CN107873050A - 细胞的载玻片标本制作装置、细胞的载玻片标本制作方法、以及dna或rna的提取方法 - Google Patents

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Abstract

细胞的载玻片标本制作装置具备：具有用于捕捉目标细胞的凹坑以及形成于该凹坑且用于使非目标细胞通过的孔的过滤器，所述目标细胞是血液中的循环癌细胞或体液中的稀少癌细胞中的至少一者；重叠于前述过滤器的前述目标细胞的捕捉侧的面且要被转印前述目标细胞的载玻片；覆盖于前述过滤器的与前述载玻片相反一侧的面、且在前述凹坑的内部封入用于浸渍前述目标细胞的生理缓冲液的覆盖部件；以及，贮存有保存液的容器，所述保存液用于浸渍前述载玻片且保存被转印至前述载玻片上的前述目标细胞。

Description

细胞的载玻片标本制作装置、细胞的载玻片标本制作方法、以 及DNA或RNA的提取方法
技术领域
本发明涉及目标细胞(血液中的循环癌细胞或体液中的稀少癌细胞)的载玻片标本制作装置、细胞的载玻片标本制作方法、以及DNA或RNA的提取方法。
背景技术
作为进行血液中的循环癌细胞(Circulating Tumor Cell；以下也称为“CTC”)的分离、检测的装置，报告有多种装置，但Veridex公司的CellSearch(注册商标)是美国食品和药物管理局(FDA)唯一认可且上市销售的装置。
此外，日本特开平6-221976号公报和美国专利第5,143,627号公报公开了在咳痰等一般的细胞诊断检体处理时使用过滤器简便且有效地将一般细胞转印至载玻片并制作载玻片标本的装置和方法。但是，截止至今，尚未公开制作CTC载玻片标本的相关装置和方法。
发明内容
发明要解决的问题
上述CellSearch等以往的CTC分离检测装置、方法通过在暗视野下利用由荧光染色表达的标记的组合(角蛋白+/EpCAM+/CD45-)来进行CTC的判定，因而核的染色质图案等CTC的细胞形态学评价不充分，无法将CTC以细胞诊断的形式来进行评价。基于上述理由，CTC检测法在日本未成为细胞诊断检测的对象，因此也没有保险应对方案。作为CTC的检测方法，以往的荧光检测法仅被极少一部分检测公司在临床试验用途中作为对外委托检测来进行，完全没有在一般医院中普及。
此外，上述日本特开平6-221976号公报、美国专利第5,143,627号公报公开的检体处理方法和装置由于使用平坦的一般过滤器，因此在咳痰等检体中存在大量癌细胞的情况下是有效的。然而，在CTC等通常在1cc血液中仅存在数个左右的极其稀少的细胞检体的情况下，细胞被压溃或者干燥而产生细胞损害性，结果，其向载玻片转印的转印效率恶化，因此无法制作载玻片标本。
另一方面，本申请人在日本特许第5961889号公报中提出了一种金属过滤器，该金属过滤器借助能够捕捉血液中的末梢循环肿瘤细胞或稀少癌细胞的凹坑以及形成于该凹坑底部的孔，仅使血液细胞滤过，从而能够浓缩末梢循环肿瘤细胞或体液中的稀少癌细胞。
本申请的目的在于，通过应用上述日本特许第5961889号公报中提出的过滤器来作为细胞的载玻片标本制作的装置和方法，从而简便、迅速且高效地分离出血液中的循环癌细胞、体液中的稀少癌细胞、即目标细胞，并且，通过制作在将细胞损害性抑制至最小限的情况下高效地进行转印的载玻片标本，从而能够在一般医院的临床检测室用于包含免疫染色的细胞诊断、基因检测等。
用于解决问题的方法
本申请包括下述特征。
[1]一种细胞的载玻片标本制作装置，其具备：具有用于捕捉目标细胞的凹坑以及形成于该凹坑且用于使非目标细胞通过的孔的过滤器，所述目标细胞是血液中的循环癌细胞或体液中的稀少癌细胞中的至少一者；重叠于前述过滤器的前述目标细胞的捕捉侧的面且被转印前述目标细胞的载玻片；覆盖于前述过滤器的与前述载玻片相反一侧的面且在前述凹坑的内部封入用于浸渍前述目标细胞的生理缓冲液的覆盖部件；以及，贮存有保存液的容器，所述保存液用于浸渍前述载玻片且保存被转印至前述载玻片上的前述目标细胞。
[2]一种细胞的载玻片标本制作方法，其具备具有用于捕捉目标细胞的凹坑以及形成于该凹坑且用于使非目标细胞通过的孔的过滤器，所述目标细胞是血液中的循环癌细胞或体液中的稀少癌细胞中的至少一者，所述细胞的载玻片标本制作方法具有下述步骤：利用前述过滤器自前述非目标细胞进行分离并捕捉前述目标细胞的第一步骤；以前述过滤器的前述目标细胞的捕捉侧的面面对载玻片的方式将前述过滤器重叠于前述载玻片，并使覆盖部件覆盖于前述过滤器，同时将前述过滤器与前述载玻片之间的前述目标细胞浸渍于生理缓冲液的第二步骤；将前述过滤器与前述载玻片之间的前述目标细胞在离心力的作用下或基于空气压力的加压下转印至前述载玻片的第三步骤；以及，通过将前述载玻片浸渍于贮存有保存液的容器，从而不损害前述目标细胞地自载玻片自然地剥离覆盖部件和前述过滤器并保存的第四步骤。
