KR20180019607A - 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 장치, 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법, 및 dna 또는 rna의 추출 방법 - Google Patents

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Abstract

세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 장치는, 혈액 중의 순환 암세포 또는 체액 중의 희소 암세포 중 적어도 한쪽인 목적 세포를 포착하는 공동과 이 공동에 형성되고 비목적 세포를 통과시키는 구멍을 갖는 필터와, 상기 필터의 상기 목적 세포의 포착측 면에 겹쳐져 상기 목적 세포가 전사되는 슬라이드 글래스와, 상기 슬라이드 글래스와 반대측의 상기 필터의 면에 씌워지고 상기 공동의 내부에서 상기 목적 세포를 침지시키기 위한 생리적 완충액을 봉입하는 커버 부재와, 상기 슬라이드 글래스를 침지하여 상기 슬라이드 글래스 위에 전사된 상기 목적 세포를 보존하는 보존액이 모인 용기를 구비하고 있다.

Description

세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 장치, 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법, 및 DNA 또는 RNA의 추출 방법
본 개시는, 목적 세포(혈액 중의 순환 암세포 또는 체액 중의 희소 암세포)의 슬라이드 글래스 표본 제작 장치, 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법, 및 DNA 또는 RNA의 추출 방법에 관한 것이다.
혈액 중의 순환 암세포(Circulating Tumor Cell; 이하, 「CTC」라고도 칭함)의 분리, 검출을 행하는 장치로서, 다수의 장치가 보고되어 있지만, Veridex사의 CellSearch(등록상표)가 미국 식품의약품국(FDA)에 유일하게 인가되어, 시판되고 있다.
또한, 일본 특허공개 평(6)-221976호 공보 및 미국 특허 제5,143,627호 공보에는, 객담 등의 일반 세포진 검체 처리 시에, 필터를 사용하여, 간편하고, 효율적으로 일반 세포를 슬라이드 글래스에 전사하여 슬라이드 글래스 표본을 작성하는 장치 및 방법이 개시되어 있다. 그러나, 지금까지 CTC의 슬라이드 글래스 표본을 작성하는 장치 및 방법에 관해서는 개시되어 있지 않다.
상기 CellSearch 등의 종래의 CTC 분리 검출 장치나 방법은, CTC의 판정을 암시야하에서 형광 염색에 의한 마커 발현의 조합(keratin+/EpCAM+/CD45-)으로 행하기 때문에, 핵의 크로마틴 패턴 등 CTC의 세포 형태학적인 평가가 불충분하여, CTC를 세포진으로서 평가하는 것은 불가능하였다. 이러한 이유에 의해, 일본에서는 CTC 검출법은 세포진 검사의 대상으로는 되지 않고, 따라서 보험 적응도 이루어져 있지 않다. CTC의 검출법으로서는, 종래의 형광 검출법이 극히 일부의 검사 회사에 의해 임상시험용으로 외주 검사로서 행해지고 있을 뿐으로, 일반 병원에서의 보급은 전혀 이루어져 있지 않다.
또한, 상기 일본 특허공개 평(6)-221976호 공보나 미국 특허 제5,143,627호 공보에 개시된 검체 처리 방법과 장치에서는, 편평한 일반적인 필터를 사용하고 있기 때문에, 객담 등의 검체 중에 암세포가 다수 존재하는 경우에는 유효하다. 그러나, CTC 등 혈액 1cc 중에 통상 불과 수개 정도밖에 존재하지 않은 극히 희소한 세포 검체의 경우에는 세포가 압궤되거나, 건조하거나 하여 세포장애성이 발생한 결과, 슬라이드 글래스에 대한 전사 효율을 악화시키기 때문에, 슬라이드 글래스 표본의 작성은 불가능하였다.
한편, 본 출원인은, 일본 특허 제5961889호 공보에서, 혈액 중의 말초 순환 종양 세포 또는 희소 암세포를 포착할 수 있는 공동과, 이 공동의 저부에 형성된 구멍을 통하여 혈액 세포만을 여과시켜, 말초 순환 종양 세포 또는 체액 중의 희소 암세포를 농축할 수 있는 금속 필터를 제시하고 있다.
본 개시는, 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작의 장치 및 방법으로서, 상기 일본 특허 제5961889호 공보에서 제시한 필터를 적용함으로써, 혈액 중의 순환 암세포나 체액 중의 희소 암세포인 목적 세포를, 간편, 신속하고 또한 고효율로 분리하며, 또한 세포장애성을 최소한으로 억제한 채 효율적으로 전사한 슬라이드 글래스 표본을 작성함으로써, 일반 병원의 임상 검사실에 있어서 면역 염색을 포함하는 세포 진단이나 유전자 검사 등에 이용할 수 있도록 하는 것을 목적으로 한다.
본 개시는, 이하의 특징을 포함한다.
[1] 혈액 중의 순환 암세포 또는 체액 중의 희소 암세포 중 적어도 한쪽인 목적 세포를 포착하는 공동과 이 공동에 형성되고 비목적 세포를 통과시키는 구멍을 갖는 필터와, 상기 필터의 상기 목적 세포의 포착측 면에 겹쳐져 상기 목적 세포가 전사되는 슬라이드 글래스와, 상기 슬라이드 글래스와 반대측의 상기 필터의 면에 씌워지고 상기 공동의 내부에서 상기 목적 세포를 침지시키기 위한 생리적 완충액을 봉입하는 커버 부재와, 상기 슬라이드 글래스를 침지하여 상기 슬라이드 글래스 위에 전사된 상기 목적 세포를 보존하는 보존액이 모인 용기를 구비하여 이루어지는 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 장치.
[2] 혈액 중의 순환 암세포 또는 체액 중의 희소 암세포 중 적어도 한쪽인 목적 세포를 포착하는 공동과 이 공동에 형성되고 비목적 세포를 통과시키는 구멍을 갖는 필터를 구비하고, 상기 필터에 의해 상기 비목적 세포로부터 분리하여 상기 목적 세포를 포착하는 제1 스텝과, 상기 필터의 상기 목적 세포의 포착측 면이 슬라이드 글래스에 대향하도록 하여 상기 필터를 상기 슬라이드 글래스에 겹쳐, 상기 필터에 커버 부재를 씌움과 함께, 상기 필터와 상기 슬라이드 글래스 사이의 상기 목적 세포를 생리적 완충액에 침지하는 제2 스텝과, 상기 필터와 상기 슬라이드 글래스 사이의 상기 목적 세포를, 원심력의 작용하 또는 공기압에 의한 가압하에서, 상기 슬라이드 글래스에 전사하는 제3 스텝과, 보존액이 모인 용기에 상기 슬라이드 글래스를 침지시킴으로써, 상기 목적 세포를 장애하지 않고 슬라이드 글래스로부터 커버 부재 및 상기 필터를 자연적으로 박리시켜, 보존하는 제4 스텝을 갖는 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법.
