CN105987843A - 分离或者检测稀有细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离或者检测稀有细胞的方法。提供一种在血液试样中含有稀有细胞的情况下，能够提高小型的稀有细胞和可变形性高的稀有细胞两者的捕获率的血液试样的处理方法。所述方法包括：使用过滤器对血液试样进行过滤处理，并分离或者检测血液试样中的稀有细胞，所述过滤器以孔密度为40个/mm2以上2000个/mm2以下、且长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm)之间的比例(w/z)为7.0以上130以下的方式包括短轴径为5μm以上8μm以下且长轴径为40μm以上的孔。

Description

分离或者检测稀有细胞的方法
技术领域
本发明涉及分离或者检测血液试样中的稀有细胞的方法、血液中循环肿瘤细胞的分析方法、以及用于它们的过滤器和稀有细胞捕获装置。
背景技术
血液的细胞成分主要为红细胞、白细胞、血小板，但在血液中虽然稀有但还存在除了这些之外的细胞。作为这样的稀有细胞的一例，可以举出血液中循环肿瘤细胞/CTC(Circulating Tumor Cell)。CTC是从原发性肿瘤组织或者转移性肿瘤组织中游离，且浸润在血液中的细胞。考虑到癌细胞通过血管或者淋巴管被运输到体内的其他部位并进行增殖导致癌的转移，已报告血液中的CTC数量和癌的转移的可能性以及预后有关系。因此，已知在癌(尤其是乳腺癌等的转移性的癌)的诊断、预后诊断、或者治疗效果的预测或者判断的指标的研究中，测定血液中的CTC数量的计数、CTC的核酸。因此，关于血液中的CTC的分离和/或浓缩，提出和研究各种方法(专利文献1～5、非专利文献1～6等)。
专利文献1：日本专利特开2013-17429号公报；
专利文献2：日本专利特表2010-530234号公报；
专利文献3：日本专利第5141919号；
专利文献4：日本专利特开2013-42689号公报；
专利文献5：日本专利特开2011-163830号公报；
非专利文献1：Vona G，Sabile A，Louha M，Sitruk V，Romana S，SchutzeK，Capron F，Franco D，Pazzagli M，Vekemans M，Lacour B，Brechot C，Paterlini-Brechot；
P.Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells：A New Method for theImmunomorphological and Molecular Characterization of Circulating TumorCells，Am J Pathol.2000Jan；156(1)：57-63；
非专利文献2：Coumans FA，van Dalum G，Beck M，Terstappen LW.(2013)Filter Characteristics Influencing Circulating Tumor Cell Enrichmentfrom Whole Blood，April|Volume 8|Issue 4|e61770；
非专利文献3：Park S，Ang RR，Duffy SP，Bazov J，Chi KN，Black PC，Ma H(2014)Morphological differences between circulating tumor cells fromprostate cancer patients and cultured prostate cancer cells，PLOSONE January2014|Volume 9|Issue 1|e85264；
非专利文献4：Xu W，Mezencev R，Kim B，Wang L，McDonald J，Sulchek T.(2012)October 2012|Volume 7|Issue 10|e46609 Cell Stiffness Isa Biomarker of the Metastatic Potential of Ovarian Cancer Cells；
非专利文献5：Zhang W，Kai K，Choi DS，Iwamoto T，Nguyen YH，Wong H，Landis MD，Ueno NT，Chang J，Qin L.(2012)Microfluidics separationreveals the stem-cell-like deformability of tumor-initiating cells；
非专利文献6：R.Negishi et al.Development of the automated circulatingtumor cell recovery system with microcavity array，Biosensors andBioelectronics(2014)。
发明内容
在10ml的血液中，通常含有数百亿个红细胞、数千万个白细胞，但CTC等的稀有细胞为0～数个左右，多的时候数千个左右。另外，这些稀有细胞中含有考虑为与上述的癌的转移之间的关联性的细胞或者免疫细胞等医学上重要的细胞，因此预测到今后更盛行血液中的稀有细胞的分析，要求更简单且丢失少的方法。因此，直接分析CTC时存在很多技术问题，例如需要分离浓缩等的处理。因此，期待更有效地从血液中分离浓缩CTC的技术的开发。
分离浓缩CTC的技术中存在几个方法，其中已报告使用抗体的分离浓缩的技术或者利用过滤器的分离浓缩的技术(非专利文献1)。非专利文献1中公开了一种使用具有φ8μm的孔的过滤器、大部分的血细胞通过过滤器、使CTC残留在过滤器上的分离浓缩技术。如非专利文献1中公开的方法，利用过滤器的分离浓缩方法与使用抗体的分离浓缩方法不同，作为不依赖于CTC的表面抗原的方法而被期待。
CTC是对于医疗的发展非常有前途的细胞，如前述，在10ml的血液中只含有数个。在10ml中只含有2个CTC的情况下，根据泊松分布，在1ml的血液的处理时，即使能够不遗漏地捕获100％，也只能期待最高20％的检测率，但在能够大量处理血液的情况下，8ml中存在一个以上的CTC的概率接近90％。如果增加血液处理量并增加过滤器的数量，则会变复杂，因此期望一种一次能够适当处理更多的血液的过滤器。
专利文献2中公开了CTC比血细胞尺寸大、且比血细胞可变形性低。另一方面，已报告CTC中存在比φ8μm的孔尺寸小的癌细胞(例如，非专利文献1、2)或者可变形性高的癌细胞、且存在这些细胞的转移性高的可能性(例如，非专利文献4、5)。在使用CTC以高精度进行癌的诊断以及分析等时，对于这些细胞，也要求进行分离。
因此，本公开在一个或者多个实施方式中提供一种在血液试样中含有稀有细胞的情况下，能够有效且简单地捕获小型的稀有细胞和可变形性高的稀有细胞两者的过滤器以及血液试样的处理方法。
本发明在一个或者多个实施方式中涉及一种稀有细胞的分离或者检测方法，其包括使用过滤器对血液试样进行过滤处理，并分离或者检测血液试样中的稀有细胞，所述过滤器以孔密度为40个/mm2以上2000个/mm2以下、且长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm)之间的比例(w/z)为7.0以上130以下的方式包括短轴径为5μm以上8μm以下且长轴径为40μm以上的孔。
本发明在一个或者多个实施方式中涉及一种过滤器，该过滤器以孔密度为40个/mm2以上2000个/mm2以下、且长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm)之间的比例(w/z)为7.0以上130以下的方式包括短轴径为5μm以上8μm以下且长轴径为40μm以上的孔。
