JP6464340B2 - 細胞のスライドグラス標本作製方法 - Google Patents
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Description
本開示は、目的細胞（血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞）の細胞のスライドグラス標本作製方法に関する。
血液中の循環癌細胞（Circulating Tumor Cell;以下、「CTC」とも称する）の分離、検出を行う装置として、多数の装置が報告されているが、Veridex社のCellSearch（登録商標）が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に唯一認可され、市販されている。
また、特開平６−２２１９７６号公報及び米国特許第５，１４３，６２７号公報には、喀痰などの一般の細胞診検体処理時に、フィルターを用いて、簡便、効率的に一般の細胞をスライドグラスに転写してスライドグラス標本を作成する装置及び方法が開示されている。しかし、これまでCTCのスライドグラス標本を作成する装置及び方法に関しては開示されていない。
上記のCellSearchなどの従来のCTC分離検出装置や方法は、CTCの判定を暗視野下で蛍光染色によるマーカー発現の組み合わせ(keratin+/EpCAM+/CD45-)で行うため、核のクロマチンパターンなどCTCの細胞形態学的な評価が不十分で、CTCを細胞診として評価することは不可能であった。かかる理由により、我が国ではCTC検出法は細胞診検査の対象とはなっておらず、従って保険適応もなされていない。CTCの検出法としては、従来の蛍光検出法がごく一部の検査会社により臨床試験用に外注検査として行われているのみで、一般病院で普及するには全く至っていない。
また、上記の特開平６−２２１９７６号公報や米国特許第５，１４３，６２７号公報に開示の検体処理方法並びに装置では、フラットな一般的なフィルターを用いているため、喀痰などの検体中に癌細胞が多数存在する場合には有効である。しかしながら、CTCなど血液1cc中に通常わずか数個程度しか存在しない極めて希少な細胞検体の場合は細胞が押し潰されたり、乾燥したりして細胞障害性が生じる結果、スライドグラスへの転写効率が悪化するため、スライドグラス標本の作成は不可能であった。
一方、本出願人は、特許第５９６１８８９号公報にて、血液中の末梢循環腫瘍細胞又は希少癌細胞を捕捉することができる窪みと、この窪みの底部に形成された孔を介して、血液細胞のみを濾過させ、末梢循環腫瘍細胞又は体液中の希少癌細胞を濃縮することができる金属フィルターを提示している。
本開示は、細胞のスライドグラス標本作製の装置及び方法として、上記の特許第５９６１８８９号公報で提示のフィルターを適用することにより、血液中の循環癌細胞や体液中の希少癌細胞である目的細胞を、簡便、迅速かつ高効率に分離し、かつ細胞障害性を最小限に抑えたまま効率よく転写したスライドグラス標本を作成することにより、一般病院の臨床検査室において免疫染色を含む細胞診断や遺伝子検査などに利用できるようにすることを目的とする。
本開示は、以下の特徴を包含する。
［１］血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞の少なくとも一方である目的細胞を捕捉する窪みとこの窪みに形成され非目的細胞を通過させる孔とを有するフィルターと、前記フィルターの前記目的細胞の捕捉側の面に重ねられ前記目的細胞が転写されるスライドグラスと、前記スライドグラスと反対側の前記フィルターの面に被せられ前記窪みの内部で前記目的細胞を浸漬させるための生理的緩衝液を封入するカバー部材と、前記スライドグラスを浸漬して前記スライドグラス上に転写された前記目的細胞を保存する保存液が貯められた容器と、を備えてなる細胞のスライドグラス標本作製装置。
［２］血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞の少なくとも一方である目的細胞を捕捉する窪みとこの窪みに形成され非目的細胞を通過させる孔とを有するフィルターを備え、前記フィルターにより前記非目的細胞から分離して前記目的細胞を捕捉する第１ステップと、前記フィルターの前記目的細胞の捕捉側の面がスライドグラスに対向するようにして前記フィルターを前記スライドグラスに重ね、前記フィルターにカバー部材を被せると共に、前記フィルターと前記スライドグラスとの間の前記目的細胞を生理的緩衝液に浸漬する第２ステップと、前記フィルターと前記スライドグラスとの間の前記目的細胞を、遠心力の作用下又は空気圧による加圧下で、前記スライドグラスに転写する第３ステップと、保存液が貯められた容器に前記スライドグラスを浸漬することにより、前記目的細胞を障害することなくスライドグラスからカバー部材及び前記フィルターを自然に剥離させ、保存する第４ステップと、を有する細胞のスライドグラス標本作製方法。
［３］血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞の少なくとも一方である目的細胞を捕捉する窪みとこの窪みに形成され非目的細胞を通過させる孔とを有するフィルターを備え、前記フィルターにより前記非目的細胞から分離して前記目的細胞を捕捉する第１ステップと、前記フィルターに捕捉された前記目的細胞を生理的緩衝液に入れる第２ステップと、前記生理的緩衝液中の前記目的細胞をスライドグラス上に密着させ、前記目的細胞を前記スライドグラスに生きたまま接着、転写させる第３ステップと、保存液が貯められた容器に前記スライドグラスを浸漬して、前記スライドグラス上に転写された前記目的細胞を保存する第４ステップと、を有する細胞のスライドグラス標本作製方法。
［４］［１］〜［３］の何れかに記載の細胞のスライドグラス標本作製装置又は細胞のスライドグラス標本作製方法により得られた細胞のスライドグラス標本上に筒状体を配置して、前記スライドグラス上に転写された前記目的細胞の周囲を前記筒状体で囲み、前記筒状体内にＤＮＡ又はＲＮＡの抽出液を所定時間保持し、前記目的細胞からＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する、ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出方法。