[3]一种细胞的载玻片标本制作方法，其具备具有用于捕捉目标细胞的凹坑以及形成于该凹坑且用于使非目标细胞通过的孔的过滤器，所述目标细胞是血液中的循环癌细胞或体液中的稀少癌细胞中的至少一者，所述细胞的载玻片标本制作方法具备下述步骤：利用前述过滤器自前述非目标细胞进行分离并捕捉前述目标细胞的第一步骤；将被前述过滤器捕捉的前述目标细胞投入生理缓冲液的第二步骤；使前述生理缓冲液中的前述目标细胞密合在载玻片上，使前述目标细胞在存活于前述载玻片的状态下粘附、转印至前述载玻片的第三步骤；以及，将所述载玻片浸渍于贮存有保存液的容器，保存被转印至前述载玻片上的前述目标细胞的第四步骤。
[4]一种DNA或RNA的提取方法，其中，在通过[1]～[3]中任一项所述的细胞的载玻片标本制作装置或者细胞的载玻片标本制作方法得到的细胞的载玻片标本上配置筒状体，用前述筒状体包围被转印至前述载玻片上的前述目标细胞的周围，将DNA或RNA的提取液在前述筒状体内保持规定时间，从前述目标细胞中提取DNA或RNA。
根据[1]所述的细胞的载玻片标本制作装置或者[2]所述的细胞的载玻片标本制作方法，通过使用具有凹坑的过滤器(例如金属制或树脂制)，能够利用目标细胞(血液中的循环癌细胞、体液中的稀少癌细胞)与非目标细胞(例如血液细胞)的尺寸差异将目标细胞不遗漏地分离，并利用凹坑进行捕捉。
此外，目标细胞被浸渍于滞留在过滤器凹坑内的生理缓冲液，因此，在转印至载玻片时，目标细胞不易被压溃或干燥，能够将细胞损害性抑制至最小限，并良好地保存细胞形态。并且，通过将载玻片浸渍于贮存有保存液的容器，不加多余外力地使覆盖部件和过滤器自然剥离，从而形成使目标细胞不被干燥地以良好保存形态的状态转印至载玻片的载玻片标本。
根据[3]所述的细胞的载玻片标本制作方法，通过具有凹坑的过滤器(例如金属制或树脂制)，能够利用目标细胞(血液中的循环癌细胞、体液中的稀少癌细胞)与非目标细胞(例如血液细胞)的尺寸差异，简便、迅速且高效地分离且捕捉目标细胞。通过将所捕捉的目标细胞投入生理缓冲液并使其密合在载玻片上，在其存活于该载玻片的状态下粘附、转印至该载玻片，能够在将细胞损害性抑制至最小限的条件下将该目标细胞转印至载玻片。
根据[4]所述的细胞的载玻片标本制作方法，能够将目标细胞固定在过滤器上，然后将该目标细胞自过滤器简便、高效地回收、转印至载玻片上。通过使用目标细胞的载玻片标本，能够将例如巴氏染色、免疫染色作为检测室的日常工作而实施，进而，能够自该载玻片标本简便且容易地提取DNA、RNA，进行基因分析。像这样，使用了载玻片标本的巴氏染色、免疫染色是永久标本，因此，与基于荧光染色的判定相比，不仅其细胞数的计测也能够通过多名细胞检测士、病理医生在明视野中进行更客观评价，而且还能够作为目标细胞的细胞学诊断、基因分析等的液体活组织检测(Liquid biopsy)进行简便、低成本的利用。
发明的效果
根据本公开，能够利用具有凹坑的过滤器简便、迅速且高效地分离循环癌细胞、稀少癌细胞之类的目标细胞，并且，能够在将细胞损害性抑制至最小限的条件下高效地转印至载玻片，能够在一般医院的检测室用于包含免疫染色的细胞诊断、基因检测等。
附图说明
图1～图16涉及第一实施方式，图1是示出包含细胞的体液在具有过滤器的过滤单元中流动的状态的截面图。
图2是示出通过过滤器捕捉到目标细胞的状态的截面图。
图3A是示出3D金属过滤器的放大截面图。
图3B是示出2D金属过滤器的放大截面图。
图3C是示出2D树脂过滤器的放大截面图。
图4A是示出3D金属过滤器的放大平面图。
图4B是示出3D金属过滤器的变形例的放大平面图。
图4C是示出图4B的3D金属过滤器的变形例的立体图(显微镜照片)。
图5是示出对载玻片重叠过滤器的状态的放大截面图。
图6是示出向覆盖部件与载玻片之间注入生理缓冲液的状态的放大截面图。
图7是示出将目标细胞浸渍于生理缓冲液的状态的放大截面图。
图8是示出重叠有载玻片和3D金属过滤器和覆盖部件，且位于3D金属过滤器与载玻片之间的目标细胞浸渍于生理缓冲液的状态的放大截面图。
图9是示出重叠有载玻片和3D树脂过滤器和覆盖部件，且3D树脂过滤器与载玻片之间存在目标细胞的状态的放大截面图。
