JP2014226065A - 微粒子分離用マイクロ流路チップ、移流集積ユニット、微粒子分離用システム及び微粒子分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】粒径が異なる微粒子が混在している溶液から、抗体等を使用する必要が無く、また、目詰まりすることなく連続的に微粒子を分離することができる微粒子分離用マイクロ流路チップ、該チップを用いた微粒子分離用システム及び微粒子分離特に循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分離する方法を提供する。【解決手段】基板、該基板上に形成された主流路、該主流路から分岐し再び主流路に接続する分岐流路、及び該分岐流路に形成され分岐流路の幅より大きな捕捉部位を含み、前記主流路が基板の中心から放射状に形成されていることを特徴とする微粒子分離用マイクロ流路チップ。流路の幅及び深さを補捉する微粒子の大きさにより、特定の値とする流路を形成し、微粒子を分離する。【選択図】図１

Description

本発明は、液体中に混在するサイズの異なる微粒子を分離するための微粒子分離用マイクロ流路チップ、移流集積ユニット、微粒子分離用システム及び微粒子分離方法に関するもので、特に、血液中の循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ、以下「ＣＴＣ」と略記することもある。）を選択的に捕捉できるＣＴＣ分離用マイクロ流路チップ、該チップを用いたＣＴＣ分離用システム、該ＣＴＣ分離システムに用いられる移流集積ユニット及びＣＴＣ分離方法に関する。

ＣＴＣはがん患者の末梢血流を循環する腫瘍細胞と定義され、原発腫瘍又は転移腫瘍から血管中へ浸潤した腫瘍細胞である。このＣＴＣの検出は、転移性悪性腫瘍の早期発見の方法の一つとして近年注目されている。その理由は、Ｘ線写真や血清中の腫瘍マーカー検出よりも低侵襲かつ正確に転移性悪性腫瘍の診断を行え、患者の予後予測や治療効果の指標として利用できる点にある。

ＣＴＣは非常に稀少な細胞であり、転移性がん患者の血液に含まれる１０⁸〜１０⁹個の血液細胞の内、わずか１細胞程度しか存在しないことが知られている。そのため、末梢血から稀少なＣＴＣを正確に検出するための技術開発に多大な努力が注がれている。これまでに開発されてきた主要な検出方法には、免疫組織化学法、ＰＣＲ法、フローサイトメトリー法などがある。しかしながら、前述したようにＣＴＣは非常に稀少な細胞であるため、血液をそのままこれらの検出方法に供することは出来ないので、通常は前処理として、ＣＴＣの濃縮操作が必須であり、検出法に則したレベルまでＣＴＣ存在比を濃縮させる必要がある。

ＣＴＣの濃縮方法として開発されてきた様々な手法の中で、最も広く利用されているのは、細胞表面の特異的抗原を標的とした腫瘍細胞の濃縮である。その多くは、上皮細胞接着分子（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥｐＣＡＭ）に対するモノクローナル抗体を固定化した磁気微粒子を血液と混合した後、磁石を用いて腫瘍細胞を濃縮する方法をとっている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ＥｐＣＡＭの発現量は腫瘍のタイプに依存し大きく変動することが知られている。

その他の濃縮方法としては、細胞のサイズなどの形態を基準として濃縮する手法がある。白血球に比べてサイズが大きな上皮性腫瘍細胞をフィルトレーションによって選別する方法は、ＩＳＥＴ法（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｚｅ ｏｆ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれている。ＩＳＥＴは、孔径８μｍのポリカーボネートメンブレンフィルターを用いて血液をフィルトレーションするという簡便な手法であり、安価かつユーザーフレンドリーな手法である。ここで用いられているポリカーボネートメンブレンフィルターは、重イオンを照射した後、エッチングを行うトラックエッチングという手法によって、孔が形成されている。しかし、孔が比較的低密度であり、二つ又はそれ以上の孔が重なりあったりする問題があるため、ＣＴＣの捕捉に利用した場合、その捕捉効率は５０〜６０％とされており、濃縮法が簡便かつ効率も良い手法は未だ開発されていない。

ＣＴＣの検出を効率的かつ正確なものにするためには、濃縮と検出といった技術を首尾一貫して行うことが必要である。多段階のハンドリング操作、例えば細胞の染色、洗浄、分離、分注などの操作はＣＴＣのロスを引き起こすため、可能な限りこれらの操作を避け、一体の検出装置中で分析が一貫して行える形が好ましい。Ｃｅｌｌｓｅａｒｃｈ（ＶｅｒｉｄｅｘＴＭ，Ｗａｒｒｅｎ，ＰＡ）はＣＴＣ検出装置として唯一ＦＤＡの認可を受けた装置である。この装置では、全血に対し抗ＥｐＣＡＭ抗体固定化磁気微粒子によるＣＴＣの濃縮を行い、腫瘍細胞に対して免疫染色を行った後、自動化蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、当該装置を用いる場合、一般的に大型の装置導入と訓練されたオペレーターの確保が必要であり、ベッドサイドで短時間且つ正確に検査をすることは困難である。

一方で、ＣＴＣ検出のための小型のマイクロ流体デバイスも知られている。例えば、Ｔｏｎｅｒらが開発したＣＴＣ検出用マイクロ流体デバイスはＣＴＣ−ｃｈｉｐと呼ばれ、フォトリソグラフィーによって形成されたシリコン製の流路内に、円筒状構造物（マイクロポスト）が７８０００個構成されている。このマイクロポストには、抗ＥｐＣＡＭ抗体がコーティングされており、本流路に血液を送液すると、血液中のＣＴＣがマイクロポスト上に捕捉される。捕捉されたＣＴＣに対して、上皮細胞マーカー（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）をターゲットとした蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍細胞の計数が行われる。本装置は、手のひらに乗る小型デバイスでありながら、５ｍＬ以上の血液をそのまま分析に供することができるという大きな利点を持っている。実際に転移性がん患者血液からＣＴＣ検出を行っており、回収したＣＴＣからチロシンキナーゼ阻害薬に対する耐性を生む変異を検出することが出来る。しかしながら、ＣｅｌｌｓｅａｒｃｈやＣＴＣ−ｃｈｉｐを用いたＣＴＣ検出は、転移性がん患者血液などの実サンプルを用いた実験が精力的に行われ実績を挙げているが、これらの手法は抗ＥｐＣＡＭ抗体でＣＴＣを濃縮するという原理になっている。そのため、ＥｐＣＡＭ陰性又は弱陽性の腫瘍細胞は検出できないという問題点が挙げられる。