[3] 혈액 중의 순환 암세포 또는 체액 중의 희소 암세포 중 적어도 한쪽인 목적 세포를 포착하는 공동과 이 공동에 형성되어 비목적 세포를 통과시키는 구멍을 갖는 필터를 구비하고, 상기 필터에 의해 상기 비목적 세포로부터 분리하여 상기 목적 세포를 포착하는 제1 스텝과, 상기 필터에 포착된 상기 목적 세포를 생리적 완충액에 넣는 제2 스텝과, 상기 생리적 완충액 중의 상기 목적 세포를 슬라이드 글래스 위에 밀착시켜, 상기 목적 세포를 상기 슬라이드 글래스에 살아 있는 채 접착, 전사시키는 제3 스텝과, 보존액이 모인 용기에 상기 슬라이드 글래스를 침지하여, 상기 슬라이드 글래스 위에 전사된 상기 목적 세포를 보존하는 제4 스텝을 갖는 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 장치 또는 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법에 의해 얻어진 세포의 슬라이드 글래스 표본 위에 통 형상체를 배치하여, 상기 슬라이드 글래스 위에 전사된 상기 목적 세포의 주위를 상기 통 형상체로 둘러싸고, 상기 통 형상체 내에 DNA 또는 RNA의 추출액을 소정 시간 유지하고, 상기 목적 세포로부터 DNA 또는 RNA를 추출하는, DNA 또는 RNA의 추출 방법.
[1]에 따른 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 장치 또는 상기 [2]에 따른 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법에 의하면, 공동을 갖는 필터(예를 들어 금속제 또는 수지제)를 사용함으로써, 목적 세포(혈액 중의 순환 암세포나 체액 중의 희소 암세포)를, 비목적 세포(예를 들어 혈액 세포)와의 사이즈 차를 이용하여 빠짐없이 분리하고, 공동에서 포착할 수 있다.
또한, 목적 세포는 필터의 공동에 고인 생리적 완충액에 침지되어 있기 때문에, 슬라이드 글래스에 전사될 때, 목적 세포가 압궤되거나, 건조되거나 하기 어려워져서 세포장애성을 최소한으로 억제하여, 세포 형태를 양호하게 보존할 수 있다. 그리고, 보존액이 모인 용기에 슬라이드 글래스를 침지하여, 커버 부재 및 필터를 여분의 외력을 가하지 않고 자연적으로 박리시킴으로써, 목적 세포가 건조되지 않고 형태가 잘 보존된 상태에서 슬라이드 글래스에 전사된 슬라이드 글래스 표본으로 된다.
[3]에 따른 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법에 의하면, 공동을 갖는 필터(예를 들어 금속제 또는 수지제)에 의해, 목적 세포(혈액 중의 순환 암세포나 체액 중의 희소 암세포)를 비목적 세포(예를 들어 혈액 세포)와의 사이즈 차를 이용하여, 간편, 신속하고 또한 고효율로 분리하여 포착할 수 있다. 포착된 목적 세포를 생리적 완충액에 넣어 슬라이드 글래스 위에 밀착시켜, 해당 슬라이드 글래스에 살아 있는 채 접착, 전사함으로써, 세포장애성을 최소한으로 억제한 채 해당 목적 세포를 슬라이드 글래스에 전사할 수 있다.
[4]에 따른 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법에 의하면, 목적 세포를 필터 위에서 고정 후, 해당 목적 세포를 필터로부터 슬라이드 글래스 위에 간편, 고효율로 회수, 전사할 수 있다. 목적 세포의 슬라이드 글래스 표본을 사용함으로써, 예를 들어 파파니콜로 염색이나 면역 염색을 검사실의 루틴 워크로서 시공할 수 있고, 또한 이 슬라이드 글래스 표본으로부터 간편하게 DNA나 RNA를 용이하게 추출하여, 유전자 해석을 행할 수 있다. 이와 같이, 슬라이드 글래스 표본을 사용한 파파니콜로 염색이나 면역 염색은 영구 표본이므로, 형광 염색에 의한 판정 에 비하여 세포수의 계측도 복수의 세포 검사 기사나 병리의에 의한 명시야에서의 보다 객관적인 평가가 가능할 뿐 아니라, 목적 세포의 세포학적 진단이나 유전자 해석 등 액체 생검(Liquid biopsy)으로서의 간편, 저비용에서의 이용이 가능해진다.
본 개시에 의하면, 순환 암세포나 희소 암세포와 같은 목적 세포를, 공동을 갖는 필터에 의해 간편, 신속하며 또한 고효율로 분리하고, 또한 세포장애성을 최소한으로 억제한 채 슬라이드 글래스에 효율적으로 전사하여, 일반 병원의 검사실에서 면역 염색을 포함하는 세포 진단이나 유전자 검사 등에 이용할 수 있다.
도 1 내지 도 16은 제1 실시 형태에 관한 것으로, 도 1은, 필터를 갖는 여과 유닛에, 세포를 포함하는 체액을 흐르게 하고 있는 상태를 나타내는 단면도이다.
도 2는, 필터에 의해 목적 세포가 포착된 상태를 나타내는 단면도이다.
도 3a는, 3D 금속 필터를 나타내는 확대 단면도이다.
도 3b는, 2D 금속 필터를 나타내는 확대 단면도이다.
도 3c는, 2D 수지 필터를 나타내는 확대 단면도이다.
도 4a는, 3D 금속 필터를 나타내는 확대 평면도이다.
도 4b는, 3D 금속 필터의 변형예를 나타내는 확대 평면도이다.
도 4c는, 도 4b의 3D 금속 필터의 변형예를 나타내는 사시도(현미경 사진)이다.
도 5는, 슬라이드 글래스에 필터를 겹친 상태를 나타내는 확대 단면도이다.
도 6은, 커버 부재와 슬라이드 글래스의 사이에 생리적 완충액을 주입하는 상태를 나타내는 확대 단면도이다.
도 7은, 목적 세포를 생리적 완충액에 침지한 상태를 나타내는 확대 단면도이다.
도 8은, 슬라이드 글래스와, 3D 금속 필터와, 커버 부재가 겹쳐져, 3D 금속 필터와 슬라이드 글래스의 사이에 위치하는 목적 세포가 생리적 완충액에 침지된 상태를 나타내는 확대 단면도이다.
도 9는, 슬라이드 글래스와, 3D 수지 필터와, 커버 부재가 겹쳐져, 3D 수지 필터와 슬라이드 글래스의 사이에 목적 세포가 위치하고 있는 상태를 나타내는 확대 단면도이다.
도 10은, 원심기에 의해 목적 세포를 슬라이드 글래스에 전사하는 상태를 나타내는 측면도이다.
도 11은, 원심기의 회전 속도와, 세포의 회수율과의 관계를 나타내는 선도이다.
도 12는, 필터 위에 포착된 목적 세포를 생리적 완충액에 넣고, 접착을 촉진하는 기질로 표면이 코팅된 슬라이드 글래스 위에 필터를 밀착시켜, 상방으로부터 시린지형 가압 기구를 사용하여 공기압 등으로 가압함으로써, 해당 목적 세포를 슬라이드 글래스 위에 스탬프식으로 전사할 수 있음을 나타내는 단면도이다.
도 13은, 목적 세포가 전사된 슬라이드 글래스를 보존액에 침지하여, 커버 부재 및 필터를 중력에 의한 자연 낙하로 슬라이드 글래스로부터 박리시키는 상태를 나타내는 단면도이다.
도 14는, 슬라이드 글래스 표본을 나타내는 단면도이다.