图10是示出利用离心机将目标细胞转印至载玻片的状态的侧视图。
图11是示出离心机的旋转速度与细胞的回收率的关系的柱状图。
图12是示出通过将过滤器上捕捉的目标细胞投入至生理缓冲液，使过滤器密合在表面涂布有促进粘附的基质的载玻片上，并使用注射器型加压器具通过空气压力等自上方进行加压，从而能够将该目标细胞以压印的方式转印在载玻片上的截面图。
图13是示出将转印有目标细胞的载玻片浸渍于保存液，并利用基于重力的自然落体使覆盖部件和过滤器自载玻片进行剥离的状态的截面图。
图14是示出载玻片标本的截面图。
图15是示出载玻片标本的巴氏染色的显微镜照片。清晰地观察到癌细胞的核的染色质图案和细胞质。
图16是实施各种免疫染色后的细胞的显微镜照片。
图17涉及第二实施方式，是示出在存活条件下进行转印时目标细胞自过滤器自行游走并粘附在载玻片上的状态的截面图。
图18是示出在转印至载玻片上的目标细胞的周围使圆筒状的筒状体密合于玻片，并添加DNA的提取液来提取DNA的方法的截面图。
图19是示出使用自载玻片上的目标细胞中提取的DNA进行基因分析的例子的柱状图。
具体实施方式
以下，基于附图来说明本具体实施方式。附图中，适当放大并示出目标细胞12、过滤器16等。
[第一实施方式]
本实施方式中，“循环癌细胞”是指癌症患者的血液中包含的循环肿瘤细胞，是在1cc血液中通常仅存在数个左右的细胞数非常少的稀少细胞。循环癌细胞取其英译文“Circulating Tumor Cell”的首字母，也称为“CTC”。
“稀少癌细胞”是指癌症患者的腹水、腹腔清洗液、淋巴液、骨髓液等体液中包含的稀少肿瘤细胞。
首先，在图1中，针对本实施方式所使用的过滤器16和安装有过滤器16的过滤单元28进行说明。
(过滤器)
过滤器16是对极薄板均匀或规则地形成数量非常多的孔26(孔密度为1×104/cm2以上)而得到的过滤器。孔26的密度因格子排列、之字排列等排列形态而异，通常为1×104～3×105/cm2、优选为5×104～2×105/cm2。此外，孔26的孔径具有能够不使目标细胞通过且使血球等血液成分等除了目标细胞之外的体液细胞、即非目标细胞通过的尺寸。对人血球成分的大小(长径)进行直方图分析的结果是，红血球约为6～7μm、白血球约为7～9μm、血小板小于5μm，与此相对，目标细胞约为12～25μm。因此，孔26的孔径通常约未7～10μm、优选约为8～10μm。
关于过滤器16的形状，只要能够配置于过滤单元28所装配的过滤器环(盒)就没有特别限定，包括例如圆形、方形等形状。此外，过滤器16的尺寸可考虑样品(血液)量、孔径、时间、流速、耐压等物理因素、操作性、成本等来适当决定。例如，对5ml血液进行处理时，直径(圆形的情况)或者纵、横的长度(方形的情况)通常约为10～15mm，还能够根据血液量将尺寸非限定性地设为例如约5～20mm的范围。此外，过滤器16的厚度可考虑其与孔密度、耐压、成本等的关系来适当决定，通常为2～40μm、优选约为5～15μm。
过滤器16可根据材质和截面形状而分类为多种，可列举出例如3D金属过滤器18(图3A、图4A)、2D金属过滤器20(图3B)、2D树脂过滤器22(图3C)、3D树脂过滤器24(图9)。
3D金属过滤器18和2D金属过滤器20的材质包含例如钯(Pd)、铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)、铱(Ir)、铑(Rh)或钌(Ru)中的至少任一种。该材质可以为钯(Pd)、铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)、铱(Ir)、铑(Rh)或钌(Ru)的金属单质，或者，可以为例如钯(Pd)·镍(Ni)合金、铂(Pt)·镍(Ni)合金或金(Au)·镍(Ni)合金等。在合金的情况下，优选上述金属相对于镍等对象金属而言的比率更多。这些金属与例如镍(Ni)等金属相比时，对目标细胞12的毒性非常低。作为理由，是因为钯(Pd)自身的毒性低、以及Pd与镍(Ni)的合金通过形成固溶体而能够防止镍(Ni)溶出。这些之中，从金属成本、低毒性的观点出发，优选为钯或钯(Pd)·镍(Ni)的合金。在Pd·Ni合金的情况下，优选为Pd超过50％(重量)的合金、例如Pd80％·Ni20％的合金。
利用Pd与Ni的合金、Pd等制作3D金属过滤器18和2D金属过滤器20时，对福尔马林、乙醇等有机系固定液具有耐性，有利于保持目标细胞的转印前后的细胞形态。进而，还具有耐酸性、耐热性且为硬性、耐久性高，因此还具有能够进行灭菌清洗、能够反复使用的优点。此外，即使不进行表面处理也不易粘附细胞。