その他の方法としては、腫瘍細胞のサイズと形態を指標として、ＣＴＣを検出するマイクロ流体デバイスが開発されている。これらのデバイスでは、その流路構造内にメンブレンマイクロフィルター、三日月型の細胞捕捉ウェル（非特許文献３参照）、４段階の細さの流路（非特許文献４参照）を配して、血液中の血球細胞と腫瘍細胞をサイズによって選別し、腫瘍細胞を選択的に濃縮している。また、その流路を利用して、濃縮後の細胞に対して溶解などの操作を連続的に行うことが出来る。これらのデバイスを用いたモデル腫瘍細胞の回収効率の評価実験においては、８０％以上のＣＴＣ回収効率を得ている。しかしながら、この評価はあくまでモデル細胞を用いた実験で行われており、実際にＣＴＣ検出時に必要となる細胞の染色操作や洗浄操作といった要素技術項目については検討されていない上、がん患者血液などの実サンプルを用いた実験は行われておらず、実際にＣＴＣ検出に利用できるかどうかは明らかにされていない。

更に、抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用しない小型のデバイスとしては、マイクロ流路内にマイクロキャビティアレイ（微細貫通孔）を設け、ＣＴＣを捕捉することができるマイクロ流体デバイスが知られている（特許文献１参照）。しかしながら、前記マイクロ流体デバイスは、微細貫通孔にＣＴＣを捕捉するタイプであるので、ＣＴＣの目詰まりによる作業効率の低下、更には分離したＣＴＣの回収が困難であるという問題がある。

上記問題点を解決するため、本出願人らは、（１）主流路、及び該主流路の幅より大きな捕捉部位が形成された微粒子分離用マイクロ流路チップ、又は（２）主流路、該主流路から分岐し再び主流路に接続する分岐流路、及び該分岐流路に分岐流路の幅より大きな捕捉部位が形成されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、を用いて気液界面のメニスカスで生じる力を利用して微粒子を沈降させ、目的とする微粒子のみを捕捉部位で捕捉することができ、特に、サンプルとして濃縮等の前処理をしていない全血を用いても、ＣＴＣのみを連続的に分離・回収ができることを新たに見出し、特許出願を行っている（特許文献２参照）。

前記特許文献２に記載されている微粒子の分離方法は、微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル用薄板の間にサンプルを注入し、微粒子分離用マイクロ流路チップとシース液用薄板の間にシース液を注入し、微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル用薄板及びシース液用薄板を相対移動させることで発生するメニスカスにより、目的とする微粒子を前記微粒子分離用マイクロ流路チップに形成された捕捉部位に捕捉している。ところで、上記特許出願に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップとサンプル用薄板の間に注入できるサンプル量は１００μｌ程度である。しかしながら、特にがん転移が初期の患者、又はがん治療後の患者の経過観察等、血液細胞に含まれるＣＴＣ細胞が非常に少ない患者のサンプルからＣＴＣが含まれているか否かを正確に判断するには、５ｍｌ程度の血液サンプルを分析することが好ましく、前記特許文献２に記載されている方法ではサンプルの再導入が必要で、微粒子の分離操作が非常に煩雑になり且つ時間がかかるという問題がある。

更に、分離した個々のＣＴＣ細胞を分析するためには、ＰＣＲで核酸増幅する必要があるが、血液サンプルからＣＴＣを分離・回収し、自動分析を行えるシステムは知られていない。

特開２０１１−１６３８３０号公報 特願２０１２−２２７７１７号

Ａｌｌａｒｄ ＷＪ， Ｍａｔｅｒａ Ｊ， Ｍｉｌｌｅｒ ＭＣ， Ｒｅｐｏｌｌｅｔ Ｍ， Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ＭＣ， Ｒａｏ Ｃ， Ｔｉｂｂｅ ＡＧ， Ｕｈｒ ＪＷ， Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ ＬＷ． ２００４． Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ａｌｌ ｍａｊｏｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０（２０）：６８９７−９０４． Ｒｉｅｔｈｄｏｒｆ Ｓ， Ｆｒｉｔｓｃｈｅ Ｈ， Ｍｕｌｌｅｒ Ｖ， Ｒａｕ Ｔ， Ｓｃｈｉｎｄｌｂｅｃｋ Ｃ， Ｒａｃｋ Ｂ， Ｊａｎｎｉ Ｗ， Ｃｏｉｔｈ Ｃ， Ｂｅｃｋ Ｋ， Ｊａｎｉｃｋｅ Ｆ ａｎｄ ｏｔｈｅｒｓ． ２００７． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ｓｙｓｔｅｍ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３（３）：９２０−８． Ｔａｎ ＳＪ， Ｙｏｂａｓ Ｌ， Ｌｅｅ ＧＹ， Ｏｎｇ ＣＮ， Ｌｉｍ ＣＴ． ２００９． Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ １１（４）：８８３−９２． Ｍｏｈａｍｅｄ Ｈ， Ｍｕｒｒａｙ Ｍ， Ｔｕｒｎｅｒ ＪＮ， Ｃａｇｇａｎａ Ｍ． ２００９． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １２１６（４７）：８２８９−９５．

本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）基板、該基板上に形成された主流路、該主流路から分岐し再び主流路に接続する分岐流路、及び該分岐流路に形成され分岐流路の幅より大きな捕捉部位を含み、前記主流路が基板の中心から放射状に形成されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、又は（２）基板、該基板上に形成された主流路、及び該主流路の幅より大きく且つ主流路上に形成された捕捉部位を含み、前記主流路が基板の中心から放射状に形成されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、を該微粒子分離用マイクロ流路チップを回転させる回転手段上に載置し、前記微粒子分離用マイクロ流路チップの表面に、シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニットを配置し、前記回転手段を回転させながら、前記シース液注入口からシース液を注入し、且つ前記サンプル注入口からサンプルを注入し、前記微粒子分離用マイクロ流路チップとシース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を相対移動させてメニスカスを発生させ、吸引手段によりシース液を吸引することで、目的とする微粒子を前記微粒子分離用マイクロ流路チップに形成された捕捉部位に捕捉し、除去される微粒子をシース液とともに微粒子分離用マイクロ流路チップから除去することで、サンプルを前記微粒子分離用マイクロ流路チップに連続的に供給することができ、目的とする微粒子を効率よく捕捉・分離できることを新たに見出した。更に、ＣＴＣ等の核酸を含む生体材料を捕捉する場合、捕捉部位で捕捉された生体材料を微粒子抽出手段で取り出し、核酸を増幅するＰＣＲ手段に移すことで、サンプル中の生体材料の抽出・増幅を自動化できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、微粒子分離用マイクロ流路チップ、移流集積ユニット、微粒子分離用システム及び微粒子分離方法を提供することである。