［１］血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞の少なくとも一方である目的細胞を捕捉する窪みとこの窪みに形成され非目的細胞を通過させる孔とを有するフィルターと、前記フィルターの前記目的細胞の捕捉側の面に重ねられ前記目的細胞が転写されるスライドグラスと、前記スライドグラスと反対側の前記フィルターの面に被せられ前記窪みの内部で前記目的細胞を浸漬させるための生理的緩衝液を封入するカバー部材と、前記スライドグラスを浸漬して前記スライドグラス上に転写された前記目的細胞を保存する保存液が貯められた容器と、を備えてなる細胞のスライドグラス標本作製装置。
［２］血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞の少なくとも一方である目的細胞を捕捉する窪みとこの窪みに形成され非目的細胞を通過させる孔とを有するフィルターを備え、前記フィルターにより前記非目的細胞から分離して前記目的細胞を捕捉する第１ステップと、前記フィルターの前記目的細胞の捕捉側の面がスライドグラスに対向するようにして前記フィルターを前記スライドグラスに重ね、前記フィルターにカバー部材を被せると共に、前記フィルターと前記スライドグラスとの間の前記目的細胞を生理的緩衝液に浸漬する第２ステップと、前記フィルターと前記スライドグラスとの間の前記目的細胞を、遠心力の作用下又は空気圧による加圧下で、前記スライドグラスに転写する第３ステップと、保存液が貯められた容器に前記スライドグラスを浸漬することにより、前記目的細胞を障害することなくスライドグラスからカバー部材及び前記フィルターを自然に剥離させ、保存する第４ステップと、を有する細胞のスライドグラス標本作製方法。
［３］血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞の少なくとも一方である目的細胞を捕捉する窪みとこの窪みに形成され非目的細胞を通過させる孔とを有するフィルターを備え、前記フィルターにより前記非目的細胞から分離して前記目的細胞を捕捉する第１ステップと、前記フィルターに捕捉された前記目的細胞を生理的緩衝液に入れる第２ステップと、前記生理的緩衝液中の前記目的細胞をスライドグラス上に密着させ、前記目的細胞を前記スライドグラスに生きたまま接着、転写させる第３ステップと、保存液が貯められた容器に前記スライドグラスを浸漬して、前記スライドグラス上に転写された前記目的細胞を保存する第４ステップと、を有する細胞のスライドグラス標本作製方法。
［４］［１］〜［３］の何れかに記載の細胞のスライドグラス標本作製装置又は細胞のスライドグラス標本作製方法により得られた細胞のスライドグラス標本上に筒状体を配置して、前記スライドグラス上に転写された前記目的細胞の周囲を前記筒状体で囲み、前記筒状体内にＤＮＡ又はＲＮＡの抽出液を所定時間保持し、前記目的細胞からＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する、ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出方法。
［１］に係る細胞のスライドグラス標本作製装置又は［２］に係る細胞のスライドグラス標本作製方法によれば、窪みを有するフィルター（例えば金属製又は樹脂製）を用いることにより、目的細胞（血液中の循環癌細胞や体液中の希少癌細胞）を、非目的細胞（例えば血液細胞）とのサイズ差を利用して漏れなく分離し、窪みで捕捉することができる。
また、目的細胞はフィルターの窪みに溜まった生理的緩衝液に浸漬されているため、スライドグラスに転写される際に、目的細胞が押し潰されたり、乾燥したりしにくくなり、細胞障害性を最小限に抑え、細胞形態を良好に保存することができる。そして、保存液が貯められた容器にスライドグラスを浸漬して、カバー部材及びフィルターを余分な外力を加えずに自然に剥離させることで、目的細胞が乾燥することなく形態がよく保存された状態でスライドグラスに転写されたスライドグラス標本となる。
［３］に係る細胞のスライドグラス標本作製方法によれば、窪みを有するフィルター（例えば金属製又は樹脂製）によって、目的細胞（血液中の循環癌細胞や体液中の希少癌細胞）を非目的細胞（例えば血液細胞）とのサイズ差を利用して、簡便、迅速かつ高効率に分離して捕捉することができる。捕捉された目的細胞を生理的緩衝液に入れてスライドグラス上に密着させ、該スライドグラスに生きたまま接着、転写することで、細胞障害性を最小限に抑えたまま該目的細胞をスライドグラスに転写することができる。
［４］に係る細胞のスライドグラス標本作製方法によれば、目的細胞をフィルター上で固定後、該目的細胞をフィルターからスライドグラス上に簡便、高率に回収、転写できる。目的細胞のスライドグラス標本を用いることにより、例えばパパニコロウ染色や免疫染色を検査室のルーチンワークとして施工でき、さらにこのスライドグラス標本から簡便にＤＮＡやＲＮＡを容易に抽出し、遺伝子解析を行うことができる。このように、スライドグラス標本を用いたパパニコロウ染色や免疫染色は永久標本なので、蛍光染色による判定に比べて細胞数の計測も複数の細胞検査士や病理医による明視野でのより客観的な評価が可能であるのみならず、目的細胞の細胞学的診断や遺伝子解析などLiquid biopsyとしての簡便、低コストでの利用が可能となる。
また、目的細胞はフィルターの窪みに溜まった生理的緩衝液に浸漬されているため、スライドグラスに転写される際に、目的細胞が押し潰されたり、乾燥したりしにくくなり、細胞障害性を最小限に抑え、細胞形態を良好に保存することができる。そして、保存液が貯められた容器にスライドグラスを浸漬して、カバー部材及びフィルターを余分な外力を加えずに自然に剥離させることで、目的細胞が乾燥することなく形態がよく保存された状態でスライドグラスに転写されたスライドグラス標本となる。
［３］に係る細胞のスライドグラス標本作製方法によれば、窪みを有するフィルター（例えば金属製又は樹脂製）によって、目的細胞（血液中の循環癌細胞や体液中の希少癌細胞）を非目的細胞（例えば血液細胞）とのサイズ差を利用して、簡便、迅速かつ高効率に分離して捕捉することができる。捕捉された目的細胞を生理的緩衝液に入れてスライドグラス上に密着させ、該スライドグラスに生きたまま接着、転写することで、細胞障害性を最小限に抑えたまま該目的細胞をスライドグラスに転写することができる。