进而，如图3A、图8所示那样，3D金属过滤器18具有能够捕捉目标细胞12的大小的凹坑30。凹坑30的尺寸非限定性地例如为直径20～30μm和深度5～15μm、优选为直径25～30μm和深度10μm。深度低于5μm时，目标细胞12不会进入。为了使目标细胞12基本完全进入，期望凹坑30的深度至少约为5～15μm。其中，如果凹坑30的深度超过15μm，则有可能影响由转印回收目标细胞12的回收率。此外，凹坑30如图9所示的3D树脂过滤器24那样的包含厚度方向的高低差形状。换言之，凹坑30可以被周壁包围，也可以不被包围。
为了维持高的孔密度，凹坑30可以形成于上述的全部或一部分孔26的上部。具体而言，凹坑30的数量相对于孔26的数量优选为80～100％。进一步优选在所有孔26的上部存在凹坑30。应予说明，3D金属过滤器18中的孔26的孔径是向凹坑30开口的开口位置处的直径。
在图3B中，2D金属过滤器20整体呈现近似平面的结构。2D金属过滤器20的厚度例如为10μm。该2D金属过滤器20未形成凹坑30(图3A)，如果深度为5μm以下则可以在孔26的上部设置凹坑(未图示)。这是为了整体呈现近似平面的结构。
在图3C中，2D树脂过滤器22的厚度例如为15～20μm。该2D树脂过滤器22未形成凹坑30(图3A)，如果深度为5μm以下，则可以在孔26的上部设置凹坑(未图示)。2D树脂过滤器22由例如环氧、丙烯酸类、聚碳酸酯等的树脂形成。
在图9中，3D树脂过滤器24在与2D树脂过滤器22(图3C)相同的平板部24A的目标细胞12的捕捉侧的面16A增加凸部24B和而形成凹坑30。该凸部24B避开孔26地与平板部24A一体成形。此外，凸部24B形成为例如点状(柱状)、堤状或格子状。凸部24B为点状时，期望散布在3处以上。凸部24B为堤状时，期望设置于2处以上。凸部24B的高度与3D金属过滤器18的凹坑30(图3A)的深度相同。
根据3D金属过滤器18，通过设置凹坑30，能够获得下述效果：1)能够减少白血球细胞的污染；2)与孔26的上部没有凹坑、目标细胞12直接嵌入孔26的情况相比，如果存在凹坑30则自过滤器的横向流入凹坑30内的目标细胞12发生局部的旋转运动，因此对于孔26的嵌入变得温和。即，通过制成设置有凹坑30的3D结构，能够控制目标细胞12被捕捉嵌入孔26的强度。3)由于生理缓冲液46能够滞留于凹坑30，因此，利用离心力将目标细胞12转印于载玻片42时，目标细胞12不易干燥，能够良好地保持细胞形态(参照图6、图7)。通过这些3个综合效果，能够进行目标细胞12的浓缩和形态的保存，能够高品质地进行后续进行的巴氏染色、免疫染色。此外，即使是具有与通常的孔径为8μm的孔26相比略大、且与目标细胞12相比略宽的孔径为10μm的孔的过滤器，有可能也能够获得与上述类似的效果。此外，如图4B、图4C所示那样，优选在各个凹坑30之间设置连通路31。该连通路31的宽度尺寸小于凹坑30的直径，并且，直径与孔26相同或者为其以下、深度与凹坑30相同或者为其以下。设置连通路31的理由在于，如后所述地使过滤器16上下翻转后再重叠于载玻片42时，即使在目标细胞12嵌入孔26并难以因凹坑30内的压力而下落的情况下，凹坑30内的压力也会因连通路31而逸散，从而使目标细胞12容易地下落。应予说明，在图4C中，“400x”是放大倍率，“WD”是显微镜的工作距离(Working distance)。
过滤器16的周边优选无孔地进行了切边。通过存在边缘部，1)能够从过滤器16的上下夹入密封件，防止液体自过滤单元28泄露；2)能够将目标细胞12高密度地转印至载玻片42的有限区域，因此容易计测细胞数；进而，3)能够利用镊子夹取而不损伤过滤器16。
本实施方式的过滤器16可通过利用例如LIGA(Lithogaphie GalvanoformungAbfomung)技术来制作(服部正、表面技术、Vol.62,No.12,619-624,2011；W.Elufeld和H.Lhe,Radiat.Phys.Chem.,45(3)：340-365,1995)。作为一例，通过包括下述操作的方法，能够制作3D金属过滤器18、2D金属过滤器20等电铸过滤器，所述操作为：进行在基板上层叠抗蚀剂、吸收材料(任意成分)、掩模，照射紫外线、X射线或同步加速器放射光而形成抗蚀图案后，将基板作为电极来进行电铸的金属镀敷，在残留规定的开孔时结束电铸，进一步进行抗蚀剂的去除。关于2D树脂过滤器22，可通过使用利用上述LIGA之类的电铸制作的模具来制作。
