CN104459131B - 血液待测体的处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供血液待测体的处理方法，所述方法能够在抑制过滤器的过滤面积的同时提高容易变形地漏过的稀少细胞或小的稀少细胞的回收率，并且能够活着回收所述细胞。在一种方式中，涉及分离或检测血液待测体中的稀少细胞的方法，所述方法包括：使用过滤器，对相对于所述过滤器的孔、6μl/孔以下的容量的血液待测体进行过滤处理，从而分离或检测稀少细胞，其中，所述过滤器以200个/mm2～40000个/mm2的孔密度含有短轴直径为3.0μm以上15μm以下且长轴直径为所述短轴直径的1.1倍～3倍的椭圆形或含有该椭圆且在夹着该椭圆的长轴的至少2点与该椭圆相接的形状的孔。

Description

血液待测体的处理方法
技术领域
本公开涉及血液待测体的处理方法，分离血液待测体中的稀少细胞的方法，血中循环肿瘤细胞的数量测定或分析方法，以及其中使用的过滤器和稀少细胞捕获装置。
背景技术
虽然血液的细胞成分主要是红血球、白血球、血小板，但是在血液中有时存在除此以外的细胞。作为其一例，可以举出血中循环肿瘤细胞/CTC (Circulating Tumor Cell)。认为癌的转移由癌细胞通过血管或淋巴管被运送到体内的其它部位并增殖引起。并且，报告了血液中的CTC数与癌的转移的可能性和预后有关，已知为了作为癌(特别是乳癌等转移性的癌)的诊断、预后诊断和治疗效果的预测或判定的指标，而测定血液中的CTC数的计数、CTC的核酸，关于其分离、浓缩提出、研究了各种手法(非专利文献1～16、专利文献1～4等)。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5086241号
专利文献2：日本专利文献特开2011-163830号公报
专利文献3：日本专利文献特开2013-17429号公报
专利文献4：日本专利文献特表2010-530234号公报
非专利文献
非专利文献1：EFRAT DOTAN,STEVEN J.COHEN,KATHERINE R.ALPAUGH,NEALJ.MEROPOL.Evolving Evidence and Future Challenges. The oncologist 2009；14；1070-1082
非专利文献2：Martin VM,Siewert C,Scharl A,Harms T,Heinze R,Ohl S,Radbruch A,Miltenyi S,Schmitz J.Immunomagnetic enrichment of disseminatedepithelial tumor cells from peripheral blood by MACS.Exp Hematol.1998 Mar；26(3):252-64.
非专利文献3：L.Yang,J.C.Lang,P.Balasubramanian,K.R.Jatana,D. Schuller,et al.Optimization of an Enrichment Process for Circulating Tumor Cells Fromthe Blood of Head and Neck Cancer Patients Through Depletion of NormalCells.Biotechnol Bioeng；102(2):521-534(2009)
非专利文献4：Ralf Gertler,Robert Rosenberg,Katrin Fuehrer,MichaelDahm,Hjalmar Nekarda,Joerg Ruediger Siewert Detection of Circulating TumorCells in Blood Using an Optimized Density Gradient Centrifugation RecentResults in Cancer Research Volume 162,2003,pp 149-155
非专利文献5：M.K.Baker,K.Mikhitarian,W.Osta,et al.Molecular detectionof breast cancer cells in the peripheral blood of advanced-stage breastcancer patients using multimarker real-time reverse transcription-polymerasechain reaction and a novel porous barrier density gradient centrifugationtechnology.Clin Cancer Res；9:4865-4871(2003)
非专利文献6：Rostagno P,Moll JL,Bisconte JC,Caldani C.Detection ofrare circulating breast cancer cells by filtration cytometry andidentification by DNA conten t:sensitivity in an experimentalmodel.Anticancer Res.1997,17, 2481-2485
非专利文献7：G.Vona,A.Sabile,M.Louha,et al.Isolation by size ofepithelial tumor cells:a new method for the immunomorphological and molecularcharacterization of circulatingtumor cells.Am J Pathol；156:57-63 (2000)
非专利文献8：F.Farace,C.Massard,N.Vimond,F.Drusch,et al.A directcomparison of CellSearch and ISET for circulating tumour-cell detection inpatients with metastatic carcinomas.Br J Cancer；105(6):847-853(2011)
非专利文献9：S.Zheng,H.Lin,J.Q.Liu,et al.Membrane microfilter devicefor selective capture,electrolysis and genomic analysis of human circulatingtumor cells.J Chromatogr A；1162:154-61(2007)
非专利文献10：H.K.Lin,S.Zheng,A.J.Williams,et al.Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumorcells. Clin Cancer Res；16(20):5011-5018(2010)
非专利文献11：Hosokawa M,Hayata T,Fukuda Y,Arakaki Ai,et al.Anal.Chem.,2010,82(15),pp 6629-6635Size-Selective Microcavity Array for Rapid andEfficient Detection of Circulating Tumor Cells