［４］に係る細胞のスライドグラス標本作製方法によれば、目的細胞をフィルター上で固定後、該目的細胞をフィルターからスライドグラス上に簡便、高率に回収、転写できる。目的細胞のスライドグラス標本を用いることにより、例えばパパニコロウ染色や免疫染色を検査室のルーチンワークとして施工でき、さらにこのスライドグラス標本から簡便にＤＮＡやＲＮＡを容易に抽出し、遺伝子解析を行うことができる。このように、スライドグラス標本を用いたパパニコロウ染色や免疫染色は永久標本なので、蛍光染色による判定に比べて細胞数の計測も複数の細胞検査士や病理医による明視野でのより客観的な評価が可能であるのみならず、目的細胞の細胞学的診断や遺伝子解析などLiquid biopsyとしての簡便、低コストでの利用が可能となる。
本開示によれば、循環癌細胞や希少癌細胞といった目的細胞を、窪みを有するフィルターによって簡便、迅速かつ高効率に分離し、かつ細胞障害性を最小限に抑えたままスライドグラスに効率よく転写し、一般病院の検査室で免疫染色を含む細胞診断や遺伝子検査などに利用できる。
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づき説明する。図面では、目的細胞１２やフィルター１６等を適宜拡大して示している。
［第１実施形態］
本実施形態において、「循環癌細胞」とは、癌患者の血液に含まれる循環腫瘍細胞であり、血液１cc中に通常わずか数個程度しか存在しない非常に細胞数が少ない希少な細胞である。循環癌細胞は、その英訳である"Circulating Tumor Cell"の頭文字を取って「CTC」とも称される。
本実施形態において、「循環癌細胞」とは、癌患者の血液に含まれる循環腫瘍細胞であり、血液１cc中に通常わずか数個程度しか存在しない非常に細胞数が少ない希少な細胞である。循環癌細胞は、その英訳である"Circulating Tumor Cell"の頭文字を取って「CTC」とも称される。
「希少癌細胞」とは、癌患者の腹水、腹腔洗浄液、リンパ液、髄液などの体液に含まれる希少な腫瘍細胞である。
初めに、図１において、本実施形態で使用されるフィルター１６と、フィルター１６が組み込まれる濾過ユニット２８について説明する。
（フィルター）
フィルター１６は、極薄板に非常に多数の孔２６（孔密度1×104 /cm2 以上）が均一に又は規則的に形成されたものである。孔２６の密度は、格子配列、千鳥配列など配列の形態により異なるが、通常1×104 〜3×105 /cm2、好ましくは5×104 〜2×105 /cm2 である。また、孔２６の孔径は、目的細胞を通過させない、かつ、血球等の血液成分等、目的細胞以外の体液細胞である非目的細胞を通過させることができるサイズを有するものである。ヒト血球成分の大きさ（長径）は、ヒストグラム解析の結果、赤血球で約６〜７μｍであり、白血球で約７〜９μｍであり、血小板で５μｍ未満であるのに対して、目的細胞で約１２〜２５μｍである。したがって、孔２６の孔径は、通常約７〜１０μｍ、好ましくは約８〜１０μｍである。
フィルター１６は、極薄板に非常に多数の孔２６（孔密度1×104 /cm2 以上）が均一に又は規則的に形成されたものである。孔２６の密度は、格子配列、千鳥配列など配列の形態により異なるが、通常1×104 〜3×105 /cm2、好ましくは5×104 〜2×105 /cm2 である。また、孔２６の孔径は、目的細胞を通過させない、かつ、血球等の血液成分等、目的細胞以外の体液細胞である非目的細胞を通過させることができるサイズを有するものである。ヒト血球成分の大きさ（長径）は、ヒストグラム解析の結果、赤血球で約６〜７μｍであり、白血球で約７〜９μｍであり、血小板で５μｍ未満であるのに対して、目的細胞で約１２〜２５μｍである。したがって、孔２６の孔径は、通常約７〜１０μｍ、好ましくは約８〜１０μｍである。
フィルター１６の形状は、濾過ユニット２８に装着されるフィルターリング（カセット）に配置可能であれば特に限定されないが、例えば円形、方形などの形状を含む。また、フィルター１６のサイズは、サンプル（血液）量、孔径、時間、流速、耐圧などの物理的ファクター、操作性、コストなどを考慮して適宜決定されうる。例えば血液５ｍｌを処理する場合、直径（円形の場合）、又は、縦、横の長さ（方形の場合）が、通常、約１０〜１５ｍｍであるが、血液量に応じてサイズを、非限定的に、例えば約５〜２０ｍｍの範囲とすることもできる。また、フィルター１６の厚さは、孔密度、耐圧、コストなどとの関係を考慮して適宜決定されるものとし、通常、２〜４０μｍ、好ましくは約５〜１５μｍである。
フィルター１６は、材質及び断面形状により複数種類に分類でき、例えば、３Ｄ金属フィルター１８（図３Ａ，図４Ａ）、２Ｄ金属フィルター２０（図３Ｂ）、２Ｄ樹脂フィルター２２（図３Ｃ）、３Ｄ樹脂フィルター２４（図９）が挙げられる。
３Ｄ金属フィルター１８及び２Ｄ金属フィルター２０の材質は、例えばパラジウム(Pd)、白金(Pt)、金(Au)、銀(Ag)、イリジウム(Ir)、ロジウム(Rh)又はルテニウム(Ru)の少なくとも何れか１つを含む。この材質は、パラジウム(Pd)、白金(Pt)、金(Au)、銀(Ag)、イリジウム(Ir)、ロジウム(Rh)又はルテニウム(Ru)の単体金属でもよく、又は例えば、パラジウム(Pd)・ニッケル(Ni)合金、白金(Pt)・ニッケル(Ni)合金、又は金(Au)・ニッケル(Ni)合金等でもよい。合金の場合、好ましくは、ニッケルなどの相手金属に対し、上記の金属の比率が多い。これらの金属は、例えばニッケル(Ni)などの金属と比べると、目的細胞１２に対する毒性が非常に低い。理由としては、パラジウム(Pd)自体の毒性が低いことと、Pdとニッケル(Ni)の合金は固溶体を形成することによりニッケル(Ni)の溶出を防ぐことができるからである。これらのうち、金属コスト、低毒性の点で、パラジウム又はパラジウム(Pd)・ニッケル(Ni)の合金が好ましい。Pd・Ni合金の場合、Pdが50％（重量）超である合金、例えばPd80％・Ni20％の合金が好ましい。
３Ｄ金属フィルター１８及び２Ｄ金属フィルター２０を、PdとNiの合金や、Pdなどで作製した場合、ホルマリン、エタノールなどの有機系固定液に耐性であり、目的細胞の転写前後の細胞形態の保持に有利である。さらに耐酸性、耐熱性でもあり、かつ硬性で耐久性が高いため滅菌洗浄ができ、繰り返しの使用が可能であるという利点を有している。また、表面処理なしでも細胞が接着しにくい。