도 15는, 슬라이드 글래스 표본의 파파니콜로 염색을 나타내는 현미경 사진이다. 암세포의 핵의 크로마틴 패턴과 세포질이 명료하게 관찰된다.
도 16은, 각종 면역 염색을 시공한 세포의 현미경 사진이다.
도 17은, 제2 실시 형태에 관한 것으로, 생존 조건하에서의 전사의 경우에, 목적 세포가 필터로부터 슬라이드 글래스 위에 스스로 유주(遊走)하고, 접착하는 상태를 나타내는 단면도이다.
도 18은, 슬라이드 글래스 위에 전사된 목적 세포의 주위에 원통형의 통 형상체를 글라스에 밀착해 두고, DNA의 추출액을 첨가하여 DNA를 추출하는 방법을 나타내는 단면도이다.
도 19는, 슬라이드 글래스 위의 목적 세포로부터 추출된 DNA를 사용한 유전자 해석의 예를 나타내는 선도이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 도면에 기초하여 설명한다. 도면에서는, 목적 세포(12)나 필터(16) 등을 적절히 확대하여 나타내고 있다.
[제1 실시 형태]
본 실시 형태에 있어서, 「순환 암세포」란, 암환자의 혈액에 포함되는 순환 종양 세포이며, 혈액 1cc 중에 통상 불과 수개 정도밖에 존재하지 않는 매우 세포수가 적은 희소한 세포이다. 순환 암세포는, 그 영역(英譯)인 "Circulating Tumor Cell"의 이니셜을 취해 「CTC」라고도 칭해진다.
「희소 암세포」란, 암환자의 복수, 복강 세정액, 림프액, 골수액 등의 체액에 포함되는 희소한 종양 세포이다.
처음에, 도 1에 있어서, 본 실시 형태에서 사용되는 필터(16)와, 필터(16)가 내장되는 여과 유닛(28)에 대하여 설명한다.
(필터)
필터(16)는, 극박판에 매우 다수의 구멍(26)(구멍 밀도 1×104/㎠ 이상)이 균일하게 또는 규칙적으로 형성된 것이다. 구멍(26)의 밀도는, 격자 배열, 지그재그 배열 등 배열의 형태에 따라 다르지만, 통상 1×104 내지 3×105/㎠, 바람직하게는 5×104 내지 2×105/㎠이다. 또한, 구멍(26)의 구멍 직경은, 목적 세포를 통과시키지 않는, 또한, 혈구 등의 혈액 성분 등, 목적 세포 이외의 체액 세포인 비목적 세포를 통과시킬 수 있는 사이즈를 갖는 것이다. 인간 혈구 성분의 크기(긴 직경)는, 히스토그램 해석의 결과, 적혈구에서 약 6 내지 7㎛이며, 백혈구에서 약 7 내지 9㎛이며, 혈소판에서 5㎛ 미만인 데 비하여, 목적 세포에서 약 12 내지 25㎛이다. 따라서, 구멍(26)의 구멍 직경은, 통상 약 7 내지 10㎛, 바람직하게는 약 8 내지 10㎛이다.
필터(16)의 형상은, 여과 유닛(28)에 장착되는 필터링(카세트)에 배치 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 원형, 사각형 등의 형상을 포함한다. 또한, 필터(16)의 사이즈는, 샘플(혈액)량, 구멍 직경, 시간, 유속, 내압 등의 물리적 팩터, 조작성, 비용 등을 고려하여 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어 혈액 5㎖를 처리하는 경우, 직경(원형의 경우), 또는 세로, 가로의 길이(사각형의 경우)가, 통상 약 10 내지 15㎜이지만, 혈액량에 따라서 사이즈를, 비한정적으로, 예를 들어 약 5 내지 20㎜의 범위로 할 수도 있다. 또한, 필터(16)의 두께는, 구멍 밀도, 내압, 비용 등과의 관계를 고려하여 적절히 결정되도록 하고, 통상 2 내지 40㎛, 바람직하게는 약 5 내지 15㎛이다.
필터(16)는, 재질 및 단면 형상에 의해 복수 종류로 분류할 수 있으며, 예를 들어 3D 금속 필터(18)(도 3a, 도 4a), 2D 금속 필터(20)(도 3b), 2D 수지 필터(22)(도 3c), 3D 수지 필터(24)(도 9)를 들 수 있다.
3D 금속 필터(18) 및 2D 금속 필터(20)의 재질은, 예를 들어 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 이리듐(Ir), 로듐(Rh) 또는 루테늄(Ru) 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 이 재질은, 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 이리듐(Ir), 로듐(Rh) 또는 루테늄(Ru)의 단체 금속이어도 되며, 또는 예를 들어, 팔라듐(Pd)·니켈(Ni) 합금, 백금(Pt)·니켈(Ni) 합금, 또는 금(Au)·니켈(Ni) 합금 등이어도 된다. 합금의 경우, 바람직하게는 니켈 등의 상대 금속에 비하여, 상기 금속의 비율이 많다. 이들 금속은, 예를 들어 니켈(Ni) 등의 금속과 비교하면, 목적 세포(12)에 대한 독성이 매우 낮다. 이유로서는, 팔라듐(Pd) 자체의 독성이 낮은 것과, Pd와 니켈(Ni)의 합금은 고용체를 형성함으로써 니켈(Ni)의 용출을 방지할 수 있기 때문이다. 이들 중, 금속 비용, 저독성 면에서, 팔라듐 또는 팔라듐(Pd)·니켈(Ni)의 합금이 바람직하다. Pd·Ni 합금의 경우, Pd가 50％(중량) 초과인 합금, 예를 들어 Pd 80％·Ni 20％의 합금이 바람직하다.
3D 금속 필터(18) 및 2D 금속 필터(20)를, Pd와 Ni의 합금이나, Pd 등으로 제작한 경우, 포르말린, 에탄올 등의 유기계 고정액에 내성이며, 목적 세포의 전사 전후의 세포 형태의 유지에 유리하다. 또한 내산성, 내열성이기도 하고, 또한 경성이며 내구성이 높기 때문에 멸균 세정을 할 수 있어, 반복 사용이 가능하다고 하는 이점을 갖고 있다. 또한, 표면 처리 없이도 세포가 접착하기 어렵다.
또한, 도 3a, 도 8에 나타낸 바와 같이, 3D 금속 필터(18)는, 목적 세포(12)를 포착할 수 있는 크기의 공동(30)을 갖고 있다. 공동(30)의 사이즈는, 비한정적으로, 예를 들어 직경 20 내지 30㎛ 및 깊이 5 내지 15㎛, 바람직하게는 직경 25 내지 30㎛ 및 깊이 10㎛이다. 깊이가 5㎛ 미만에서는, 목적 세포(12)가 들어갈 수 없다. 목적 세포(12)가 거의 완전하게 들어가도록 하기 위해서는, 공동(30)의 깊이는, 적어도 약 5 내지 15㎛인 것이 바람직하다. 단, 공동(30)의 깊이가 15㎛를 초과하면, 전사에 의한 목적 세포(12)의 회수율에 영향을 미칠 우려가 있다. 또한, 공동(30)은, 도 9에 나타낸 3D 수지 필터(24)와 같이, 두께 방향에 있어서의 단차 형상을 포함한다. 바꾸어 말하면, 공동(30)은, 주위벽에 둘러싸여 있어도 되며, 또한 둘러싸여 있지 않아도 된다.