非专利文献12：S.Zheng,H.K.Lin,B.Lu.3D microfilter device for viablecirculating tumor cell(CTC)enrichment from blood.Biomed Microdevices；13:203-213(2011)
非专利文献13：Frank A.W.Coumans.,Guus van Dalum.,Markus Beck, LeonW.M.M.Terstappen*Filter Characteristics Influencing Circulating Tumor CellEnrichment from Whole Blood,April 2013|Volume 8|Issue 4| e61770
非专利文献14：Sunyoung Park,Richard R.Ang,Simon P.Duffy,Jenny Bazov,Kim N.Chi,Peter C.Black,Hongshen Ma,Morphological differences betweencirculating tumor cells from prostate cancer patients and cultured prostatecancer cells,January 2014|Volume 9|Issue 1|e85264
非专利文献15：Jochen Guck,Stefan Schinkinger,Bryan Lincoln,FalkWottawah,Susanne Ebert、Maren Romeyke,Dominik Lenz,Harold M. Erickson,RevathiAnanthakrishnan,*Daniel Mitchell,Josef Ka¨s,Optical Deformability as anInherent Cell Marker for Testing Malignant Transformation and MetastaticCompetence,Biophysical Journal Volume 88 May 2005 3689– 3698
非专利文献16：Wenwei Xu,Roman Mezencev,Byungkyu Kim,Lijuan Wang,JohnMcDonald,Todd Sulchek,October 2012|Volume 7|Issue 10| e46609Cell Stiffness Isa Biomarker of the Metastatic Potential of Ovarian Cancer Cells
发明内容
发明所要解决的问题
以往，关于血液和CTC，虽然红血球、白血球压倒性地多，但是在血液中难以检测或取得只以极少的水平发现的细胞。例如，现在虽然由FDA 认证的细胞检测体系将EpCAM抗体作为癌细胞的表面指标利用，但是由于也报告了几乎或者完全没有发现EpCAM或细胞角蛋白(CK)的肿瘤细胞，因此在使用了依赖抗原的表达量的亲和力的方法中，对于能够捕获的癌细胞存在界限。现在，由美国的FDA认可的细胞检测体系为了得到CTC而使用固定化和抗体来实施分离、浓缩。然而，由于依赖于CTC的表面抗原的表达量，因此也存在不能捕获的细胞。因此，实际上存在很多即使在血液中流动，也无法捕获的CTC，灵敏度低。于是，期望不依赖于抗体而能够分离CTC的方法。
非专利文献6―8所记载的方法主要是利用了如下性质：癌细胞是尺寸一般比血球大的细胞、以及白血球能够通过比自身小的孔等血球能够柔软地变形的性质的分离。然而，由于过滤器的孔不均匀，因此存在产生各穴结合在一起的情况，穴变大，癌细胞漏过而捕获率低的问题。
另一方面，近年来，报告了新的捕获CTC的过滤器不是径迹蚀刻膜过滤器(聚碳酸酯制过滤器、PC过滤器)，而是通过达成均匀的孔来以塑料或金属材料来实现捕获率的提高，并且公开了得到比细胞检测体系高的捕获率。专利文献1将以使用聚对二甲苯原料制作了均一的孔的过滤膜分离CTC作为血液中的CTC的分离、检测技术公开。另外，专利文献2 公开使用尺寸选择微腔阵列(金属过滤器)以过滤面积100μm2的过滤器 (孔的直径是孔数10000个)从血液1ml分离CTC，通过使另外孔为能够捕获以漏过的尺寸小的小型癌细胞。(表面特性不同的塑料和金属同样得到高捕获率的结果，依赖于过滤原理是在过滤器上捕获比孔穴大的细胞。也就是说，这样，由于孔的大小作为左右通过滤过进行细胞捕获的效率的最大的因素起作用，因此在其它材料中也期待同样的效果。)
另外，最近，报告了小型的CTC(平均7.97μm)也存在〔非专利文献13-14〕，提出了为了以孔径的尺寸使血液1ml通过而至少带有 10万个孔的开口率10％以下的过滤器，期望也能够捕获小型CTC。
并且，也存在变形能高的癌细胞〔非专利文献14-15〕，转移等恶性度高的癌细胞的可能性高，如果也能够捕获变形能高的癌细胞，则CTC的基因等解析也会进步，存在关系到治疗的提高的可能性。
CTC虽然是对医疗的发展非常有前途的细胞，但是如前所述在血液 10ml中只有数个。在10ml中CTC只有2个的情况下，根据泊松分布，只处理1ml的血液，CTC存在1个以上的概率为大约20％左右。因此即使不漏过而能够捕获也只能够期待最高20％的检测率，但是在大量处理血液的情况下，在8ml中存在1个以上的CTC的概率为大约接近90％。因此，期望能够合适地处理更大量血液的过滤器。
此处，关于所述文献的过滤器，在超过了10μm的孔中，直径10μm 左右的孔处细胞尺寸由于比该孔径小，因此存在不能捕获漏过的小型的细胞的问题。即，例如，在想捕获预定的尺寸的细胞的情况下，通常，作为对策能够假定将使过滤器的孔的直径设置得比起预定的尺寸小。然而，当实际上尝试时，在单纯地使孔小的情况下，血球也容易被捕获，因此过滤器孔径越小越容易堵塞越难以流动，过滤时间也变长。于是，为了解决该问题，如果过滤时提高适用于过滤器的压力(过滤压)从而进行迅速的处理，则会发生下次细胞从过滤器漏过，或者在孔接触时带来损伤的可能性变高等问题。
例如，作为捕获小的癌细胞的方法，公开了使血液溶血，减少血球数之后，使用直径25mm(面积490mm2)具有孔径为短轴直径5μm×长轴直径5μm以下的小孔的过滤器的方法〔专利文献3〕。然而，在所述文献中，虽然记载了以孔径0.4μm的滤纸状过滤器滤过总计1ml的稀释血液，从而回收白血球的例子，但是认为滤过超过总计1ml的量的血液从而能够适当地回收目的细胞(在此例中为白血球)的希望低。况且，在也有血液中的存在频率极低的情况(例如，在10ml的血液中数个左右等)的想检测CTC等稀少细胞的情况下，在文献记载的血液量程度中捕获效率低，需要更大量血液流过过滤器。因此，假如当采用所述文献记载的方法时，需要使过滤器面积扩大，导致检测所需的试剂成本的增大，清洗液量的增加或废液量的增大，操作工序也变复杂。
即，如果只通过单单使孔变小的解决方法，不能处理大量血液，为了避免过滤器的堵塞，需要增加过滤面积(在过滤器中能够滤过液体的面积)或过滤器中的孔的数(孔数)，结果，设备的体积增加，使用的标记试剂(一般是高价的)增加，从而成本变高。另外由于孔密度的增加过滤器的强度也变差，由于孔间的间距变小膜的耐久性也降低。这样，如果为了提高降低了的耐久性增加膜的膜厚，血液流动所需要的压力也不得不增加，施加在细胞上的负荷也增大，并且也容易发生进一步的堵塞。另外，也伴随着大量残存目的细胞之外的细胞从而解析变困难的问题。