这些过滤器16中，孔26“规则地配置”是指尽可能达到高密度那样的配置，是指所有的孔26具有特定规则性地进行排列。这种规则性包括例如格子状的排列、之字格子的排列(图4)、放射状的排列、同心圆状的排列等。
(过滤单元)
在图1、图2中，过滤单元28通过上部体32和下部体34在内部形成有流路36。过滤器16例如在上部体32与下部体34之间可装卸地配置。流路36与过滤器16垂直。过滤器16可以借助未图示的过滤器盒等而被固定于上部体32或下部体34。
上部体32设置有入口部38，下部体34设置有出口部40。作为血液或体液的检体液10自入口部38被供给。自出口部40起通过过滤器16的孔26的、主要包含非目标细胞14的检体液10被排出。检体液10的供给可以利用基于泵等的加压来进行，可以对出口部40作用有负压。此外，可以利用检体液10的自重。应予说明，上部体32可以设置有能够开关的顶部33。
从加工容易度、成本的方面出发，过滤单元28优选其整体由丙烯酸类等的树脂或聚合物形成。如果为透明的材质，则能够监控液体的流下速度，故而优选。
虽然省略图示，但除了过滤单元28之外，还可以包含蓄积池单元、流量调节单元和废液回收单元(积液台)。
(细胞的载玻片标本制作方法)
本实施方式所述的细胞的载玻片标本制作方法具有第一步骤S1～第四步骤S4。
在图1、图2中，第一步骤S1中，利用过滤器16自非目标细胞14分离并捕捉目标细胞12，所述目标细胞12是血液中的循环癌细胞或体液中的稀少癌细胞中的至少一者。如图1所示那样，如果自入口部38向过滤单元28内的流路36注入检体液10，则检体液10中包含的目标细胞12被过滤器16捕捉，非目标细胞14、水分通过过滤器16的孔26，自出口部40被排出。其结果，如图2所示那样，呈现过滤器16捕捉有目标细胞12的状态。
此处，检体液10的量(体积)通常为0.2-20ml、优选为5～10ml。通常，检体液10(尤其是血液)被磷酸缓冲生理盐水(PBS)(根据目的为0.25～1ml含有EDTA的PBS)稀释例如2～20倍后进行过滤。5～20ml的检体量通常不需要进行前处理，但血液量多时(20～50ml)，可以进行下述前处理。
前处理中，通过例如向血液等检体液10中添加氯化铵基质的溶血剂而去除红血球、并将CTC或稀少癌细胞等目标细胞12浓缩10倍以上而得到的液体导入至过滤单元28，能够缩短过滤时间而不提高过滤速度。此时，能够在大幅降低3D金属过滤器18流速的状态下去除白血球，因此，目标细胞12不会深深地嵌入孔26，而被3D金属过滤器18的凹坑30温和地捕捉。组合使用本实施方式的前处理时，与不组合使用前处理时相比，对被3D金属过滤器18捕捉的目标细胞12施加的剪断应力得以减轻，减少基本没有细胞质的脱核细胞，能够期待保持更良好的细胞形态。但是，另一方面，这种前处理有可能导致目标细胞12的损失。
本方法是将检体液10注入至过滤单元28，并通过基于泵的加压来进行过滤的单纯方法，但通过使用超高孔密度(例如5×104～1.5×105/cm2)的3D(或2D)金属过滤器18，能够实现可允许的充分迅速处理。例如，对于约5-7ml的检体(全血)，包括清洗在内能够以约30分钟进行处理。清洗液使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)，根据需要可以包含EDTA。
在第一步骤S1与第二步骤S2之间，可以利用标记抗体对目标细胞12进行染色。具体而言，使用特异性地结合于目标细胞12的荧光标记抗体、例如Alexa488标记抗角蛋白抗体、PE标记抗EpCAM抗体、特异性地结合于白血球的Alexa647标记抗CD45抗体等的抗体混合物和核染色用的荧光色素(Hoechst)，对目标细胞12进行染色。这些染色可以在固定于过滤单元28的3D金属过滤器18上直接进行。由此，在后述第二步骤S2与第三步骤S3之间，使用荧光显微镜，能够计数被捕捉在过滤器16上的目标细胞12的数量等。
在图5～图7中，第二步骤S2中，以过滤器16的目标细胞12的捕捉侧的面16A面对载玻片42的方式，将该过滤器16重叠于载玻片42(图5)，使覆盖部件44覆盖过滤器16(图6)，并且，将过滤器16与载玻片42之间的目标细胞12浸渍于生理缓冲液46(图6、图7)。