さらに、図３Ａ，図８に示されるように、３Ｄ金属フィルター１８は、目的細胞１２を捕捉することができる大きさの窪み３０を有している。窪み３０のサイズは、非限定的に、例えば直径２０〜３０μｍ及び深さ５〜１５μｍ、好ましくは直径２５〜３０μｍ及び深さ１０μｍである。深さが５μｍ未満では、目的細胞１２が入り込めない。目的細胞１２がほぼ完全に入り込むようにするには、窪み３０の深さは、少なくとも約５〜１５μｍであることが望ましい。ただし、窪み３０の深さが１５μｍを超えると、転写による目的細胞１２の回収率に影響する恐れがある。また、窪み３０は、図９に示される３Ｄ樹脂フィルター２４のように、厚さ方向における段差形状を含む。換言すれば、窪み３０は、周壁に囲まれていてもよく、また囲まれていなくてもよい。
高い孔密度を維持するために、窪み３０が上記の全部又は一部の孔２６の上部に形成されていてもよい。具体的には、窪み３０の数は、孔２６の数に対して好ましくは８０〜１００％である。すべての孔２６の上部に窪み３０が存在することが、さらに好ましい。なお、３Ｄ金属フィルター１８における孔２６の孔径は、窪み３０への開口位置での直径である。
図３Ｂにおいて、２Ｄ金属フィルター２０は、全体的に平面に近い構造となっている。２Ｄ金属フィルター２０の厚さは、例えば１０μｍである。この２Ｄ金属フィルター２０には、窪み３０（図３Ａ）が形成されていないが、深さ５μｍ以下であれば窪みを孔２６の上部に設けてもよい（図示せず）。全体的に平面に近い構造となるためである。
図３Ｃにおいて、２Ｄ樹脂フィルター２２の厚さは、例えば１５〜２０μｍである。この２Ｄ樹脂フィルター２２には、窪み３０（図３Ａ）が形成されていないが、深さ５μｍ以下であれば窪みを孔２６の上部に設けてもよい（図示せず）。２Ｄ樹脂フィルター２２は、例えばエポキシ、アクリル、ポリカーボネートなどの樹脂から形成されたものである。
図９において、３Ｄ樹脂フィルター２４は、２Ｄ樹脂フィルター２２（図３Ｃ）と同様の平板部２４Ａにおける目的細胞１２の捕捉側の面１６Ａに、凸部２４Ｂを加えて窪み３０を形成したものである。この凸部２４Ｂは、孔２６を避けて平板部２４Ａと一体成形されている。また、凸部２４Ｂは、例えば点状（柱状）、堤状、又は格子状に形成されている。凸部２４Ｂが点状の場合、３箇所以上に点在していることが望ましい。凸部２４Ｂが堤状の場合、２箇所以上に設けられることが望ましい。凸部２４Ｂの高さは、３Ｄ金属フィルター１８の窪み３０（図３Ａ）の深さと同様である。
３Ｄ金属フィルター１８によれば、窪み３０を設けることによって、１）白血球細胞のコンタミネーションを少なくすることができ、２）孔２６の上部に窪みがなく目的細胞１２が直接孔２６に嵌入する場合に比べ、窪み３０が存在するとフィルターの横方向から窪み３０内に流れてきた目的細胞１２に局所的な回転運動が発生するため、孔２６への嵌入がソフトになる。すなわち窪み３０を設けた３Ｄ構造にすることにより、目的細胞１２が孔２６に捕捉嵌入される強さを制御できる、という効果が得られる。３）窪み３０に生理的緩衝液４６の溜めができるため、遠心力による目的細胞１２のスライドグラス４２への転写に際し、目的細胞１２が乾燥しにくくなり、細胞形態を良好に保持することができる（図６、図７参照）。これら３つの総合的な効果によって、目的細胞１２の濃縮と形態の保存ができ、後に行うパパニコロウ染色や免疫染色を高品質に行うことが可能となる。また、通常の孔径８μｍの孔２６に比べてやや大きく、かつ目的細胞１２に比べてやや幅広な孔径１０μｍの孔を有するフィルターでも、上記と類似した効果が得られる可能性がある。また、図４Ｂ、図４Ｃに示すように、個々の窪み３０の間に連通路３１を設ける方が好ましい。この連通路３１は、幅寸法が窪み３０の直径よりも小さく、且つ、孔２６の直径と同じか、もしくはそれ以下であり、深さが窪み３０と同じか、もしくはそれ以下である。連通路３１を設ける理由は、後述するように、フィルター１６を上下反転させてからスライドグラス４２に重ねる際、目的細胞１２が孔２６に嵌りあって窪み３０内の圧力で落下しにくい場合でも窪み３０内の圧力を連通路３１で逃がして、容易に落下させるためである。なお、図４Ｃにおいて、「４００ｘ」は拡大倍率であり、「ＷＤ」は顕微鏡の作動距離（Working distance）である。
フィルター１６の周縁は、孔なしに縁取りされていることが好ましい。縁部が存在することによって、１）パッキンをフィルター１６の上下から挟み込み、濾過ユニット２８からの液漏れを防ぐことができ、２）目的細胞１２をスライドグラス４２の限られた領域に高密度に転写することが可能になるため、細胞数の計測が容易になること、さらに３）フィルター１６を傷つけることなしにピンセットでつまむことが可能になる。
本実施形態のフィルター１６は、例えばLIGA(Lithogaphie Galvanoformung Abfomung)技術を利用することによって作製することができる（服部正、表面技術、Vol. 62, No. 12, 619-624, 2011; W. Elufeld and H. Lhe, Radiat. Phys. Chem., 45(3): 340-365, 1995）。一例として、基板上にレジスト、吸収材（任意成分）、マスクを積層し、紫外線、X線又はシンクロトロン放射光を照射してレジストパターンを形成したのち、基板を電極として電鋳を行う金属メッキを行い、所定の開孔を残すところで電鋳を終え、さらにレジストの除去を行うことを含む方法により、３Ｄ金属フィルター１８や２Ｄ金属フィルター２０等の電鋳フィルターを作製することができる。２Ｄ樹脂フィルター２２については、上記LIGAのような電鋳により作製した金型を用いることで、作製することができる。
これらのフィルター１６において、孔２６が「規則的に配置」されているとは、できるかぎり高密度になるような配置であって、すべての孔２６が特定の規則性をもって配列されていることを指す。そのような規則性には、例えば格子状の配列、千鳥格子の配列（図４）、放射状の配列、同心円状の配列などが包含される。
（濾過ユニット）
図１，図２において、濾過ユニット２８は、上部体３２と下部体３４とで内部に流路３６を形成されたものである。フィルター１６は、例えば上部体３２と下部体３４との間に、着脱可能に配置されている。流路３６は、フィルター１６に対して垂直となっている。フィルター１６は、図示しないフィルターカセット等を介して、上部体３２又は下部体３４に固定されてもよい。
図１，図２において、濾過ユニット２８は、上部体３２と下部体３４とで内部に流路３６を形成されたものである。フィルター１６は、例えば上部体３２と下部体３４との間に、着脱可能に配置されている。流路３６は、フィルター１６に対して垂直となっている。フィルター１６は、図示しないフィルターカセット等を介して、上部体３２又は下部体３４に固定されてもよい。