另一方面，为了捕获容易变形的细胞，考虑使夹着过滤器的上下的压力差ΔP2变小从而细胞难以漏过过滤器的孔。根据哈根泊肃叶定律的式子，当Q作为流量，η作为粘性，L作为膜厚，d作为孔半径时，在过滤器之一的正圆孔的上下产生的压力差(ΔP)为Δp＝8ηL/πd4×Q，在同流量下，当使过滤器的孔径从变为或时，压力差(ΔP)变为大约0.6倍或大约0.4倍，能够期待捕获增大。然而如果使孔比10μm 大，则即使变得能够捕获容易变形的细胞，尺寸小的癌细胞的捕获可能性也降低。另外，虽然考虑通过使单位时间流过的液体的量(流量)变小并缓和施加在过滤器孔上的负荷来提高捕获率的对策，但是已知当实际尝试时，对于变形能高的细胞而言，存在捕获率降低的情况。
此处，公开了通过粘弹性的不同来分离癌细胞和白血球的技术〔专利文献4〕。该文献所记载的发明利用以下的情况：白血球能够变形并漏过比自身小的孔，另一方面，由于癌细胞与血球相比难以变形，因此无法容易地通过比自身小的孔。根据该文献，在目的细胞比血球硬的情况下，分离变容易。然而实际上也存在直径10μm以上的细胞尺寸，并且容易通过直径5μm～6.5μm的圆形过滤器孔的变形能高的癌细胞。要使这样的癌细胞无法通过过滤器，虽然如所述专利文献3所记载的方法，考虑使孔变小作为对策，但是会产生所述问题。更有意思的是，实际上，根据发明者的实验确认了以下的结果：在1ml的少量的血液能够达成高捕获的相同的条件下，在变形能高的细胞中，根据血液待测体的处理量捕获率变差。
可是，在这种情况下，为了提高捕获率，考虑预先向血液中加入多聚甲醛等固定液来使细胞变硬从而分离的方法(例如，非专利文献7-8、 10)。然而，在这样的方法中，额外需要稀释血液来使粒子密度变稀且使过滤面积变大等使堵塞变难的对策，复杂度增加。另外由于白血球也由于固化而变得难以通过过滤器，因此作为该对策需要扩大过滤器孔的尺寸，其结果是：如果要捕获容易变形的癌细胞，则小的癌细胞漏过。另外，根据这样的固定化法，血液的过滤处理时，虽然需要施加堵塞不发生的高的压力，但是也存在目的细胞漏过过滤器，或者破坏目的细胞的问题。即，在固定化法的情况下，存在不能单单使孔变小，每个孔单位过滤面积的血液处理量的降低、压力增大、废液量的增加或使用剧毒物质的问题。并且，不能活着捕获、解析细胞。
如上，在以往的方法中在抑制过滤器的过滤尺寸或张数的同时不固定化地对大量血液进行处理，难以达成活着捕获在10μm的孔径漏过的癌细胞或在直径的圆形孔变形漏过的癌细胞。
本公开在一个或多个实施方式中，提供一种血液待测体的迅速且简便的处理方法，在血液待测体中存在稀少细胞的情况下，通过使用将膜过滤器中的孔的形状和面积以及孔数设定为合适的值的过滤器，或者基于孔的形状和面积以及孔数来决定每个孔的血液容量，对于10μm的孔径，能够提高如下稀少细胞的捕获率，所述稀少细胞是细胞尺寸小于该孔径因此漏过孔的小型的稀少细胞，或当以每个孔血液待测体处理量是14nl以上且每个孔5nl/min～20nl/min输送全血时在的正圆孔处容易漏过的、容易变形的稀少细胞，并且能够在抑制用于过滤器中的待测体滤过的部分的面积(过滤器的过滤面积)的同时或者捕获所述细胞。
此处，所述孔数的设定能够按照以下的式1决定其合适的范围。
式1：“孔数(个)＝总计血液待测体处理容量(nl)/170～总计血液待测体处理容量(nl)/10”
另一方面，合适的全合计孔面积能够按照以下的式2决定其范围。
式2：“全合计孔面积(μm2)＝总计血液待测体处理量(nl)/3.4 (nl/μm2)～总计血液待测体处理量(nl)/0.2(nl/μm2)”
本公开在其它一个或多个实施方式中，还提供在血液待测体中存在稀少细胞的情况下，能够提高稀少细胞的捕获率的血液待测体的处理方法。
用于解决问题的手段
本公开在一个或多个实施方式中，涉及分离或检测血液待测体中的稀少细胞的方法，其特征在于，包括：使用过滤器，以下(1)和(2)，其中，所述过滤器以200个/mm2～40000个/mm2的孔密度含有短轴直径为 3.0μm以上15μm以下且长轴直径为所述短轴直径的1.1倍～3倍的椭圆形或含有该椭圆且在含有该椭圆的长轴的两端的至少2点与该椭圆相接的形状的孔。
(1)使用具有由式子“式1：孔数(个)＝总计血液待测体处理容量 (nl)/170～总计血液待测体处理容量(nl)/10”得到的孔数，或由式子“式2：全合计孔面积＝总计血液待测体处理容量(nl)/3.4(nl/μm2)～总计血液待测体处理容量(nl)/0.2(nl/μm2)”得到的孔面积的过滤器；或者
(2)以相对于所述过滤器的孔的过滤器处理容量换算成血液为10～ 170nl/孔以下的容量的方式来对血液待测体进行过滤器处理从而分离或检测稀少细胞。
本公开在其它一个或多个实施方式中，涉及分离或检测所述血液待测体中的稀少细胞的方法，所述稀少细胞是从癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶系干细胞、胎儿细胞以及它们的组合构成的组选择的细胞。
本公开在其它一个或多个实施方式中，涉及分离或检测所述血液待测体中的稀少细胞的方法，所述方法包括：对于所述稀少细胞使用从由如下检测方法构成的组中选择的检测方法所附带的标记方法来进行标记，即利用放射性物质的检测方法、利用发光现象的检测方法、使用染料的检测方法、利用磁性的检测方法、电检测方法、光学检测方法及其组合。
本公开在其它一个或多个实施方式中，涉及血液待测体中的稀少细胞的分析方法，所述方法包括：在以分离或检测所述血液待测体中的稀少细胞的方法分离或检测稀少细胞之后，以包括该细胞的动态的观察或活性测定的方法进行分析。
本公开在其它一个或多个实施方式中，涉及过滤器，所述过滤器以 200个/mm2～40000个/mm2的孔密度含有短轴直径为3.0μm以上15μm以下且长轴直径为所述短轴直径的1.1倍～3倍的椭圆形或在含有该椭圆的长轴的两端的至少2点与该椭圆相接的形状的孔。
本公开在其它一个或多个实施方式中，涉及用于捕获待测体中所含的稀少细胞的稀少细胞捕获装置，其特征在于，形成有供应口和排出口以及连通所述供应口和所述排出口的流路，并且具有分离部，所述分离部在相当于所述流路的一部分的位置包括过滤器和过滤器保持部。
根据本公开，在一个或多个实施方式中，在抑制过滤面积的同时能够活着捕获容易变形地容易漏过的癌细胞或尺寸小的癌细胞。另外，根据本公开，在一个或多个实施方式中，在血液待测体中存在稀少细胞的情况下，能够提高稀少细胞的捕获率。
附图说明
图1示出过滤器的照片；
图2示出稀少细胞捕获装置的概要；
图3示出孔面积的不同对细胞的捕获率的影响；
图4示出每个孔的血液待测体的过滤器容量的不同对细胞的捕获率的影响；
图5示出当血液量处理量变多时与过滤器种类或细胞的种类无关地捕获率降低的倾向；
图6示出送液条件的不同对细胞的捕获率的影响；
图7示出每个孔的血液量和过滤器的种类、孔密度、材质中的变形细胞的捕获率；
图8示出每个孔108nl的各癌细胞的捕获率；
图9是说明孔径的概略图。
具体实施方式
预计循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell：CTC)等血液中的稀少细胞的分析今后会更加盛行，需求更简便且损耗少的方法。在10ml的血液中，通常含有红血球数百亿个、白血球数千万个、CTC零～数千个。从而，就这样解析CTC中存在很多技术问题，例如，需要浓缩分离等处理。因此，期待从血液中更有效和/或简便地浓缩分离CTC的技术的开发。
