JP5961889B2 - 末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス、希少細胞分離用デバイス、末梢循環腫瘍細胞分離方法及び希少細胞分離方法 - Google Patents
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Description
[1] 体液中の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞を捕捉することができる窪みと、該窪みに形成され前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞以外の体液細胞を通過させることができる孔とを有し、材質がパラジウム・ニッケル合金である金属フィルターを備えた末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
[2] 前記窪みの直径は20〜30μmであり、前記窪みの深さは5〜15μmである[1]に記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
[3] 前記孔の直径は7〜10μmである[1]又は[2]に記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
[4] 前記窪み及び前記孔の孔密度は1cm2あたり1×104〜2×105個である[1]〜[3]のいずれか1つに記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
[5] 前記金属フィルターの厚さは、10〜40μmである[1]〜[4]のいずれかに記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
[6] 前記金属フィルターを装着するためのフィルターカセットを有する[1]〜[5]のいずれかに記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
[7] [1]〜[6]のいずれかに記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイスに、がん患者の血液、腹水又は腹腔洗浄液から選択される体液を注入して、該体液中の前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞を、前記金属フィルターの前記窪みで捕捉した後、生きたまま回収する末梢循環腫瘍細胞分離方法又は希少細胞分離方法。
[8] 前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞を特異的に染色することをさらに含む、[7]に記載の末梢循環腫瘍細胞分離方法又は希少細胞分離方法。
[9] 前記体液を希釈又は前処理することを含む、[7]又は[8]に記載の末梢循環腫瘍細胞分離方法又は希少細胞分離方法。
[10] 前記前処理が、前記体液を磁性ナノ粒子含有カチオン性リポソームと混合して、前記体液中の前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞及び白血球細胞中に前記磁性ナノ粒子を取り込ませたのち、前記金属フィルターに通じる流路に流し込み、前記金属フィルターの前に配置された磁石で磁性ナノ粒子を取り込まない赤血球等の細胞を該体液から除去することを含む、[9]に記載の末梢循環腫瘍細胞分離方法又は希少細胞分離方法。
本明細書中の「CTC」とは、がん患者の血液に含まれる循環腫瘍細胞であり、血液細胞等の体液細胞に比べて非常に細胞数が少ない希少な細胞をいう。
本実施形態はさらに、多孔性の金属フィルター17を備えたことを特徴とする、血液等の体液からCTC又は希少細胞を分離するためのデバイスを提供する。
その結果、血球細胞などのコンタミネーションが少ない状態で、CTC又は希少細胞を整列させることができる。しかも孔101の上に窪み102を設けることにより、一定の条件下では流体力学的に重力と逆方向の流れが発生すると考えられる。このため、CTCが孔101に深くトラップされることなく、従ってCTCにかかる剪断応力を最小限に抑えることができる。このため、CTC又は希少細胞の細胞傷害を最小限に抑えることができ、CTC又は希少細胞をほぼ100%の生存率でかつ約80%以上の回収率で分離することが可能である。