本発明は、以下に示す、微粒子分離用マイクロ流路チップ、移流集積ユニット、微粒子分離用システム及び微粒子分離方法に関する。

（１）基板、該基板上に形成された主流路、該主流路から分岐し再び主流路に接続する分岐流路、及び該分岐流路に形成され分岐流路の幅より大きな微粒子の捕捉部位を含み、前記主流路が基板の中心から放射状に形成されていることを特徴とする微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（２）前記捕捉部位で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路及び前記分岐流路の幅ＦはＹ＜Ｆ＜Ｘ、前記捕捉部位の幅Ｇは１Ｘ＜Ｇ＜１０Ｘ、前記主流路、前記分岐流路及び前記捕捉部位の深さＨは１Ｘ＜Ｈ＜１０Ｘであることを特徴とする上記（１）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（３）前記幅Ｇが１Ｘ＜Ｇ＜２Ｘ、前記深さＨが１Ｘ＜Ｈ＜２Ｘであることを特徴とする上記（２）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（４）前記幅ＦがＹ＜Ｆ＜０．８Ｘであることを特徴とする上記（２）又は（３）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（５）前記主流路、前記分岐流路及び前記捕捉部位の下方に、幅がＦ、深さＪがＹ＜Ｊの流路が更に形成されていることを特徴とする上記（１）〜（４）の何れか一に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（６）基板、該基板上に形成された主流路、及び該主流路の幅より大きく且つ主流路上に形成された捕捉部位を含み、前記主流路が基板の中心から放射状に形成されていることを特徴とする微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（７）前記捕捉部位で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路の幅ＡはＹ＜Ａ＜Ｘ、前記捕捉部位の幅Ｂは１Ｘ＜Ｂ＜１０Ｘであり、前記捕捉部位の深さＣは１Ｘ＜Ｃ＜１０Ｘ、前記捕捉部位における主流路の深さＤはＹ＜Ｄであり、前記捕捉部位以外の主流路の深さＥはＥ＝Ｃ＋Ｄであることを特徴とする上記（６）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（８）前記幅Ｂが１Ｘ＜Ｂ＜２Ｘ、前記深さＣが１Ｘ＜Ｃ＜２Ｘであることを特徴とする上記（７）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（９）前記幅ＡがＹ＜Ａ＜０．８Ｘであることを特徴とする上記（７）又は（８）に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（１０）前記基板上に、放射状に伸びた前記主流路の先端部分を連結する円状の溝部が形成されていることを特徴とする上記（１）〜（９）の何れか一に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（１１）前記捕捉部位で捕捉される微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞であることを特徴とする上記（１）〜（１０）の何れか一に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
（１２）シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニット。
（１３）シース液吸引パッドを装着する孔及びシース液吸引口を更に含むことを特徴とする上記（１２）に記載の移流集積ユニット。
（１４）シース液を毛管力で吸引する孔及びシース液吸引口を更に含むことを特徴とする上記（１２）に記載の移流集積ユニット。
（１５）上記（１）〜（１１）の何れか一に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、
上記（１２）〜（１４）の何れか一に記載されている移流集積ユニット、
前記微粒子分離用マイクロ流路チップを回転させる回転手段、及び
シース液吸引手段、
を少なくとも含む微粒子分離用システム。
（１６）前記微粒子分離用マイクロ流路チップに形成されている捕捉部位に捕捉された微粒子を取り出す微粒子抽出手段及び微粒子を検出する検出手段を更に含むことを特徴とする上記（１５）に記載の微粒子分離用システム。
（１７）核酸を増幅するＰＣＲ手段を更に含むことを特徴とする上記（１６）に記載の微粒子分離用システム。
（１８）前記微粒子分離用マイクロ流路チップの捕捉部位に磁場を発生させる磁場発生装置及び／又は電場を発生させる電場発生装置を更に含むことを特徴とする上記（１５）〜（１７）の何れか一に記載の微粒子分離用システム。
（１９）上記（１）〜（１１）の何れか一に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップを、
該微粒子分離用マイクロ流路チップを回転させる回転手段上に載置し、前記微粒子分離用マイクロ流路チップ上に、シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニットを配置し、
前記回転手段を回転させながら、前記シース液注入口からシース液を注入し、前記サンプル注入口からサンプルを注入することで前記微粒子分離用マイクロ流路チップとシース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を相対移動させ、相対移動により発生したメニスカスにより目的とする微粒子を前記微粒子分離用マイクロ流路チップに形成された捕捉部位に捕捉し、
シース液吸引手段によりシース液を吸引することで、除去される微粒子をシース液とともに微粒子分離用マイクロ流路チップから除去することを特徴とする微粒子分離方法。
（２０）前記捕捉部位で捕捉される微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞であることを特徴とする上記（１９）に記載の微粒子分離方法。

本発明の微粒子分離用システムは、捕捉部位を有する主流路を基板の中心から放射状に設けた微粒子分離用マイクロ流路チップを回転させ、移流集積ユニットに形成されたサンプル注入口からサンプル及びシース液注入口からシース液を連続的に前記微粒子分離用マイクロ流路チップに投入することができる。したがって、例えば、赤血球、白血球等が混在している全血中から前処理なしに含有量の少ないＣＴＣのみを短時間で高精度に分離することができる。そのため、例えば、がん転移が初期の患者又はがん治療後の患者の経過観察等、血液細胞に含まれるＣＴＣ細胞が非常に少ない患者のサンプルであっても効率よくＣＴＣを分離することができ、簡便な操作によるベッドサイド型がん診断が可能となる。

本発明の微粒子分離用システムに用いられる微粒子分離用マイクロ流路チップは抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用していないので、ＣＴＣ陰性又は弱陽性の腫瘍細胞であっても確実に検出することができる。また、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップは、赤血球、白血球等のサイズの小さい細胞はシース液によりチップの外に流し、ＣＴＣ等のサイズが大きな細胞は流路に設けた捕捉部位で捕捉することができるので、従来のフィルタタイプのデバイスと異なり、デバイスの目詰まりが無く、連続的に処理することが可能となる。

分離する微粒子がＣＴＣ等の核酸を含む生体材料の場合、捕捉部位で捕捉された生体材料を微粒子抽出手段で取り出し、核酸を増幅するＰＣＲ手段に移すことで、サンプル中の生体材料の抽出・増幅を自動化することができる。

また、プレート上の細胞を抽出手段で自動的に抽出して、核酸を増幅するためのＰＣＲ手段に移植する公知の細胞ピッキングシステムに回転手段を取り付け、本発明の移流集積ユニット及び微粒子分離用マイクロ流路チップを用いることで、従来装置を微粒子分離用システムとして用いることができる。

更に、本発明の微粒子分離用システムに用いられる微粒子分離用マイクロ流路チップは、半導体形成プロセスを用いて量産が可能であることから、ＣＴＣ検査のコストを大幅に削減することができる。

図１は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの一例を示す概略図である。 図２は、主流路１２、該主流路１２から分岐し再び主流路１２に接続する分岐流路１３、該分岐流路１３に形成される捕捉部位１４の拡大図である。 図３は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの他の実施形態を示す図である。 図４は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの他の実施形態を示す図である。 図５は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの主流路２０及び捕捉部位２１の他の形態を示す図である。 図６は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップを作製する手順を示したフローチャートである。 図７は、本発明の微粒子分離用システムの概略を示す図である。 図８は、メニスカスの発生原理を説明する図である。 図９は、図面代用写真で、移流集積ユニット５０の構成と、システム３０に移流集積ユニット５０とチップ１をセットした際の位置関係を示す写真である。 図１０は、図面代用写真で、システム３０の移流集積ユニット５０を斜め上から拡大した写真である。 図１１は、図面代用写真で、移流集積ユニット５０の側面からの写真である。 図１２は、図面代用写真で、本発明の微粒子分離用システムの全体を示す写真である。 図１３は、図面代用写真で、本発明のシステムを用いて微粒子を分離した後に、捕捉部位で捕捉した微粒子を取り出す様子を示す写真である。 図１４は、図面代用写真で、実施例１で得られたチップの外観を示す写真である。 図１５は、図面代用写真で、実施例３で得られたた移流集積ユニットの外観を示す写真である。 図１６は、図面代用写真で、実施例４で得られたた移流集積ユニットのシース液を毛管力で吸引する孔部分を拡大した写真である。