本发明在其他一个或者多个实施方式中涉及一种用于捕获试样中含有的稀有细胞的稀有细胞捕获装置，其包括供应口、排出口、用于连通所述供应口和所述排出口的流道、以及分离部，所述分离部被配置在相当于所述流道的一部分的位置上，并包括上述的过滤器以及过滤器保持部。
根据本发明，在一个或者多个实施方式中，在血液试样中含有稀有细胞的情况下，能够有效且简单地捕获小型的稀有细胞和可变形性高的稀有细胞两者。
附图说明
图1的A以及图1的B示出过滤器的照片，图1的A是本发明的过滤器(孔形状为狭缝形状)的一例，图1的B是比较例的过滤器(孔形状为椭圆)的一例；
图2示出本发明的稀有细胞捕获装置的一例；
图3是示出实施例1的结果的图，图3是短轴径中的小型的细胞的SW620的捕获率的结果；
图4是示出实施例2的结果的图；
图5是示出实施例3的结果的图；
图6是示出实施例4的结果的图；
图7的A以及图7的B是示出实施例5的结果的图，图7的A是系统整体的过滤压力(ΔP1)为0.4kPa的结果，图7的B是系统整体的过滤压力(ΔP1)为1.3kPa的结果；
图8是示出实施例8的结果的图；
图9是示出实施例9的结果的图；
图10是示出实施例10的结果的图；
图11是示出实施例11的结果的图；
图12是示出实施例12的结果的图。
具体实施方式
本发明者们从专利文献1～4以及非专利文献1～5的方法中发现以下的问题。
非专利文献1中公开的过滤器的孔密度不均匀，孔连结，可能变成比细胞大的孔，因此存在细胞容易逃离且不能获得高的捕获率的问题。
在专利文献1以及非专利文献2中，为了捕获小型的细胞，尝试通过使孔径变小来提高捕获率，但在φ5μm以下时，容易发生堵塞，并存在高压力引起的对细胞的破损、用于减少血细胞的溶血操作、过滤器的过滤尺寸变大等变复杂的问题。
专利文献2公开了利用血液和血液以外的细胞的粘弹性的不同而分离稀有细胞的内容。但是，在专利文献2中记载的条件中，存在以下问题：分离时的过滤膜的两侧产生的压力差为较高的20kPa～190kPa，分离时可能给稀有细胞带来破损，并且难以捕获可变形性高的稀有细胞。
专利文献3公开使用具备锥形部、狭窄部以及倒锥形部的狭缝过滤器而捕获CTC的内容。专利文献4以及非专利文献5中记载了具有狭缝形状的孔的过滤器中的稀有细胞的分离浓缩。但是，在专利文献4以及非专利文献5中记载的过滤器中，存在处理大量的血液、且不能同时进行可变形性大的细胞和小型的癌细胞的捕获两者。尤其在专利文献4的实施例中记载的过滤器中，在处理8～10ml的血液时，存在小型的癌细胞或者可变形性大的癌细胞的捕获率降低、不能处理大量的血液量的问题。
本发明基于以下而作出的：在减小过滤器的孔径时难以进行可变形性高的细胞的捕获，并在配合可变形性高的细胞的捕获率而增大孔径时小型的细胞容易脱离，进一步地，在圆形孔的过滤器中难以同时进行小型和可变形性高的癌细胞的捕获。本发明基于以下而作出：在一个或者多个实施方式中，通过使用以孔密度为40个/mm2以上2000个/mm2以下、且长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm)之间的比例(w/z)为7.0以上130以下的方式包括短轴径为5μm以上8μm以下且长轴径为40μm以上的孔的过滤器而进行血液试样的过滤处理，由此能够有效且简单地捕获血液试样中可能含有的小型的稀有细胞和可变形性高的稀有细胞两者。本发明基于以下而作出的：在一个或者多个实施方式中，通过使用上述过滤器而进行血液试样的过滤处理，能够降低过滤处理时的过滤压力条件(系统整体中的过滤压力或者过滤处理时的过滤器上表面和下表面之间的压力差)，其结果为，能够进一步地提高可变形性高的稀有细胞的捕获率，优选能够降低细胞捕获时给细胞带来的破损，能够进行活着的状态下的稀有细胞的回收。本发明基于以下而作出：在一个或者多个实施方式中，通过使用上述过滤器进行血液试样的过滤处理，例如尤其在针对过滤器的每个孔的过滤处理容量多的情况下，与椭圆孔或者圆孔的过滤器相比，能够降低试样间的差异引起的稀有细胞的捕获率的偏差，优选的是，即使是具有高浓度的血细胞比容或者白细胞的浓度的试样，也可以以高捕获率捕获稀有细胞。本发明基于以下而作出：在一个或者多个实施方式中，在处理8～10ml左右的大量的血液的情况下，有时稀有细胞的捕获率降低，但通过使用上述的本公开的过滤器、且过滤处理血液试样使得在换算成与过滤器的每个孔面积对应的处理容量时针对过滤器的每个孔的过滤器处理容量为0.1nl/μm2以上3nl/μm2以下，由此能够进一步提高可变形性高的稀有细胞的捕获率。这里，“针对每个孔的过滤器处理容量”是指通过一个孔能够处理的血液试样的量。
本发明的方法是使用过滤器的方法，因此在一个或者多个实施方式中，为了区别过滤器中捕获的血细胞成分以及CTC等的细胞，例如能够容易进行细胞的染色以及清洗，并能够容易观察过滤器中捕获的细胞。在过滤器上进行细胞的染色以及清洗或者细胞的观察的情况下，当过滤面积变大时，试剂量以及清洗量并且观察范围增大并变得复杂，因此期待抑制过滤面积的过滤器或者抑制体积的过滤器壳体。根据本发明的方法，在一个或者多个实施方式中，能够发挥相对于血液处理量抑制过滤器的过滤面积的效果。
[稀有细胞]
在本发明中，可能包含在血液中或者血液试样中的“稀有细胞”是指可能包含在人或者人以外的动物的血液中的细胞成分(红细胞、白细胞以及血小板)以外的细胞。在一个或者多个实施方式中，作为稀有细胞可以举出肿瘤细胞和/或癌细胞。通常，在血液中循环的肿瘤细胞或者癌细胞是指CTC。作为血液中的稀有细胞，根据试样，血液10ml中有时含有数个～数十个、多时数百个～数千个。在一个或者多个实施方式中，“稀有细胞”是选自由癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胎儿细胞、干细胞及其组合组成的组中的细胞。
[小型的稀有细胞]
本发明中的“稀有细胞”是指稀有细胞中的直径小的细胞，在一个或者多个实施方式中，可以举出能够从直径约为10μm的圆孔中脱离的大小的稀有细胞。
[可变形性高的稀有细胞]
本发明中的“可变形性高的稀有细胞”是指细胞大小为10μm以上、且可以通过直径为5μm以上6.5μm以下的圆形的过滤孔的细胞。在一个或者多个实施方式中，作为可变形性高的稀有细胞，可以举出在每个孔的血液试样处理量为14nl以上且每个孔为5nl/min以上20nl/min以下、并向具备直径为5μm以上6.5μm以下的圆孔的过滤器中输送全血的情况下，相比相同程度的尺寸的稀有细胞更容易通过孔(通过孔的细胞的比率多)的稀有细胞。在一个或者多个实施方式中，作为可变形性高的癌细胞，可以举出SNU-1等。
[血液试样]
本发明中的“血液试样”是指能够应用到本发明的处理方法中的、含有构成血液的成分的样品，可以举出含有血液、红细胞成分的血液来源物、混合血液或者血液来源物的体液或者尿、以及由它们调制的样品等。作为血液，可以举出从活体中采集的血液，作为所述活体，可以举出人或者人以外的动物(例如，哺乳类)。作为含有红细胞成分的血液来源物，可以举出从血液中分离或者调制的且含有红细胞成分的或者其稀释/浓缩物，例如包括去除血浆的血细胞成分、血细胞浓缩物、血液或者血细胞的冻干燥物、溶血处理全血且去除红细胞的成分的样品或者溶血样品、离心分离血液、自发沉淀血液、清洗血细胞、或者特定的成分等。在这些之中，在没有限制的一个或者多个实施方式中，从简单且迅速处理的观点以及抑制对血液中的稀有细胞的破损观点出发，作为含有所述血液的样品，优选含有血液或者血细胞成分的源自血液的血细胞。