높은 구멍 밀도를 유지하기 위해서, 공동(30)이 상기 전부 또는 일부의 구멍(26)의 상부에 형성되어 있어도 된다. 구체적으로는, 공동(30)의 수는, 구멍(26)의 수에 대하여 바람직하게는 80 내지 100％이다. 모든 구멍(26)의 상부에 공동(30)이 존재하는 것이, 더욱 바람직하다. 또한, 3D 금속 필터(18)에 있어서의 구멍(26)의 구멍 직경은, 공동(30)으로의 개구 위치에서의 직경이다.
도 3b에 있어서, 2D 금속 필터(20)는, 전체적으로 평면에 가까운 구조로 되어 있다. 2D 금속 필터(20)의 두께는, 예를 들어 10㎛이다. 이 2D 금속 필터(20)에는, 공동(30)(도 3a)이 형성되어 있지 않지만, 깊이 5㎛ 이하이면 공동을 구멍(26)의 상부에 설치해도 된다(도시생략). 전체적으로 평면에 가까운 구조로 되기 때문이다.
도 3c에 있어서, 2D 수지 필터(22)의 두께는, 예를 들어 15 내지 20㎛이다. 이 2D 수지 필터(22)에는, 공동(30)(도 3a)이 형성되어 있지 않지만, 깊이 5㎛ 이하이면 공동을 구멍(26)의 상부에 설치해도 된다(도시생략). 2D 수지 필터(22)는, 예를 들어 에폭시, 아크릴, 폴리카르보네이트 등의 수지로 형성된 것이다.
도 9에 있어서, 3D 수지 필터(24)는, 2D 수지 필터(22)(도 3c)와 마찬가지의 평판부(24A)에 있어서의 목적 세포(12)의 포착측 면(16A)에, 볼록부(24B)를 더하여 공동(30)을 형성한 것이다. 이 볼록부(24B)는, 구멍(26)을 피해서 평판부(24A)와 일체 성형되어 있다. 또한, 볼록부(24B)는, 예를 들어 점 형상(기둥 형상), 제방 형상, 또는 격자 형상으로 형성되어 있다. 볼록부(24B)가 점 형상의 경우, 3군데 이상에 점재되어 있는 것이 바람직하다. 볼록부(24B)가 제방 형상의 경우, 2군데 이상에 설치되는 것이 바람직하다. 볼록부(24B)의 높이는, 3D 금속 필터(18)의 공동(30)(도 3a)의 깊이와 마찬가지이다.
3D 금속 필터(18)에 의하면, 공동(30)을 마련함으로써, 1) 백혈구 세포의 콘타미네이션을 적게 할 수 있고, 2) 구멍(26)의 상부에 공동이 없이 목적 세포(12)가 직접 구멍(26)에 감입하는 경우에 비해, 공동(30)이 존재하면 필터의 가로 방향으로부터 공동(30) 내에 흘러 온 목적 세포(12)에 국소적인 회전 운동이 발생하기 때문에, 구멍(26)으로의 끼워넣기가 부드럽게 된다. 즉 공동(30)을 설치한 3D 구조로 함으로써, 목적 세포(12)가 구멍(26)에 포착 끼워 넣는 강도를 제어할 수 있다고 하는 효과가 얻어진다. 3) 공동(30)에 생리적 완충액(46)의 고임이 생기기 때문에, 원심력에 의한 목적 세포(12)의 슬라이드 글래스(42)로의 전사 시에, 목적 세포(12)가 건조하기 어려워져서, 세포 형태를 양호하게 유지할 수 있다(도 6, 도 7 참조). 이들 3개의 종합적인 효과에 의해, 목적 세포(12)의 농축과 형태의 보존을 할 수 있어, 후에 행하는 파파니콜로 염색이나 면역 염색을 고품질로 행하는 것이 가능해진다. 또한, 통상의 구멍 직경 8㎛의 구멍(26)에 비하여 약간 크고, 또한 목적 세포(12)에 비하여 약간 폭이 넓은 구멍 직경 10㎛의 구멍을 갖는 필터라도, 상기와 유사한 효과가 얻어질 가능성이 있다. 또한, 도 4b, 도 4c에 도시한 바와 같이, 개개의 공동(30)의 사이에 연통로(31)를 설치하는 편이 바람직하다. 이 연통로(31)는, 폭 치수가 공동(30)의 직경보다도 작고, 또한, 구멍(26)의 직경과 동일하거나, 혹은 그 이하이며, 깊이가 공동(30)과 동일하거나, 혹은 그 이하이다. 연통로(31)를 설치하는 이유는, 후술하는 바와 같이, 필터(16)를 상하 반전시키고 나서 슬라이드 글래스(42)에 겹칠 때, 목적 세포(12)가 구멍(26)에 꼭 들어맞게 공동(30) 내의 압력으로 낙하하기 어려운 경우라도 공동(30) 내의 압력을 연통로(31)에서 빠져나가, 용이하게 낙하시키기 위해서이다. 또한, 도 4c에 있어서, 「400x」는 확대 배율이며, 「WD」는 현미경의 작동 거리(Working distance)이다.
필터(16)의 주연은, 구멍 없이 테두리 처리되어 있는 것이 바람직하다. 테두리부가 존재함으로써, 1) 패킹을 필터(16)의 상하로부터 끼워 넣어, 여과 유닛(28)으로부터의 누액을 방지할 수 있고, 2) 목적 세포(12)를 슬라이드 글래스(42)의 한정된 영역에 고밀도로 전사하는 것이 가능하게 되기 때문에, 세포수의 계측이 용이해지는 것, 또한 3) 필터(16)를 손상시키지 않고 핀셋으로 집는 것이 가능해진다.
본 실시 형태의 필터(16)는, 예를 들어 LIGA(Lithogaphie Galvanoformung Abfomung) 기술을 이용함으로써 제작할 수 있다(핫토리 다다시, 표면 기술, Vol. 62, No. 12, 619-624, 2011; W. Elufeld and H. Lhe, Radiat. Phys. Chem., 45(3): 340-365, 1995). 일례로서, 기판 위에 레지스트, 흡수재(임의 성분), 마스크를 적층하고, 자외선, X선 또는 싱크로트론 방사광을 조사하여 레지스트 패턴을 형성한 뒤, 기판을 전극으로서 전주를 행하는 금속 도금을 행하고, 소정의 개공을 남기는 부분에서 전주를 종료하고, 또한 레지스트의 제거를 행하는 것을 포함하는 방법에 의해, 3D 금속 필터(18)나 2D 금속 필터(20) 등의 전주 필터를 제작할 수 있다. 2D 수지 필터(22)에 대해서는, 상기 LIGA와 같은 전주에 의해 제작한 금형을 사용함으로써 제작할 수 있다.
이들 필터(16)에 있어서, 구멍(26)이 「규칙적으로 배치」되어 있다고 함은, 될 수 있는 한 고밀도가 되는 배치로서, 모든 구멍(26)이 특정한 규칙성을 갖고 배열되어 있음을 가리킨다. 그와 같은 규칙성에는, 예를 들어 격자 형상의 배열, 바둑판의 배열(도 4), 방사상의 배열, 동심원상의 배열 등이 포함된다.