上部体３２には入口部３８が設けられ、下部体３４には出口部４０が設けられている。血液又は体液である検体液１０は、入口部３８から供給されるようになっている。出口部４０からは、フィルター１６の孔２６を通過した、主に非目的細胞１４を含む検体液１０が排出されるようになっている。検体液１０の供給は、ポンプ等による加圧を利用したものが良いが、出口部４０に負圧を作用させるものであってもよい。また、検体液１０の自重を利用したものであってもよい。なお、上部体３２には、開閉可能な天井部３３が設けられていてもよい。
濾過ユニット２８は、加工のしやすさやコストの面で、その全体についてアクリルなどの樹脂又はポリマーで形成されているのが好ましい。透明な材質であれば、液体の流下速度を監視できるので好ましい。
図示は省略するが、濾過ユニット２８の他に、リザーバーユニット、流量調節ユニット、及び排液回収ユニット（液だめベース）をさらに含むことができる。
（細胞のスライドグラス標本作製方法）
本実施形態に係る細胞のスライドグラス標本作製方法は、第１ステップＳ１〜第４ステップＳ４を有している。
本実施形態に係る細胞のスライドグラス標本作製方法は、第１ステップＳ１〜第４ステップＳ４を有している。
図１，図２において、第１ステップＳ１では、血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞の少なくとも一方である目的細胞１２を、フィルター１６により非目的細胞１４から分離して捕捉する。図１に示されるように、入口部３８から濾過ユニット２８内の流路３６に検体液１０を注入すると、検体液１０に含まれる目的細胞１２がフィルター１６に捕捉され、非目的細胞１４や水分はフィルター１６の孔２６を通過し、出口部４０から排出される。この結果、図２に示されるように、フィルター１６に目的細胞１２が捕捉された状態となる。
ここで、検体液１０の量（体積）は、通常0.2-20ml、好ましくは5〜10mlである。通常、検体液１０（特に血液）はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)（目的に応じて0.25〜1ml EDTA含有のPBS）で、例えば2〜20倍に希釈した後に濾過する。5-20mlの検体量では通常必要ないが、血液量が多い場合(20-50ml)には、以下の前処理を行ってもよい。
前処理は、例えば、血液などの検体液１０に塩化アンモニウムベースの溶血剤を添加して赤血球を除去し、CTC又は希少癌細胞などの目的細胞１２を１０倍以上濃縮した液を濾過ユニット２８に導くことにより、濾過速度を上げずに、濾過時間を短縮できる。この場合、３Ｄ金属フィルター１８の流速を大幅に遅くした状態で白血球を除去することができるため、目的細胞１２は孔２６に深く嵌入せずに３Ｄ金属フィルター１８の窪み３０にソフトに捕捉される。本実施形態の前処理を併用する場合、前処理を併用しない場合に比べ、３Ｄ金属フィルター１８に捕捉された目的細胞１２にかかる剪断応力が軽減され、細胞質のほとんどない脱核細胞を減らし、より良好な細胞形態の保持が期待できる。ただし、一方でこのような前処理は、目的細胞１２のロスにつながる恐れがある。
本方法は、検体液１０を濾過ユニット２８に注入し、ポンプによる加圧により濾過を行うという単純な方法であるが、超高孔密度（例えば、5×104 〜1.5×105 /cm2）の３Ｄ(あるいは２Ｄ)金属フィルター１８を使用することによって、許容可能な十分な迅速処理を達成できる。例えば、検体(全血)約5-7mlは洗浄を含めて約30分で処理することができる。洗浄液にはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いるが、必要によりEDTAを含んでもよい。
第１ステップＳ１と第２ステップＳ２との間で、目的細胞１２を標識抗体により染色してもよい。具体的には、目的細胞１２に特異的に結合する蛍光標識抗体、例えばAlexa488標識抗Keratin抗体、PE標識抗EpCAM抗体、白血球に特異的に結合するAlexa647標識抗CD45抗体などの抗体混合物及び核染色用の蛍光色素（Hoechst）を用いて、目的細胞１２を染色する。これらの染色は、濾過ユニット２８に固定された３Ｄ金属フィルター１８上で直接行うことができる。これにより、後述する第２ステップＳ２と第３ステップＳ３の間で、蛍光顕微鏡を用いて、フィルター１６上に捕捉された目的細胞１２の数などをカウントすることができる。
図５から図７において、第２ステップＳ２では、フィルター１６の目的細胞１２の捕捉側の面１６Ａがスライドグラス４２に対向するようにして、該フィルター１６をスライドグラス４２に重ね（図５）、フィルター１６にカバー部材４４を被せると共に（図６）、フィルター１６とスライドグラス４２との間の目的細胞１２を生理的緩衝液４６に浸漬する（図６，図７）。
フィルター１６が濾過ユニット２８に固定された状態（図２）において、該フィルター１６における目的細胞１２の捕捉側の面１６Ａは、上側の面である。捕捉側の面１６Ａをスライドグラス４２に対向させるためには、フィルター１６を上下反転させてからスライドグラス４２に重ねるか、又はフィルター１６の上にスライドグラス４２を重ねて、フィルター１６及びスライドグラス４２を上下反転させる。フィルター１６がスライドグラス４２に重ねられた状態においては、フィルター１６の捕捉側の面１６Ａは下側の面となる。この状態において、フィルター１６に捕捉された目的細胞１２は、該フィルター１６とスライドグラス４２の間に位置している。
図８に示されるように、フィルター１６が３Ｄ金属フィルター１８である場合には、目的細胞１２が窪み３０に収まっているため、細胞を変形させる応力が少なく、細胞障害性が低い。図９に示されるように、フィルター１６が３Ｄ樹脂フィルター２４である場合も、凸部２４Ｂにより形成された窪み３０によってフィルター１６の捕捉側の面１６Ａとスライドグラス４２との間の間隔が確保されているので、細胞を変形させる応力が少なく、細胞障害性が低いが、３Ｄ金属フィルター１８に比べ硬性に乏しく、耐久性に難点がある。
カバー部材４４は、例えばフィルター１６よりも大きく、該フィルター１６を、全体的に余裕を持って覆っていることが好ましい。カバー部材４４の材質は、ガラスや樹脂等である。