在本发明中，通过过滤器的每个孔的血液试样的容量以从人体中采集的血液、即每1μl含有1000～20000个白细胞的血液为基准。因此在使用稀释的血液试样的情况下，基于白细胞数量，能够将该稀释血液试样换算成稀释前的血液试样容量。即，例如在处理10倍稀释的血液试样的情况下，处理「X」μl/孔的容量的所述稀释血液试样相当于处理「X/10」μl/孔的容量的所述稀释血液试样。
[血液试样的处理方法]
在一个方式中，本发明涉及包含过滤处理血液试样的方法(以下，也称为“本发明涉及的处理方法”)。
<过滤器>
在一个或者多个实施方式中，用于本发明涉及的处理方法中的过滤处理的过滤器是具有多个贯通孔的狭缝形状的过滤器，各孔的短轴径为5μm以上8μm以下、且长轴径为40μm以上。在一个或者多个实施方式中，形成于过滤器中的多个贯通孔中优选其尺寸实质上均匀，更优选短轴径以及长轴径实质上相同。在一个或者多个实施方式中，作为短轴径实质上相同，可以举出过滤器中含有的贯通孔的短轴径被包含在通过下述方法获得的短轴径的平均值±1μm以内、±0.5μm以内、±0.4μm以内、±0.3μm以内或者±0.2μm以内。另外，作为长轴径实质上相同，可以举出被包含在通过与上述同样的方法获得的长轴径的平均值±3μm以内、±2μm以内、±1μm以内、±0.5μm以内、±0.3μm以内或者±0.2μm以内。
在一个或者多个实施方式中，从提高小型的稀有细胞的捕获率的观点出发，短轴径是5μm以上、大于5μm、5.5μm以上、6μm以上或者6.5μm以上，从相同的观点出发，短轴径是8μm以下、小于8μm、7.5μm以下、7μm以下或者6.5μm以下。本发明中的“短轴径”是指外切到孔的长方形的短边(参照图1的A)。例如使用金属显微镜、激光显微镜等的市售的光学显微镜或者电子显微镜，通过附带于所述显微镜的软件或者市售的图像分析软件以公知的方法进行测定(50个以上)，并求出其平均，由此获得短轴径。具体而言，通过实施例中记载的方法能够求出。
在一个或者多个实施方式中，从提高可变形性高的稀有细胞的捕获率的观点出发，长轴径是40μm以上、50μm以上、60μm以上、70μm以上或者80μm以上，从抑制过滤器的偏转或者污垢等的发生、并提高稀有细胞的捕获率的观点出发，长轴径是5000μm以下、4000μm以下、3000μm以下、2000μm以下、1000μm以下、970μm以下、900μm以下、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、400μm以下、300μm以下、200μm以下、150μm以下、120μm以下、100μm以下、90μm以下或者80μm以下。本发明中的“长轴径”是指外切到孔的长方形的长边(参照图1的A)。长轴径例如使用金属显微镜、激光显微镜等的市售的光学显微镜或者电子显微镜，通过附带于所述显微镜的软件或者市售的图像分析软件以公知的方法进行测定(50个以上)，并求出其平均，由此获得长轴径。具体而言，通过实施例中记载的方法，能够求出。
用于本发明涉及的处理方法中的过滤处理的过滤器以40个/mm2以上2000个/mm2以下的孔密度包含具有上述的短轴径以及长轴径的孔。从进一步提高可变形性高的稀有细胞的捕获率的观点、以及抑制过滤面积的观点出发，孔密度(每1mm2的孔的数量)是45个/mm2以上、60个/mm2以上、70个/mm2以上、90个/mm2以上、200个/mm2以上、300个/mm2以上、400个/mm2以上、500个/mm2以上、600个/mm2以上或者700个/mm2以上，从相同的观点出发，孔密度是1500个/mm2以下、1000个/mm2以下、900个/mm2以下或者800个/mm2以下。通过公知的方法，能够测定孔密度。例如以市售的光学显微镜中使用10倍～100倍的物镜拍摄图像，并使用所述显微镜中附带的软件或者市售的图像分析软件而能够从图像计算。
过滤器的过滤面中包含的孔的总数能够通过将过滤面积除以孔的中心之间的间隔的方法而能够求出。另外，除此之外，用孔密度乘以过滤面积的方法能够求出。具体而言，通过实施例中记载的方法能够求出。
在用于本发明涉及的处理方法中的过滤处理的过滤器中，具有上述的短轴径以及长轴径的孔形成为使得长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm))之间的比例(w/z)为7.0以上130以下。从提高小型的稀有细胞和可变形性高的稀有细胞两者的捕获率的观点、以及能够降低试样之间差异的分散的观点出发，w/z是7.3以上、超过7.3、7.5以上、8.0以上、8.5以上或者9.0以上或者10以上，从抑制过滤器的偏转或者污垢等的发生、并提高稀有细胞的捕获率的观点出发，w/z是130以下、129以下、120以下、100以下、90以下、80以下或者70以下。
本发明中的“短轴径侧的孔之间的空白(z)”是指连结分别与邻接短轴径方向上的孔外切的长方形之间的直线之中最短的直线。从提高小型的稀有细胞和可变形性高的稀有细胞两者的捕获率的观点、以及能够降低试样之间差异的偏差的观点出发，短轴径侧的孔之间的空白(z)是60μm以下、50μm以下、40μm以下、30μm以下、20μm以下、10μm以下，从抑制过滤器的偏转或者污垢等的发生、并提高稀有细胞的捕获率的观点出发，短轴径侧的孔之间的空白(z)是4μm以上、5μm以上、6μm以上、7μm以上、7.5μm以上、8μm以上、9μm以上、10μm以上。
例如使用金属显微镜、激光显微镜等的市售的光学显微镜或者电子显微镜，通过附带于所述显微镜的软件或者市售的图像分析软件以公知的方法进行测定(50个以上)，并求出其平均，由此获得短轴径侧的孔之间的空白(z)。具体而言，通过实施例中记载的方法，能够求出。
在一个或者多个实施方式中，从进一步提高可变形性高的稀有细胞的捕获率以及抑制过滤面积的观点出发，用于过滤处理中的过滤器的每个孔的面积是200μm2以上7000μm2以下。从相同观点出发，每个孔的面积是250μm2以上、260μm2以上、300μm2以上、350μm2以上、390μm2以上、400μm2以上、500μm2以上或者550μm2以上，从相同观点出发，每个孔的面积是6800μm2以下、6500μm2以下、6300μm2以下或者6000μm2以下。
在一个或者多个实施方式中，从进一步提高可变形性高的稀有细胞的捕获率以及抑制过滤面积的观点出发，过滤器的开口率是10％以上60％以下。这里，开口率是指形成孔的表面积相对于过滤器表面积的比例。从相同观点出发，过滤器的开口率是15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、31％以上、35％以上或者40％以上，从相同观点出发，过滤器的开口率是55％以下或者45％以下。通过公知的方法，能够测定开口率。例如使用市售的光学显微镜中的10倍～100倍的物镜拍摄图像，并使用所述显微镜中附带的软件或者市售的图像分析软件而能够从图像中求出。
在一个或者多个实施方式中，从提高小型的稀有细胞和可变形性高的稀有细胞两者的捕获率的观点出发，过滤器的厚度是1μm以上100μm以下。从降低过滤器的堵塞、且提高稀有细胞的捕获率的观点出发，过滤器的厚度是60μm以下、50μm以下、40μm以下、30μm以下、20μm以下、15μm以下或者10μm以下，从同样的观点出发，过滤器的厚度是2μm以上、3μm以上、4μm以上、5μm以上。
对于过滤器的材质，没有特别的限制，但在一个或者多个实施方式中，可以举出主要成分为聚碳酸酯(PC)、聚对二甲苯膜过滤器、杨氏模量1GPa以上的塑料材料、或者镍(Ni)、SUS、金、银、铜、铝、钨、铬等的金属、或者玻璃材料。另外，在观察过滤器上的细胞时，优选选择与观察时使用的染料或者荧光染色等对应的塑料、金属玻璃材料，可以由这些组合组成。