(여과 유닛)
도 1, 도 2에 있어서, 여과 유닛(28)은, 상부체(32)와 하부체(34)에서 내부에 유로(36)가 형성된 것이다. 필터(16)는, 예를 들어 상부체(32)와 하부체(34)의 사이에, 착탈 가능하게 배치되어 있다. 유로(36)는, 필터(16)에 대하여 수직으로 되어 있다. 필터(16)는, 도시하지 않은 필터 카세트 등을 통하여, 상부체(32) 또는 하부체(34)에 고정되어도 된다.
상부체(32)에는 입구부(38)가 마련되고, 하부체(34)에는 출구부(40)가 마련되어 있다. 혈액 또는 체액인 검체액(10)은, 입구부(38)로부터 공급되도록 되어 있다. 출구부(40)로부터는, 필터(16)의 구멍(26)을 통과한, 주로 비목적 세포(14)를 포함하는 검체액(10)이 배출되도록 되어 있다. 검체액(10)의 공급은, 펌프 등에 의한 가압을 이용한 것이 좋지만, 출구부(40)에 부압을 작용시키는 것이어도 된다. 또한, 검체액(10)의 자중을 이용한 것이어도 된다. 또한, 상부체(32)에는, 개폐 가능한 천장부(33)가 마련되어 있어도 된다.
여과 유닛(28)은, 가공의 용이함이나 비용면에서, 그 전체에 대하여 아크릴 등의 수지 또는 중합체로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 투명한 재질이면, 액체의 유하 속도를 감시할 수 있으므로 바람직하다.
도시는 생략하였지만, 여과 유닛(28) 외에, 리저버 유닛, 유량 조절 유닛, 및 액체 배출 회수 유닛(액 저장 베이스)을 더 포함할 수 있다.
(세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법)
본 실시 형태에 따른 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법은, 제1 스텝 S1 내지 제4 스텝 S4를 갖고 있다.
도 1, 도 2에 있어서, 제1 스텝 S1에서는, 혈액 중의 순환 암세포 또는 체액 중의 희소 암세포 중 적어도 한쪽인 목적 세포(12)를, 필터(16)에 의해 비목적 세포(14)로부터 분리하여 포착한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 입구부(38)로부터 여과 유닛(28) 내의 유로(36)에 검체액(10)을 주입하면, 검체액(10)에 포함되는 목적 세포(12)가 필터(16)에 포착되고, 비목적 세포(14)나 수분은 필터(16)의 구멍(26)을 통과하여, 출구부(40)로부터 배출된다. 이 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 필터(16)에 목적 세포(12)가 포착된 상태로 된다.
여기서, 검체액(10)의 양(체적)은, 통상 0.2 내지 20㎖, 바람직하게는 5 내지 10㎖이다. 통상, 검체액(10)(특히 혈액)은 인산 완충 생리 식염수(PBS)(목적에 따라 0.25 내지 1㎖ EDTA 함유의 PBS)이며, 예를 들어 2 내지 20배로 희석한 후에 여과한다. 5 내지 20㎖의 검체량에서는 통상 필요 없지만, 혈액량이 많은 경우(20 내지 50㎖)에는, 이하의 전처리를 행해도 된다.
전처리는, 예를 들어 혈액 등의 검체액(10)에 염화암모늄 베이스의 용혈제를 첨가하여 적혈구를 제거하고, CTC 또는 희소 암세포 등의 목적 세포(12)를 10배 이상 농축한 액을 여과 유닛(28)으로 유도함으로써, 여과 속도를 올리지 않고, 여과 시간을 단축할 수 있다. 이 경우, 3D 금속 필터(18)의 유속을 대폭으로 늦춘 상태에서 백혈구를 제거할 수 있기 때문에, 목적 세포(12)는 구멍(26)에 깊게 감입하지 않고 3D 금속 필터(18)의 공동(30)에 부드럽게 포착된다. 본 실시 형태의 전처리를 병용하는 경우, 전처리를 병용하지 않는 경우에 비해, 3D 금속 필터(18)에 포착된 목적 세포(12)에 걸리는 전단 응력이 경감되어, 세포질이 거의 없는 탈핵 세포를 저감시켜, 보다 양호한 세포 형태의 유지를 기대할 수 있다. 단, 한편으로 이와 같은 전처리는, 목적 세포(12)의 손실로 이어질 우려가 있다.
본 방법은, 검체액(10)을 여과 유닛(28)에 주입하고, 펌프에 의한 가압에 의해 여과를 행한다고 하는 단순한 방법이지만, 초고공 밀도(예를 들어, 5×104 내지 1.5×105/㎠)의 3D(혹은 2D) 금속 필터(18)를 사용함으로써, 허용 가능한 충분한 신속 처리를 달성할 수 있다. 예를 들어, 검체(전혈) 약 5 내지 7㎖는 세정을 포함해 약 30분으로 처리할 수 있다. 세정액에는 인산 완충 생리 식염수(PBS)를 사용하지만, 필요에 따라 EDTA를 포함해도 된다.
제1 스텝 S1과 제2 스텝 S2의 사이에서, 목적 세포(12)를 표지 항체에 의해 염색해도 된다. 구체적으로는, 목적 세포(12)에 특이적으로 결합하는 형광 표지 항체, 예를 들어 Alexa488 표지항 Keratin 항체, PE 표지항 EpCAM 항체, 백혈구에 특이적으로 결합하는 Alexa647 표지항 CD45 항체 등의 항체 혼합물 및 핵 염색용 형광 색소(Hoechst)를 사용하여, 목적 세포(12)를 염색한다. 이들 염색은, 여과 유닛(28)에 고정된 3D 금속 필터(18) 위에서 직접 행할 수 있다. 이에 의해, 후술하는 제2 스텝 S2와 제3 스텝 S3의 사이에서, 형광 현미경을 사용하여, 필터(16) 위에 포착된 목적 세포(12)의 수 등을 카운트할 수 있다.
도 5 내지 도 7에 있어서, 제2 스텝 S2에서는, 필터(16)의 목적 세포(12)의 포착측 면(16A)이 슬라이드 글래스(42)에 대향하도록 하여, 해당 필터(16)를 슬라이드 글래스(42)에 겹쳐(도 5), 필터(16)에 커버 부재(44)를 씌움과 함께(도 6), 필터(16)와 슬라이드 글래스(42) 사이의 목적 세포(12)를 생리적 완충액(46)에 침지한다(도 6, 도 7).