以下に、微粒子分離用マイクロ流路チップ、移流集積ユニット、微粒子分離用システム及び微粒子分離方法について詳しく説明する。

図１は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップ（以下、単に「チップ」と記載することもある。）の一例を示しており、チップ１は、基板１０、該基板１０の中心１１から放射状に形成された主流路１２、前記主流路１２から分岐し再び主流路１２に接続する分岐流路１３、該分岐流路１３に形成され目的とする微粒子を捕捉する捕捉部位１４、を少なくとも含んでいる。また、主流路１２の先端部分には、各々の主流路１２の先端部分を連結する円状の溝部１５が形成されてもよく、後述する移流集積ユニットから注入されたシース液及びサンプル中の除去すべき微粒子を溝部１５に導き、シース液吸引手段のシース液に当接する部分１８を介して、溝部１５から吸引・除去できるようにしてもよい。

なお、本発明において、「微粒子」とは、液体に分散できる粒子を意味し、粒子の形態は単独又は凝集状態のどちらでもよい。また、微粒子の大きさは、メニスカスの原理が適用できる範囲であれば特に制限はなく、約１ｍｍ以下の大きさであればよい。前記の条件を満たす微粒子であれば、非生体材料又は生体材料を問わず用いることができる。なお、図１では、捕捉すべき微粒子がＣＴＣで、除去すべき微粒子が血液細胞の例を示している。

チップ１は、後述する微粒子分離用システムの回転手段に載置し回転することができれば形状等に特に制限は無いが、スペース及び取扱いの利便性から円形状が好ましい。また、回転手段上に載置した後はチップ１がずれないようにすることが好ましく、回転手段を形成する材料と密着性の高い材料で基板１０を形成してもよいし、例えば、回転手段に凸部を形成し基板１０に凹部を形成してもよい。基板１０の材料としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、ガラス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明のチップ１を用いて微粒子を分離する際には、後述する移流集積ユニットのシース液移流集積用平面部（以下、「シース液平面部」と記載することもある。）に対応するエリアでシース液にメニスカスを発生させ、そして、シース液にメニスカスを発生させるエリアより外周側であって、サンプル移流集積用平面部（以下、「サンプル平面部」と記載することもある。）に対応するエリアでサンプルにメニスカスを発生させる。したがって、主流路１２は、捕捉部位１４が形成されていない部分１６及び捕捉部位１４が形成されている部分１７で形成されてもよいが、様々な形状の移流集積ユニットに対応するため、主流路１２の全長に渡り捕捉部位１４が形成されていてもよい。

図２は、主流路１２、該主流路１２から分岐し再び主流路１２に接続する分岐流路１３、該分岐流路１３に形成される捕捉部位１４の拡大図である。なお、分岐流路１３に形成される捕捉部位１４は、分岐流路１３の途中に形成されてもよいし、図２の（１）〜（４）に示されるように、捕捉部位１４の一部が主流路１２と接触していてもよい。図２（１）は捕捉部位１４が円形状の例を示しており、該円形状の捕捉部位１４の一部が主流路１２と接触しており、（２）は主流路１２の流れ方向の鉛直方向に、角が滑らかな略正方形の捕捉部位１４が形成された例を示しており、該略正方形の捕捉部位１４の一辺が主流路１２と接触しており、（３）は主流路１２の流れ方向に角を滑らかにした略正方形の捕捉部位１４が形成されるとともに主流路１２の流れ方向を約９０度変化させた例を示しており、前記略正方形の捕捉部位１４の一辺が主流路１２と接触しており、（４）は分岐流路１３に形成された捕捉部位１４が略楕円形状の例を示しており、該楕円形状の捕捉部位１４の一部が主流路１２と接触している。なお、前記（１）〜（４）に記載されている捕捉部位１４の形状は単なる例示に過ぎず、例えば、６角形又は８角形の多角形等、微粒子が捕捉できれば他の形状であってもよい。また、１本の分岐流路１３に１個の捕捉部位１４が形成されてもよいし、複数本の分岐流路に１個の捕捉部位１４が形成されてもよい。更に、主流路１２及び分岐流路１３は、直線又は曲線でもよいし、直線の途中で方向を変える折れ線でもよい。

主流路１２、分岐流路１３及び捕捉部位１４の幅及び深さは、捕捉する微粒子の大きさに応じて適宜設定すればよいが、捕捉部位１４で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路１２及び分岐流路１３の幅ＦはＹ＜Ｆ＜Ｘが好ましい。前記捕捉部位１４の幅Ｇ（なお、捕捉部位１４の幅Ｇとは、捕捉部位１４の形状が円形の場合は直径、正方形の場合は１辺、６又は８角形等の多角形や楕円の場合は多角形や楕円の中心を通る最短となる長さを意味する。）は、１Ｘ＜Ｇ＜１０Ｘが好ましい。また、前記主流路１２、分岐流路１３及び捕捉部位１４の深さＨは、１Ｘ＜Ｈ＜１０Ｘの範囲で同じ深さとすることが好ましい。Ｇ及びＨを１０以上にすると、捕捉部位１４の大きさに対する分岐流路１３の幅が小さくなりすぎ、微粒子の分離・除去の処理能力が低下するので好ましくない。なお、捕捉部位１４に連結する分岐流路１３の数を複数本設ける場合、微粒子分離の処理能力が向上することから、Ｇ及びＨは１０Ｘ以上であってもよい。また、前記の数値は捕捉した微粒子の濃縮等、個々の捕捉部位１４で複数個の微粒子を捕捉する場合の範囲であるが、捕捉した微粒子を分析等するために個々の捕捉部位１４で捕捉する微粒子を１個とする場合は、１Ｘ＜Ｇ＜２Ｘ、１Ｘ＜Ｈ＜２Ｘとすることが好ましい。更に、捕捉部位１４で捕捉される微粒子が生体細胞等、形状が変化し易い場合は、捕捉部位１４で捕捉した生体細胞等が流体力により形状が変化し分岐流路１３に流れ出ないようにするため、分岐流路１３の幅Ｆを生体細胞の形状の変化割合に応じて適宜選択すればよく、例えば、ＣＴＣの場合は、Ｙ＜Ｆ＜０．８Ｘとすることが好ましい。なお、主流路及び分岐流路の幅Ｆについては、前記Ｆの範囲内であれば同じでも異なっていてもよい。また、主流路１２、分岐流路１３及び捕捉部位１４の深さＨは、前記Ｈの範囲内であれば同じでも異なっていてもよい。更に、本発明では、捕捉部位１４の下方に流路を形成してもよい。その場合、主流路１２、分岐流路１３及び捕捉部位１４の下方に、幅がＦ、深さＪがＹ＜Ｊの流路を更に設ければよく、図２（５）は更に流路を設けた際の捕捉部位１４部分の断面図を表している。

