JP2017163905A - 希少細胞の単離方法及び遺伝子解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】希少細胞を高収率で単離する方法を提供する。【解決手段】希少細胞含有液をフィルターでろ過して希少細胞を上記フィルターの面上に捕捉する捕捉工程と、上記フィルターの面上に捕捉された上記希少細胞を、少なくとも一方の面に粘着性を有するフィルム状の転写部材に転写することで、上記希少細胞を上記転写部材の一方の面に保持する転写工程と、上記転写部材から上記希少細胞を回収する回収工程と、を含む、希少細胞の単離方法。【選択図】図３

Description

本発明は、希少細胞の単離方法及び遺伝子解析方法に関する。

癌は世界各国で死因の上位を占め、わが国においては年間３０万人以上が癌によって死亡している。癌による死亡のほとんどが、癌の転移再発によるものである。癌の転移再発は、癌細胞が原発巣から血管又はリンパ管を経由して、別の臓器組織の血管壁に定着し、血管壁を浸潤して、血管壁に微細転移層を形成することで起こる。このように、血管又はリンパ管を介して体内を循環する癌細胞は、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ、ＣＴＣ）と呼ばれる。

一方、末梢血液中には循環内皮細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ、ＣＥＣ）が存在する。ＣＥＣは、内皮細胞が代謝によって血管壁から剥がれ落ちた成熟細胞であり、循環器疾患、感染症、免疫疾患及び癌等の多くの疾患によってＣＥＣの数が増加することが知られている。

以上のように、ＣＴＣ及びＣＥＣ等の希少細胞から疾患に関する多くの情報を得られるため、これら希少細胞の存在及びその増加の早期発見が期待される。

しかしながら、血液には、赤血球、白血球及び血小板等の血球成分が多く含まれ、その数は、血液１ｍＬ中に３．５×１０^９〜９×１０^９個ともいわれている。これに対し、希少細胞は、血液１ｍＬ中に僅か数個程度しか存在しないため、希少細胞の検出及び観察は非常に困難である。血球成分が多く存在する中、希少細胞を効率的に検出するには、希少細胞と血球成分とを分離する必要がある。

血液中の希少細胞を分離する方法として、フィルターを用いる方法がある（例えば、特許文献１〜３）。この方法は、細胞のサイズ及び変形能の違いで希少細胞を分離する方法である。

特開２０１３−４２６８９号公報 特開２０１１−１６３８３０号公報 国際公開第２０１５／０１２３１５号

近年の動向として、分離した希少細胞の遺伝子解析結果を、例えば、最適な薬剤の選定及び予後診断に利用することへの期待が高まっている。遺伝子解析に用いられるＰＣＲ及び次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＮＧＳ）等では、解析の基となる希少細胞の量及び純度が重要となる。

しかしながら、特許文献１〜３のような従来の方法を用いても、フィルター上に捕捉された希少細胞を回収するのが難しく、十分な収率で希少細胞を単離することができなかった。

本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、希少細胞含有液から希少細胞を高収率で単離することが可能な希少細胞の単離方法及び遺伝子解析方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、フィルターを用いて細胞を分離する方法の利点として、分離後の希少細胞がフィルターの表面に平面状に分布されており、個々の細胞を特定しやすい状態となっていることに着目し、鋭意検討の結果、本発明を想到するに至った。

すなわち、本発明の一形態に係る希少細胞を単離する方法は、希少細胞含有液をフィルターでろ過して希少細胞を上記フィルターの面上に捕捉する捕捉工程と、上記フィルターの面上に捕捉された上記希少細胞を、少なくとも一方の面に粘着性を有するフィルム状の転写部材に転写することで、上記希少細胞を上記転写部材の一方の面に保持する転写工程と、上記転写部材から上記希少細胞を回収する回収工程と、を含む。このように、フィルターの表面に平面状に分布する希少細胞を転写部材に対して転写した上で、転写部材から希少細胞を回収する構成とすることで、フィルター上から希少細胞を直接回収する場合と比べて、希少細胞の単離を確実に行うことができる。したがって、高収率で希少細胞の単離を行うことができる。

ここで、上記転写部材は両面テープであり、上記転写工程において、上記両面テープの一方の粘着面を、上記フィルターの面上に捕捉された上記希少細胞に対して接触させることで、上記一方の粘着面に対して上記希少細胞を転写し、上記回収工程において、上記両面テープのもう一方の粘着面をスライドガラスに貼り合わせ、上記スライドガラス上に上記両面テープを介して保持された上記希少細胞を回収することが好ましい。このように転写部材が両面テープであり、且つ、スライドガラスを用いて希少細胞を回収することにより、転写部材がスライドガラスに固定された状態で、希少細胞を転写部材から回収することができるため、回収の効率を向上することができる。