필터(16)가 여과 유닛(28)에 고정된 상태(도 2)에 있어서, 해당 필터(16)에 있어서의 목적 세포(12)의 포착측 면(16A)은, 상측 면이다. 포착측 면(16A)을 슬라이드 글래스(42)에 대향시키기 위해서는, 필터(16)를 상하 반전시키고 나서 슬라이드 글래스(42)에 겹치거나, 또는 필터(16) 위에 슬라이드 글래스(42)를 겹쳐, 필터(16) 및 슬라이드 글래스(42)를 상하 반전시킨다. 필터(16)가 슬라이드 글래스(42)에 겹쳐진 상태에 있어서는, 필터(16)의 포착측 면(16A)은 하측 면이 된다. 이 상태에 있어서, 필터(16)에 포착된 목적 세포(12)는, 해당 필터(16)와 슬라이드 글래스(42)의 사이에 위치하고 있다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 필터(16)가 3D 금속 필터(18)인 경우에는, 목적 세포(12)가 공동(30)에 들어가 있기 때문에, 세포를 변형시키는 응력이 적어, 세포장애성이 낮다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 필터(16)가 3D 수지 필터(24)인 경우에도, 볼록부(24B)에 의해 형성된 공동(30)에 의해 필터(16)의 포착측 면(16A)과 슬라이드 글래스(42) 사이의 간격이 확보되어 있으므로, 세포를 변형시키는 응력이 적어, 세포장애성이 낮지만, 3D 금속 필터(18)에 비해 경성이 부족하여, 내구성에 난점이 있다.
커버 부재(44)는, 예를 들어 필터(16)보다도 크고, 해당 필터(16)를, 전체적으로 여유를 갖고 덮고 있는 것이 바람직하다. 커버 부재(44)의 재질은, 유리나 수지 등이다.
목적 세포(12)를 생리적 완충액(46)에 침지하기 위해서는, 예를 들어 커버 부재(44)를 필터(16)에 겹치기 전에, 목적 세포(12)를 생리적 완충액(46)에 침지하고, 그 후방 커버 부재(44)를 살짝 겹친다. 도 6에 도시한 바와 같이, 피펫(48)을 사용하여, 커버 부재(44)와 슬라이드 글래스(42)의 사이에 생리적 완충액(46)을 주입해도 된다. 어느 경우에도, 생리적 완충액(46)의 표면 장력에 의해, 필터(16) 및 커버 부재(44)가 슬라이드 글래스(42)에 유지된다.
생리적 완충액(46)은 예를 들어 생리 식염수 또는 인산 완충 생리 식염수이지만, 이들로 한정되는 것이 아니라, 목적 세포(12)의 건조를 방지하는 의미에서도 다당류 등 완충액에 점성을 부여할 수 있고, 세포에 있어서 무독의 중합체 등을 첨가해도 된다.
제1 스텝 S1과 제2 스텝 S2의 사이에서, 목적 세포(12)를 항Keratin 항체, 항EpCAM 항체, 항CD45 항체 및 핵 염색(Hoechst)으로 4중 염색할 수 있고, 제3 스텝 S3으로 진행하기 전에, 형광 현미경을 사용하여, 필터(16) 위에 포착된 목적 세포(12)(Keratin+/EpCAM+/CD45-/Hoechst+)의 수 등을 카운트할 수 있다.
도 10에 있어서, 제3 스텝 S3에서는, 필터(16)와 슬라이드 글래스(42) 사이의 목적 세포(12)에, 예를 들어 원심력의 작용하에서, 슬라이드 글래스(42) 위에 코팅된 기질(도시생략)에 대한 세포 접착력을 이용하여, 목적 세포(12)를 슬라이드 글래스(42)에 전사한다. 구체적으로는, 필터(16) 및 커버 부재(44)가 겹쳐져, 목적 세포(12)가 생리적 완충액(46)에 침지된 슬라이드 글래스(42)를, 예를 들어 스윙 로터형의 원심기(50)의 아암부(52)에 설치하고, 해당 아암부(52)가 고정되어 있는 회전축(53)을 회전시킨다. 이때, 슬라이드 글래스(42)를 원심기(50)의 직경 방향 외측에 배치함으로써, 목적 세포(12)에 대하여, 필터(16)의 면 및 슬라이드 글래스(42)의 면 수직 방향으로 원심력을 작용시킬 수 있다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 원심기(50)의 회전 속도가 크면, 세포의 회수율이 증가한다. 회수율이란, 원심기(50)를 사용하기 전에 필터(16)에 포착되어 있던 세포의 수에 대한, 원심기(50)의 사용 후에 슬라이드 글래스(42)에 전사되고 형태가 잘 보존된 세포의 수의 비율이다. 도 11로부터, 회전 속도는 1500 내지 2000rpm이 바람직하다. 회전 속도가 이보다도 지나치게 크면, 세포장애성에 대한 영향이 커지기 때문이다.
또한, 제3 스텝 S3에서는, 목적 세포(12)에 원심력이 아니라, 공기압 등의 가압하에서의 슬라이드 글래스(42)에 대한 세포의 접착성을 이용해도 된다. 구체적으로는, 도 12에 나타낸 바와 같이, 제2 스텝 S2에서 여과 유닛(28)으로부터 꺼낸 필터(16)(2D 필터)를, 표면에 플라스마 등에 의한 친수 처리 등의 다양한 물질을 표면에 코팅하여 세포 접착성을 증강한 슬라이드 글래스(42) 위에 정치한 후, 원통형의 시린지형 가압 기구(59) 등에 의해 수동으로 가벼운 공기압을 가하고, 세포와 기질의 접착능을 이용하여, 목적 세포(12)를 슬라이드 글래스(42) 위에 스탬프식으로 전사해도 된다. 시린지형 가압 기구(59) 중, 통 형상체(62)의 내부에 면하는 선단에는, 고무(59A)가 설치되어 있다. 통 형상체(62)와 슬라이드 글래스(42)의 사이에는, 필터(16)를 갖는 필터 카세트(63)가 배치된다. 통 형상체(62)와 필터 카세트(63)의 사이에는, 실리콘 가스킷(61)이 설치된다.
목적 세포(12)가 고정된 세포인 경우에는 표면에 플라스마 등에 의한 친수 처리나 다양한 물질을 표면에 코팅한 시판 중인 슬라이드 글래스(42)를 사용해도 된다. 또한, 슬라이드 글래스(42)에 대한 목적 세포(12)의 전사를 촉진시키기 위해서, 슬라이드 글래스(42)의 표면에 폭 1 내지 5㎛, 깊이 1 내지 5㎛의 홈(43)을 절삭 등에 의해 적당 수 설치하여, 배수구를 작성하고, 상방으로부터의 가압에 의해 완만한 액류를 만드는 등으로 해도 된다.
도 13에 있어서, 제4 스텝 S4에서는, 보존액(56)이 저장된 용기(54)에 슬라이드 글래스(42)를 침지시킴으로써, 목적 세포(12)를 장애하지 않고, 커버 부재(44) 및 필터(16)를 자연적으로 박리시켜, 보존한다. 보존액(56)은, 그 후의 염색에 따른 각종 고정액, 예를 들어 10％ 포르말린이나 95％ 에탄올 등의 고정액, 나아가서는 생리적 완충액이지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 슬라이드 글래스(42)를 보존액(56)에 침지함으로써, 생리적 완충액(46)의 표면 장력이 보존액(56)의 표면 장력에 져서, 필터(16) 및 커버 부재(44)가 자연적으로 슬라이드 글래스(42)로부터 박리한다. 이로 인해, 커버 부재(44)를 박리하는 과정에서의 목적 세포(12)에 대한 장애는 최소한으로 억제된다. 제3 스텝 S3에 있어서, 목적 세포(12)는 슬라이드 글래스(42)에 견고하게 전사되고 있으므로, 필터(16) 및 커버 부재(44)가 박리해도, 목적 세포(12)는 슬라이드 글래스(42)에 유지된다. 이에 의해, 도 14에 나타낸 바와 같이, 슬라이드 글래스(42)에 목적 세포(12)가 고정된 슬라이드 글래스 표본(60)이 얻어진다.