本公开在一个或多个实施方式中基于如下的想法：在对血液待测体进行过滤器处理时，当调节过滤器的孔的形状和大小时，以及使用带有由式子“孔数(个)＝总计血液待测体处理容量(nl)/170～总计血液待测体处理容量(nl)/10，或者全合计孔面积(μm2)＝总计血液待测体处理容量(nl)/3.4(nl/μm2)～总计血液待测体处理容量(nl)/0.2(nl/μm2)”的得到的孔数的过滤器，或者通过“总计血液待测体处理容量(nl)＝全合计孔面积(μm2)×0.2(nl/μm2)/～全合计孔面积(μm2)×3.4 (nl/μm2)”来调节通过过滤器的孔的血液待测体的容量，能够活着捕获血液待测体中所包含的稀少细胞(包括尺寸比较小的细胞或容易变形的细胞)。
即，本公开在一种方式中涉及血液待测体的处理方法，包括对所述试样进行过滤器处理的方法(以下，也称作“本公开所涉及的处理方法”)。
[血液待测体]
在本公开中，“血液待测体”意味着能适用本公开所涉及的处理方法的、含有构成血液的成分的试样，可以举出血液、含有红血球成分的血液来源物、血液或血液来源物混合存在的体液或尿，以及由它们调制的试样等。在本公开中，通过过滤器的每个孔的血液待测体的容量以从人体采集的血液，即，每1μl包含1000～20000个白血球细胞的血液为基准。由此，在使用稀释了的血液待测体的情况下，能够基于白血球数将该稀释血液待测体换算成稀释前的血液待测体容量。即，例如，在对10倍稀释的血液待测体进行处理的情况下，对“X”μl/孔的容量的所述稀释血液待测体进行处理相当于对“X/10”μl/孔的容量的所述稀释血液待测体进行处理。作为血液，可以举出从生物体采集的血液，作为所述生物体，可以举出人类或人类以外的动物(例如，哺乳类)。作为包含红血球成分的血液来源物，可以举出从血液分离或调制的物质即包含红血球成分的物质或它们的稀释/浓缩物，例如，包括：除去了血浆的血球分化或血球浓缩物、血液或者血球的冷冻干燥物、对全血进行溶血处理且除去了红血球成分的试样或者溶血试样、离心分离血液、自然沉淀血液、洗净血球、特定的分化。其中，在不被限定的一个或多个实施方式中，从简便且迅速的处理的观点和对于血液中的稀少细胞的损伤抑制的观点来看，作为包含所述血液的试样也优选为血液或包含血球成分的血液来源的血球。
[稀少细胞]
在本公开中，血液中或血液待测体中所包含的“稀少细胞”是人类或人类以外的动物的血液中可包含的细胞成分(红血球、白血球和血小板) 以外的细胞，包括肿瘤细胞和/或癌细胞。一般将在血液中循环的肿瘤细胞或癌细胞称作CTC。作血液中的稀少细胞数，存在取决于待测体在血液 10ml中包含数个至数十个，多则数百～千个的情况。“稀少细胞”在一个或多个实施方式中，是从由癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶系干细胞、胎儿细胞以及它们的组合组成的组中选择的细胞。
在血液待测体中所存在的稀少细胞和/或CTC中包括：在直径左右能够捕获的大型的细胞，在所述孔尺寸直径左右的孔处从孔漏过的小型的细胞或在当以直径的孔尺寸的每个孔5nl/min～ 20nl/min输送全血时变形从而从孔漏过的、容易变形的细胞。本发明在一个或多个实施方式中，涉及如下的处理方法：能够使用预定的过滤器来分离和/或捕获血液待测体中所包含的、容易变形的大的稀少细胞和大小小的稀少细胞的一者或两者。
[过滤器容量]
在本公开所涉及的处理方法中的过滤器处理中，过滤器的孔数或过滤器容量(即，通过过滤器的血液待测体的量：记载为总计血液待测体处理容量)能够通过“孔数(个)＝总计血液待测体处理容量(nl)/170～总计血液待测体处理容量(nl)/10”或者“全合计孔面积(μm2)＝总计血液待测体处理容量(nl)/3.4(nl/μm2)～总计血液待测体处理容量(nl) /0.2(nl/μm2)”来规定。在一个或多个实施方式中，从维持稀少细胞的捕获率的观点来看，过滤器容量相对于过滤器的每个孔是0.005μL/孔以上、 0.01μl/孔以上、0.014μl以上、0.015μl/孔以上、0.02μl/孔以上。另外，在一个或多个实施方式中，从一次对大量待测体进行处理的观点、抑制过滤器的过滤面积的观点以及不堵塞过滤器地捕获容易变形的细胞或小的细胞的观点来看，过滤器容量是1μl/孔以下、0.2μl/孔以下、0.170μl/孔以下、 0.163μl/孔以下、0.108μl/孔以下或者0.054μl/孔、0.028μl/孔、0.014μL/孔以下。此处，由于过滤器包含多个孔，过滤器的每个孔的血液待测体的量意味着对该过滤器进行处理的血液待测体的量除以过滤器的孔的个数的平均值。发明者发现能够通过调节过滤器容量来取得容易变形的细胞。
在本公开所涉及的处理方法中的过滤器处理中，在一个或多个实施方式中，过滤器容量能够通过“总计血液待测体处理容量(nl)＝孔数 (个)×10～孔数(个)×170或者总计血液待测体处理容量(nl)＝全合计孔面积(μm2)×0.2(nl/μm2)～全合计孔面积(μm2)×3.4(nl/μm2)”来规定。相对于5mm2～10000mm2的过滤面积，过滤器容量是0.07ml以上、0.25ml以上、0.5ml以上、1ml以上、比1ml多的量、2ml以上、3ml以上或4ml以上。另外，在一个或多个实施方式中，从维持稀少细胞的捕获率的观点来看，相对于5mm2～10000mm2的过滤面积，过滤器容量是6L以下、4L以下、2L以下、400ml以下、200ml以下、100ml以下、80ml以下、50ml以下、30ml以下、25ml以下、12ml以下、11ml以下、10ml以下、9ml以下、8ml以下。或者，在一个或多个实施方式中，从一次对大量试样进行处理的观点、捕获容易变形的细胞的观点以及维持稀少细胞的捕获率的观点来看，相对于15mm2～200mm2的过滤面积，过滤器容量是0.2ml～130ml、0.8ml～90ml、0.8ml～60ml、2ml～50ml、2ml～40ml。
[过滤器的孔]
本公开所涉及的处理方法中的用于过滤器处理的过滤器的孔的形状不被特别地限定，在一个或多个实施方式中，是从圆形、椭圆形、矩形、对称多边形、非对称多边形、不规则的形状以及它们的组合构成的组中选择的形状。过滤器的孔的形状从提高稀少细胞的捕获率的观点来看，在一个或多个实施方式中，是短轴直径的长度为3.0μm以上15μm以下且长轴直径的长度为所述短轴直径的1.1倍～3倍的椭圆形或含有该椭圆且在夹着该椭圆的长轴的两端的至少2点与该椭圆相接的形状。在一个或多个实施方式中，“含有椭圆且在夹着该椭圆的长轴的两端的至少2点与该椭圆相接的形状”是如椭圆的形状，可以举出从由在含有该椭圆的长轴的两端的至少2点与该椭圆外接的圆形、矩形、对称多边形、非对称多边形、不规则的形状以及它们的组合构成的组中选择的形状。在本公开中，在一个或多个实施方式中孔的长径或长轴直径是指使孔为椭圆时的长轴的长度，在一个或多个实施方式中，孔的短径或短轴直径是指使孔为椭圆时的短轴的长度。孔的长径和短径相同时，孔是圆或如圆的形状。在本公开中没有特别提及的情况下，表示孔是长径为aμm短径为bμm的圆，表示孔是直径cμm的圆(图9)。
