施例３：
次に、フィルター処理時のろ過圧を変動させた場合の細胞捕捉率データを以下に示す。一般的に、高圧にすれば、細胞が抜けやすくなると考えられるため捕捉性能が落ち、低圧にすればフィルターの孔を細胞が通り抜けにくくなり、細胞捕捉率の改善が期待できる。しかしながら、表７−１のように孔あたり１０８ｎｌ、φ８や、φ９．８×６．５において、特に低圧側で、捕捉率が安定せず、捕捉率の低下がみられた。これは、濾過時間が長すぎるために、細胞の粘弾性により、かえって細胞が抜けてしまったためと考えられる。

次に、孔あたり１０８ｎｌの血液検体処理容量（トータル血液検体処理容量を８ｍｌ）と孔あたり１４ｎｌの血液検体処理容量（トータル血液検体処理容量を１ｍｌ）に対し、ろ過圧を変動させたデータを以下に示す。表７−２のように、孔あたり血液検体処理容量を減らすことよって、より速いろ過流量、より高い圧力でも捕捉できるようになることがわかった。孔あたりの血液検体処理容量に応じて送液条件を適宜決めてよい。つまり孔あたり１４ｎｌ〜１０８ｎｌにおいて、孔あたり３０ｎｌ／ｍｉｎ以下、又は、３．７ｋｐａ以下（もしくはΔＰ₂₌１００Ｐａ以下）になるように適宜設定すれば高い細胞捕捉率が得られることがわかる。たとえば、孔あたりの血液検体処理容量１４ｎｌの場合、系全体の圧力差が１．３ｋｐａ（孔あたり流量１４ｎｌ／ｍｉｎ〜１７ｎｌ／ｍｉｎ）で血液１ｍｌを１ｍｉｎ程度でろ過でき、小型のがん細胞と変形しやすい細胞の高い捕捉率を達成できる。孔あたり血液検体処理容量を適宜設定することで、以下従来法（１ｍｌの血液検体を５分程度、８ｍｌの血液検体を４０分程度で処理）と比べて多量の血液検体から稀少細胞を、より短時間で回収できることが分かる。血液は時間とともに劣化していくため、短時間に処理できればできるほどよく、新鮮な稀少細胞の取得でき、解析に良好な影響を及ぼす。

送液条件の一定圧力と、流量と、回収率の関係を表７及び図６に示す。

表７−１，表７−２より、本開示の送液条件において、孔あたりの血液量１４〜１０８ｎｌにおいて適宜設定した量に対し、孔あたりの血液量に応じて系全体の圧力差３．７ｋｐａ以下、又はフィルターをはさんだ上下の圧力が１００Ｐａ以下、もしくは孔あたりの流量３０ｎｌ／ｍｉｎ以下となるように流量を設定することで高い捕捉率が得られる。

ろ過面積、孔数、孔密度の異なるフィルターで表８−１に示すろ過条件（表８−１）で、孔あたりの血液検体処理容量を１４ｎｌ〜１０８ｎｌとした場合の、各フィルターのＳＮＵ−１細胞を捕捉したデータの比較を以下に示す（表８−２）。プロットしたものを図７に示す。孔数に応じて検体の容量を設定すれば、または孔あたりの血液量を設定すれば、フィルターの材質、孔数、密度に関係なく変形しやすい細胞を捕捉することができることがわかる。また目的の処理量に対し適切な孔数を設定することができ、ろ過面積も抑制することができる。

血液検体処理容量が孔あたり１０８ｎｌを送液した場合のがん細胞の種類と捕捉率の関係をまとめた結果の一例を表９及び図８に示す。また孔あたり１０８ｎｌ以下でも高い捕捉率が得られる。