通过用于制作过滤器的现有的公知的方法，能够制作用于本发明涉及的处理方法中的过滤器。作为制作过滤器的方法，例如可以举出蚀刻、电铸加工、激光加工、溅射加工。过滤器可以根据目标从孔被整体或者部分图案化的板材中切出适当的尺寸而制作，也可以通过铸造方法制造一张板材。
<过滤处理条件>
在一个或者多个实施方式中，本发明涉及的处理方法中的过滤处理能够通过在流道内组装上述的过滤器、并将血液试样导入流道内，由此捕获CTC等的稀有细胞。
从进一步提高可变形性高的稀有细胞的捕获率的观点出发，本发明涉及的处理方法包括过滤处理血液试样，使得在换算成与过滤器的每个孔面积对应的处理容量时，针对过滤器的每个孔的过滤器处理容量为0.1nl/μm2以上3.0nl/μm2以下。从抑制过滤面积的观点出发，针对过滤器的每个孔的过滤器处理容量为0.1nl/μm2以上或者0.2nl/μm2以上，从捕获可变形性高的癌细胞的观点出发，过滤器处理容量为2.5nl/μm2以下、2nl/μm2以下、1.5nl/μm2以下或者1nl/μm2以下。
从进一步提高可变形性高的稀有细胞的捕获率的观点、以及减少给过滤处理时捕获的细胞带来的破损的观点出发，本发明涉及的处理方法中的过滤处理的过滤压力(ΔP1)为0.1kPa以上2.6kPa以下。从相同观点出发，过滤压力为0.1kPa以上或者0.2kPa以上，从相同观点出发，过滤压力为1.5kPa以下、1.3kPa以下、1.0kPa或者0.5kPa以下。本发明中的“过滤处理的过滤压力”是指从系统的入口至出口为止的系统整体的压力差，例如指含有包含从配置血液试样的罐至废液罐为止的流道的系统的压力差。因此，根据流道构造，也可以是记载以上的压力。过滤处理的过滤压力(系统的压力差)通过公知的方法并使用市售的压力计能够测定，或者从流道和流道结构的关系中计算出。
从进一步提高可变形性高的稀有细胞的捕获率的观点、以及减少给过滤处理时捕获的细胞带来的破损的观点出发，在一个或者多个实施方式中，本发明涉及的处理方法中的过滤处理时的过滤器上表面和下表面之间的压力差(ΔP2)为100Pa以下。从相同观点出发，在一个或者多个实施方式中，ΔP2为0.1Pa以上或者1Pa以上，从相同观点出发，ΔP2为70Pa以下、50Pa以下、30Pa以下、15Pa以下或者10Pa以下。本发明中的“过滤器上表面和下表面之间的压力差(ΔP2)”是指以过滤器为边界上下上产生的压力差(参照图2)。通过公知的计算式，能够计算出压力差。作为狭缝过滤器的压力差的计算方法，通过ΔP2＝Q/N0×12ηL/[(1-0.63)(h/w)]×(1/h3w)计算，其中，Q为总孔总计平均流量、h为短轴径、w为长轴径、L为孔的流道长度、η为输送的液体的粘性、π为圆周率、N0为孔的数量。血液是非牛顿液体，另外，即使在系统处于相同压力差，由于血细胞比容(Hct)不同引起的粘性，而改变平均流速。因此，平均流速具有一定的范围。在使用全血时的压力差的ΔP2设定中，为了方便，使用η＝4.5mPa·S，并且只要以计算时进入所述ΔP2内的方式设定输送液体或者压力即可。在因稀释等引起血液试样的血细胞比容值(Hct)小于20的情况下，只要设定为使用η＝1～2mPa·S的值计算时进入所述ΔP2内即可。或者，在稀释到血浆或者Hct引起的粘性影响变小为止的情况(例如，将全血稀释4～10倍的情况)下，根据该稀释液的粘性计算并输送液体即可。在使用注射泵等进行定流量输送液体的情况下，输送液体使得进入所述ΔP2即可。关于这样的输送液体的条件，本领域技术人员使用公知的能以一定的压力输送液体的机构或者以一定流量能够输送液体的机构而能够实现。
对于本发明涉及的处理方法中的过滤处理中的过滤面积，没有特别限制。在一个或者多个实施方式中，通过孔的数量(孔面积)和血液的处理量能够设定过滤面积。从抑制过滤面积且减少过滤处理后的染色操作以及标记操作的试剂使用量的观点、观察操作的方面以及有效捕获稀有细胞的观点出发，一个或者多个实施方式中，过滤面积是5mm2以上200mm2以下。从相同观点出发，过滤面积为10mm2以上，从相同观点出发，过滤面积为150mm2以下、100mm2以下或者80mm2以下。另外，从抑制相对于血液处理量的过滤器的过滤面积的观点出发，过滤面积为100mm2以下、80mm2以下、50mm2以下、40mm2以下、30mm2以下或者25mm2以下。
对于本发明的处理方法中的过滤处理中的向流道输送血液试样，没有特别的规定，只要有能够输送液体的驱动力即可。作为向流道的血液试样的导入，在一个或者多个实施方式中，能够例示使用从流道入口方向加压的方法、使用从流道的出口方向减压的方法、使用注射泵或者蠕动泵的方法等。由于向流道导入血液试样，因此针对过滤器的每个孔(1个)以1mm/min以上600mm/min以下的平均流速输送血液试样，由此与现有例相比，能够适当捕获稀有细胞。在一个或者多个实施方式中，血液试样的输送条件为2mm/min以上300mm/min以下的流速、3mm/min以上100mm/min以下的流速、4mm/min以上80mm/min以下的流速或者4mm/min以上40mm/min以下的流速。另外，可以从平均流量换算并设定输送液体条件。作为计算方法，测定单位时间的过滤废液出口的流量(总孔总计平均流量)或者单位流量的过滤时间并求出平均流量，并将其除以孔的数量，由此获得各孔的平均流量。另外，通过平均流量除以孔面积，能够求出平均流速。并且，只要以进入在前述各孔的平均流速或者平均流量的范围内的方式输送液体即可。在一个或者多个实施方式中，可以过滤废液出口的流量(总孔总计平均流量)除以总孔面积而计算。
[血液试样中的稀有细胞的分离或者检测方法]
通过进行本发明涉及的处理方法中的过滤处理，在过滤血液试样之后的过滤器上残留稀有细胞(如果存在)，能够进行稀有细胞的分离或者检测。因此，本发明在其他方式中涉及分离或者检测血液试样中的稀有细胞的方法，其包括通过本发明涉及的处理方法处理血液试样而进行稀有细胞的分离或者检测。
[对血液中的稀有细胞的标记处理]
在本发明涉及的处理方法中，可以进行对血液中的稀有细胞的标记处理。在一个或者多个实施方式中，标记处理可以在通过过滤处理进行的细胞的分离之前进行，可以在分离时并行进行，也可以在分离之后进行。稀有细胞的标记在上述的本发明涉及的分离或者检测方法以及后述的CTC数量测定方法中有用，另外，可以在分离之后的稀有细胞的分析中有用。因此，在一个或者多个实施方式中，本发明涉及的处理方法包括标记处理。另外，稀有细胞的标记在后述的CTC数量测定方法中有用，另外，可以在分离之后的稀有细胞的分析中有用。因此，在一个或者多个实施方式中，本发明涉及的分离或者检测方法包括标记处理。
在一个或者多个实施方式中，标记处理能够通过使公知的标记试剂接触稀有细胞而进行，典型地，能够通过使所述标记试剂混合到血液试样而进行。对于标记，没有特别的限制，在一个或者多个实施方式中，可以举出放射性标记、荧光染料标记、染料染色或者标记、磁性标记、电荷标记及其组合，能够通过适合它们的标记试剂而进行。
即，标记处理能够使用标记方法对稀有细胞进行标记，其中，该标记方法是能够用于选自利用发射性物质的检测方法、利用发光现象的检测方法、使用染料的检测方法、利用磁性的检测方法、电检测方法、光检测方法及其组合的组中的检测方法。
在本发明中的处理方法中，稀有细胞的分离或者检测还能够通过电、重量、光学的方法检测所述过滤器的变化来实现。
[血液试样中的稀有细胞的分析方法]