また、上記捕捉工程の後に、上記フィルターの上記希少細胞が捕捉された面を洗浄液で洗浄する洗浄工程をさらに含み、上記転写工程において、上記洗浄工程における上記洗浄液が残存する上記フィルターの面上の上記希少細胞に、上記転写部材を接触させることで上記希少細胞を上記転写部材に転写することが好ましい。このようにフィルターの表面が洗浄液に浸っている状態を維持することで、洗浄液の貫通孔内への移動に伴って希少細胞が貫通孔内へ移動することを抑制できる。したがって、フィルター表面に残留する希少細胞の減少を抑制し、希少細胞をより高収率で単離することができる。また、フィルターに洗浄液が滞留する状態を維持することでフィルター表面の乾燥を防ぐことができるため、フィルター表面に滞留する希少細胞の乾燥による損傷及び変形を防ぐことができる。

また、上記フィルターの面上に残存する洗浄液の、上記フィルターの表面から液面までの高さは、上記希少細胞の平均直径の０．０５〜２０倍であることが好ましい。このように液面の高さが上記数値範囲内であると、洗浄液の移動に伴って希少細胞がフィルターの外に流出するのを防ぐことができるため、より高収率で希少細胞を単離することができる。また、液面の高さが上記数値範囲内であると、希少細胞を転写部材に転写する際に、洗浄液が希少細胞と転写部材との接触を妨げない。よって、希少細胞を効率よく転写部材に転写することができ、より高収率で希少細胞を単離することができる。

さらに、上記回収工程は、マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーターを用いて上記希少細胞を上記転写部材から回収する工程であることが好ましい。このようにマイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーターを用いることで、転写部材からの希少細胞の回収を効率よく行うことができる。

本発明の一形態に係る希少細胞の遺伝子解析方法は、上記の希少細胞の単離方法より単離された希少細胞の遺伝子を解析する工程を含む。このように上記の希少細胞の単離方法により高収率で単離された希少細胞の遺伝子を解析することにより、希少細胞に係る遺伝子解析の精度を向上させることができる。

本発明によれば、希少細胞含有液から希少細胞を高収率で単離することが可能な希少細胞の単離方法及び遺伝子解析方法が提供される。

本発明の一実施形態に係る希少細胞の単離方法及び遺伝子解析方法を説明するフロー図である。 細胞捕捉カートリッジの構成を示す模式図である。 転写工程及び回収工程を示す模式図である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。

本発明の一実施形態に係る希少細胞の単離方法は、希少細胞含有液をフィルターでろ過して希少細胞をフィルターに捕捉した後、この希少細胞を転写部材に転写し、転写により転写部材上に保持された希少細胞を回収することで、希少細胞を高収率で単離することを特徴とする。また、本発明の一実施形態に係る希少細胞の遺伝子解析方法は、上記の方法により単離された希少細胞の遺伝子を解析することを特徴とする。

本実施形態に係る希少細胞の単離方法における単離の対象及び希少細胞の遺伝子解析方法における遺伝子解析の対象となる「希少細胞」とは、生体試料に含まれる特定種類の細胞のことであり、通常、その細胞数の割合が希少細胞含有液に含有される全細胞の総数に対して極めて小さいものをいう。希少細胞は、例えば、ＣＴＣ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ）等の癌細胞及びＣＥＣ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）等の内皮細胞であることができるが、これらに限定されない。

希少細胞含有液は、上記の希少細胞が含まれる液であり、例えば、血液、腹水、胸水及びその他の細胞懸濁液であることができる。細胞懸濁液は、例えば、白血球を含有する液であることができる。なお、希少細胞含有液には、緩衝液又は添加剤がさらに含まれていてもよい。

本実施形態における「捕捉」とは、希少細胞含有液をフィルターでろ過して、希少細胞をフィルター上に残留させることをいう。

また、本実施形態における「転写」とは、フィルターの希少細胞が捕捉された面（以下、単に「フィルター表面」ともいう。）に、粘着性を有する転写部材を貼り合わせて剥がすことによって、フィルター表面に捕捉されている希少細胞を転写部材上に移動することを意味する。

以下、本実施形態に係る希少細胞の単離方法及び遺伝子解析方法について図１〜３を参照しながら、詳細に説明していく。本発明の一実施形態に係る希少細胞の単離方法及び遺伝子解析方法は、図１に示すように、捕捉工程（ステップＳ０１）と、洗浄工程（ステップＳ０２）と、転写工程（ステップＳ０３）と、回収工程（ステップＳ０４）と、解析工程（ステップＳ０５）と、を含む。図１に示す各工程のうち、捕捉工程、洗浄工程、転写工程及び回収工程が希少細胞の単離方法に含まれる。また、解析工程が希少細胞の遺伝子解析方法に含まれる。