目的細胞１２を生理的緩衝液４６に浸漬するためには、例えば、カバー部材４４をフィルター１６に重ねる前に、目的細胞１２を生理的緩衝液４６に浸漬し、その後カバー部材４４をそっと重ねる。図６に示すように、ピペット４８を用いて、カバー部材４４とスライドグラス４２との間に生理的緩衝液４６を注入してもよい。いずれの場合にも、生理的緩衝液４６の表面張力により、フィルター１６及びカバー部材４４がスライドグラス４２に保持される。
生理的緩衝液４６は例えば生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水であるが、これらに限られるものではなく、目的細胞１２の乾燥を防ぐ意味からも多糖類など緩衝液に粘性を付与でき、細胞にとって無毒なポリマーなどを添加してもよい。
第１ステップＳ１と第２ステップＳ２との間で、目的細胞１２を抗Keratin抗体、抗EpCAM抗体、抗CD45抗体及び核染色（Hoechst）で４重染色することができ、第３ステップＳ３に進む前に、蛍光顕微鏡を用いて、フィルター１６上に捕捉された目的細胞１２（Keratin+/EpCAM+/CD45-/Hoechst+)の数などをカウントすることができる。
図１０において、第３ステップＳ３では、フィルター１６とスライドグラス４２との間の目的細胞１２に、例えば遠心力の作用下で、スライドグラス４２上にコーティングされた基質（図示せず）への細胞接着力を利用して、目的細胞１２をスライドグラス４２に転写する。具体的には、フィルター１６及びカバー部材４４が重ねられ、目的細胞１２が生理的緩衝液４６に浸漬されたスライドグラス４２を、例えばスウィングローター型の遠心機５０の腕部５２に取り付け、該腕部５２が固定されている回転軸５３を回転させる。この際、スライドグラス４２を遠心機５０の径方向外側に配置することで、目的細胞１２に対して、フィルター１６の面及びスライドグラス４２の面の垂直方向に遠心力を作用させることができる。
図１１に示されるように、遠心機５０の回転速度が大きいと、細胞の回収率が増加する。回収率とは、遠心機５０を用いる前にフィルター１６に捕捉されていた細胞の数に対する、遠心機５０の使用後にスライドグラス４２に転写され形態がよく保存された細胞の数の割合である。図１１より、回転速度は１５００−２０００ｒｐｍが望ましい。回転速度がこれよりも大き過ぎると、細胞障害性への影響が大きくなるためである。
なお、第３ステップＳ３では、目的細胞１２に遠心力ではなく、空気圧などの加圧下におけるスライドグラス４２への細胞の接着性を利用してもよい。具体的には、図１２に示されるように、第２ステップＳ２で濾過ユニット２８から取り出したフィルター１６（２Ｄフィルター）を、表面にプラズマなどによる親水処理などの種々の物質を表面にコーティングし細胞接着性を増強したスライドグラス４２上に静置した後、円筒状のシリンジ型加圧器具５９などにより手動で軽い空気圧を加え、細胞と基質との接着能を利用して、目的細胞１２をスライドグラス４２上にスタンプ式に転写してもよい。シリンジ型加圧器具５９のうち、筒状体６２の内部に面する先端には、ゴム５９Ａが設けられている。筒状体６２とスライドグラス４２との間には、フィルター１６を有するフィルターカセット６３が配置される。筒状体６２とフィルターカセット６３との間には、シリコンガスケット６１が設けられる。
目的細胞１２が固定された細胞である場合には表面にプラズマなどによる親水処理や種々の物質を表面にコーティングした市販のスライドグラス４２を用いてもよい。また、スライドグラス４２への目的細胞１２の転写を促進させるために、スライドグラス４２の表面に幅１〜５μｍ、深さ１〜５μｍの溝４３を切削等により適当数設け、排水口を作成し、上方からの加圧により緩徐な液流を作るなどしてもよい。
図１３において、第４ステップＳ４では、保存液５６が貯められた容器５４にスライドグラス４２を浸漬することにより、目的細胞１２を障害することなく、カバー部材４４及びフィルター１６を自然に剥離させ、保存する。保存液５６は、その後の染色に応じた各種固定液、例えば１０％ホルマリンや９５％エタノールなどの固定液、さらには生理的緩衝液であるが、これらに限られるものではない。スライドグラス４２を保存液５６に浸漬することで、生理的緩衝液４６の表面張力が保存液５６の表面張力に負けて、フィルター１６及びカバー部材４４が自然にスライドグラス４２から剥離する。このため、カバー部材４４を剥ぐ過程での目的細胞１２への障害は最小限に抑えられる。第３ステップＳ３において、目的細胞１２はスライドグラス４２に強固に転写されているので、フィルター１６及びカバー部材４４が剥離しても、目的細胞１２はスライドグラス４２に保持される。これにより、図１４に示されるように、スライドグラス４２に目的細胞１２が固定されたスライドグラス標本６０が得られる。
本実施形態に係る細胞のスライドグラス標本作製方法によれば、フィルター１６を用いることにより、検体液１０中の目的細胞１２（循環癌細胞や希少癌細胞）を、非目的細胞１４（例えば血液細胞）とのサイズ差を利用して濃縮、分離して捕捉することができる。
また、捕捉された目的細胞１２を、遠心力の作用下又は空気圧などの加圧下における細胞接着性を利用してスライドグラス４２にソフトに転写する際、目的細胞１２はフィルター１６の窪み３０に溜まった生理的緩衝液４６に浸漬されているため、スライドグラス４２に転写される際に、目的細胞１２が押し潰されたり、乾燥したりしにくくなるので、細胞障害性を最小限に抑えることができる。
そして、保存液５６が貯められた容器５４にスライドグラス４２を浸漬して、カバー部材４４及びフィルターを自然に剥離させることで、目的細胞１２がスライドグラス４２に転写されたスライドグラス標本６０となる。スライドグラス標本６０は、保存液５６の中で室温あるいは４℃で長期保存が可能である。
また、第１ステップＳ１と第２ステップＳ２との間で、標識抗体により目的細胞１２を染色し、染色した目的細胞１２の数を、蛍光顕微鏡を用いてカウントした場合でも、該目的細胞１２をフィルター１６から簡便にスライドグラス４２上に安定した状態で回収、転写できる。
［第２実施形態］
図１７において、本実施形態に係る細胞のスライドグラス標本作製方法は、第１実施形態と同様の第１ステップＳ１（図１も参照）と、第２ステップＳ１２〜第４ステップＳ１４とを有している。第１実施形態と同一の部分には図面に同一の符号を付し、説明を省略する。
図１７において、本実施形態に係る細胞のスライドグラス標本作製方法は、第１実施形態と同様の第１ステップＳ１（図１も参照）と、第２ステップＳ１２〜第４ステップＳ１４とを有している。第１実施形態と同一の部分には図面に同一の符号を付し、説明を省略する。