本发明在其他方式中可以涉及血液试样中的稀有细胞的分析方法，其包括在通过本发明涉及的分离或者检测方法进行稀有细胞的分离或者检测之后、通过包含该细胞的动态的观察或者活性测定的方法进行分析或该细胞的基因分析。即，根据本发明，能够捕获活细胞，因此在通过本发明涉及的分离或者检测方法分离或者检测了稀有细胞之后，能够通过包含该细胞的动态的观察或者活性测定的方法进行分析或者该细胞的基因分析。另外，可以在分离之后回收，并进行培养。除此之外，可以对目标细胞在过滤器上分析基因，或者从过滤器中回收目标细胞并分析基因。例如，存在染色体的分析或者单碱基的分析等，通过公知的技术而能够分析基因。
[CTC数量测定方法]
已报告血液中的CTC数量和癌的转移或者预后相关的内容，已知为了作为癌的诊断、预后诊断以及治疗效果的预测或者判断的指标而进行研究、且测定血液中CTC数量的内容。根据本公开涉及的处理方法和/或本发明涉及的分离或者检测方法，能够抑制对作为稀有细胞的CTC的破损并能够分离。因此，本公开在其他方式中涉及所述血液试样中的CTC数量的测定方法，其包括通过本公开涉及的处理方法处理血液试样而进行稀有细胞的分离或者检测和/或通过本公开涉及的分离或者检测方法而从所述血液试样中分离CTC。此外，CTC数量的计测或者CTC的核酸的测定例如可以与基于癌细胞的形态观点的测定、或者进行适当的标记处理之后的通过流式细胞仪的分离同时进行，也可以在显微镜下观察并测定已分离的细胞。
[过滤器]
本发明在另一个方式中涉及一种过滤器，其用于本公开涉及的处理方法、本公开涉及的分离或者检测方法和/或本公开涉及的CTC数量测定方法，该过滤器以孔密度为40个/mm2以上2000个/mm2以下、且长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm)之间的比例(w/z)为7.0以上130以下的方式包括短轴径为5μm以上8μm以下且长轴径为40μm以上的孔。本发明涉及的过滤器的孔的形状等与用于上述的本发明涉及的处理方法的过滤器相同。
[稀有细胞捕获装置]
本公开在另一个方式中涉及一种用于捕获试样中含有的稀有细胞的稀有细胞捕获装置。在一个或者多个实施方式中，本发明涉及的稀有细胞捕获装置具有供应口、排出口、用于连通所述供应口和所述排出口的流道、以及分离部，所述分离部配置于相当于所述流道的一部分的位置上，并包括本公开的过滤器和过滤器保持部。根据本公开涉及的稀有细胞捕获装置，使用本发明涉及的过滤器能够进行本发明涉及的血液试样的处理方法。
图2示出本发明涉及的稀有细胞捕获装置的一例。图2所示的稀有细胞捕获装置具有用于向过滤器供应试样、清洗液或者染色液等的供应口1、排出口2、用于连通供应口1和排出口2的流道3、以及配置于相当于流道3的一部分的位置上的分离部。分离部包括过滤器4以及用于保持过滤器4的过滤器保持器5。过滤器保持器5由能够设置过滤器4的支承部(底座)6、用于固定过滤器4的O环7以及罩8构成。通过在支承部(底座)6上设置过滤器4、过滤器4的上表面上载置O环7以及罩8、固定过滤器4，由此形成具备具有孔的过滤器的分离部(过滤装置)。用于连接供应口1和分离部以及分离部和排出口2的流道3通过在分离部的两端上连接轴管(Safeed tubes)(泰尔茂制造)而被形成。用于连接供应口1和分离部的流道3可以在分离部的上部配置连接部(未图示)以及能够进行液体的切换的三路活塞(未图示)。另外，可以在连接供应口1和分离部的流道3(作为由一定压力能够输送液体的机构或者由一定流量能够输送液体的机构)中通过配置加压装置9并使得施加到过滤中的压力变成一定，或者由注射泵抽出使得施加到过滤中的压力变成一定以上，由此输送液体。
本公开涉及的稀少细胞的分离盒或分离设备包括本公开的过滤器和保持所述过滤器的保持部，构成为能够相对于流路装卸。在一个或多个实施方式中，本公开涉及的稀少细胞的分离盒或分离设备是用于稀少细胞捕获装置的稀少细胞的分离盒或分离设备，包括本公开的过滤器、保持所述过滤器的保持部和连接部，所述连接部能够连接所述保持部和所述稀少细胞捕获装置的流路，来自所述稀少细胞捕获装置的血液试样能够在所述保持部和所述过滤器中流通，所述分离盒或分离设备构成为能够相对于所述稀少细胞捕获装置装卸。由此，在本公开涉及的稀少细胞捕获装置的一个或多个实施方式中，流路也可以包括能够装卸本公开涉及的稀少细胞的分离盒或分离设备的连接部。以图2的稀少细胞捕获装置为例进行说明，本方式的稀少细胞捕获装置在流路3的、加压装置9和分离部之间、以及分离部和排出口2之间的各个中包括连接部，通过连接部分离部能够从流路3装卸。此外，如此，相对于流路3能够装卸地形成的分离部是本公开涉及的稀少细胞的分离盒或分离设备的一例。但是，本公开的稀少细胞的分离盒或分离设备不限于这样的构成。
本发明能够涉及以下的一个或者多个实施方式。
(1)一种稀有细胞的分离或者检测方法，其包括使用过滤器对血液试样进行过滤处理，并分离或者检测血液试样中的稀有细胞，
所述过滤器以孔密度为40个/mm2以上2000个/mm2以下、且长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm)之间的比例(w/z)为7.0以上130以下的方式包括短轴径为5μm以上8μm以下且长轴径为40μm以上的孔。
(2)如(1)所述的方法，其中，
过滤处理血液试样，使得在换算成与过滤器的每个孔面积对应的处理容量时针对过滤器的每个孔的过滤器处理容量为0.1nl/μm2以上3nl/μm2以下。
(3)如(1)或(2)所述的方法，其中，
所述过滤器的开口率为10％以上60％以下。
(4)如(1)至(3)中任一项所述的方法，其中，
所述过滤处理中的过滤压力为0.1kPa以上2.6kPa以下。
(5)如(1)至(4)中任一项所述的方法，其中，
所述过滤处理时的过滤器上表面和下表面之间的压力差为100Pa以下。
(6)如(1)至(5)中任一项所述的方法，其中，
所述血液试样以所述过滤器的每个孔1mm/min以上600mm/min以下的平均流速向所述过滤器输送液体。
(7)如(1)至(6)中任一项所述的方法，其中，
所述稀有细胞是选自由癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胎儿细胞、干细胞及其组合组成的组中的细胞。
(8)一种血液试样中的稀有细胞的分析方法，其包括：
通过(1)至(7)中任一项所述的方法分离或者法检测稀有细胞之后，通过包含该细胞的动态的观察或者活性测定的方法进行分析或者该细胞的基因分析。
(9)一种过滤器，其用于(1)至(7)中任一项所述的方法，以孔密度为40个/mm2以上2000个/mm2以下、且长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm)之间的比例(w/z)为7.0以上130以下的方式包括短轴径为5μm以上8μm以下且长轴径为40μm以上的孔。
(10)一种用于捕获试样中含有的稀有细胞的稀有细胞捕获装置，其具有供应口、排出口、用于连通所述供应口和所述排出口的流道、以及分离部，所述分离部被配置在相当于所述流道的一部分的位置上，并包括上述的过滤器以及过滤器保持部。
(11)一种稀少细胞的分离盒或分离设备，包括(9)所述的过滤器、保持所述过滤器的保持部，所述分离盒或分离设备能够相对于流路装卸。
(12)一种分离盒或分离设备，是用于稀少细胞捕获装置的稀少细胞的分离盒或分离设备，包括(9)的过滤器、保持所述过滤器的保持部和连接部，所述连接部能够连接所述保持部和所述稀少细胞捕获装置的流路，来自所述稀少细胞捕获装置的血液试样能够在所述保持部和所述过滤器中流通，所述分离盒或分离设备构成为能够相对于所述稀少细胞捕获装置装卸。
(13)(12)所述的分离盒或分离设备，所述稀少细胞捕获装置是(10)所述的稀少细胞捕获装置。