捕捉工程Ｓ０１は、希少細胞含有液をフィルターでろ過して、希少細胞をフィルターの面上に捕捉する工程である。洗浄工程Ｓ０２は、フィルター表面を洗浄液（ウォッシュバッファ）により洗浄する工程である。転写工程Ｓ０３は、フィルターの面上に捕捉された希少細胞を、粘着性を有するフィルム状の転写部材に転写する工程である。回収工程Ｓ０４は、転写部材から希少細胞を回収する工程である。解析工程Ｓ０５は、回収された希少細胞の遺伝子を解析する工程である。各工程の詳細は後述する。

まず、捕捉工程Ｓ０１について説明する。捕捉工程Ｓ０１は、希少細胞含有液をフィルターでろ過して希少細胞をフィルターの面上に捕捉する工程である。

ろ過を行うための装置構成は特に限定されないが、ここでは一例として、細胞捕捉カートリッジ（単に「カートリッジ」ともいう。）を用いる場合について、図２を参照しながら説明する。

図２は細胞捕捉カートリッジの構成を示す模式図である。カートリッジ１００は、液体が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、液体が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、フィルター１０５とを備える。フィルター１０５は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される筐体１２０により固定されている。筐体１２０の形状は直方体又は円筒等であってよく、特に制約はない。

上部部材１１０及び下部部材１１５は、例えばクリップ（図示せず）で互いに固定されており、クリップを外して筐体１２０を解体することで、フィルター１０５を取り出すことができる。

流入管１２５の上流には、例えば、希少細胞含有液又は洗浄液等の処理液が入ったリザーバーが接続される。リザーバーに入った液体は、流入管１２５から筐体１２０の内部に流れ、フィルター１０５を通って、流出管１３５から外部に排出される。このような液体の流れは、流出管１３５の下流に接続されたポンプＰの駆動により作り出すことができる。

フィルター１０５には複数の貫通孔１０６が形成されている。例えば、希少細胞含有液として癌細胞を含む血液をカートリッジ１００内に導入すると、血液の血小板及び赤血球等の成分は貫通孔１０６を通過するが、希少細胞及び一部の白血球は貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５表面に残留する。

フィルター１０５は、プラスチック又は金属等の薄膜に、多数の貫通孔が形成されている構造を有するものであれば特に限定されず、従来公知のものを使用することができる。フィルター１０５は、希少細胞含有液から希少細胞以外の成分をろ液とともに取り除き、貫通孔１０６を通過しなかった希少細胞をその表面に捕捉する。例えば、希少細胞含有液として癌細胞を含む血液を使用する場合には、８μｍ×１００μｍ程度の大きさの貫通孔１０６を有するフィルターを用いることによって、赤血球、白血球、及び血小板等の血液成分をろ液として取り除き、希少細胞である癌細胞をフィルター１０５に捕捉することができる。

希少細胞含有液及び洗浄液等の液体が貫通孔１０６を通過するときの流速は、１００〜８００μＬ／分であることが好ましく、２００〜６００μＬ／分であることがより好ましい。液体の流速が上記範囲以内であると、希少細胞に対するダメージをより低減することができ、希少細胞の単離収率を向上させることができる。

フィルター１０５の貫通孔１０６に対して希少細胞含有液を通過させることが可能であれば、カートリッジ１００の具体的な構成は特に限定されない。

次に、洗浄工程（ステップＳ０２）について説明する。洗浄工程Ｓ０２は、フィルター表面を洗浄液で洗浄する工程である。

まず、カートリッジ１００の流入管１２５から洗浄液を導入し、希少細胞を捕捉したフィルター１０５を洗浄液で洗浄する。洗浄液としては、フィルター１０５上に残留した希少細胞以外の成分を洗い流せるものであれば特に限定されない。洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝液等が挙げられる。洗浄液の量は特に制限されないが、希少細胞含有液の量の倍量程度であることができる。

洗浄液でフィルター１０５を洗浄する際は、フィルター１０５の表面が常に洗浄液に浸っていることが好ましい。フィルター１０５の表面が洗浄液に浸っている状態でフィルター１０５の表面を洗浄するためには、フィルター１０５表面の洗浄液が貫通孔１０６を通過する速度よりもフィルター１０５表面への洗浄液の供給速度が大きくなるように洗浄液の供給量を調節すればよい。フィルター１０５の表面が洗浄液に浸っている状態を維持することで、洗浄液の移動に伴って希少細胞が貫通孔１０６内へ移動することを抑制することができる。特に、フィルター１０５の表面に残存する洗浄液の全量が貫通孔１０６内へ流れ込む際には、貫通孔１０６内に希少細胞が引きずり込まれやすい。したがって、フィルター１０５の表面に洗浄液が滞留する状態を維持することでフィルター１０５表面に残留する希少細胞の減少を抑制し、収率を向上させることができる。また、フィルター１０５に洗浄液が滞留する状態を維持することでフィルター１０５表面の乾燥を防ぐことができる。したがって、フィルター１０５表面に滞留する細胞の乾燥による損傷及び変形を防ぐことができる。