第１ステップＳ１では、目的細胞１２に対して固定および界面活性剤処理は行わず、目的細胞１２が生きた状態のまま第２ステップＳ１２に進む。
第２ステップＳ１２では、濾過ユニット２８から取り出したフィルター１６を、Ｉ型コラーゲンなどの接着促進物質が表面にコーティングされたスライドグラス４２上に静置した後、ただちに培養液５８を加え、目的細胞１２を例えば生きたまま接着させる。
第３ステップＳ１３では、目的細胞１２をCO2 インキュベーター内で、３７℃，１〜数時間加温することで、細胞の遊走能を利用し、目的細胞１２をスライドグラス４２上に充分に接着させ、加圧下あるいは非加圧下で転写する。
第４ステップＳ１４では、スライドグラス４２上に筒状体６２を配置して培養皿とし、該培養皿に培養液５８を充分量加え、フィルター１６を培地中に浮かせて、スライドグラス４２から取り除く。これにより遠心力や空気圧などの外力を細胞に加えることなく、細胞障害を最小限度に抑え、目的細胞１２を生かしたままスライドグラス４２上に回収することができる（図１７）。目的細胞１２の生存条件下での転写の場合には、該目的細胞１２がフィルター１６からスライドグラス４２上に自ら遊走し、接着する。
第２ステップＳ１２では、濾過ユニット２８から取り出したフィルター１６を、Ｉ型コラーゲンなどの接着促進物質が表面にコーティングされたスライドグラス４２上に静置した後、ただちに培養液５８を加え、目的細胞１２を例えば生きたまま接着させる。
第３ステップＳ１３では、目的細胞１２をCO2 インキュベーター内で、３７℃，１〜数時間加温することで、細胞の遊走能を利用し、目的細胞１２をスライドグラス４２上に充分に接着させ、加圧下あるいは非加圧下で転写する。
第４ステップＳ１４では、スライドグラス４２上に筒状体６２を配置して培養皿とし、該培養皿に培養液５８を充分量加え、フィルター１６を培地中に浮かせて、スライドグラス４２から取り除く。これにより遠心力や空気圧などの外力を細胞に加えることなく、細胞障害を最小限度に抑え、目的細胞１２を生かしたままスライドグラス４２上に回収することができる（図１７）。目的細胞１２の生存条件下での転写の場合には、該目的細胞１２がフィルター１６からスライドグラス４２上に自ら遊走し、接着する。
図１７の第４ステップＳ１４において、フィルター１６、カバー部材４４が除去され、スライドグラス４２に転写された目的細胞１２は、例えばホルマリンやエタノールの固定液による固定の後、パパニコロウ染色や免疫染色に利用することができる。また、目的細胞１２は、培養皿内で短期間培養することもできる。つまり、目的細胞１２は、染色用や培養用の細胞として利用することができる。
この細胞のスライドグラス標本作製方法によれば、第１実施形態と同様に、フィルター１６（例えば金属製又は樹脂製）によって、検体液中の目的細胞１２（循環癌細胞や希少癌細胞）を非目的細胞１４（例えば血液細胞）とのサイズ差を利用して、簡便、迅速かつ高効率に分離して捕捉することができる。ただし、前者の生きたままの障害の少ない細胞を採取する場合には、第１実施形態に比べて、CO2 インキュベーター内での加温操作が必要なため、細胞回収には数時間〜数日、細胞培養には数日〜数週間の時間を要する。
[スライドグラス標本の利用]
目的細胞の１２のスライドグラス標本６０を用いることにより、例えばパパニコロウ染色（図１５）や免疫染色（IHC法）（図１６）を検査室のルーチンワークとして施工できる。図１５は、パパニコロウ染色を行った細胞の顕微鏡写真である。クロマチンパターンが明瞭で細胞質も残っているなど細胞形態の保存が良好なため、病理医や細胞検査士が細胞診のように観察することができ、CTCの正確かつ客観的な評価が可能になる。図１６は、ＩＨＣ法による免疫染色を行った細胞の顕微鏡写真であり、サイトケラチンおよびCD45の染色結果を示す。細胞形態による評価に加えて、免疫染色による評価が加わるため、CTCの判定はより一層正確になる。またＨＥＲ２、ＥＲ、ＰｇＲ染色などコンパニオン診断に必要な免疫染色も可能である。
目的細胞の１２のスライドグラス標本６０を用いることにより、例えばパパニコロウ染色（図１５）や免疫染色（IHC法）（図１６）を検査室のルーチンワークとして施工できる。図１５は、パパニコロウ染色を行った細胞の顕微鏡写真である。クロマチンパターンが明瞭で細胞質も残っているなど細胞形態の保存が良好なため、病理医や細胞検査士が細胞診のように観察することができ、CTCの正確かつ客観的な評価が可能になる。図１６は、ＩＨＣ法による免疫染色を行った細胞の顕微鏡写真であり、サイトケラチンおよびCD45の染色結果を示す。細胞形態による評価に加えて、免疫染色による評価が加わるため、CTCの判定はより一層正確になる。またＨＥＲ２、ＥＲ、ＰｇＲ染色などコンパニオン診断に必要な免疫染色も可能である。
（ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出方法）
スライドグラス標本６０上で、目的細胞１２からＤＮＡやＲＮＡを抽出して、公知の方法で遺伝子解析を行うこともできる。図１８はスライドグラス標本６０上に筒状体６２を配置して、スライドグラス４２上に転写された目的細胞１２の周囲を、例えば樹脂製の円筒状の筒状体６２で密着して囲んだ状態を示している。この筒状体６２内に、ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出液６４を所定時間保持する。具体的には、筒状体６２内に、例えばProteinase K solnなどのＤＮＡの抽出液を添加して、５６℃で６０分間（以上）インキュベーションし、ＤＮＡを抽出する。必要に応じて、ＤＮＡを精製し、これを用いてPCR法などにより各種遺伝子解析を行うことができる（図１９）。なお、筒状体６２の材質は樹脂に限られず、金属等の他の材質であってもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出液６４を漏れなく液貯めして、一定期間（例えば１−４時間)56℃でインキュベートするために、図１８に示されるように、筒状体６２の側部に密着用の圧を作用させる柄６６を設け、筒状体６２の底部に環状のゴム６８（シール材）を配置し、柄６６に圧を作用させてスライドグラス４２に密着させる構造であっても良い。