例えば、全血からＣＴＣを捕捉し、ＣＴＣ以外の赤血球、白血球等の細胞を除去する場合、主流路１２及び分岐流路１３の幅Ｆは、ＣＴＣの直径（１５〜３０μｍ）よりは小さく、血球細胞（約７μｍ）より大きくすればよく、８〜１２μｍが好ましい。一方、捕捉部位１４は、ＣＴＣを捕捉する必要があることから、捕捉部位１４の幅は、ＣＴＣの直径より大きい必要がある。例えば、図２（１）に示す捕捉部位１４が円形状の場合は、直径Ｇが１６〜３６μｍであることが好ましく、図２（２）及び（３）に示す捕捉部位１４が略正方形の場合は、一辺Ｇが、１６〜３６μｍであることが好ましく、図２（４）に示す捕捉部位１４が略楕円形状の場合は、短軸Ｇが１６〜３６μｍであることが好ましい。なお、捕捉部位１４の形状が多角形の場合は、上記のとおり、中心を通る最短となる線の長さが１６〜３６μｍとすればよい。

図２（１）〜（４）に示される捕捉部位を含むチップ１の場合、ＣＴＣは捕捉部位１４にトラップされるが、後述するシース液は主流路１２を流れるため、ＣＴＣはシース液の流体力を受けることがない。さらに、ＣＴＣより小さな血球細胞の多くは、後述するシース液と共に主流路１２を流れ、捕捉部位１４に流入してしまった血球細胞は、捕捉部位１４から更に伸びている分岐流路１３を通り再び主流路１２に戻すことができる。したがって、図２に示されるチップ１では、ＣＴＣとＣＴＣ以外の細胞の主要な流れが異なることから、捕捉部位１４の下方に流路を形成することは必須ではない。下方に流路を設けない場合、主流路１２、分岐流路１３及び捕捉部位１４の深さは１６〜３６μｍが好ましい。捕捉部位１４の下方に流路を設ける場合は、捕捉部位１４の下方の流路の深さは８〜２０μｍが好ましく、捕捉部位１４以外の主流路１２及び分岐流路１３については、捕捉部位１４と流路の深さを合計した深さとすればよい。

上記の例は、全血からＣＴＣを分離する場合の大きさであるが、例えば、腹腔洗浄液において血球細胞または中皮細胞（約７〜１５μｍ）から胃がん細胞塊（２５〜５０μｍ）を分離する場合は、主流路１２及び分岐流路１３の幅Ｆは８〜２４μｍとすればよく、主流路１２、分岐流路１３及び捕捉部位１４の幅Ｇ及び深さＨは２６μｍ〜６０μｍとすればよい。

図１の溝部１５の幅及び深さは、主流路１２からシース液が流入できれば特に制限は無いが、溝部１５の幅は、シース液吸引手段のシース液に当接する部分１８より大きくすることが望ましい。また、溝部１５の深さは、シース液がスムーズに流れ込むようにするため、主流路１２と同じ深さにすることが好ましい。

図３は、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップの他の実施形態を示す図で、溝部１５は図１に示す形状に限定されず、例えば、放射状に伸びた各主流路１２の先端部分を連結する円形状の幅をシース液吸引手段のシース液に当接する部分１８より小さくし、シース液吸引手段のシース液に当接する部分１８の一部が溝部１５に重なるように配置してもよい。また、溝部１５を形成することは必須ではなく、例えば、図４に示すように、主流路１２の先端部分に、シース液吸引手段のシース液に当接する部分１８を当接するようにしてもよい。

図５（１）は、主流路２０及び捕捉部位２１の他の形態を示しており、本形態では、分岐流路を形成せず、主流路２０上に捕捉部位２１を配置している。捕捉部位２１の形状は、前記捕捉部位１４と同様、円形、略正方形、６角形や８角形等の多角形、楕円形等、目的とする微粒子を捕捉できるものであれば特に制限は無い。また、捕捉部位の幅の定義も捕捉部位１４と同様である。

図５（２）は、図５（１）の主流路２０上に捕捉部位２１が形成されていない位置ａ−ａの断面図、図５（３）は主流路２０上に捕捉部位２１が形成されている位置ｂ−ｂの断面図である。主流路２０の幅及び深さ、捕捉部位２１の幅及び深さは、捕捉する微粒子の大きさに応じて適宜設定すればよいが、本形態では、図５（３）に示す下段部分の流路で除去すべき微粒子をシース液を用いて排出し、上段の捕捉部位２１で目的とする微粒子を捕捉することから、前記捕捉部位２１で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路２０の幅ＡはＹ＜Ａ＜Ｘ、前記捕捉部位２１の幅Ｂは１Ｘ＜Ｂ＜１０Ｘ、前記捕捉部位２１の深さＣは１Ｘ＜Ｃ＜１０Ｘ、前記捕捉部位２１における流路の深さＤはＹ＜Ｄとすることが好ましく、前記捕捉部位２１以外の流路の深さＥはＥ＝Ｃ＋Ｄとすることが好ましい。Ｂ及びＣを１０以上にすると、捕捉部位２１の大きさに対する主流路２０の幅Ａが小さくなりすぎ、微粒子の分離・除去の処理能力が低下するので好ましくない。なお、前記の１Ｘ＜Ｂ＜１０Ｘ、１Ｘ＜Ｃ＜１０Ｘは、捕捉部位２１の下段の主流路２０が一本の例であるが、捕捉部位２１の下段に複数本の主流路２０を設けて微粒子分離の処理能力を上げれば、Ｂ及びＣは１０Ｘ以上であってもよい。

また、前記捕捉部位１４と同様、個々の捕捉部位２１で捕捉する微粒子を１個とする場合は、１Ｘ＜Ｂ＜２Ｘ、１Ｘ＜Ｃ＜２Ｘとすればよく、目的の微粒子がＣＴＣの場合は、前記主流路２０の幅ＡをＹ＜Ａ＜０．８Ｘとすることが好ましい。

全血から、ＣＴＣを捕捉し、ＣＴＣ以外の赤血球、白血球等の血球細胞を除去する場合も、前記と同様、主流路２０の幅Ａは８〜１２μｍが好ましく、捕捉部位２１の幅Ｂ及び深さＣは１６〜３６μｍが好ましい。

また、捕捉部位２１においては、図５（３）で示される上段部分でＣＴＣを捕捉し、下段部分でシース液により血球細胞を除去することから、捕捉部位２１が形成されている部分の主流路２０の下段部分の深さＤは、少なくとも血球細胞の直径より大きい必要があり、また、１以上の血球細胞を同時に除去できることが好ましいことから、深さＤは、８〜２０μｍが好ましい。捕捉部位２１が形成されていない主流路２０の深さＥはＣ＋Ｄとすればよい。