过滤器的孔中的椭圆的短轴直径，从提高尺寸小的稀少细胞的捕获率的观点来看，在一个或多个实施方式中，是3.0μm以上、4.0μm以上或 5.0μm以上，基于同样的观点，是15.0μm以下、8.0μm以下、不满 8.0μm、7.5μm以下、7.0μm以下或6.5μm以下。此处，尺寸小的稀少细胞在一个或多个实施方式中可以举出漏过直径大约10μm的正圆孔的大小的小型的稀少细胞。
从提高尺寸大且容易变形的稀少细胞的捕获率的观点和使过滤器容量增加的观点来看，在一个或多个实施方式中，过滤器的孔中的椭圆的长轴直径是所述短轴直径的1.1倍～3倍，1.2倍～2.8倍，1.3倍～2.6倍。本公开在一个或多个实施方式中，使椭圆的短轴直径为上述的范围，并且在使椭圆的长轴直径为上述的范围的情况下，通过调整过滤器容量来得到提高稀少细胞的捕获率的惊人的效果。即，通过使椭圆的短轴直径为上述的范围，能够维持大小小的稀少细胞的捕获率，并且通过在长轴方向上拉伸椭圆调整过滤器容量，能够提高容易变形的稀少细胞的捕获率。
本公开所涉及的处理方法中的用于过滤器处理的过滤器在一个或多个实施方式中，也可以在不影响过滤器处理的前提下具有不符合前述的规定的孔。或者，该过滤器在一个或多个实施方式中是具有大致均一的孔的过滤器。
[膜过滤器]
本公开所涉及的处理方法中的用于过滤器处理的过滤器在一个或多个实施方式中是膜过滤器。该膜过滤器从维持大小小的稀少细胞的捕获率的观点、提高容易变形的稀少细胞的捕获率的观点和抑制过滤面积的观点来看，在一个或多个实施方式中，具有上述的短轴直径和长轴直径的范围的椭圆形或含有该椭圆且在夹着该椭圆的长轴的至少2点与该椭圆相接的形状的孔。该膜过滤器的每个孔的面积从维持尺寸小的稀少细胞的捕获率的观点、提高容易变形的稀少细胞的捕获率的观点和抑制过滤面积的观点来看，在一个或多个实施方式中，是15μm2～250μm2、20μm2～150μm2或 30μm2～100μm2、40μm2～80μm2。
该膜过滤器中的所述孔的孔数，基于要处理的血液待测体容量由“孔数(个)＝总计血液待测体处理容量(nl)/170～总计血液待测体处理容量(nl)/10，或者全合计孔面积＝总计血液待测体处理容量/3.4nl～总计血液待测体处理容量/0.2nl/μm2”决定。虽然没有特别限定，但是在一个或多个实施方式中，在试样通过的区域中，能够根据每个孔的血液量适当设定。
如果处理0.1ml血液，则所述孔的孔数为600个以上，更优选为900 个以上、1200个以上、1800个以上，如果处理1ml血液，则所述孔的孔数为6000个以上，更优选为9000个以上、10000个以上、12000个以上、 18000个以上，如果处理5ml血液以上则所述孔的孔数为29400个以上，更优选为46000个以上、92000个以上、178000个以上即可。如果处理 10ml血液，则所述孔的孔数为61000个以上，更优选为92000个以上、 120000个以上、185000个以上、357500个以上即可。如果处理100ml血液，则所述孔的孔数为610000个以上，更优选为920000个以上、 1200000个以上、1850000个以上。可以根据从血液中所存在的稀少细胞的存在概率适当选择。在处理1ml以下的情况下，优选为能够捕获8成以上，在血液量增加至1ml以上的情况下，设定得到80％～50％以上的捕获率的孔数即可。
从维持大小小的稀少细胞的捕获率的观点、提高容易变形的稀少细胞的回收率的观点和抑制过滤面积的观点来看，该膜过滤器中的所述孔的孔数，在一个或多个实施方式中，是每1mm2的孔为300个～40000个、300 个～7000个、500个～4000个、700个～4000个、800个～3999个、900 个～3900个、1000个～3900个的孔密度。另外，该膜过滤器的厚度，在一个或多个实施方式中，是1～100μm、1～50μm、1～30μm或优选为1～ 20μm，更优选为1～10μm。
膜过滤器的孔的形状、孔数、孔密度、面积，例如可由光学显微镜、激光显微镜、电子显微镜测定，具体地可以以实施例的方法测定。例如，能够使用激光显微镜以物镜倍率10～100倍测定孔的大小。
作为本公开所涉及的处理方法中的用于过滤器处理的膜过滤器的种类，在一个或多个实施方式中，不论原料的种类如何，优选为在片状的材料上打开实质上均一的通孔的过滤器。例如，可以举出聚碳酸酯(PC)、聚对二甲苯膜过滤器、镍(Ni)等金属过滤器等。另外当观察过滤器上的细胞时，优选为根据在观察时使用的染料或荧光染色等来选择塑料或金属、玻璃原料，也可以由它们的组合构成。
[过滤条件]
本公开所涉及的处理方法中的过滤器处理，在一个或多个实施方式中，将上述的过滤器装入流路内，并且能够通过将血液导入流路来捕获 CTC。没有特别规定只要是能够输送液体的驱动力即可。例如，向流路中导入血液中，能够例示使用从流路的入口方向加压的方法、使用流路的出口方向减压的方法、使用注射泵或蠕动泵的方法等。由于向流路导入血液，因此例如通过对于过滤器的每个孔以5mm/min～600mm/min的流速 (0.25nl/min～30nl/min的流量)输送血液待测体而与以往例相比能够以短时间适当地捕获稀少细胞。
上述血液待测体的送液条件优选为5mm/min～600mm/min的流速 (0.25nl/min～30nl/min的流量)，更优选为10mm/min～480mm/min的流速(0.5nl/min～24nL/min的流量)，进一步优选为20mm/min～ 360mm/min的流速(1nl/min～18nL/min的流量)，更优选为20mm/min～ 120mm/min的流速(1nl/min～7nL/min的流量)。
虽然施加于过滤器设备和流路全体系的压力差(从体系入口到出口的压力差)(ΔP1)没有特别制限，但是优选为3.7kpa以下，更优选为 2.6kpa以下，进一步优选为1.3kpa以下。
上述血液待测体的送液条件，关于以过滤器为边界上下产生的压力差 (ΔP2)为110Pa以下，优选为100Pa以下，更优选为70Pa以下，或者 50Pa以下，进一步优选为30Pa以下、15pa以下。作为计算方法，Q：全孔合计平均流量、d：半径、L：孔的流路长、η：送液的液体的粘性、π：圆周率、N0：孔数，在正圆中以ΔP2＝Q×8ηL/(πd4×N0)求出，基于各孔的形状以公知的计算方法得到。血液是非牛顿性液体，另外即使是相同的压力差，也通过由HCt的不同引起的粘性来改变平均流速。因此平均流速具有恒定的范围。在使用全血时的压力差的ΔP2设定中，为了方便使用η＝4.5mPa·S的值，以在计算上带入到所述记载的ΔP2的值中的方式来进行送液或压力的设定即可。在通过稀释等使血液待测体的红细胞压积值 (HCt)不满20的情况下，如果使用η＝1～2mPa·S的值，在计算上带入到所述记载的值中的方式进行设定即可。或者在稀释至由血浆或红细胞压积(HCt)引起的粘性影响不变小的情况(例如4～10倍稀释全血的情况)下，也可以结合其稀释液的粘性来计算并送液。在使用注射泵等进行定流量送液的情况下，以带入所述ΔP2中的方式进行送液即可。这样的送液条件，能够使用本领域技术人员所周知的能够以恒定压力送液的机构或能够以恒定流量送液的机构来实现。
[含有血液成分的试样中的稀少细胞的分离或检测方法]
通过进行本公开所涉及的处理方法中的过滤器处理，稀少细胞(如果存在)残留在过滤了含有血液成分的试样之后的过滤器上，能够分离或检测稀少细胞。从而，本公开在其它方式中涉及分离或检测血液成分含有试样中的稀少细胞的方法，该方法包括以本公开所涉及的处理方法来处理血液待测体并分离或检测稀少细胞。