次に、転写工程（ステップＳ０３）について、図３を参照しながら説明する。転写工程Ｓ０３は、フィルターの面上に捕捉された希少細胞を、少なくとも一方の面に粘着性を有するフィルム状の転写部材に転写することで、希少細胞を転写部材の一方の面に転写する工程である。なお、捕捉工程（ステップＳ０１）の後、洗浄工程（ステップＳ０２）を経ずに、直接転写工程（ステップＳ０３）に移行することもできる。

転写部材は、フィルム状であり、少なくとも一方の面に粘着性を有する部材である。転写部材は、自家蛍光の低い材料からなり、透明であることが好ましい。転写部材がこのような特性を有すると、希少細胞を顕微鏡で観察（希少細胞の観察については、後述する。）しやすくなる。このような観点から、転写部材の材料としては、例えば、寒天、アガー、ゼラチン及びでんぷん等の天然材料、並びに、ゴム、アクリル、シリコーン及びウレタン等の合成材料が挙げられる。これらの材料には、例えば、その他の樹脂、軟化剤、プロセスオイル、充填剤、架橋剤、老化防止剤及び可塑剤が添加されることができる。

転写部材の大きさは特に限定されないが３０ｍｍ^２以上であることが好ましく、３５ｍｍ^２以上であることがより好ましい。また、転写部材の厚さは特に限定されないが、１〜１０００μｍであることが好ましく、５〜５００μｍであることがより好ましく、１０〜１００μｍであることがさらに好ましい。また、転写部材は、フィルター１０５よりも柔軟性が高いことが好ましい。転写部材が柔軟性を有していることで、フィルター１０５に対する転写部材の貼り付け及びフィルター１０５からの転写部材のはく離を好適に行うことができる。

転写部材の粘着力は、希少細胞の転写部材からの脱落が防がれ、希少細胞を転写部材の面上に保持することができる範囲であれば特に限定されない。

転写部材は、タック性（瞬間的な粘着力）を有することが好ましい。転写部材がタック性を有すると、軽い力で、短時間に粘着することができ、また、転写部材をフィルター１０５から高速ではく離した場合であっても、フィルター１０５に捕捉された希少細胞を効率よく転写部材に転写することができ、より高収率で希少細胞を単離することができる。

転写部材として、例えば、基材となるテープに対して粘着剤層が積層された粘着テープを用いることができる。粘着テープは、テープの片面に粘着剤を有するテープであってもよいが、テープの両面に粘着剤を有する両面テープが好ましい。以下の実施形態では、転写部材として両面テープを用いる場合について説明する。

洗浄工程Ｓ０２の後から転写工程Ｓ０３を実施するまでは、図３（Ａ）に示すように、フィルター１０５の希少細胞Ｃが捕捉された面（フィルター１０５表面）には、洗浄工程Ｓ０２で使用した洗浄液Ｗが残存していることが好ましい。これは、上述の通り、フィルター１０５の表面が洗浄液に浸っている状態を維持することで、洗浄液の移動に伴って希少細胞Ｃが貫通孔１０６内へ移動することを防ぐことができるためである。また、フィルター１０５の表面が洗浄液に浸っている状態を維持することで、フィルター１０５表面に滞留する希少細胞Ｃの乾燥による損傷及び変形を防ぐことができる。なお、洗浄工程Ｓ０２の後に、さらに洗浄液Ｗ以外の液体をフィルター１０５に流した場合、洗浄液Ｗの代わりに、その液体がフィルター１０５上に残っていることが好ましい。すなわち、希少細胞Ｃは、フィルター１０５上に捕捉された後、転写部材に対して転写されるまで、その周囲の少なくとも一部が液体で覆われている状態で保持されていることが好ましい。