上記の例は、全血からＣＴＣを分離する場合の大きさであるが、例えば、腹腔洗浄液において血球細胞または中皮細胞（約７〜１５μｍ）から胃がん細胞塊（２５〜５０μｍ）を分離する場合は、主流路２０の深さＤは８〜２４μｍとすればよく、捕捉部位２１の幅Ｂ及び深さＣは２６μｍ〜６０μｍとすればよい。

チップ１に形成される主流路１２、２０の数は少なくとも２以上であって、隣の主流路に形成されている捕捉部位１４、２１に干渉しなければ、形成する主流路の数は特に制限は無い。また、各主流路１２、２０に形成される捕捉部位１４、２１の数は少なくとも１以上で、主流路１２、２０の長さ、形成する捕捉部位の幅等を考慮し適宜調整すればよい。また、主流路１２，２０の形状は直線でも良いし、図１に示すように曲線であってもよい。本発明においては、チップ１と移流集積ユニットを相対移動することでメニスカスを発生させているが、チップ１は基板１０の中心１１を中心に回転していることから、シース液平面部及びサンプル平面部におけるメニスカスが発生するラインは直線ではなく曲線になる。したがって、メニスカスが発生するラインと主流路１２、２０のラインは一致した方が好ましく、また捕捉部位数を多く確保するためにも、主流路１２、２０は曲線の方が好ましい。曲線の曲がり具合は、チップ１の回転速度等を考慮しながら、適宜調整すればよい。

前記チップ１は、フォトリソグラフィー技術を用いて作製することができる。図６は作製手順の一例を示したフローチャートで、図５に示すように捕捉部位２１の下に流路が設けられている２段形状のチップを作製する場合の２段露光技術を用いた手順を示している。

先ず、シリコン基板を超音波洗浄機により有機洗浄し、ベイクする。次いで、図６に示す以下の手順で作製する。
１．ネガティブフォトレジスト（ＳＵ−８）をＳｉの基板上にスピンコートし、ホットプレート上でプリベイクする。
２．捕捉部位、捕捉部位以外の主流路部分及び溝部を形成するためのクロムマスク等のフォトマスクを用い露光する。
３．ホットプレート上でポストエクスポージャーベイクを行い、現像液（ＰＭシンナー等）を用い現像した後、超純水を用いリンスし、スピンドライヤー等で水分をとばし乾燥させる。
４．２段目のＳＵ−８のネガティブフォトレジストをスピンコートし、プリベイクする。
５．捕捉部位の下段の主流路、捕捉部位以外の主流路部分及び溝部を形成するためのクロムマスク等を用い露光する。
６．ポストエクスポージャーベイク、現像、リンスを行い、パターンを形成する。
７．形成されたパターンを、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に転写する。
８．形成されたパターンからＰＤＭＳを分離する。
９．ＰＤＭＳ表面を親水化する。

有機洗浄は、アセトン、エタノール等、半導体製造分野で一般的に用いられている洗浄剤であれば特に制限はされない。また、上記の手順では、基板としてＳｉを用いた例を示したが、フォトリソグラフィー技術分野で一般的に用いられている材料であれば基板の材料は特に限定はされず、例えば、シリコンカーバイド、サファイア、リン化ガリウム、ヒ化ガリウム、リン化ガリウム、窒化ガリウム等が挙げられる。ネガティブフォトレジストもＳＵ−８に限定されず、例えば、ＫＭＰＲ等、また、ポジティブフォトレジストであれば、例えば、ＰＭＥＲ、ＡＺ等一般的に使用されているレジストを用いることもできる。

上記の手順は、捕捉部位２１の下側に主流路２０を形成する場合の手順であるが、図２に示されるような主流路１２、分岐流路１３、捕捉部位１４及び溝部１５が同じ深さの場合は、それらの形状のマスクを用い、上記手順「４．〜６．」の２段目のレジスト層を設ける手順を省略する以外は、上記と同様の手順で作製することができる。

チップ１の表面は親水化処理されることで、マイクロチップに液体を注入した際、溝に気泡が入ることを防止できる。親水化処理方法等しては、プラズマ処理、界面活性剤処理、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）処理、光触媒等が挙げられ、例えば、チップ表面を１０〜３０秒間プラズマ処理することで、チップ表面に水酸基を導入することができる。

図７は、本発明の微粒子分離用システム（以下、単に「システム」と記載することもある。）３０の概略を示す図で、チップ１を載置して回転させる回転手段４０、移流集積ユニット５０、図示しないシース液吸引手段を少なくとも含んでおり、捕捉部位で捕捉した微粒子を取り出す場合は微粒子抽出手段７０を含んでもよい。更に、捕捉した微粒子が核酸を含む生体材料で、分離後にＰＣＲを行う場合はＰＣＲ手段８０を含んでいてもよく、図７ではＰＣＲに用いられるウェルを配置した例を示している。また、後述する移流集積ユニットのシース液注入口にシース液を送液するシース液インジェクション６１及びサンプル注入口にサンプルを送液するサンプルインジェクション６２を設けてもよい。シース液インジェクション６１及びサンプルインジェクション６２は、送液できるものであれば特に制限は無く、シリンジ等を用いて手動で送液してもよいし、市販の定流量ポンプ等を用いてもよい。また、送液に動力を使用せず、ボトル等から重量により滴下してもよく、その場合、点滴の流量調整に用いられるクレンメを設けて流量を調整してもよい。

図８は、回転手段４０によりチップ１と移流集積ユニット５０を相対移動させた際に発生するメニスカスの原理を説明する図で、移流集積法と呼ばれる、気液界面に存在する微粒子間の毛管力（特に横毛管力：ｌａｔｅｒａｌ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｏｒｃｅと呼ばれる。）を利用して、微粒子同士を細密充填構造に配列する手法を用いている。チップ１と移流集積ユニット５０のシース液平面部５３及びサンプル平面部５４を相対移動すると、微粒子が溶液に分散した懸濁液のメニスカスがチップ１とシース液平面部５３及びサンプル平面部５４に間に形成され、メニスカスの先端において、図８に示すように微粒子が溶液から頭を出す箇所が形成される。この頭が出ている箇所では、界面張力及び重力により下に押し付けられる力が微粒子に発生しながらメニスカスと共に移動し、微粒子はチップ１に押し付けられ、そして目的とする微粒子が主流路に形成された捕捉部位に捕捉される。

回転手段４０は、チップ１を載置して回転できるものであれば特に制限は無く、例えば、チップ１を載置できる回転可能な円盤の下にモーター等の駆動手段を設けて、円盤を回転するようにすればよい。なお、発生するメニスカスの大きさを一定にすることが好ましいことから、駆動手段は円盤を一定速度で回転制御できるものであることが好ましい。