[对血液中的稀少细胞进行的标记处理]
在本公开所涉及的处理方法中，对血液中的稀少细胞进行的标记处理可以在处理分开进行、同时进行、或在分离后进行都可以。稀少细胞的标记对上述的本公开所涉及的分离或检测方法，以及后述的CTC数测定方法有用，并且对分离后的稀少细胞的分析。从而，本公开所涉及的处理方法在一个或多个实施方式中包括标记处理。另外，稀少细胞的标记对后述的 CTC数测定方法有用，并且对分离后的稀少细胞的分析有用。从而，本公开所涉及的分离或检测方法在一个或多个实施方式中包括标记处理。
所述标记处理例如能够通过使公知的标记试剂与稀少细胞接触来进行，典型地，能够通过使所述标记试剂与血液待测体混合来进行。作为所述标记，没有特别，在一个或多个实施方式中，可以举出放射性标记、荧光染料标记、染料染色或标记、磁标记、电荷标记以及它们的组合，并且能够分别通过适合标记试剂来进行。
即，所述标记处理对于所述稀少细胞能够使用从由如下检测方法构成的组中选择的检测方法附带的标记方法来进行，利用放射性物质的检测方法、利用发光现象的检测方法、使用染料的检测方法、利用磁性的检测方法、电检测方法、光学检测方法以及它们的组合。
在本公开中的处理方法中，稀少细胞的分离或检测，还能够通过电、重量、光学地检测所述过滤器的变化来实现。
[含有血液成分的试样中的稀少细胞的分析方法]
本公开在其它方式中可涉及含有血液成分的试样中的稀少细胞的分析方法，包括在以本公开所涉及的分离或检测方法分离或检测稀少细胞之后以包含该细胞的动态观察或活性测定的方法进行分析。即，根据本公开，由于能够活着捕获细胞，因此能够在以本公开所涉及的分离或检测方法分离或检测稀少细胞之后以包含该细胞的动态观察或活性测定的方法进行分析。
[CTC数测定方法]
报告了血液中的CTC数和癌的转移或预后有关，已知为了作为癌的诊断、预后诊断及治疗效果的预测或判定的指标进行研究，测定血中CTC 数。根据本公开所涉及的处理方法和/或本公开所涉及的分离或检测方法，能够抑制作为向作为稀少细胞的CTC的损伤并进行分离。可以测定另外 CTC的核酸。从而，本公开在其它方式中，涉及所述血液待测体中的CTC 数的测定方法，包括以本公开所涉及的处理方法处理血液待测体并分离或检测稀少细胞和/或通过本公开所涉及的分离或检测方法从所述血液待测体分离CTC。CTC数的计测或CTC的核酸的测定，例如，可以在进行了适当的标记处理之后通过流式细胞仪来与分离同时进行，并且也可以在显微镜下观察分离的细胞来计测。另外，从癌细胞的形态学的、DNA或RNA 的量的观点来看，也可以通过荧光值测定。
[过滤器]
本公开在其它方式中还涉及用于本公开所涉及的处理方法、本公开所涉及的分离或检测方法和/或本公开所涉及的CTC数测定方法的过滤器，所述过滤器以至少200个/mm2～40000个/mm2的孔密度，包含如下形状的孔：短轴直径为3.0μm以上15μm以下且长轴直径为所述短轴直径的1.1 倍～3倍的椭圆形或含有该椭圆且在夹着该椭圆的长轴的至少2点与该椭圆相接的形状的孔。本公开所涉及的过滤器的孔的形状等与上述的用于本公开所涉及的处理方法的过滤器相同。
[稀少细胞捕获装置]
本公开在其它方式中还涉及用于捕获待测体中所含有的稀少细胞的稀少细胞捕获装置。本公开所涉及的稀少细胞捕获装置在一个或多个实施方式中，形成有供应口和排出口以及连通所述供应口和所述排出口的流路，并且具有分离部，所述分离部在相当于所述流路的一部分的位置包括保持本公开所涉及的过滤器的过滤器保持部。根据本公开所涉及的稀少细胞捕获装置，能够使用本公开所涉及的过滤器来进行本公开所涉及的血液待测体的处理方法。
实施例
以下，虽然通过实施例更详细地说明本公开，但是这些是例示性的，本公开不限制于这些实施例。
使用表1和图1所示的过滤器和送液条件实施血液待测体的处理方法。
表1
关于各种孔径，分别设计长轴直径侧、短轴直径侧间距，并且制作过滤器。另外塑料原料的过滤器使用聚碳酸酯材质的Φ5μm孔或Φ8μm孔的径迹蚀刻膜(沃特曼公司)。过滤器的孔径的特定使用由使用了泡点法或水银压入法的细孔径分布评价装置进行的测定或荧光显微镜、激光显微镜、电子显微镜等光学显微镜，通过公知的测定方法来测定。具体地，使用显微镜直接计数，或者求出单位面积的孔数，计算使用的过滤面积积分来求出。
(癌细胞的调制方法)
按照通常方法，除去在培养皿中培养的人类乳腺上皮癌(细胞株名 MCF-7)、人类结肠腺癌(细胞株名SW620)、人类前列腺癌(细胞株名PC3-9)、人类肺胞上皮癌(细胞株名NCI-H358)、人类胃癌细胞 (细胞株名MKN-7)、肉瘤(HT-1080)的培养基上清液后，以PBS(-)清洗，并且除去上清液，进行胰蛋白酶(英杰公司)处理(37℃、3分钟)。向其中加入含血清培养基并回收至15ml离心管中。以离心机 (CR20F：日立)对其离心，除去上清液。使其再次在含血清培养基中悬浮从而回收。作为浮游系的人类胃癌细胞株(细胞株名SNΜ-1)和结肠腺癌细胞株(细胞株名SNΜ-C1)不进行胰蛋白酶处理，在15ml离心管中回收。另外由于人类结肠腺癌(细胞株Colo320DM)是与浮游细胞一部分接触着的细胞，因此浮游着的细胞在15ml离心管中回收，接触着的细胞在进行与其它接触细胞同样的胰蛋白酶处理后，在同一离心管中回收。将其离心之后，添加、悬浊、回收含血清培养基。
(细胞数的调制)
作为癌细胞试样，将预先染色的胃癌、乳癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、肉肿来源的SNΜ-1、MKN-7、MCF-7、SW620、Colo320DM、 SNΜ―C1、PC3-9、NCI-H358、HT-1080调制达到任意数例如 0.5×105CellS/ml或1×105Cells/ml，并使用。SNΜ-1细胞是对于直径8μm的孔，与其它细胞悬浊液相比容易漏过的细胞，因此将其作为变形从而容易漏过的细胞的模型。SW620是上述细胞中最小的细胞，因此作为小的细胞的模型。另外，关于细胞的变形性，使用径迹蚀刻膜(PC聚碳酸酯圆/过滤径)，对于各细胞添加比孔数多的过剩的细胞悬浊液从而堵塞，当位于过滤器下部的、废液侧流路连通的密封瓶为负压时，当堵塞消除从而强势地流过开始时，将相对地压力低的细胞选择作为变形性高的细胞(表2)。
表2
SNU-1 SW620 HT-1080 NCI-H358 PC3-9 MCF-7
消除了过滤器的细胞堵塞时的压力 0.6-1 3.5 2-2.2 6.5-6.7 3.5-3.8 5-8
(稀少细胞捕获处理)
使用图2示出的稀少细胞捕获装置来进行细胞分离实验。
所述稀少细胞捕获装置形成用于向过滤器供应待测体或清洗液、染色液等的供应口1和排出口2以及连通所述供应口和所述排出口的流路3，并且具有分离部，所述分离部在相当于所述流路3的一部分的位置包括保持过滤器4和保持过滤器4的过滤器保持器5。详细地，制作过如下滤器设备，在支持部(基座)6上设置过滤器4，在过滤器4的上表面载置O 形环7，载置罩8从而固定分离部，具有表中示出的孔。在本例中，过滤面积使用5mm2～80mm2的多个过滤器。在该设备的上部安装接连接部和能够进行液的切换的三通栓，以萨菲德(サフィード)延长管(泰尔茂公司生产)形成流路。供应口1位于与流路3的过滤器4相反侧的端部侧，在供应口1和过滤器4之间形成(作为能够以恒定压力送液的机构或能够以恒定流量送液的机构的)加压单元9，通过对过滤所施加的压力或以注射泵牵引成恒定的方式来设定送液条件。废液侧连结萨菲德和内径2mm 的管，将末端作为排出口2。