フィルター１０５表面上の洗浄液Ｗの量は、フィルター１０５表面を基準とした液面の高さで表すことができる。液面の高さは、希少細胞Ｃの平均直径に応じて異なる。液面の高さは、希少細胞Ｃの平均直径に対して、０．０５〜２０倍であることが好ましく、０．２５〜１０倍であることがより好ましく、１〜５倍であることがさらに好ましい。液面の高さが希少細胞Ｃの平均直径に対して０．０５倍以上であると、フィルター１０５表面に滞留する希少細胞Ｃの乾燥をより確実に防ぐことができるため、希少細胞Ｃの乾燥による損傷及び変形を防ぐことができる。液面の高さが希少細胞Ｃの平均直径に対して２０倍以下であると、後にカートリッジ１００の上部部材１１０を外す際に、洗浄液Ｗが周囲に飛び散ること、及び、洗浄液Ｗがカートリッジ１００の外に流出することを防ぐことができる。すなわち、カートリッジ１００外への洗浄液Ｗの移動による希少細胞Ｃの紛失を抑えることができるため、より高収率で希少細胞Ｃを単離することができる。また、液面の高さが希少細胞Ｃの平均直径に対して２０倍以下であると、希少細胞Ｃを転写部材に転写する際に、洗浄液Ｗが希少細胞Ｃと転写部材との接触を妨げない。よって、希少細胞Ｃを効率よく転写部材に転写することができ、より高収率で希少細胞Ｃを単離することができる。

ここで、細胞の「直径」とは、顕微鏡で観察した場合の細胞の輪郭上の任意の２点を結ぶ線分のうち最も長い線分の長さのことである。なお、フィルター１０５表面上の洗浄液Ｗの高さの基準となる希少細胞Ｃの平均直径としては、単離対象の希少細胞Ｃに係る公知の平均直径の情報を用いることができる。

なお、フィルター１０５表面上の洗浄液Ｗの高さの制御は、カートリッジ１００内に残留する洗浄液Ｗの量を調整することで制御することができる。上部部材１１０と下部部材１１５との間にフィルター１０５が保持された状態でフィルター１０５の表面上の洗浄液Ｗの量を制御する場合には、例えば、カートリッジ１００へ供給する洗浄液Ｗの量及びカートリッジ１００から排出される洗浄液の量からカートリッジ１００内に滞留する洗浄液Ｗの体積を推定することができる。また、カートリッジ１００の設計からフィルター１０５表面の面積を推定することができる。したがって、これらの値が所望の値となるようにフィルター１０５の表面上の洗浄液Ｗの高さを制御する構成としてもよい。

転写工程Ｓ０３において、フィルター１０５の表面上の希少細胞Ｃを両面テープ２００に対して転写する際には、まず、カートリッジ１００の上部部材１１０を外してフィルター１０５の表面を露出させる。次に、図３（Ｂ）に示すように、予め一方の保護フィルム２１０を剥がして一方の粘着面を露出させておいた両面テープ２００を、露出した粘着面がフィルター１０５表面側になるようにして、フィルター１０５に貼り合わせる。このとき、洗浄液Ｗとともに希少細胞Ｃが両面テープ２００とフィルター１０５表面との間から流出しないように、先に両面テープ２００の端部４辺をフィルター１０５表面と密着させる。次いで、両面テープ２００と希少細胞Ｃとが接触するように両面テープ２００全体を洗浄液Ｗと馴染ませる。

次に、両面テープ２００をフィルター１０５から剥がす。このとき、図３（Ｃ）に示すように、両面テープ２００の粘着力で希少細胞Ｃがフィルター１０５表面から両面テープ２００の粘着面上に移動し、希少細胞Ｃは両面テープ２００上に保持される（転写）。

次に、回収工程（ステップＳ０４）について、引き続き図３を参照しながら説明する。回収工程Ｓ０４は、転写部材から希少細胞を回収する工程である。

まず、フィルター１０５から剥がした両面テープ２００を、図３（Ｃ）に示すように上下反転させ、両面テープ２００のもう一方の粘着面を覆っている保護フィルム２１０を剥がす。保護フィルム２１０を剥がして露出した粘着面を、図３（Ｄ）に示すように、スライドガラス２５０に貼り合わせる。必要に応じて顕微鏡を使用しながら、スライドガラス２５０上の両面テープ２００に保持された希少細胞Ｃを別容器等へ移動させて回収する。希少細胞Ｃを回収する方法としては、特に限定されないが、マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーター３００を用いる方法が好ましい。癌細胞は、細胞一つ一つが異なる遺伝子型である可能性があるため、個々に遺伝子解析をすることが好ましく、マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーター３００を用いる方法であれば、希少細胞Ｃを一つ一つ個別に回収することができ、効率が良い。なお、マイクロダイセクタは、細胞を上に飛ばして単離する技術である。また、マイクロマニピュレーター３００は、微細なピンセットのようなもので細胞をつまみ出す技術である。希少細胞の単離に用いるマイクロダイセクタ及びマイクロマニピュレーター３００としては、公知のものを利用することができる。

次に、解析工程（ステップＳ０５）について、説明する。解析工程Ｓ０５は、捕捉工程Ｓ０１から回収工程Ｓ０４までの一連の工程によって単離された希少細胞Ｃの遺伝子解析を行う工程である。