在过滤器16被固定于过滤单元28的状态(图2)下，该过滤器16的目标细胞12的捕捉侧的面16A是上侧的面。为了使捕捉侧的面16A面对载玻片42，使过滤器16上下翻转后再重叠于载玻片42，或者在过滤器16上重叠载玻片42，然后使过滤器16和载玻片42上下翻转。在过滤器16重叠于载玻片42的状态下，过滤器16的捕捉侧的面16A成为下侧的面。在该状态下，被过滤器16捕捉的目标细胞12位于该过滤器16与载玻片42之间。
如图8所示那样，过滤器16为3D金属过滤器18时，目标细胞12容纳于凹坑30，因此，使细胞变形的应力小，细胞损害性低。如图9所示那样，在过滤器16为3D树脂过滤器24的情况下，通过由凸部24B形成的凹坑30来确保过滤器16的捕捉侧的面16A与载玻片42之间的间隔，因此，使细胞变形的应力也小、细胞损害性也低，但与3D金属过滤器18相比缺乏硬性，在耐久性方面存在缺点。
覆盖部件44例如大于过滤器16，优选整体留有空余地覆盖该过滤器16。覆盖部件44的材质为玻璃、树脂等。
为了将目标细胞12浸渍于生理缓冲液46，例如将覆盖部件44重叠于过滤器16之前，将目标细胞12浸渍于生理缓冲液46，其后轻轻地重叠覆盖部件44。如图6所示那样，可以使用移液管48，向覆盖部件44与载玻片42之间注入生理缓冲液46。在任意情况下，通过生理缓冲液46的表面张力，过滤器16和覆盖部件44被保持于载玻片42。
生理缓冲液46例如为生理盐水或磷酸缓冲生理盐水，但不限定于它们，从防止目标细胞12干燥的意义出发，可以添加能够对多糖类等缓冲液赋予粘性且对细胞无毒的聚合物等。
在第一步骤S1与第二步骤S2之间，可以利用抗角蛋白抗体、抗EpCAM抗体、抗CD45抗体和核染色(Hoechst)对目标细胞12进行四重染色，在进入第三步骤S3之前，可以使用荧光显微镜，计数被捕捉在过滤器16上的目标细胞12(角蛋白+/EpCAM+/CD45-/Hoechst+)的数量等。
在图10中，第三步骤S3中，对于过滤器16与载玻片42之间的目标细胞12，在例如离心力的作用下，利用对于涂布至载玻片42上的基质(未图示)的细胞粘附力，将目标细胞12转印至载玻片42。具体而言，将重叠有过滤器16和覆盖部件44、且目标细胞12被浸渍于生理缓冲液46的载玻片42安装于例如摇摆转子型离心机50的腕部52，使固定有该腕部52的旋转轴53旋转。此时，通过将载玻片42配置于离心机50的径向外侧，能够使离心力沿着过滤器16的面和载玻片42的面的垂直方向而作用于目标细胞12。
如图11所示那样，如果离心机50的旋转速度大，则细胞的回收率增加。回收率是指：使用离心机50后被转印至载玻片42且形态被良好保存的细胞数量相对于使用离心机50之前被过滤器16捕捉的细胞数量的比例。根据图11，旋转速度期望为1500-2000rpm。这是因为：如果旋转速度比其大太多时，对细胞损害性的影响变大。
应予说明，第三步骤S3中，可以对目标细胞12利用在空气压力等的加压下的细胞对载玻片42的粘附性，而不利用离心力。具体而言，如图12所示那样，可以将在第二步骤S2中从过滤单元28取出的过滤器16(2D过滤器)静置在对表面涂布基于等离子体等的亲水处理等的各种物质从而增强了细胞粘附性的载玻片42上，然后利用圆筒状的注射器型加压器具59等通过手动稍微增加空气压力，利用细胞与基质的粘附能力，将目标细胞12以压印的方式转印在载玻片42上。注射器型加压器具59之中，在面向筒状体62的内部的前端设置有橡胶59A。在筒状体62与载玻片42之间配置具有过滤器16的过滤器盒63。在筒状体62与过滤器盒63之间设置有硅垫片61。
在为固定有目标细胞12的细胞时，可以使用对表面涂布了基于等离子体等的亲水处理等的各种物质的市售载玻片42。此外，为了促进目标细胞12对于载玻片42的转印，可以通过切削等在载玻片42的表面设置适当数量的宽1～5μm、深1～5μm的槽43，制作排水口，通过自上方进行加压来制作缓慢的液流等。
在图13中，第四步骤S4中，通过将载玻片42浸渍于贮存有保存液56的容器54，从而不损害目标细胞12地使覆盖部件44和过滤器16自然剥离，并进行保存。保存液56是与其后的染色相符的各种固定液、例如10％福尔马林、95％乙醇等固定液、进而生理缓冲液，但不限定于它们。通过将载玻片42浸渍于保存液56，生理缓冲液46的表面张力小于保存液56的表面张力，过滤器16和覆盖部件44自然地自载玻片42进行剥离。因此，能够在剥离覆盖部件44的过程中将对于目标细胞12的损害抑制至最小限。在第三步骤S3中，目标细胞12被稳固地转印至载玻片42，因此，即使过滤器16和覆盖部件44发生剥离，目标细胞12也被保持于载玻片42。由此，如图14所示那样，能够得到在载玻片42固定有目标细胞12的载玻片标本60。