实施例
以下，使用实施例以及比较例对本发明进行进一步的说明，但这些是示例性的，对于本发明的解释不局限于以下的实施例。
(过滤器的制作)
制作了表1所示的各种过滤器。#3～14的过滤器的孔的形状是图1的A所示的狭缝形状，#2的过滤器的孔的形状是图1的B所示的形状。表1中的w是孔的长轴径(μm)，z是短轴径侧的孔之间的空白(μm)(参照图1的A)。
表1
通过使用市售的激光显微镜VK-8510(基恩士)中的10倍～100倍的物镜，使用显微镜用的摄像机拍摄过滤器中央部以及端部(上、下、左、右)的孔，并使用显微镜中附带的软件或者市售的图像分析软件计测其拍摄的图像中的、与各孔外切的长方形的长边以及短边(孔为50个以上)，并求出其平均，由此获得过滤器的长轴径(w)以及短轴径。另外，除了激光显微镜以外，在金属显微镜、倒置显微镜或者显微镜中同样也可以测定，优选用在1μm以下也能够测定的倍率进行拍摄。
通过以市售的光学显微镜中用10倍～100倍的物镜拍摄过滤器，使用显微镜中附带的软件，从其拍摄的图像中测量连结短轴径方向上相邻的孔的外切长方形之间的直线之中最短的长度(50处)，由此获得孔之间的空白(z)。或者，孔之间的空白是实质上均匀，因此通过测量长轴径的长度的中间点的短轴径的长度(50处)并求出其平均而能够求出。
总孔数是以市售的光学显微镜使用10倍～100倍的物镜拍摄过滤器，并直接计数过滤器中含有的孔的数量而获得。或者，每单位面积的孔密度中乘以过滤面积而求出总孔数。
孔密度通过测量各孔之间的中心之间的间隔的长度、并从平均值中计算1mm2的孔数而被求出。
(小型的癌细胞样品的调制)
[SW620样品]
按照常用的方法，在培养皿中培养作为粘附细胞的人结肠癌(细胞株名SW620)之后，去除培养基，接着添加PBS(-)清洗并去除培养基成分之后，进行胰蛋白酶(英杰公司)处理(37℃、3分钟)。向其中添加含血清培养基，并回收到15ml离心管。通过离心机(CR20F：日立)对其进行离心，并去除上清。再次悬浮在含血清培养基中，并进行回收。从培养液中回收了调制的癌细胞悬浮液之后，通过离心机(CR20F/日立制)在1500rpm、室温(24℃)下进行3分钟的离心。去除上清，添加PBS(-)而悬浮细胞。通过使用染色试剂CellTracker(英杰公司)对该PBS(-)中悬浮的细胞进行荧光染色。CellTracker溶解于DMSO中以使得达到10mM之后，添加到细胞悬浮液使得反应时的浓度变成最终浓度0.5～0.25μM。并且，反应之后，对细胞悬浮液进行离心并去除上清，再次悬浮在PBS中。通过反复进行该操作，进行未反应液的去除和细胞的清洗。此后，使用培养基或者PBS(-)进行悬浮使得细胞的悬浮液的浓度变成任意的浓度(10个/mL～5×104个/mL左右)。
接着，将采集到采血管(EDTA-2K)中的血液(含白细胞数3000M0000个/μl)的一部分添加到与过滤装置连通的血液过滤用试样容器之后，将10μ的染色的癌细胞悬浮液添加到相同的血液过滤用试样容器内的血液中，添加剩余的血液并混合，由此调制血液试样。由于SW620的直径为13μm左右，因此将SW620作为模型。
(可变形性高的癌细胞样品的调制)
[SNU-1样品]
作为浮游系统的人胃癌细胞株(细胞株名SNU-1)不进行胰蛋白酶处理，回收在15ml离心管。除了使用回收的癌细胞悬浮液以外，与SW620样品的调制同样地，进行荧光染色以及添加到血液，并调制血液试样。SNU-1的细胞直径为16.8μm，但与SW620相比，容易通过直径为6.5μm的孔。
[Colo320DM样品]
由于人大肠癌(细胞株名Colo320DM)中存在一部分与浮游细胞粘附的细胞，因此浮游的细胞回收到15ml离心管，粘附的细胞与SW620同样进行胰蛋白酶处理之后，回收到相同离心管。除了使用回收的癌细胞悬浮液以外，与SW620样品的调制相同，进行向荧光染色以及血液的添加，并调制血液试样。Colo320DM的细胞直径是14μm，但与SW620相比，容易通过直径为6.5μm的孔。
在以下的实施例以及比较例中，将SNU-1以及Colo320DM作为容易变形和通过的细胞(可变形性高的细胞)的模型使用。
(比较例1)
在图2所示的稀有细胞捕获装置中配置过滤器#1(长轴径：6.5μm、短轴径：6.5μm、w/z：0.9)，使用SW620样品、SNU-1样品以及Colo320DM样品，在下述过滤条件下进行过滤，并进行细胞的分离回收。过滤结束之后，以ΔP1＝0.4kPa输送PBS(-)等的缓冲液并进行过滤器的清洗，缓慢拆除被连接在分离部之上的连接部，在过滤器上部上缓慢载置载玻片，并制作观察面。将其设置在荧光显微镜上，并对过滤器上残留的、被荧光染色的癌细胞进行计数。另外，另行将与添加到血液中的量等量的所述癌细胞悬浮液添加到微孔板，通过荧光显微镜对细胞数量进行计数。以微孔板内的细胞数量为分母，以过滤器上残留的作为分子而进行计算，计算出捕获率。下述表2示出其结果。
<过滤条件>
总血液试样处理量：1ml、4ml、8ml
系统整体的过滤压力(ΔP1)试样过滤时：1.3kPa
表2
专利文献5(日本专利特开2011-163830号公报)中公开了在使用10μm直径的尺寸选择微阵列的情况下，SW620的平均回收率为38％。与此相对，可知根据具备直径为6.5μm的圆孔的过滤器#1，能够以超过90％的高的捕获率捕获SW620。另一方面，作为细胞直径比SW620大且可变形性高的癌细胞的SNU-1以及Colo320DM与SW620相比捕获率低。并且，可知当血液量处理量增加时，尤其可变形性高的细胞的捕获率进一步降低。可知在具备直径为6.5μm的圆孔的过滤器中，不能充分捕获可变形性高的癌细胞。
在过滤器#1中，为了维持两者的高捕获率，考虑到进一步降低血液处理量，或者增大过滤面积。除此之外，也存在增大孔密度的方法，但由于对过滤器的耐久性带来影响，因此不优选。
(实施例1)
为了确认小型的癌细胞的捕获性能，将开口率和长轴径(w)相同且短轴径不同的过滤器#3、4或者5配置在如图2所示的稀有细胞捕获装置，使用SW620样品在下述的过滤条件1或2下进行过滤并进行细胞的分离回收，并求出SW620的捕获率。分离回收以及捕获率的计算与比较例1相同。图3示出其结果。此外，过滤器上下的压力差(ΔP2)通过ΔP2＝Q/N0×12ηL/[(1-0.63)(h/w)]×(1/h3w)如前所述作为前述η＝4.5mPa计算。
<过滤器>
过滤器#3(短轴径：5.0μm、长轴径：88μm、w/z：9.8)
过滤器#4(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、w/z：7.3)
过滤器#5(短轴径：8.0μm、长轴径：88μm、w/z：6.1)
<过滤条件>
图3是示出孔的短轴径和小型的细胞(SW620)的捕获率之间的关系的图。如图3所示，作为直径比较小的细胞的SW620在处理量为2ml的情况下，在任何过滤器中也能以超过80％的捕获率回收，其中，短轴径为6.5μm的过滤器#4的捕获率最高。另一方面，在处理为8ml的情况下，短轴径为6.5μm的过滤器#4的捕获率最高，但在短轴径为8μm的过滤器#5中确认到捕获率低于80％。
使用作为易变形的细胞的SNU-1而进行相同的测定的结果为，短轴径5μm的过滤器#3的捕获率最低(未示出数据)。
(实施例2)
除了使用具有相同的短轴径以及开口率的过滤器#6、4、7或8(开口率：31％)并设为下述的过滤条件以外，与实施例1同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。样品使用了SNU-1样品。图4示出其结果。
<过滤器>