(送液条件的设定)
从流路到废液出口以PBS(-)(组成：1L蒸馏水中含有氯化钠 8000mg、氯化钾200mg、磷酸氢二纳(无水)1150mg和磷酸二氢纳(无水)200mg)充填，在血液的过滤的时，基于过滤器的孔数以压力或注射泵来设定，以使每个孔为30nl/min以下(600mm/min以下)的。关于从血液分离癌细胞后的流路的清洗，进行设定以使成为PBS(-)1000μL/min (每个孔14nl/min)左右。使用直径8μm、椭圆9.8×6.5μm的孔来设定的情况和流量的关系为〔表7〕的结果。根据该结果，设定流量达到如下条件的过滤条件作为基础：使体系整体的过滤压为1.3kpa±0.1，或每个孔的血液量为108nl的情况的每个孔的流量为4～7nl/min的方式。关于和各过滤器的比较，以所述基本条件进行、设定相同的压力。条件根据孔数而适当设定。
(待测体处理的实施)
将采集到采血管(EDTA-2K)中的血液(含白血球数3000～ 10000/μl)的一部分加入注射器，其后，将任意浓度的癌细胞悬浊液10μL 添加到注射器中的血液中后，加入剩余的血液混合，调制血液待测体。将该血液待测体向稀少细胞捕获装置的供应口供应，通过加压单元以每个孔成需要的送液条件的方式以以下的表4示出的压力进行血液待测体的滤过。滤过结束后，使用PBS(-)进行清洗，慢慢地卸下在分离部之上连接的三通阀和连接部，在过滤器上部慢慢地放上载玻片，从而制作观察面。将其设置在荧光显微镜中，对残留于过滤器上的被荧光染色了的癌细胞进行计数。以本实施例的处理回收的癌细胞在回收后能够培养。
在上述处理中，如下地进行癌细胞的染色。即，将调制的癌细胞从培养液回收之后，以离心机(CR20F/日立制)在1500Rpm、室温(24℃)、离心3分钟。除去上清液，添加PBS(-)从而使细胞悬浊。对在该PBS (-)中悬浊的细胞进行荧光染色。作为染色试剂使用CellTracker(英杰)。CellTracker(英杰)是也能够通过生细胞的细胞膜的试剂，与细胞内物质反应，转变为荧光物质。
将CellTracker溶解在DMSO中成为10mM，以反应时的浓度为最终浓度0.5～0.25μM的方式使用。在PBS(-)中反应30～40分。各癌细胞中使用的染色试剂以发出绿色、橙色、蓝色的荧光的细胞追踪器 (CellTracker Green CMFDA)、(CellTracker Orange CMRA)、(CellTracker Blue CMF2HC)适当染色。
另外，癌细胞的回收率的计算在将癌细胞悬浊液添加到血液中过滤器分离后，对处于过滤器表面的、预先进行了荧光染色的癌细胞进行计数。另外，另行将与添加到血液中的量等量的所述癌细胞悬浊液添加到微量滴定板上，以荧光显微镜对癌细胞数进行计数。将微量滴定板内的细胞数作为分母、将过滤器上残余的细胞数作为分子来计算，从而计数出捕获率。
(在过滤器上的细胞染色和活性)
除了没有以CellTracker事先对PC3细胞进行染色以外如上所述，从血液分离PC3后，从供应路侧添加以PBS调制的1mM 5-氨基乙酰丙酸 (ALA)，进行反应，进行由使用过滤器上的PC3细胞内的酶的活性的 ALA的代谢造成的原卟啉IX变换和由积累造成的荧光染色。除此以外，以CD45等的抗体进行白血球的染色、通过即使活的细胞也能染色的赫斯特进行的核染色。结果，观察到81％的PC3的原卟啉IX来源的荧光发光，能够确认活性。考虑这是因为，癌细胞中，三羧酸循环中使用的血红素的合成代谢路径中代谢被抑制，生成在血红素被代谢之前的原卟啉IX (红色荧光物质)。利用该方法，已知通过将作为原卟啉IX的前体物质的 5-氨基乙酰丙酸(ALA)添加到癌细胞中来使作为红色荧光物质的原卟啉 IX累积，能够进行癌细胞特异的荧光检测。
在表3～9中示出稀少细胞捕获处理的结果。
由表3～7可知，在本公开的过滤器中，在不是单单使孔变小，而是控制孔形状、恒定的孔面积和每个孔的血液量、每个孔的血液流量从而以本公开的过滤器容量处理血液待测体的情况下，能够活着获取小尺寸的小细胞或变形容易的细胞。另外从表8惊奇的发现，即使过滤面积不同的、孔密度不同的、孔数不同的血液待测体量不同，也能够得到容易变形的细胞的捕获效果。
孔数不同、孔密度不同、过滤面积不同、血液处理量不同的数据记载于表8。
实施例1：
通过以下的本实施例，在以带有相同孔数、相同过滤面积的过滤器对血液待测体容量为每个孔14nl(总计血液待测体处理容1ml)进行处理的情况下，漏过10μm的小型的细胞与孔的形状无关只要是比细胞小的孔回收率都高，另一方面，容易变形的癌细胞在孔小的情况下，回收率变差。在表3和图3中示出比较了总计血液待测体处理容量1ml中的各孔的捕获性能的数据。如以下的表，关于容易变形的癌细胞，已知在孔的面积小的情况下，确认无论正圆还是椭圆捕获率都显著下降，并且对于孔未达到将血液待测体容量设为每个孔14nl的情况下的总计血液待测体处理容量而发生堵塞(闭塞)。即，已知在孔面积小的情况下，尤其是对容易变形的细胞的捕获率带来坏影响，对此发现通过伸长长轴来改善捕获率，只单单使孔变小不能解决容易变形的细胞中的捕获率的问题。并且如所述文献记载，已知在或11μm漏过的小型癌细胞也能够通过以的椭圆的方式使短径侧变短来捕获。如果是至少33μm2以上的孔面积，则无论正圆还是椭圆容易变形的细胞都得到高的捕获率。
表3
＜小型癌细胞＞
＜变形能大的细胞＞
实施例2：
讨论本过滤器的血液待测体处理量。如果能够以相同过滤面积处理大量的血液，与不这样的情况(以往)相比，能够抑制使用的过滤器的过滤面积，能够抑制装置中的滤过处理部的体积，并且有成本优势。关于以 1ml的血液捕获率好的的过滤器，达到25ml的 SW620细胞和SNΜ-1细胞的捕获率的平均数据在表4、表5中，绘成曲线的图在图4中示出。惊奇地，在本过滤器中，在过滤面积为20mm2的情况下，达到25ml血液(过滤时间50～70min)能够在不堵塞(闭塞)的情况下进行处理，小型的癌细胞能够维持高的捕获率(表4)并且的过滤器发生堵塞。
表4
虽然对于SW620细胞而言，血液量的影响小地维持捕获性能，但是在作为比较容易变形的癌细胞的SNΜ-1中，能够确认到血液的量越增加时捕获率越低(表5)。当不考虑每个孔的血液待测体处理量，只以细胞的大小从血液进行过滤器处理时，在含有容易变形的癌细胞的血液中得不到捕获性能。即，我们发现在稀少细胞的捕获中，即使不发生堵塞(闭塞)，在相对于孔数的血液待测体处理量中也存在合适的量。发现从血液待测体处理量和捕获率的观点来看如果适当设定血液待测体处理量和孔数以使得每个孔为10nl～170nl，则对于容易变形的细胞得到高的捕获率。在图4中示出各孔的过滤器的捕获率和曲线图。确认了血液变多时捕获率减小的倾向的程度不依赖那个细胞的种类或过滤器的种类(表6、图5)。
表5
表6
实施例3：
接着，以下示出过滤器处理时的使过滤压变动的情况的细胞捕获率数据。一般地，如果设为高压则考虑到细胞容易漏过因此捕获性能下降，如果设为低压则使过滤器的孔变得难以漏过细胞，能够期待细胞捕获率的改善。然而，如表7-1所示，当每个孔108nl、或时，特别地在低压侧，捕获率不稳定，视为捕获率的降低。考虑这是因为滤过时间过长，由于细胞的粘弹性变化细胞漏过。