本実施形態はさらに、上で説明した金属フィルター17を装着したデバイスを使用してがん患者の体液からCTC又は希少細胞を分離する方法を提供する。
[パラジウム・ニッケルフィルターの製作方法]
図8Aに示すように、基板19に感光性レジスト20を所定の厚さに塗布した。尚、基板19として、導電性のないシリコン基板やガラス基板を用いる場合は導電膜層(例えば銅)を付加するが、ステンレス基板、ニッケル基板、銅基板などの導電性を有するものでもよい。
このような工程を経て、パラジウム・ニッケルフィルター(「3Dフィルター」又は「Pd・Niフィルター」ともいう)を製作した。
[パラジウム・ニッケルフィルターの特徴づけ]
本パラジウム・ニッケルフィルターは、独自かつ高度の電鋳技術で微細加工して作製されるため、他のポリカーボネート、パリレンまたはシリコン製のフィルターにくらべて100,000/cm2以上の高孔密度、10%以上、通常50%以上の高開口率を達成できる。これにより全血の高速濾過が可能になり、目詰まりもなく、CTCの高率かつ迅速な回収が可能となった(図2Aおよび図2B)。また、平滑な表面性状や孔の均一性など高精度な加工と細胞毒性の少ないパラジウムを材質とすることが相まって細胞障害も大幅に低減しうる(図1A,図1B)。
[培養がん細胞を用いたCell Spike実験]
ヒト胃がん細胞MKN−45、GCIYおよびヒト大腸がん細胞COLM−5を、10%牛胎児血清を含むRPMI培地に、1.0×106個/10cm dishとなるように播種し、37℃/5%CO2下で静置培養した。培養3〜4日後、培地を吸引除去し、PBS(pH7.2)で洗浄した後、0.2%トリプシン/2mM EDTAを添加し、37℃/5%CO2下で3〜5分インキュベートした。検鏡し細胞がdishから剥離していることを確認して、血清を含むRPMI培地を加え、トリプシンの作用を停止させた後ピペッティングし、細胞を回収した。回収した細胞は遠心分離(1200rpm、3分)し、上清を吸引除去して新鮮なRPMI培地に再懸濁した。トリパンブルーを用いた色素排除法により生細胞数を計数し、1×106細胞/mlに調製後、新しいdishに播種した。
3Dフィルターを装着したCTC分離デバイスのリザーバーユニットに1mM EDTA/0.5%BSAを含むPBSを5ml導入してリザーバーおよびフィルターを洗浄した後、GFP導入あるいは非導入培養がん細胞 (50、500、又は5000個)を添加した血液(2〜2.5ml)をPBSで5〜10倍に希釈し導入した。約10分間の濾過後、残留する血球成分を洗浄するためPBSを5ml導入した。GFP非導入培養がん細胞の場合、PBS洗浄液を流しきった後、液量調節ねじを締め、流路を閉じた後、500μlの細胞染色液(Alexa488標識抗EpCAM抗体、PE標識抗CD45抗体およびHoechst33342。それぞれ0.5μg/ml)を導入した。GFP導入培養がん細胞の場合、後2者からなる細胞染色液を導入した。遮光して30分室温で反応させた後、液量調節ねじを開放し、細胞染色液を排出した。リザーバーに5mlの1mM EDTA/0.5%BSAを含むPBSを導入してフィルター上の細胞を洗浄した。この作業をPBSのみでもう1回行い、液量調節ねじを締めた後、CTC分離デバイスからフィルターカセットを直ちに取り出し、フィルターカセット上部の液貯めに100〜200μlのPBSを添加し、顕微鏡ステージに載せ、そのまま蛍光顕微鏡観察を行った。
3Dフィルターを装着したCTC分離デバイスには液量調節ねじがあり、自重によって流れる液量を調節することにより、流速を制御することができる。培養がん細胞500個を混合した10倍希釈血液(2.5mlの血液をPBSで10倍に希釈)を用いて、2ml/min、4ml/min、又は8ml/minに流速を変化させた場合の回収率を検討した。3Dフィルターは、窪みの直径30μm、窪みの深さ10μm、孔の直径8μm、孔密度99,178/cm2、千鳥格子配列のPd・Niフィルターを使用した。その結果、2ml/min、4ml/minでは各々約90%、80%と高い回収率を示したが、8ml/minでは70%以下であった。2〜4ml/minの流速であれば、80〜90%の回収率を得られることが分かったので、以降の実験はこの範囲の流速で行うこととした(図5A)。