본 실시 형태에 따른 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법에 의하면, 필터(16)를 사용함으로써, 검체액(10) 중의 목적 세포(12)(순환 암세포나 희소 암세포)를, 비목적 세포(14)(예를 들어 혈액 세포)의 사이즈 차를 이용하여 농축, 분리해서 포착할 수 있다.
또한, 포착된 목적 세포(12)를, 원심력의 작용하 또는 공기압 등의 가압하에서의 세포 접착성을 이용하여 슬라이드 글래스(42)에 부드럽게 전사할 때, 목적 세포(12)는 필터(16)의 공동(30)에 고인 생리적 완충액(46)에 침지되어 있기 때문에, 슬라이드 글래스(42)에 전사될 때, 목적 세포(12)가 압궤되거나, 건조하거나 하기 어려워지므로, 세포장애성을 최소한으로 억제할 수 있다.
그리고, 보존액(56)이 저장된 용기(54)에 슬라이드 글래스(42)를 침지하여, 커버 부재(44) 및 필터를 자연적으로 박리시킴으로써, 목적 세포(12)가 슬라이드 글래스(42)에 전사된 슬라이드 글래스 표본(60)으로 된다. 슬라이드 글래스 표본(60)은, 보존액(56) 중에서 실온 혹은 4℃에서 장기 보존이 가능하다.
또한, 제1 스텝 S1과 제2 스텝 S2의 사이에서, 표지 항체에 의해 목적 세포(12)를 염색하고, 염색한 목적 세포(12)의 수를, 형광 현미경을 사용해서 카운트한 경우에도, 해당 목적 세포(12)를 필터(16)로부터 간편하게 슬라이드 글래스(42) 위에 안정된 상태에서 회수, 전사할 수 있다.
[제2 실시 형태]
도 17에 있어서, 본 실시 형태에 관한 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법은, 제1 실시 형태와 마찬가지의 제1 스텝 S1(도 1도 참조)과, 제2 스텝 S12 내지 제4 스텝 S14를 갖고 있다. 제1 실시 형태와 동일한 부분에는 도면에 동일한 부호를 부여하고, 설명을 생략한다.
제1 스텝 S1에서는, 목적 세포(12)에 대해 고정 및 계면 활성제 처리는 행하지 않고, 목적 세포(12)가 살아 있는 상태 그대로 제2 스텝 S12로 진행된다.
제2 스텝 S12에서는, 여과 유닛(28)으로부터 꺼낸 필터(16)를, I형 콜라겐 등의 접착 촉진 물질이 표면에 코팅된 슬라이드 글래스(42) 위에 정치한 후, 곧 배양액(58)을 첨가하여, 목적 세포(12)를 예를 들어 살아 있는 채 접착시킨다.
제3 스텝 S13에서는, 목적 세포(12)를 CO2 인큐베이터 내에서, 37℃, 1 내지 수 시간 가온함으로써, 세포의 유주능을 이용하고, 목적 세포(12)를 슬라이드 글래스(42) 위에 충분히 접착시켜, 가압하 혹은 비가압하에서 전사한다.
제4 스텝 S14에서는, 슬라이드 글래스(42) 위에 통 형상체(62)를 배치하여 배양 접시로 하고, 해당 배양 접시에 배양액(58)을 충분량 첨가하고, 필터(16)를 배지 중에 뜨게 하여, 슬라이드 글래스(42)로부터 제거한다. 이에 의해 원심력이나 공기압 등의 외력을 세포에 가하지 않고, 세포 장애를 최소 한도로 억제하여, 목적 세포(12)를 살린 채 슬라이드 글래스(42) 위에 회수할 수 있다(도 17). 목적 세포(12)의 생존 조건하에서의 전사의 경우에는, 해당 목적 세포(12)가 필터(16)로부터 슬라이드 글래스(42) 위에 스스로 유주하고, 접착한다.
도 17의 제4 스텝 S14에 있어서, 필터(16), 커버 부재(44)가 제거되고, 슬라이드 글래스(42)에 전사된 목적 세포(12)는, 예를 들어 포르말린이나 에탄올의 고정액에 의한 고정의 후, 파파니콜로 염색이나 면역 염색에 이용할 수 있다. 또한, 목적 세포(12)는, 배양 접시 내에서 단기간 배양할 수도 있다. 즉, 목적 세포(12)는, 염색용이나 배양용 세포로서 이용할 수 있다.
이 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법에 의하면, 제1 실시 형태와 마찬가지로, 필터(16)(예를 들어 금속제 또는 수지제)에 의해, 검체액 중의 목적 세포(12)(순환 암세포나 희소 암세포)를 비목적 세포(14)(예를 들어 혈액 세포)와의 사이즈 차를 이용하여, 간편, 신속 또한 고효율로 분리하여 포착할 수 있다. 단, 전자(前者)의 살아 있는 상태의 장애가 적은 세포를 채취하는 경우에는, 제1 실시 형태에 비해 CO2 인큐베이터 내에서의 가온 조작이 필요하기 때문에, 세포 회수에는 수 시간 내지 수일, 세포 배양에는 수일 내지 수주일의 시간을 요한다.
[슬라이드 글래스 표본의 이용]
목적 세포(12)의 슬라이드 글래스 표본(60)을 사용함으로써, 예를 들어 파파니콜로 염색(도 15)이나 면역 염색(IHC법)(도 16)을 검사실의 루틴 워크로서 시공 할 수 있다. 도 15는, 파파니콜로 염색을 행한 세포의 현미경 사진이다. 크로마틴 패턴이 명료하며 세포질도 남아 있는 등 세포 형태의 보존이 양호하기 때문에, 병리의나 세포 검사 기사가 세포진과 같이 관찰할 수 있어, CTC의 정확하고 또한 객관적인 평가가 가능해진다. 도 16은, IHC법에 의한 면역 염색을 행한 세포의 현미경 사진이며, 사이트 케라틴 및 CD45의 염색 결과를 나타낸다. 세포 형태에 의한 평가 외에도, 면역 염색에 의한 평가가 더해지기 때문에, CTC의 판정은 보다 한층 정확해진다. 또한 HER2, ER, PgR 염색 등 컴패니언 진단에 필요한 면역 염색도 가능하다.