根据本实施方式所述的细胞的载玻片标本制作方法，通过使用过滤器16，能够利用检体液10中的目标细胞12(循环癌细胞、稀少癌细胞)与非目标细胞14(例如血液细胞)的尺寸差异，对目标细胞12进行浓缩、分离并捕捉。
此外，利用离心力的作用下或者空气压力等的加压下的细胞粘附性，将所捕捉的目标细胞12温和地转印至载玻片42时，目标细胞12被浸渍于过滤器16的凹坑30内积存的生理缓冲液46，因此被转印至载玻片42时，目标细胞12不易被压溃或发生干燥，因此能够将细胞损害性抑制在最小限。
并且，通过将载玻片42浸渍于贮存有保存液56的容器54，使覆盖部件44和过滤器自然地剥离，从而形成目标细胞12被转印至载玻片42的载玻片标本60。载玻片标本60能够在保存液56中以室温或4℃长期保存。
此外，在第一步骤S1与第二步骤S2之间，利用标记抗体将目标细胞12染色，并使用荧光显微镜计数被染色的目标细胞12的数量时，也能够将该目标细胞12自过滤器16简便地以稳定存在于载玻片42上的状态进行回收、转印。
[第二实施方式]
在图17中，本实施方式所述的细胞的载玻片标本制作方法具有与第一实施方式相同的第一步骤S1(也参照图1)、以及第二步骤S12～第四步骤S14。在附图中，对与第一实施方式相同的部分赋予相同的符号，并省略说明。
第一步骤S1中，不对目标细胞12进行固定和表面活性剂处理，在目标细胞12存活的状态下直接进入第二步骤S12。
第二步骤S12中，将自过滤单元28取出的过滤器16静置在表面涂布有I型胶原等粘附促进物质的载玻片42上，然后立即添加培养液58，使目标细胞12例如在存活的条件下进行粘附。
第三步骤S13中，通过将目标细胞12在CO2保温箱内以37℃加热1小时～数小时，利用细胞的游走能力，使目标细胞12充分地粘附在载玻片42上，在加压下或不加压的条件下进行转印。
第四步骤S14中，在载玻片42上配置筒状体62而制成培养皿，向该培养皿中添加充分量的培养液58，使过滤器16浮在培养基中，从而自载玻片42去除。由此，不会对细胞施加离心力、空气压力等外力，能够将细胞损害抑制至最小限度，将目标细胞12在存活的状态下回收至载玻片42上(图17)。在目标细胞12存活的条件下进行转印时，该目标细胞12自过滤器16自行游走并粘附在载玻片42上。
在图17的第四步骤S14中，过滤器16、覆盖部件44被去除，被转印至载玻片42的目标细胞12例如利用福尔马林、乙醇的固定液进行固定后，可以用于巴氏染色、免疫染色。此外，目标细胞12也可以在培养皿内进行短时间培养。换言之，目标细胞12可以用作染色用途、培养用途的细胞。
根据该细胞的载玻片标本制作方法，与第一实施方式同样地通过过滤器16(例如金属制或树脂制)，利用检体液中的目标细胞12(循环癌细胞、稀少癌细胞)与非目标细胞14(例如血液细胞)的尺寸差异，能够简便、迅速且高效地分离并捕捉目标细胞12。但是，在要采取前者存活状态的损害小的细胞时，与第一实施方式相比，需要在CO2保温箱内进行加热操作，因此，细胞回收需要数小时～数天、细胞培养需要数天～数周的时间。
[载玻片标本的利用]
通过使用目标细胞12的载玻片标本60，能够将例如巴氏染色(图15)、免疫染色(IHC法)(图16)作为检测室的日常工作来实施。图15是进行巴氏染色后的细胞的显微镜照片。染色质图案清晰且残留有细胞质等，细胞形态的保存良好，因此，病理医生、细胞检测士能够如细胞诊断那样地进行观察，能够进行CTC的正确且客观的评价。图16是利用IHC法进行免疫染色后的细胞的显微镜照片，显示细胞角蛋白和CD45的染色结果。在基于细胞形态的评价的基础上，还增加基于免疫染色的评价，因此CTC的判定更加正确。此外，还能够进行HER2、ER、PgR染色等伴随诊断所需的免疫染色。
(DNA或RNA的提取方法)
在载玻片标本60上，自目标细胞12提取DNA、RNA后，也可以利用公知的方法来进行基因分析。图18示出在载玻片标本60上配置筒状体62，将转印至载玻片42上的目标细胞12的周围用例如树脂制的圆筒状筒状体62密合包围的状态。将DNA或RNA的提取液64在该筒状体62内保持规定时间。具体而言，向筒状体62内添加例如Proteinase K soln等DNA提取液，以56℃保温60分钟(以上)，提取DNA。根据需要，可以将DNA进行精制，并使用其通过PCR法等进行各种基因分析(图19)。应予说明，筒状体62的材质不限定于树脂，可以为金属等其它材质。为了不泄露DNA或RNA的提取液64地进行贮液，并以56℃保温一定期间(例如1～4小时)，如图18所示那样可以呈现下述结构：在筒状体62的侧部设置要作用密合用压力的柄66，在筒状体62的底部配置环状橡胶68(密封材料)，使压力作用于柄66，从而密合于载玻片42。