単離された希少細胞Ｃに、ＮＧＳ（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）等公知の遺伝子解析法を用いて、希少細胞Ｃの遺伝子情報を得る。得られた遺伝子情報は、各種研究、検査又は診断に利用することができる。また、希少細胞Ｃは、得られた遺伝子情報に基づいて、遺伝子型によって分類されることができる。遺伝子型別に分類された癌細胞を培養して、所定濃度の癌細胞サンプルとして提供することも可能である。このように、本発明は医学及び生物学の分野において幅広く応用可能である。

本実施形態の希少細胞の単離方法は、希少細胞とその他の細胞とを判別する観点から、以上の工程の他に、希少細胞を染色する工程をさらに含むこともできる。希少細胞Ｃを染色する工程は、希少細胞Ｃをスライドガラス２５０上から回収する前であれば特に限定されず、捕捉工程Ｓ０１の前、洗浄工程Ｓ０２の前、転写工程Ｓ０３の前、回収工程Ｓ０４の前又は回収工程Ｓ０４の一部として含まれることができる。希少細胞Ｃの染色の方法は、特に限定されないが、例えば、蛍光染色及びギムザ染色であることができる。例えば、図３（Ｄ）に示すように、両面テープ２００をスライドガラス２５０に貼り合わせた後に、スライドガラス２５０上の希少細胞Ｃにギムザ染色を行うことで、希少細胞Ｃが肉眼で観察しやすくなるため、希少細胞Ｃの回収がしやすくなり、より高収率で希少細胞Ｃを単離することができる。

本実施形態の希少細胞Ｃの単離方法によれば、フィルター１０５によるろ過によって、希少細胞含有液から希少細胞Ｃを収率良く、且つ、希少細胞Ｃが転写されやすいように平面的に分布された状態で捕捉することができる。そして、フィルター１０５から転写部材へ希少細胞Ｃを転写することで、希少細胞Ｃへの影響及び希少細胞Ｃの紛失を最小限に抑えながら、希少細胞Ｃを観察及び回収しやすい状態にできるため、希少細胞Ｃを高収率で単離することができる。このように希少細胞Ｃを高収率で単離することで、遺伝子解析を精度よく行うことができる。

本実施形態に係る希少細胞Ｃの単離方法では、転写部材として機能する両面テープ２００を使用して希少細胞Ｃをフィルター１０５から両面テープ２００上へ移動し、これを回収することで希少細胞Ｃを単離する。この方法は、従来のアガロースゲル法、ハイドロゲル法及びパラフィン固定法のようにフィルター上の細胞を取り巻く液体を固化させて回収する方法に比べて様々な利点がある。例えば、低融点アガロースを用いて液体全体を凝固させるアガロースゲル法は、簡便で細胞紛失のリスクの低い方法であるが、アガロースの融点が高いために、取扱いが難しく、回収率も低い。また、ハイドロゲル法は、目的の細胞のみを樹脂で固めて取り出すことができるが、紫外線照射による細胞へのダメージが懸念される。また、パラフィン固定法は、古くから用いられているパラフィンを用いることで信用性が高いが、融点が高いため、細胞への影響が懸念される。これに対して、本実施形態に係る希少細胞Ｃの単離方法は、上記の種々の問題を解決した方法である。具体的には、転写部材を使用することで、簡便で、且つ細胞紛失のリスクが低くなる。また、希少細胞Ｃへのダメージも抑えることができる。

また、上記の希少細胞Ｃの単離方法によれば、転写部材として両面テープ２００を用いて、且つ、希少細胞Ｃの回収にスライドガラス２５０を用いることで、両面テープ２００がスライドガラス２５０に固定された状態で、希少細胞Ｃを両面テープ２００から回収することができるため、回収の効率を向上することができる。

また、上記の単離方法によれば、フィルター１０５の表面が洗浄液Ｗに浸っている状態を維持することで、貫通孔１０６内への洗浄液Ｗの移動に伴う希少細胞Ｃの紛失を防止し、フィルター１０５表面に滞留する希少細胞Ｃの乾燥による損傷及び変形を防ぐことができる。

さらに、上記の単離方法によれば、フィルター１０５の表面上に残存する洗浄液Ｗのフィルター１０５の表面から液面までの高さを希少細胞Ｃの平均直径の０．０５〜２０倍とすることで、希少細胞Ｃを効率よく転写部材に転写することができる。

また、上記の単離方法によれば、回収工程においてマイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーター３００を用いることで、転写部材からの希少細胞の回収を効率よく行うことができる。