(DNA 또는 RNA의 추출 방법)
슬라이드 글래스 표본(60) 위에서, 목적 세포(12)로부터 DNA나 RNA를 추출하여, 공지의 방법으로 유전자 해석을 행할 수도 있다. 도 18은 슬라이드 글래스 표본(60) 위에 통 형상체(62)를 배치하여, 슬라이드 글래스(42) 위에 전사된 목적 세포(12)의 주위를, 예를 들어 수지제의 원통형 통 형상체(62)로 밀착하여 둘러싼 상태를 나타내고 있다. 이 통 형상체(62) 내에, DNA 또는 RNA의 추출액(64)을 소정 시간 유지한다. 구체적으로는, 통 형상체(62) 내에, 예를 들어 Proteinase K soln 등의 DNA의 추출액을 첨가하여, 56℃에서 60분간(이상) 인큐베이션하고, DNA를 추출한다. 필요에 따라 DNA를 정제하고, 이것을 사용하여 PCR법 등에 의해 각종 유전자 해석을 행할 수 있다(도 19). 또한, 통 형상체(62)의 재질은 수지로 한정되지 않고, 금속 등의 다른 재질이어도 된다. DNA 또는 RNA의 추출액(64)을 빠짐없이 액 저장하여, 일정 기간(예를 들어 1 내지 4시간) 56℃에서 인큐베이트하기 위해서, 도 18에 나타낸 바와 같이, 통 형상체(62)의 측부에 밀착용의 압을 작용시키는 자루(66)를 마련하고, 통 형상체(62)의 저부에 환상의 고무(68)(시일재)를 배치하여, 자루(66)에 압을 작용시켜 슬라이드 글래스(42)에 밀착시키는 구조여도 된다.
RNA의 추출액은, RLT soln을 사용할 수 있다. 슬라이드 글래스 표본(60) 위의 통 형상체(62) 내에 RNA의 추출액을 첨가하고, 적절히 RNeasy Kit 등을 사용하여 RNA를 정제하고, PCR법에 의해 각종 유전자 해석을 행할 수 있다.
이와 같이, 목적 세포(12)의 슬라이드 글래스 표본 작성에 의해 세포수의 계측뿐만 아니라, 목적 세포(12)의 면역 염색을 사용한 세포학적 진단이나 유전자 해석 등, 컴패니언 진단에 필요한 액체 세포진(Liquid biopsy)으로서의 간편, 저비용에서의 이용이 가능해진다.
상기 실시 형태에 따른 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법에 있어서, 필요한 기기는 저비용이고 안전한 일회용 사용이 가능한 필터(16)와 여과 디바이스, 간단한 시린지 펌프, 저속의 탁상형 원심기(50), 일회용 사용의 코팅 슬라이드 글래스(슬라이드 글래스(42)) 및 소형, 원통형의 시린지형 가압 기구(59)나 DNA/RNA 회수 기구(통 형상체(62))만이다. 이 CTC 등 목적 세포의 슬라이드 글래스로의 전사·회수 장치 및 시스템은, 일반 병원의 검사실에 있어서의 CTC 등의 검사를 가능하게 하는 것으로, CTC 등의 목적 세포의 검출, 회수, 해석 기술로서 달리 유례를 볼 수 없는 다기능성을 갖고 있다.
[다른 실시 형태]
이상, 본 발명의 실시 형태의 일례에 대하여 설명하였지만, 본 발명의 실시 형태는, 상기로 한정되는 것이 아니라, 상기 이외에도, 그 주지를 일탈하지 않는 범위 내에 있어서 다양하게 변형하여 실시 가능한 것은 물론이다.
예를 들어, 제1 스텝 S1과 제2 스텝 S2, S12의 사이에 있어서, 형광 표지 항체에 의한 염색이나 형광 현미경을 사용한 목적 세포의 수의 카운트를 행하지 않아도 되며, 오히려 슬라이드 글래스 표본 위의 쪽이 더욱 정확한 계측이 가능하다. 또한, 이 단계에서 표지 항체 염색을 하지 않는 쪽이, 제4 스텝 S4, S14 이후의 슬라이드 글래스 표본 작성 후의 면역 염색의 결과도, 오히려 양호해지는 경향이 보인다.
2016년 7월 25일에 출원된 일본 특허출원 제2016-145568호의 개시는, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격이 참조에 의해 포함되는 것이 구체적이며 또한 개별적으로 기재된 경우와 동일 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의해 포함된다.

Claims (4)

  1. 혈액 중의 순환 암세포 또는 체액 중의 희소 암세포 중 적어도 한쪽인 목적 세포를 포착하는 공동과 이 공동에 형성되고 비목적 세포를 통과시키는 구멍을 갖는 필터와,
    상기 필터의 상기 목적 세포의 포착측 면에 겹쳐져 상기 목적 세포가 전사되는 슬라이드 글래스와,
    상기 슬라이드 글래스와 반대측의 상기 필터의 면에 씌워지고 상기 공동의 내부에서 상기 목적 세포를 침지시키기 위한 생리적 완충액을 봉입하는 커버 부재와,
    상기 슬라이드 글래스를 침지하여 상기 슬라이드 글래스 위에 전사된 상기 목적 세포를 보존하는 보존액이 모인 용기
    를 구비하여 이루어지는, 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 장치.
  2. 혈액 중의 순환 암세포 또는 체액 중의 희소 암세포 중 적어도 한쪽인 목적 세포를 포착하는 공동과 이 공동에 형성되고 비목적 세포를 통과시키는 구멍을 갖는 필터를 구비하고,
    상기 필터에 의해 상기 비목적 세포로부터 분리하여 상기 목적 세포를 포착하는 제1 스텝과,
    상기 필터의 상기 목적 세포의 포착측 면이 슬라이드 글래스에 대향하도록 하여 상기 필터를 상기 슬라이드 글래스에 겹쳐, 상기 필터에 커버 부재를 씌움과 함께, 상기 필터와 상기 슬라이드 글래스 사이의 상기 목적 세포를 생리적 완충액에 침지하는 제2 스텝과,
    상기 필터와 상기 슬라이드 글래스 사이의 상기 목적 세포를, 원심력의 작용하 또는 공기압에 의한 가압하에서, 상기 슬라이드 글래스에 전사하는 제3 스텝과,
    보존액이 모인 용기에 상기 슬라이드 글래스를 침지시킴으로써, 상기 목적 세포를 장애하지 않고, 상기 커버 부재 및 상기 필터를 자연적으로 박리시켜, 보존하는 제4 스텝
    을 갖는, 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법.
  3. 혈액 중의 순환 암세포 또는 체액 중의 희소 암세포 중 적어도 한쪽인 목적 세포를 포착하는 공동과 이 공동에 형성되어 비목적 세포를 통과시키는 구멍을 갖는 필터를 구비하고,
    상기 필터에 의해 상기 비목적 세포로부터 분리하여 상기 목적 세포를 포착하는 제1 스텝과,
    상기 필터에 포착된 상기 목적 세포를 생리적 완충액에 넣는 제2 스텝과,
    상기 생리적 완충액 중의 상기 목적 세포를 슬라이드 글래스 위에 밀착시켜, 상기 목적 세포를 상기 슬라이드 글래스에 살아있는 채로 접착, 전사시키는 제3 스텝과,
    보존액이 모인 용기에 상기 슬라이드 글래스를 침지하여, 상기 슬라이드 글래스 위에 전사된 상기 목적 세포를 보존하는 제4 스텝
    을 갖는, 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 어느 한 항에 기재된 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 장치 또는 세포의 슬라이드 글래스 표본 제작 방법에 의해 얻어진 세포의 슬라이드 글래스 표본 위에 통 형상체를 배치하여, 상기 슬라이드 글래스 위에 전사된 상기 목적 세포의 주위를 상기 통 형상체로 둘러싸고, 상기 통 형상체 내에 DNA 또는 RNA의 추출액을 소정 시간 유지하고, 상기 목적 세포로부터 DNA 또는 RNA를 추출하는, DNA 또는 RNA의 추출 방법.
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