図９は、移流集積ユニット５０の構成と、システム３０に移流集積ユニット５０とチップ１をセットした際の位置関係を示す写真である。移流集積ユニット５０は、シース液注入口５１、サンプル注入口５２、シース液平面部５３及びサンプル平面部５４が少なくとも形成されている。また、本発明の移流集積ユニット５０には、シース液吸引パッドを装着又はシース液を毛管力で吸引する孔５５、該孔５５に連通し図示しないシース液吸引装置と接続するためのシース液吸引口５６が設けられていてもよい。シース液平面部５３及びサンプル平面部５４は、チップ１と相対移動することでメニスカスを発生させるため、チップ１に相対する面は平面形状であることが好ましい。また、シース液平面部５３及びサンプル平面部５４とチップ１との間でメニスカスが発生し、シース液平面部５３及びサンプル平面部５４以外ではメニスカスが発生する必要は無いことから、移流集積ユニットのシース液平面部５３及びサンプル平面部５４は、他の部分より厚くし段差を設ける必要がある。一方、孔５５に関しては、孔５５にシース液吸引パッドを装着する場合は、シース液吸引パッドがシース液に当接するように、シース液吸引パッドを装着する孔５５からの突出量を調整すればよいので、孔５５は前記他の部分と同じ面に形成してもよいし、シース液平面部５３及びサンプル平面部５４と同じ高さとなる位置に孔５５を設ける平面部を形成し、該平面部に孔５５を形成してもよいし、孔５５は溝部１５に対応して設けられることから、孔５５を設ける平面部をシース液平面部５３及びサンプル平面部５４より厚くしてもよい。また、孔５５をシース液を毛管力で吸引する孔として用いる場合には、孔５５はチップ１と摩擦が発生しない程度でほぼ当接するように配置することが好ましい。後述するように、チップ１とシース液平面部５３及びサンプル平面部５４は、５００〜１０００μｍ離れた位置にセットされるので、シース液を毛管力で吸引する孔５５を形成する平面部は、シース液平面部５３及びサンプル平面部５４より５００〜１０００μｍ程度、厚めに形成することが好ましい。

また、図９に示すように、シース液注入口５１はシース液平面部５３内に、サンプル注入口５２はサンプル平面部５４内に形成されてもよいし、移流集積ユニット５０とチップ１を相対移動させる際に、シース液平面部５３の上流側にシース液注入口５１を、サンプル平面部５４の上流側にサンプル注入口５２を形成してもよい。システム３０にチップ１と移流集積ユニット５０をセットする際、チップ１に捕捉部位１４が形成されていない部分１６がある場合は、シース液平面部５３は前記部分１６に対応してセットされ、サンプル平面部５４は捕捉部位が形成されている部分１７に対応してセットされる。したがって、シース液平面部５３は前記部分１６と一部が対応していれば形状は特に制限は無いが、前記部分１６と同心となる２つの円弧を含む形状に形成されることが好ましく、前記２つの円弧の幅を前記部分１６と同じ幅Ｒ１とすることがより好ましい。円弧の長さは適宜調整すればよい。サンプル平面部５４も同様に、前記部分１７と一部が対応していれば形状は特に制限は無いが、前記部分１７と同心となる２つの円弧を含む形状に形成されることが好ましく、前記２つの円弧の幅を前記部分１７と同じ幅Ｒ２とすることがより好ましい。円弧の長さは適宜調整すればよい。本実施形態においては、シース液吸引パッドを装着する孔５５は溝部１５に対応するように配置されるので、該孔５５はシース液吸引パッドを装着でき溝部１５より小さければ孔５５の幅及び形状に特に制限はないが、溝部１５と同心となる円弧状の孔であることが好ましい。また、シース液吸引口５６は前記孔５５に連通していれば形成する個数、位置は特に制限は無く、適宜調整すればよい。

図１０はシステム３０の移流集積ユニット５０を斜め上から拡大撮影した写真で、移流集積ユニット５０は、回転手段４０に載置されたチップ１との間隔を保つための高さ調整手段５７に取り付けられている。高さ調整手段５７は、螺子等により移流集積ユニットの高さを調整できるものであれば特に制限は無い。また、移流集積ユニット５０を使用する際には、シリコン等のチューブ５８を介して、シース液注入口５１はシース液インジェクション６１、サンプル注入口５２はサンプルインジェクション６２、及びシース液吸引口５６は図示しないシース液吸引装置に接続すればよい。

シース液吸引手段は、チップ１の溝部１５又は主流路１２、２０からシース液を吸引できるものであれば特に制限は無い。例えば、布、コットン、スポンジ、セーム皮等のシース液吸引パッドを直接又は移流集積ユニット５０の孔５５を介して溝部１５又は主流路１２、２０に当接してシース液を吸引すればよい。

また、孔５５にシース液吸引パッドを挿入する代わりに、孔５５の幅を毛管力が発生する幅に調整し、孔５５を溝部１５又は主流路１２、２０に当接することで、毛管力によりシース液を吸引してもよい。その場合、孔５５の幅は、少なくともシース液と共に除去された微粒子を通過させる必要があることから、サンプルが全血の場合は少なくとも８μｍ以上、処理能力を上げるためには１０μｍ以上とすることがより好ましい。一方、孔５５の幅は毛管力が発生すれば特に上限は無く、吸引するシース液量や毛管力等を考慮して適宜調整すればよく、例えば、２００μｍ程度の幅を設けてもよい。

シース液吸引手段としては、上記に例示した他、吸引ポンプ等の吸引装置を用い、該吸引装置に接続する吸引口を溝部１５又は主流路１２、２０に当接してシース液を吸引してもよい。なお、本発明においては、主流路１２、２０を流れるシース液の流速は、シース液吸引手段の吸引力で調整する。そのため、微粒子の分離に使用するシース液量及びサンプル量が多くなり、シース液吸引パッド又は毛管力を発生させる孔が、シース液で飽和状態になるとシース液の吸引速度が安定しなくなるおそれがある。そのため、シース液の流速をより安定に保てるよう、上記のシース液吸引手段を組合せて用いてもよい。例えば、コットン等のシース液吸引パッドの一端をシース液に接触させてシース液を吸収しつつ、吸引ポンプ等の吸引装置を用いて、シース液吸引パッドの他端からシース液吸引パッドに吸収されたシース液を吸引してもよい。また、シース液を毛管力で吸引できる孔５５の一端から毛管力によりシース液を吸引しつつ、前記孔５５に連通する吸引口から吸引装置でシース液を吸引してもよい。更に、移流集積ユニット５０に前記孔５５を設けず、シース液吸引ポンプ等の吸引装置に接続する吸引口を毛管力が発生する大きさ又は吸引口に吸引パッドを差し込み、前記吸引口を溝部１５や主流路１２、２０に当接するようにしてもよい。

図１１は、移流集積ユニット５０の側面からの写真で、孔５５に、シース液吸引パッド５９を装着し、シース液吸引口５６にシリコン等のチューブ５８を連結している状態を示す写真である。シース液吸引パッド５９の下端はチップ１の溝部１５のシース液に接触し、シース液吸引パッド５９に吸引されたシース液は、シース液吸引口５６に接続しているシリコン等のチューブ５８を介して接続している吸引ポンプ等の吸引装置により吸引され、シース液吸引パッド５９から排除される。