本実施形態の遺伝子解析方法によれば、希少細胞Ｃの遺伝子解析の精度が向上する。

以上、本発明の実施形態について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、様々な変形態様が可能である。例えば、本実施形態では、転写部材として両面テープ２００を使用したが、転写部材はこれに限定されず、例えば、テープの片面のみに粘着剤を有する粘着テープであることができる。転写部材の少なくとも片面が粘着性を有していれば、フィルター１０５上の希少細胞Ｃを転写部材に対して転写することができるため、より高い収率で希少細胞Ｃを単離することが可能となる。また、転写部材が片面のみに粘着剤を有する粘着テープであっても、テープをスライドガラス２５０上に配置して希少細胞Ｃの観察及び回収を行うことが可能である。ただし、転写部材が両面テープ２００のように両面に粘着性を有するものであれば、転写部材がスライドガラス２５０に固定された状態で、希少細胞Ｃを転写部材から回収することができるため、回収の効率を向上することができる。

また、本実施形態ではカートリッジ１００を使用したろ過について説明したが、カートリッジ１００を使用せずにフィルター１０５を用いたろ過を行うこともできる。この場合、転写工程において、フィルター１０５上に残っている洗浄液Ｗの量は、ろ過の方法に応じた方法で適宜調整される。

また、上記実施形態では、希少細胞Ｃをフィルター１０５で捕捉し、捕捉された希少細胞Ｃを転写部材に転写し、転写された希少細胞Ｃを転写部材から回収することで、希少細胞を高収率で単離する技術及び単離された希少細胞Ｃの遺伝子を解析する方法について説明した。しかしながら、本発明における転写部材を使用した転写工程は、希少細胞Ｃの単離での使用に限定されず、ウェット状態の様々な細胞の転写に幅広く応用可能である。

＜実施例１＞
（サンプル調製）
サンプルとして、真空採血管に採血した健常者の血液に、血液１ｍＬあたり１０００個のヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８を含有させた血液サンプルを用いた。なお、血液は採血後６時間のものを用いた。また、ＮＣＩ−Ｈ３５８はあらかじめＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ株式会社製）で蛍光染色されたものを用いた。

（癌細胞の捕捉）
フィルターをセットした細胞捕捉カートリッジをＣＴＣ回収装置：ＭＣ６１００（日立化成株式会社製）にセットし、以下の実験を行った。使用したフィルターは、２０ｍｍ×２０ｍｍ×２０μｍ大のニッケル薄膜に、厚み０．２μｍの金めっきを施したもので、７．８μｍ×１００μｍ大の開口部（貫通孔）を、開口率６．７％で有する。ここで、開口率とは、フィルター全体の面積に対する貫通孔が占める面積をいう。細胞捕捉カートリッジは、上記実施形態で説明したものに相当する。ＣＴＣ回収装置は、血液サンプル及び試薬を導入する流路を備える。この流路の入り口に、１０ｍＬシリンジを加工して作製したリザーバーを接続した。

ＣＴＣ回収装置内を蒸留水で満たし、装置のプライミングを行った。リザーバーに、２ｍＭ ＥＤＴＡ−１０．０％ＦＢＳ（牛胎児血清）−ＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ社製）（以下、「洗浄液」ともいう。）を７ｍＬ入れ、リザーバーの下部に血液サンプルを、血液サンプルと洗浄液が層をなすように加えた。

ＣＴＣ回収装置を作動させ、流速２００μＬ／分でリザーバー中の血液サンプル及び洗浄液をフィルターに送液し、癌細胞をフィルターで捕捉した。リザーバー下層の血液が先に流れ（所要時間約１５分）、その後、リザーバー上層の洗浄液が流れた（所要時間約３５分）。

洗浄液が流れきる前に、流速の設定を２０μＬ／分に下げ、カートリッジ内の液面の高さが２０μｍになったところで、洗浄液の送液を止めた。洗浄液の送液を止めた時点でのカートリッジ内の液面の高さ及び癌細胞の平均直径に対する液面の比を表１に示す。なお、液面の高さは、下式のようにして求めた。下式において、「カートリッジ内の洗浄液の面積」とは、カートリッジを鉛直方向上向きからみたときに、カートリッジ内の洗浄液が占める面積をいう。
液面の高さ（μｍ）＝カートリッジ内の洗浄液の体積（μｍ^３）／カートリッジ内の洗浄液の面積（μｍ^２）
カートリッジ内の洗浄液の体積（μｍ^３）＝カートリッジ内の洗浄液の質量（μｇ）／カートリッジ内の洗浄液の比重（μｇ／μｍ^３）

（細胞数の計測）
カートリッジに入った状態のフィルター上の細胞を、電動ステージ（ＰｒｏＳｃａｎ ＩＩ、Ｐｒｉｏｒ社製）を装備した蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ ２、Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、蛍光観察した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ由来の蛍光を観察するために、蛍光顕微鏡に３８フィルタ（Ｚｅｉｓｓ社製）を使用した。観察視野の画像を取得し、フィルターに捕捉された癌細胞の数を計測した。画像の取得及び解析にはＬｕｍｉｎａ Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事株式会社製）を用いた。