5000個の培養がん細胞を混合した希釈血液(2.5mlの血液をPBSで10倍に希釈)を3Dフィルターで分離し、捕捉した細胞の生存率についてトリパンブルーを用いた色素排除法により計数した。3Dフィルターは、窪みの直径30μm、窪みの深さ10μm、孔の直径8μm、孔密度99,178/cm2のPd・Niフィルターを使用した。回収した細胞の生存率は99%で、非常に細胞傷害性の低い回収方法であることが示された。ただし、1mM以上のEDTA存在下で濾過した場合、回収したがん細胞の増殖性を見ると、対照(EDTA無添加)に比べて有意に低かった。しかし、抗凝固剤としてヘパリンを用い、コラーゲンコートdishを用いて接着を促進させると増殖性は有意に回復した。従って、EDTA存在下で濾過した場合の回収がん細胞の増殖性の低下はフィルターデバイスからのストレスよりも長時間のEDTA処理が原因と考えられた。
がん細胞の捕捉、整列および回収の効率を向上させる目的で、金属フィルターは図2Aに示すように貫通孔の上部に窪みを設けた3D形状に加工している。この形状は直径20〜30μm、深さ5〜15μmが望ましいが、先端径を40μm程度に加工したガラスキャピラリーを用いて捕捉した細胞を吸引回収する場合、窪みの直径は30μmの場合が最も回収しやすかった。窪みの深さ5μmと10μmとを比較すると、深さは5μmよりも10μmの方が、マニピュレーション等により液面が動いても細胞は捕捉された窪みから移動しにくいため、安定して、しかもコンタミネーションなく、目標とする1細胞の回収が可能であった(図4Bに、マニピュレーターでがん細胞1個を回収しているときの明視野像を示す。)。抗凝固剤としてヘパリンを用いると、細胞の金属フィルターへの接着性が増し(なお、EDTA存在下では細胞は金属フィルターへの接着性を殆ど示さない)、マニピュレーターによる細胞の回収率が低下した。従って、抗凝固剤は目的に応じて使い分ける必要があると考えられる。
[CTCモデルマウスからのCTCの分離]
in vitroの培養細胞とin vivoのCTCでは細胞の生存環境が著しく異なるため、健常人血液に培養がん細胞を添加するCell Spike実験だけではCTC分離デバイスの性能を正確に評価することは難しい。一方、患者の臨床検体では、がんの進行度(Stage)の異なる多数の症例を収集し、これを測定し、統計的に解析しないとデバイスの性能を評価することは難しい。これらに対し、がん細胞移植後、経時的に再現性をもってCTCが出現するマウス(以下「CTC モデルマウス」と呼ぶ)が存在すれば、CTC分離デバイスの性能の迅速かつ正確な評価が期待できる。また、CTCモデルマウスは、CTCの生体内におけるダイナミックスの解析など、CTCの基礎的な研究にも極めて有用である。そこで独自にCTCモデルマウスの作製を行った。
GFP遺伝子が導入されたことにより高輝度の緑色蛍光を発する転移性の高い、胃がん細胞株(GCIY−EGFP)と大腸がん細胞株(COLM5−EGFP)をそれぞれ、ヌードマウスの皮下に移植した。経時的にマウスを屠殺し、後大静脈から0.5〜1.0mlの血液を採取し、PBSで10倍希釈後にCTC分離デバイスでCTCを測定した。同時に倒立型蛍光顕微鏡で肺、肝、腎などの微小転移の有無を検討した。大腸がんCOLM5−EGFP皮下移植モデルでは、移植後1〜2ヶ月までは肺転移は少数の微小転移に限られ、CTC数もほとんど0(ゼロ)で、稀に1〜2個のCTCが検出された程度であった。一方、移植後2〜3ヶ月では、肉眼的にも肺転移が認められ、少数ながら肝、腎にも転移が認められ、このとき10〜100個程度のCTCが検出され、多いときには1000個以上のCTCが検出された(図6A及び図6Bに結果を示す)。胃がんGCIY−EGFP皮下移植モデルでも、肉眼的転移および全身転移の出現に合わせてCTCが検出された。同様に本デバイスを用いてマウスLewis肺がん細胞株(Lewis−GFP)を用いた肺がんモデルでも実験を行い、CTCの出現が肝、腎などへの多臓器転移と同期することを明らかにした。CTCが肉眼的転移や全身的転移と同期して出現することから、CTC検出は、がん転移の早期診断に有用である可能性が示唆された。また、CTCモデルマウスを用いた検討から、本デバイスはCTCの生体内動態を正確にとらえることができる充分な感度と精度を備えていることが示された。
[胃がん患者及び乳がん患者の末梢血からのCTC分離]
胃がん患者4名、乳がん患者6名、健常人4名の肘静脈からEDTA2Na入り採血管で5mlの採血を行った。胃がん患者4名および乳がん患者6名は、愛知県がんセンター中央病院(日本、名古屋)に入院した患者である。患者からの採血は、愛知県がんセンター倫理委員会(日本、名古屋)で承認され、患者から同意書を取得した上で行われた。