过滤器#6(短轴径：6.5μm、长轴径：0μm、w/z：5.3)
过滤器#4(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、w/z：7.3)
过滤器#7(短轴径：6.5μm、长轴径：200μm、w/z：15.4)
过滤器#8(短轴径：6.5μm、长轴径：500μm、w/z：35.7)
<过滤条件>
图4是示出w/z和捕获率之间的关系的图。如图4所示，任何w/z为7.0以上的过滤器均能以超过80％的高的捕获率回收SNU-1。另外，能够确认到即使具有相同的开口率，w/z的值越大越能以高的捕获率回收。另外，考虑由于能够以过滤处理时的系统整体的过滤压力(ΔP1)0.4kPa(过滤器上下的压力差(ΔP2)的计算值：2Pa～3Pa)的低的压力回收，因此也能降低对回收的稀有细胞的破损。
(实施例3)
除了使用短轴径和z(短轴径侧的孔之间的空白)相同的过滤器#9或者10(短轴径：6.5μm、z：7.5μm)、且将过滤条件设为下述3或4以外，与实施例2同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。图5示出其结果。此外，作为参考例，除了使用孔的形状为圆的过滤器#1(短轴径侧的孔之间的空白(z)＝7.5μm)以及孔的形状为椭圆形的过滤器#2(短轴径侧的孔之间的空白(z)＝7.5μm)，并设为下述的参考过滤条件1或2以外，同样地进行。
<过滤器>
过滤器#1(短轴径：6.5μm、长轴径：6.5μm、w/z：0.9)
过滤器#2(短轴径：6.5μm、长轴径：9.8μm、w/z：1.3)
过滤器#9(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、w/z：11.7)
过滤器#10(短轴径：6.5μm、长轴径：968μm、w/z：129.1)
<过滤条件>
图5是示出w/z和捕获率之间的关系的图。如图5所示，过滤器#9以及10(w/z为7以上)均能以超过90％的高的捕获率回收SNU-1。尤其过滤器#9(长轴径：88μm、w/z：11.7)与过滤器#10(长轴径：968μm、w/z：129.1)相比，偏转或者污垢的发生降低，并能以接近100％的捕获率回收。
(实施例4)
除了使用具有相同的短轴径以及长轴径(w)的过滤器#4或9、且将过滤条件设为下述5～8中的任何一个以外，与实施例2同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。图6示出其结果。
<过滤器>
过滤器#4(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、长轴径：7.3)
过滤器#9(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、w/z：11.7)
<过滤条件>
图6是示出w/z和捕获率之间的关系的图。图6中的白色的图是示出总血液试样处理量2ml(过滤条件5或7)的结果的图，黑色的图是示出总血液试样处理量8ml(过滤条件6或8)的结果的图。如图6所示，w/z为7.3的过滤器#4在总的血液试样处理量为8ml时能够看到捕获率的降低，但在2ml时获得高的捕获率。令人惊讶的是，w/z为11.7的过滤器#9与总的血液试样处理量无关，能以接近100％的高的捕获率捕获SNU-1。
从固定开口率、短轴径、长轴径以及z中的一个或者两个、且使w/z变化的实施例1～4的结果中确认到，通过将w/z设为7以上，能够提高可变形性高的细胞的捕获率，进一步地，在增加总血液处理量的情况下，也能够提高捕获率。
(实施例5)
除了使用过滤器#9(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、w/z：11.7)、并改变总的血液试样处理量以外，与实施例2同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。过滤时的压力如以下所示。表7示出其结果。
<过滤条件>
系统整体的过滤压力(ΔP1)：0.4kPa
表7
如表7所示，均能以超过70％的捕获率回收SNU-1。另外，确认到通过将每孔面积的处理量设为超过0.1nl/μm2且3.1nl/μm2以下的范围，能以更高的捕获率回收SNU-1。
(实施例6)
除了使用过滤器#9或10、将总血液试样处理量设为8ml、过滤条件设为下述9～12的任一个以外，与实施例2同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。图7的A以及图7的B示出其结果。此外，作为参考例，使用孔形状为椭圆形的过滤器#2，通过下述的参考过滤条件3或4同样地进行。
<过滤器>
过滤器#2(短轴径：6.5μm、长轴径：9.8μm、长轴径：1.5)
过滤器#9(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、长轴径：11.7)
过滤器#10(短轴径：6.5μm、长轴径：968μm、长轴径：129.1)
<过滤条件>
替代SNU-1样品使用SW620样品，与实施例2～6同样地进行实验时，在任何过滤器和条件下均能以接近90％或90％以上的高的捕获率捕获SW620(数据未示出)。
图7的A以及图7的B是示出各过滤器的捕获率的分散的图，图7的A示出系统整体的过滤压力(ΔP1)为0.4kPa(过滤条件9及10并且参考过滤条件3)的结果，图7的B示出系统整体的过滤压力(ΔP1)为1.3kPa(过滤条件11及12并且参考过滤条件4)的结果。能够确认到如图7的A以及7的B所示，在任何压力条件下，过滤器#9及10与过滤器#2相比，分散小且试样之间差异小。尤其能够确认到在任何压力条件下，过滤器#9均示出高的捕获率，分散非常小。
(实施例7)
作为癌细胞样品，使用SNU-1、SW620、Colo320DM、人肺癌(细胞株名NCI-H1703)、人肺癌(细胞株名A549)、人肺癌(细胞株名NCI-H1975)、人肺癌(细胞株名NCI-H69)以及人肺癌(细胞株名HCI-H1603)，由此进行细胞的捕获以及捕获率的计算。血液样品的调制与上述的小型的癌细胞样品的调制同样地进行。另外，关于凝集块多的细胞(例如，NCI-H69)，由于细胞的计数中产生分散，因此按照分散试剂FACSmax(Genlantis)和协议使细胞分散之后，使用20μm孔的尼龙网格过滤器(密理博)、过滤面积φ13mm的过滤器，去除没有分散而残留的凝集块，使用过滤液中的细胞悬浮液。作为过滤器，使用了除了过滤面积不同以外，短轴径、长轴径以及w/z相同的过滤器#9及#11(w/z＝11.7、长轴径＝88μm、短轴径＝6.5μm)。过滤条件如下。下述表10以及11示出其结果。
<过滤条件>
表10
表11
表10示出过滤器#9(过滤面积：20mm2)的捕获率，表11示出过滤器#11(过滤面积：79mm2)的捕获率。如上述表10以及11所示，不论浮游细胞或粘附细胞，均能有效捕获多种细胞。另外，不论过滤面积如何，均能够有效捕获多种细胞。
(实施例8)
使用高Hct(Hct值高)试样而进行癌细胞的捕获。
首先，进行高Hct试样的调制。将采集的血液分别分到2支15ml的离心管中，使用离心机以1500×g进行10分钟左右的离心处理。进行离心之后，另行将分离的血浆的层分到15ml的离心管中。将只有血细胞层的两支离心管中的一支离心管的红细胞层添加到另一个离心管中，接着，添加取出的血浆使得Hct值变成60以上，由此调制高Hct血液试样。接着，除了替代血液使用调制的高Hct血液试样以外，与上述的SNU-1试样同样地，调制了高Hct试样。此外，调制的高Hct血液试样的Hct值使用血细胞计数测定装置SB-1440(爱科来)而求出。