（癌細胞の転写）
カートリッジ内部の液体がこぼれないように、カートリッジ下部を固定したまま、カートリッジの上蓋を外し、フィルターをカートリッジから取り出した。速やかに、６ｍｍ角に切った皮膚用両面テープ１５１０（３Ｍ社製）の小片の一方の面の保護フィルムをはく離し、露出した粘着面を、フィルターの細胞が捕捉された面に貼り付けた。このとき、まずテープ端部を密着させて細胞の流出を防ぎ、その後、テープ全体とフィルターをよく密着させて、フィルター上の細胞の取りこぼしがないようにした。

（癌細胞の回収）
両面テープの、細胞が転写された粘着面とは反対側の粘着面の保護フィルムをはく離し、その面を、その面が下になるようにして、スライドガラスに貼り付けた。電動ステージ（ＰｒｏＳｃａｎ ＩＩ、Ｐｒｉｏｒ社製）を装備した蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ ２、Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、スライドガラス上の両面テープに転写された癌細胞を観察した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ由来の蛍光を観察するために、蛍光顕微鏡に３８フィルタ（Ｚｅｉｓｓ社製）を使用し、観察視野の画像を取得した。画像の取得及び解析にはＬｕｍｉｎａ Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事株式会社製）を用いた。

油圧式三次元粗動ジョイスティックマイクロマニピュレーターＢＭＯ−２０（ベックス社製）及びレーザマイクロダイセクタＰＡＬＭ ＭｉｃｒｏＢｅａｍ（Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、両面テープに転写された癌細胞を回収し、その単離収率を、単離収率（％）＝粘着テープから回収された癌細胞数／血液サンプルに混合した癌細胞数×１００として求めた。結果を表１に示す。

＜実施例２＞
ＣＴＣ回収装置を使用しなかったこと、及び、カートリッジ内の液面の高さが５０μｍになったところで洗浄液の送液を止めたこと以外は実施例１と同様にして、癌細胞を単離し、その単離収率を求めた。結果を表１に示す。ＣＴＣ回収装置を使用しなかったため、サンプル及び洗浄液は、カートリッジの流入管に直接接続されたリザーバーを通してカートリッジ内に送液した。また、流速は、カートリッジの流出管に直接接続したペリスタポンプを用いて調節した。実施例１と同様に、洗浄液の送液を止めた時点でのカートリッジ内の液面の高さ及び癌細胞の平均直径に対する液面の比を表１に示す。

１００…カートリッジ、１０５…フィルター、１０６…貫通孔、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体、１２５…流入管、１３０…流入口、１３５…流出管、１４０…流出口、２００…両面テープ、２１０…保護フィルム、２５０…スライドガラス、３００…マイクロマニピュレーター、Ｃ…希少細胞、Ｗ…洗浄液。

Claims (6)

1. 希少細胞含有液をフィルターでろ過して希少細胞を前記フィルターの面上に捕捉する捕捉工程と、
   前記フィルターの面上に捕捉された前記希少細胞を、少なくとも一方の面に粘着性を有するフィルム状の転写部材に転写することで、前記希少細胞を前記転写部材の一方の面に保持する転写工程と、
   前記転写部材から前記希少細胞を回収する回収工程と、を含む、
   希少細胞の単離方法。
2. 前記転写部材が両面テープであり、
   前記転写工程において、前記両面テープの一方の粘着面を前記フィルターの面上に捕捉された前記希少細胞に対して接触させることで、前記一方の粘着面に対して前記希少細胞を転写し、
   前記回収工程において、前記両面テープのもう一方の粘着面をスライドガラスに貼り合わせ、前記スライドガラス上に前記両面テープを介して保持された前記希少細胞を回収する、請求項１に記載の単離方法。
3. 前記捕捉工程の後に、前記フィルターの前記希少細胞が捕捉された面を洗浄液で洗浄する洗浄工程をさらに含み、
   前記転写工程において、前記洗浄工程における前記洗浄液が残存する前記フィルターの面上の前記希少細胞に、前記転写部材を接触させることで前記希少細胞を前記転写部材に転写する、請求項１又は２に記載の単離方法。
4. 前記フィルターの面上に残存する洗浄液の、前記フィルターの表面から液面までの高さが、前記希少細胞の平均直径の０．０５〜２０倍である、請求項３に記載の単離方法。
5. 前記回収工程において、マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーターを用いて前記希少細胞を前記転写部材から回収する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離方法。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離方法より単離された前記希少細胞の遺伝子を解析する工程を含む、希少細胞の遺伝子解析方法。

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