スライドグラス標本６０上で、目的細胞１２からＤＮＡやＲＮＡを抽出して、公知の方法で遺伝子解析を行うこともできる。図１８はスライドグラス標本６０上に筒状体６２を配置して、スライドグラス４２上に転写された目的細胞１２の周囲を、例えば樹脂製の円筒状の筒状体６２で密着して囲んだ状態を示している。この筒状体６２内に、ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出液６４を所定時間保持する。具体的には、筒状体６２内に、例えばProteinase K solnなどのＤＮＡの抽出液を添加して、５６℃で６０分間（以上）インキュベーションし、ＤＮＡを抽出する。必要に応じて、ＤＮＡを精製し、これを用いてPCR法などにより各種遺伝子解析を行うことができる（図１９）。なお、筒状体６２の材質は樹脂に限られず、金属等の他の材質であってもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出液６４を漏れなく液貯めして、一定期間（例えば１−４時間)56℃でインキュベートするために、図１８に示されるように、筒状体６２の側部に密着用の圧を作用させる柄６６を設け、筒状体６２の底部に環状のゴム６８（シール材）を配置し、柄６６に圧を作用させてスライドグラス４２に密着させる構造であっても良い。
ＲＮＡの抽出液は、RLT solnを用いることができる。スライドグラス標本６０上の筒状体６２内にＲＮＡの抽出液を添加し、適宜RNeasy Kitなどを用いてＲＮＡを精製し、ＰＣＲ法により各種遺伝子解析を行うことができる。
このように、目的細胞１２のスライドグラス標本作成により細胞数の計測のみならず、目的細胞１２の免疫染色を用いた細胞学的診断や遺伝子解析など、コンパニオン診断に必要な液体細胞診（Liquid biopsy）としての簡便、低コストでの利用が可能となる。
上記実施形態に係る細胞のスライドグラス標本作製方法において、必要な機器は低コストで安全な使い捨てができるフィルター１６と濾過デバイス、簡単なシリンジポンプ、低速の卓上型の遠心機５０、使い捨てのコーティングスライドグラス（スライドグラス４２）および小型、円筒状のシリンジ型加圧器具５９やＤＮＡ/ＲＮＡ回収器具（筒状体６２）のみである。このCTCなど目的細胞のスライドグラスへの転写・回収装置およびシステムは、一般病院の検査室におけるCTC等の検査を可能とするものであり、CTC等の目的細胞の検出、回収、解析技術として他に類を見ない多機能性を有している。
［他の実施形態］
以上、本発明の実施形態の一例について説明したが、本発明の実施形態は、上記に限定されるものでなく、上記以外にも、その主旨を逸脱しない範囲内において種々変形して実施可能であることは勿論である。
以上、本発明の実施形態の一例について説明したが、本発明の実施形態は、上記に限定されるものでなく、上記以外にも、その主旨を逸脱しない範囲内において種々変形して実施可能であることは勿論である。
例えば、第１ステップＳ１と第２ステップＳ２,Ｓ１２との間において、蛍光標識抗体による染色や蛍光顕微鏡を用いた目的細胞の数のカウントを行わなくてもよく、むしろスライドグラス標本上の方がより正確な計測が可能である。また、この段階で標識抗体染色をしない方が、第４ステップＳ４，Ｓ１４以降のスライドグラス標本作成後の免疫染色の結果も、むしろ良好となる傾向が見られる。
２０１６年７月２５日に出願された日本国特許出願２０１６−１４５５６８号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載されたすべての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
本明細書に記載されたすべての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (2)
- 血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞の少なくとも一方である目的細胞を捕捉する窪みとこの窪みに形成され非目的細胞を通過させる孔とを有するフィルターが組み込まれ、前記フィルターの前記目的細胞の捕捉側の面へ前記血液又は前記体液を供給する濾過ユニットを用い、前記フィルターにより前記非目的細胞から分離して前記目的細胞を前記窪みに捕捉する第１ステップと、
前記フィルターの前記目的細胞の捕捉側の面にスライドグラスを重ね、前記スライドグラスと反対側の前記フィルターの面に板状のカバー部材を被せると共に、前記フィルターの前記窪みと前記スライドグラスとの間に収められた前記目的細胞を生理的緩衝液に浸漬する第２ステップと、
前記フィルターと前記スライドグラスとの間の前記目的細胞を、遠心力の作用下で、前記スライドグラスに転写する第３ステップと、
保存液が貯められた容器に、前記目的細胞が転写された前記スライドグラス、前記カバー部材、及び前記フィルターを浸漬することにより、前記目的細胞を障害することなく、前記スライドグラスから前記カバー部材及び前記フィルターを自然に剥離させ、前記スライドグラス上に転写された前記目的細胞を保存する第４ステップと、
を有する細胞のスライドグラス標本作製方法。 - 血液中の循環癌細胞又は体液中の希少癌細胞の少なくとも一方である目的細胞を捕捉する窪みとこの窪みに形成され非目的細胞を通過させる孔とを有するフィルターが組み込まれ、前記フィルターの前記目的細胞の捕捉側の面へ前記血液又は前記体液を供給する濾過ユニットを用い、前記フィルターにより前記非目的細胞から分離して前記目的細胞を前記窪みに捕捉する第１ステップと、
前記フィルターの前記目的細胞の捕捉側にスライドグラスを静置し、前記フィルターの前記窪みと前記スライドグラスとの間に収められた前記目的細胞を生理的緩衝液に浸漬する第２ステップと、
前記フィルターと前記スライドグラスとの間の前記目的細胞を、加圧下で作られる前記生理的緩衝液の緩徐な液流により、前記スライドグラスに転写する第３ステップと、
保存液が貯められた容器に、前記目的細胞が転写された前記スライドグラス及び前記フィルターを浸漬することにより、前記目的細胞を障害することなく、前記スライドグラスから前記フィルターを自然に剥離させ、前記スライドグラス上に転写された前記目的細胞を保存する、又は前記容器に、前記目的細胞が転写された前記スライドグラスを浸漬することにより、前記目的細胞を障害することなく、前記スライドグラス上に転写された前記目的細胞を保存する第４ステップと、
を有する細胞のスライドグラス標本作製方法。
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