接着，对于每个孔108nl的血液待测体处理容量(使总计血液待测体处理容量为8ml)和每个孔14nl的血液待测体处理容量(使总计血液待测体处理容量为1ml)，以下示出使过滤压变动的数据。如表7-2所示，已知每个孔使血液待测体处理容量减少，从而即使更快的过滤流量、更高的压力也能捕获。根据每个孔的血液待测体处理容量可以适当决定送液条件。也就是说，已知当每个孔14nl～108nl时，如果以每个孔30nl/min以下或3.7kpa以下(或者ΔP2＝100Pa以下)的方式适当设定即可得到高的细胞捕获率。例如，在每个孔的血液待测体处理容量14nl的情况下，体系整体的压力差为1.3kpa(每孔流量14nl/min～17nl/min)且能够使血液1ml 以1min程度过滤，能够达到小型的癌细胞和容易变形的细胞的高的捕获率。已知通过适当设定针对每个孔的血液待测体处理容量，从而与以下以往方法(对1ml的血液待测体处理5分左右，对8ml的血液待测体处理40 分左右)相比能够以更短时间从多量的血液待测体回收稀少细胞。由于血液随时间劣化，因此越能够尽可能在短时间处理越好，能够获得新鲜的稀少细胞，给解析带来良好的影响。
在表7和图6中示出送液条件的恒定压力、流量和回收率的关系。
表7-1
＜表7－1＞
※Q：全孔合算平均流量、a：半径、L:流路长、η：血液粘性、N0：孔数、全部SI单位
Φ8和Φ9.8x6.5的捕捉率(每个孔108nl)
表7-2
Φ9.8x6.5的每个孔14nl和108nl的比较
根据表7-1、表7-2，在本公开的送液条件下，对于在每个孔的血液量 14～108nl中适当设定的量，通过根据每个孔的血液量以体系整体的压力差为3.7kpa以下、或者夹着过滤器的上下的压力为100Pa以下、或者每个孔的流量为30nl/min以下的方式设定流量，能够得到高的捕获率。
过滤面积、孔数、孔密度不同的过滤器以表8-1示出的漏过条件(表 8-1)如下地示出每个孔的血液待测体处理容量设为14nl～108nl的情况的、捕获各过滤器的SNΜ-1细胞的数据的比较(表8-2)。在图7中示出绘出的曲线。如果根据孔数来设定待测体的容量，则能够与过滤器的材质、孔数、密度无关地捕获容易变形的细胞。并且能够根据目标处理量设定适当的孔数，也能够抑制过滤面积。
表8-1
表8-2
在表9和图8中示出总结了血液待测体容量为每个孔送液108nl的情况的癌细胞的种类和捕获率的关系的结果的一例。并且即使在每个孔 108nl以下也得到了高的捕获率。
表9
血液待测体每个孔108nl的各细胞的捕捉率
由表9和图8可知，通过本公开的方法能够有效地回收多种癌细胞。
工业应用性
本公开在血液中的稀少细胞的回收、测定、分析领域有用，例如，在医学或药学的学术领域和/或治疗、诊断等医疗领域有用。

Claims (24)

1.一种血液待测体中的稀少细胞的分离方法，包括：使用过滤器，以相对于所述过滤器的孔的过滤器处理容量换算成血液为6μl/孔以下的容量、且为下式(1)或(2)计算出的范围的处理容量的方式来对血液待测体进行过滤器处理，从而分离稀少细胞，其中，所述过滤器以200个/mm2～40000个/mm2的孔密度含有如下形状的孔，所述孔的形状是短轴直径为3.0μm以上15μm以下且长轴直径为所述短轴直径的1.1倍～3倍的椭圆形或是含有该椭圆且在含有该椭圆的长轴的两端的至少2点与该椭圆相接的形状，
(1)总计血液待测体处理容量(nl)＝孔数(个)×10～孔数(个)×170，
(2)总计血液待测体处理容量(nl)＝全合计孔面积(μm2)×0.2(nl/μm2)～全合计孔面积(μm2)×3.4(nl/μm2)。
2.如权利要求1所述的方法，其中，对相对于所述过滤器的孔换算成血液1μl/孔以下的容量的血液待测体进行过滤器处理。
3.如权利要求1所述的方法，其中，对相对于所述过滤器的孔换算成血液0.2μl/孔以下的容量的血液待测体进行过滤器处理。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器的孔密度是300个/mm2～7000个/mm2。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器的孔密度是300个/mm2～5000个/mm2。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器的孔密度是500个/mm2～4000个/mm2。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器的孔密度是800个/mm2～4000个/mm2。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述孔的形状是短轴直径为4.0μm以上10μm以下且长轴直径为所述短轴直径的1.1～3倍的椭圆形，或是在含有该椭圆的长轴的两端的至少2点与该椭圆相接的形状。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器的孔面积是15μm2～250μm2。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器的孔面积是20μm2～100μm2。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器的孔面积是25μm2～80μm2。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述孔的形状是短轴直径为5.0μm以上8μm以下且长轴直径为所述短轴直径的1.1～3倍的椭圆形，或是在含有该椭圆的长轴的两端的至少2点与该椭圆相接的形状。
13.如权利要求1所述的方法，其中，对相对于所述过滤器的孔换算成血液0.1μl/孔以下的容量的血液待测体进行过滤器处理。
14.如权利要求1所述的方法，其中，对相对于所述过滤器的孔换算成血液0.06μl/孔以下的容量的血液待测体进行过滤器处理。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器中所含的孔的个数多于10000个。
16.如权利要求1所述的方法，其中，作为过滤时的送液条件，以使用血液使每个孔的流速为5mm/min～600mm/min的方式来设定压力。
17.如权利要求1所述的方法，其中，作为过滤时的送液条件，以使用血液使每个孔为0.05nl/min～30nl/min的方式来设定压力。
18.如权利要求1所述的血液待测体中的稀少细胞的分离方法，其中，以过滤血液时的过滤器上表面和下表面的压力差为4Pa以上、110Pa以下的方式来输送血液待测体。
19.如权利要求1所述的方法，其中，所述过滤器由从由玻璃、塑料、金属以及它们的组合构成的组选择的至少1个构成。
20.如权利要求1所述的方法，其中，所述稀少细胞是从循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、造血干细胞、间叶系干细胞以及它们的组合构成的组选择的细胞。
21.如权利要求1所述的方法，其中，所述稀少细胞是癌细胞。
22.如权利要求1所述的方法，其中，所述稀少细胞是癌干细胞。
23.如权利要求1所述的方法，其中，所述稀少细胞是胎儿细胞。
24.如权利要求1所述的方法，其中，所述稀少细胞是上皮细胞。
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