[磁性ナノ粒子による細胞の磁気分離の併用]
胃がん細胞N87を用いて、CTCの全回収を目指し、磁性ナノ粒子を用いた磁気分離(前処理)と、3D Pd・Niフィルターを用いた大きさによる分離とを併用し、回収率の向上を試みた。Magnetic Cationic Liposome(直径150nm)100pg/細胞をN87細胞100個の細胞懸濁液に2時間作用させ、白血球細胞20万個を含むウシ血清に混和させた後、磁気分離流路とフィルターを組み合わせたデバイスで捕捉した。約80〜90%の細胞を捕捉回収することができ、フィルター単独に比べて回収率の向上が認められた。
7・・空気孔
8・・液量調節ねじ
9・・ねじ機構(固定用)
10・・リザーバーユニット
11・・濾過ユニット(中にフィルターカセットを含む)
12・・流量調節ユニット
13・・液だめフタ
14・・排液回収ユニット(液だめベース)
15・・スタンド
16・・フィルターカセット(フィルターリングとも呼ぶ)
17・・金属フィルター
18・・隙間はめ(差込み式)
19・・基板
20・・感光性レジスト
21・・Crマスク
22・・紫外線
23・・パラジウム(Pd)・ニッケル(Ni)合金の析出成膜
24・・開孔
Claims (10)
- 体液中の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞を捕捉することができる窪みと、該窪みに形成され前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞以外の体液細胞を通過させることができる孔とを有し、材質がパラジウム・ニッケル合金である金属フィルターを備えた末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
- 前記窪みの直径は20〜30μmであり、前記窪みの深さは5〜15μmである請求項1に記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
- 前記孔の直径は7〜10μmである請求項1又は請求項2に記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
- 前記窪み及び前記孔の孔密度は、1cm2あたり1×104〜2×105個である請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
- 前記金属フィルターの厚さは、10〜40μmである請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
- 前記金属フィルターを装着するためのフィルターカセットを有する請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイス。
- 請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の末梢循環腫瘍細胞分離用デバイス又は希少細胞分離用デバイスに、がん患者の血液、腹水又は腹腔洗浄液から選択される体液を注入して、該体液中の前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞を、前記金属フィルターの前記窪みで捕捉した後、生きたまま回収する末梢循環腫瘍細胞分離方法又は希少細胞分離方法。
- 前記末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞を特異的に染色することをさらに含む、請求項7に記載の末梢循環腫瘍細胞分離方法又は希少細胞分離方法。
- 前記体液を希釈又は前処理することを含む、請求項7又は請求項8に記載の末梢循環腫瘍細胞分離方法又は希少細胞分離方法。
- 前記前処理が、前記体液を磁性ナノ粒子含有カチオン性リポソームと混合して、前記体液中の前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞及び白血球細胞中に前記磁性ナノ粒子を取り込ませたのち、前記金属フィルターに通じる流路に流し込み、前記金属フィルターの前に配置された磁石で磁性ナノ粒子を取り込まない赤血球等の細胞を該体液から除去することを含む、請求項9に記載の末梢循環腫瘍細胞分離方法又は希少細胞分離方法。
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