RNA的提取液可以使用RLT soln。向载玻片标本60上的筒状体62内添加RNA的提取液，适当使用RNeasy Kit等来精制RNA，通过PCR法可以进行各种基因分析。
像这样，不仅能够通过制作目标细胞12的载玻片标本来计测细胞数，还能够作为目标细胞12的使用了免疫染色的细胞学诊断、基因分析等伴随诊断所需的液体细胞诊断(Liquid biopsy)而简便、低成本的利用。
在上述实施方式所述的细胞的载玻片标本制作方法中，必要的机器仅为低成本且能够安全地一次性使用的过滤器16和过滤设备、简单的注射器泵、低速的台式型离心机50、一次性的涂布载玻片(载玻片42)、以及小型且圆筒状的注射器型加压器具59、DNA/RNA回收器具(筒状体62)。该CTC等目标细胞对于载玻片的转印·回收装置和系统能够进行一般医院的检测室中的CTC等的检测，作为CTC等目标细胞的检验、回收、分析技术，具有空前的多功能性。
[其它实施方式]
以上，针对本发明的实施方式的一例进行了说明，但本发明的实施方式不限定于上述，除了上述之外，在不超脱其主旨的范围内还可以进行各种变形来实施。
例如，在第一步骤S1与第二步骤S2、S12之间，可以不利用荧光标记抗体进行染色、不使用荧光显微镜数出目标细胞的数量，能够在载玻片标本上进行更准确的计测。此外，在该阶段不进行标记抗体染色时，第四步骤S4、S14之后的载玻片标本制作后的免疫染色的结果反而可观察到良好的倾向。
2016年7月25日申请的日本专利申请2016-145568号的公开内容通过参照其整体而援引至本说明书中。
本说明书记载的全部文献、专利申请和技术标准与具体且分别记载了通过参照而援引各个文献、专利申请和技术标准的情况同种程度地通过参照而援引至本说明书中。

Claims (4)

1.一种细胞的载玻片标本制作装置，其具备：
具有用于捕捉目标细胞的凹坑以及形成于该凹坑且用于使非目标细胞通过的孔的过滤器，所述目标细胞是血液中的循环癌细胞或体液中的稀少癌细胞中的至少一者；
重叠于所述过滤器的所述目标细胞的捕捉侧的面且用于转印所述目标细胞的载玻片；
覆盖于所述过滤器的与所述载玻片相反一侧的面、且在所述凹坑的内部封入用于浸渍所述目标细胞的生理缓冲液的覆盖部件；以及
贮存有保存液的容器，所述保存液用于浸渍所述载玻片而保存被转印至所述载玻片上的所述目标细胞。
2.一种细胞的载玻片标本制作方法，其具备具有用于捕捉目标细胞的凹坑以及形成于该凹坑且用于使非目标细胞通过的孔的过滤器，所述目标细胞是血液中的循环癌细胞或体液中的稀少癌细胞中的至少一者，
所述细胞的载玻片标本制作方法具有下述步骤：
利用所述过滤器自所述非目标细胞进行分离并捕捉所述目标细胞的第一步骤；
以所述过滤器的所述目标细胞的捕捉侧的面面对载玻片的方式将所述过滤器重叠于所述载玻片，使覆盖部件覆盖于所述过滤器，并且将所述过滤器与所述载玻片之间的所述目标细胞浸渍于生理缓冲液的第二步骤；
将所述过滤器与所述载玻片之间的所述目标细胞在离心力的作用下或基于空气压力的加压下转印至所述载玻片的第三步骤；以及
通过将所述载玻片浸渍于贮存有保存液的容器，从而不损害所述目标细胞地使所述覆盖部件和所述过滤器自然地剥离并保存的第四步骤。
3.一种细胞的载玻片标本制作方法，其具备：具有用于捕捉目标细胞的凹坑以及形成于该凹坑且用于使非目标细胞通过的孔的过滤器，所述目标细胞是血液中的循环癌细胞或体液中的稀少癌细胞中的至少一者，
所述细胞的载玻片标本制作方法具备下述步骤：
利用所述过滤器自所述非目标细胞进行分离并捕捉所述目标细胞的第一步骤；
将被所述过滤器捕捉的所述目标细胞投入生理缓冲液的第二步骤；
使所述生理缓冲液中的所述目标细胞密合在载玻片上，使所述目标细胞在存活于所述载玻片的状态下粘附、转印至所述载玻片的第三步骤；以及
将所述载玻片浸渍于贮存有保存液的容器，保存被转印至所述载玻片上的所述目标细胞的第四步骤。
4.一种DNA或RNA的提取方法，其中，在通过权利要求1～3中任一项所述的细胞的载玻片标本制作装置或者细胞的载玻片标本制作方法得到的细胞的载玻片标本上配置筒状体，用所述筒状体包围被转印至所述载玻片上的所述目标细胞的周围，将DNA或RNA的提取液在所述筒状体内保持规定时间，从所述目标细胞中提取DNA或RNA。
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