表９および図８より、本開示の方法により、多様ながん細胞を効率的に回収できることが分かる。

本開示は、血液中の稀少細胞の回収、測定、分析の分野で有用であり、例えば、医学や薬学の学術分野、及び／又は治療・診断等の医療の分野で有用である。

Claims

短軸直径が３．０μｍ以上１５μｍ以下で、長軸直径が、前記短軸直径に対し１．１倍〜３倍の楕円形、又は、該楕円を含み該楕円と該楕円の長軸の両端を含む少なくとも２点で接する形状の孔を、２００個／ｍｍ²〜４００００個／ｍｍ²の孔密度で含むフィルターを用い、前記フィルターの孔に対するフィルター処理容量が血液に換算して６μｌ／孔以下の容量となるように血液検体をフィルター処理して、稀少細胞を分離又は検出することを含む、血液検体中の稀少細胞の分離又は検出方法。
前記フィルターの孔に対して血液に換算して１ｕｌ／孔以下の容量の血液検体をフィルター処理する、請求項１に記載の方法。
前記フィルターの孔に対して血液に換算して０．２μｌ／孔以下の容量の血液検体をフィルター処理する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
前記フィルターの孔密度が、３００個／ｍｍ²〜７０００個／ｍｍ²である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記フィルターの孔密度が、３００個／ｍｍ²〜５０００個／ｍｍ²である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記フィルターの孔密度が、５００個／ｍｍ²〜４０００個／ｍｍ²である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記フィルターの孔密度が、８００個／ｍｍ²〜４０００個／ｍｍ²である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記孔の形状が、短軸直径が４．０μｍ以上１０μｍ以下で、長軸直径が、前記短軸直径に対し１．１〜３倍の楕円形、又は、該楕円と該楕円の長軸の両端を含む少なくとも２点で接する形状である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記フィルターの孔面積が、１５μｍ²〜２５０μｍ²である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記フィルターの孔面積が、２０μｍ²〜１００μｍ²である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記フィルターの孔面積が、２５μｍ²〜８０μｍ²である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記孔の形状が、短軸直径が５．０μｍ以上８μｍ以下で、長軸直径が、前記短軸直径に対し１．１〜３倍の楕円形、又は、該楕円と該楕円の長軸の両端を含む少なくとも２点で接する形状である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
フィルターの孔に対するフィルター処理容量が血液に換算して、「トータル血液検体処理容量（ｎｌ）＝孔数（個）×１０〜孔数（個）×１７０、又はトータル血液検体処理容量（ｎｌ）＝全合計孔面積（ｕｍ²）×０．２（ｎｌ／ｕｍ²）〜全合計孔面積（ｕｍ²）×３．４（ｎｌ／ｕｍ²）」の容量となるように血液検体をフィルター処理して、稀少細胞を分離又は検出することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の血液検体中の稀少細胞の分離又は検出方法。
トータル血液検体処理容量（ｎｌ）に対し、「孔数（個）＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１７０〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／１０」、又は「全合計孔面積（ｕｍ²）＝トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／３．４（ｎｌ／ｕｍ²）〜トータル血液検体処理容量（ｎｌ）／０．２（ｎｌ／ｕｍ²）」となるようなフィルターを用いて、血液検体を処理して、稀少細胞を分離又は検出することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の血液検体中の稀少細胞の分離又は検出方法。
フィルターの孔に対するフィルター処理容量が血液に換算して１０ｎｌ／孔〜１０８ｎｌ／孔以下の容量となるように血液検体をフィルター処理して、稀少細胞を分離又は検出することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の血液検体中の稀少細胞の分離又は検出方法。
前記フィルターの孔に対して血液に換算して０．１μｌ／孔以下の容量の血液検体をフィルター処理する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記フィルターの孔に対して血液に換算して０．０６μｌ／孔以下の容量の血液検体をフィルター処理する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
前記フィルターに含まれる孔の個数が、１０，０００個より多い、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
ろ過する際の送液条件として、血液を用いて孔あたりの流速を、５μｍ／ｍｉｎ〜６００μｍ／ｍｉｎとなるように圧力を設定する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
ろ過する際の送液条件として、血液を用いて、孔あたり０．０５ｎｌ／ｍｉｎ〜３０ｎｌ／ｍｉｎとなるように圧力を設定する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
血液をろ過する際のフィルター上面と下面の圧力差が４〜１１０Ｐａ以下になるように血液検体を送液する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の血液検体中の稀少細胞の分離又は検出方法。
前記フィルターが、ガラス、プラスチック、金属、及びこれらの組み合せからなる群から選択される少なくとも１つから構成される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
前記稀少細胞が、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法で稀少細胞を分離又は検出した後、該細胞の動態の観察又は活性測定を含む方法で分析することを含む、血液検体中の稀少細胞の分析方法。
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法に使用する、短軸直径が３．０μｍ以上１５μｍ以下で、長軸直径が、前記短径に対し１．２〜３倍の楕円形、又は、該楕円と該楕円の長軸の両端を含む少なくとも２点で接する形状の孔を、少なくとも２００個／ｍｍ²〜４００００個／ｍｍ²の孔密度で含むフィルター。
血液１ｍｌ〜５ｍｌを処理するフィルターであって、孔を１０，０００個より多く有する、請求項１〜２４に記載の方法に使用するフィルター。
血液を５ｍｌ〜１０ｍｌを処理するフィルターであって、孔を２９，０００個以上有する、請求項１〜２６に記載の方法に使用するフィルター。
血液を１０ｍｌより多く処理するフィルターであって、孔を６０，０００個以上を有する、請求項１〜２７に記載の方法に使用するフィルター。
供給口と排出口、及び前記供給口と前記排出口を連通する流路が形成され、前記流路の一部に相当する位置に、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のフィルターとフィルター保持部を含む分離部を有することを特徴とする、検体中に含まれる稀少細胞を捕捉するための稀少細胞捕捉装置。