除了使用调制的高Hct试样(三种)以及过滤器#9或者11、且使过滤条件作为下述13～15中的任一个以外，与实施例1同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。图8示出其结果。
如图8所示，即使是Hct超过60％的高Hct试样，也能以超过90％或者接近90％的高的捕获率捕获SNU-1细胞。
(实施例9)
使用高白细胞数(白细胞数多)试样，进行了癌细胞的捕获。
首先，进行了高白细胞数试样的调制。将使用HetaSep(STEMCELLTechnologies)而分离回收的白细胞与血液混合，调制了高白细胞数的血液试样，接着，除了替代血液使用调制的高白细胞数的血液试样以外，与上述的SNU-1试样同样地，调制高Hct试样。此外，调制的高白细胞数试样的白细胞数使用血细胞计数测定装置SB-1440(爱科来)而求出。
除了使用调制的高白细胞数试样以及过滤器11、且使过滤条件作为下述以外，与实施例1同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。图9示出其结果。
<过滤条件>
如图9所示，即使是白细胞数量超过10,000个/μL的高白细胞数试样，也能以超过80％的高的捕获率捕获SNU-1细胞。
(比较例2)
使用与非专利文献6中记载的过滤器相同的孔配置的过滤器(短直径8μm×长直径100μm、W/Z＝6.7)，并使用SW620试样、SNU-1试样以及NCI-H69试样而进行捕获率的评价。过滤条件以0.4kPa输送各血液试样8ml，与实施例1同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。下述表14示出获得的捕获率。另外，在相同过滤条件下使用过滤器#9进行了捕获实验。将其结果一并在下述表14中示出。
表14
如上述表14所示，过滤器#9(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、w/z：11.7)获得90％以上的捕获率，与非专利文献6中公开的过滤器相比，针对大肠癌细胞、胃癌细胞以及肺癌细胞的任何一个细胞，都示出高的捕获率。因此，可以说通过使用过滤器#9这样的本发明的过滤器，与非专利文献6的过滤器相比，能够实现小型的癌细胞以及易变形的细胞的捕获率的提高。
(实施例10)
除了使用开口率、短轴径以及长轴径(w)相同的过滤器#4或12、并使用SW620试样以及SNU-1试样并设为下述过滤条件16以外，与实施例1同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。图10示出其结果。
<过滤器>
过滤器#4(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、w/z：7.3)
过滤器#12(短轴径：6.5μm、长轴径：88μm、w/z：11.7)
<过滤条件>
图10是示出w/z和捕获率的关系的图。图10中的白色的图是示出SW620试样的结果的图，黑色的图是示出SNU-1试样的结果的图。如图10所示，只要w/z为7以上，就能以80％以上的捕获率捕获SW620以及SNU-1，尤其只要w/z为11以上时，就能以超过90％的高的捕获率捕获SW620以及SNU-1。
(实施例11)
除了使用过滤器的厚度不同的过滤器#11、13或者14、并使用SW620以及SNU-1并设为下述过滤条件17以外，与实施例1同样地进行细胞的捕获以及捕获率的计算。图11示出其结果。
<过滤器>
过滤器#11(长轴径：88μm、w/z：11.7、厚度：5μm)
过滤器#13(长轴径：88μm、w/z：11.7、厚度：3μm)
过滤器#14(长轴径：88μm、w/z：11.7、厚度：15μm)
<过滤条件>
图11是示出过滤器的厚度和捕获率的关系的图。图11中的涂白的图是示出SW620试样的结果的图，涂黑的图是示出SNU-1试样的结果的图。如图11所示，在任何厚度的情况下，都能以90％以上的高的捕获率捕获SW620以及SNU-1。
(实施例12)
除了使用#9、并使用含有的细胞的数量不同的多个SNU-1试样并设为下述过滤条件18以外，与实施例1同样地，进行细胞的捕获以及捕获率的计算。图12示出其结果。
<过滤条件>
图12是示出试样中含有的细胞数量和捕获的细胞数量的关系的图。如图12所示，不论试样中含有的细胞的数量如何，均能以高的捕获率捕获SNU-1细胞。

Claims (11)

1.一种稀有细胞的分离或者检测方法，所述方法包括：
使用过滤器对血液试样进行过滤处理，并分离或者检测血液试样中的稀有细胞，
所述过滤器以孔密度为40个/mm2以上2000个/mm2以下、且长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm)之间的比例(w/z)为7.0以上130以下的方式，包括短轴径为5μm以上8μm以下且长轴径为40μm以上的孔。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
以在换算成与过滤器的每个孔面积对应的处理容量时、针对过滤器的每个孔的过滤器处理容量为0.1nl/μm2以上3nl/μm2以下的方式过滤处理血液试样。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
所述过滤器的开口率为10％以上60％以下。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中，
所述过滤处理中的过滤压力为0.1kPa以上2.6kPa以下。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，
所述过滤处理时的过滤器上表面和下表面之间的压力差为100Pa以下。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，
以所述过滤器的每个孔1mm/min以上600mm/min以下的平均流速向所述过滤器输送所述血液试样。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，
所述稀有细胞是选自由癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胎儿细胞、干细胞及其组合组成的组中的细胞。
8.一种血液试样中的稀有细胞的分析方法，其包括：
通过1至7中任一项所述的方法分离或者检测稀有细胞之后，通过包含该细胞的动态的观察或者活性测定的方法进行分析或该细胞的基因分析。
9.一种过滤器，其用于1至7中任一项所述的方法，所述过滤器以孔密度为40个/mm2以上2000个/mm2以下、且长轴径w(μm)和短轴径侧的孔之间的空白z(μm)之间的比例(w/z)为7.0以上130以下的方式包括短轴径为5μm以上8μm以下且长轴径为40μm以上的孔。
10.一种稀有细胞捕获装置，用于捕获试样中含有的稀有细胞，所述稀有细胞捕获装置包括：
供应口、排出口、用于连通所述供应口和所述排出口的流道、以及分离部，
所述分离部被配置在相当于所述流道的一部分的位置上，并包括权利要求9所述的过滤器以及所述过滤器的保持部。
11.一种稀有细胞的分离盒或分离设备，包括权利要求9所述的过滤器和保持所述过滤器的保持部，能够相对于流路装卸。
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