移流集積ユニット５０を構成する材料は、アクリル、ナイロン、テフロン（登録商標）等の樹脂、又はガラス等、サンプルやシース液と反応しないものであれば特に制限はない。移流集積ユニット５０は、ドリル及びエンドミル等の切削工具を用いた切削加工、又は移流集積ユニット５０の形状のモールドを作製し射出成形により作製することができる。なお、本発明における移流集積ユニット５０は、シース液注入口５１、サンプル注入口５２、シース液平面部５３及びサンプル平面部５４、更に必要に応じて形成される孔５５及びシース液吸引口５６が含まれていれば、単一の部材で形成されていても、別々に作製した部材を組み合わせてもよい。

微粒子抽出手段７０は、捕捉部位１４、２１で捕捉された微粒子を抽出できるものであれば特に制限は無く、例えば、細胞吸引手段を備えたマニピュレータ等が挙げられる。前記微粒子抽出手段７０は、捕捉部位１４、２１に捕捉された目的とする微粒子を検出する検出手段９０と連動したマニピュレータにより自動的に回収できるようにすればよく、例えば、特開２０１０−２９１７８号公報に記載されているような細胞ピッキングシステムを用いることができる。また、検出手段９０としては、捕捉された微粒子がＣＴＣの場合、ＦＩＴＣやＰＥで標識された抗ＥｐＣＡＭ抗体等のＣＴＣ特異的な抗体を用いて蛍光染色したＣＴＣを観察できる蛍光顕微鏡等を用いることができる。また、光学顕微鏡を用いて明視野観察を行う場合には、パパニコロウ染色やギムザ染色を行うことで細胞内の核、細胞質等の形態的特徴を指標としてＣＴＣ検出を行うことが出来る。

微粒子抽出手段７０で抽出した微粒子が核酸を含む生体材料で、抽出後にＰＣＲを行う場合は、ＰＣＲ手段８０に抽出した生体材料を移せばよい。また、ＰＣＲ手段は公知の装置を用いればよい。

次に、システム３０を用いた微粒子分離方法について説明する。図１２はシステム３０の全体を示す写真で、回転手段４０の上にチップ１が載置され、チップ１から５００〜１０００μｍ離れた位置に移流集積ユニット５０のシース液平面部５３及びサンプル平面部５４が位置するように配置されている。チップ１と移流集積ユニット５０のシース液平面部５３及びサンプル平面部５４との間隔が５００μｍ以下であるとサンプル液の導入量が減少し処理能力が低下し、１０００μｍ以上であるとメニスカス力が低下し十分な分離が得られない。

シース液は、分離すべき微粒子に損傷等を与えないものであれば特に制限はなく、全血をサンプルとして用いる場合は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等各種緩衝液、疑似体液（ＳＢＦ）、一般的な細胞培養液等、一般的に使用されているシース液であれば特に制限はない。図１２に示す例では、ボトル６１に貯めたシース液を重力により滴下し、その際クレンメを用いて流量を調整している。サンプルはシリンジ６２に入れ、重力により滴下している。サンプルは、全血の場合はそのまま注入してもよいし、非生物材料又は生物材料の混合物から目的とする微粒子を分離・抽出する場合は、上記シース液と同様の組成の溶液に懸濁してもよい。

シース液平面部５３とサンプル平面部５４は半径方向の位置が異なるので、チップ１を回転させた場合の両者の相対速度は異なるが、何れも、チップ１との相対速度が５０〜１５００μｍ／ｓの範囲となるようチップ１を回転させることが好ましく、６０〜１０００μｍ／ｓがより好ましい。５０μｍ／ｓより遅いと処理時間が長くなり処理能力が低下し、１５００μｍ／ｓより速いと微粒子が捕捉されずに分離効率が低減する。なお、図１２に示すシステムでは、移流集積ユニット５０を固定しチップ１を回転させているが、チップ１を固定して移流集積ユニット５０を回転させてもよい。

注入するサンプル量は、１．０〜１０．０μｌ／ｓが好ましい。１．０μｌより少ないと処理時間が長くなり処理能力が低下し、１０．０μｌより多いと移流集積ユニットのサンプル平面部とチップの間にサンプルを保持できなくなり好ましくない。主流路１２を流れるシース液の流速は、主流路の深さ及び幅や捕捉部位の形状及び大きさ等により異なるものの、１０〜１０００μｍ／ｓが好ましく、１００〜７００μｍ／ｓがより好ましくい。１０μｍ／ｓより遅いと血球細胞を洗浄する能力の低下により分離効率が低減し、１０００μｍ／ｓより速いと捕捉されたＣＴＣが吸引され分離効率が低減する。シース液の流速は、シース液吸引手段の吸引力により調整すればよい。また、シース液は、吸引されるシース液の量と同じになるように注入すればよい。

図１３は、本システムを用いて微粒子を分離した後に、捕捉部位で捕捉した微粒子を取り出す様子を示している。微粒子の取り出しの際には、微粒子抽出手段７０が移動し易くするため、移流集積ユニット５０を取り付けている高さ調整手段５７をＸ，Ｙ，Ｚ軸方向に移動できるようにしておき、チップ１から離間できるようにしてもよい。検出手段９０により検出された目的の微粒子は、微粒子抽出手段７０で吸引され、ＰＣＲ手段８０のウェルに移される。

本発明のシステム３０は、微粒子の捕捉効率を上げるための磁場発生装置及び／又は電場発生装置等を設けてもよい。例えば、チップ１の捕捉部位が形成されている部分１７に対応する回転手段４０の円盤部分を永久磁石等で形成してもよいし、前記部分１７に対応する円盤部分の下側に磁場発生装置として永久磁石又は電磁石を設置して磁場ポテンシャル場を発生させてもよい。ＥｐＣＡＭ抗体等を標識した磁性粒子を特異的に吸着させたＣＴＣ、又は磁性粒子を非特異的に吸着させたＣＴＣ（エンドサイトーシスから取り込む）等、捕捉したい粒子に磁性を帯びさせた上で、本発明の微粒子分離用システムを用いると、磁性標識されていない他の微粒子から精度よく目的とする微粒子を分離することが可能である。

また、捕捉部位に対応する円盤部分又は当該円盤部分の下側に、電場発生装置として電極を設けて電場ポテンシャル場（不均一電場中）を発生させ、ＣＴＣと周囲媒質の分極と電場の勾配により生じる静電気力（クーロン力）を用いてＣＴＣの捕捉をアシストすることも可能である。

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

〔微粒子分離用マイクロ流路チップの作製〕
＜実施例１＞
先ず、シリコン基板をアセトン・エタノール・超純水の順に、４５ｋＨｚで５分間ずつ超音波洗浄機により有機洗浄し、１４５℃で２０分間ベイクした。次に、シリコン基板上にＳＵ−８をスピンコートし、ホットプレート上で９５℃で３０分間、プリベイクした。次に、捕捉部位１４が図２（４）の形状で、溝部１５が図１に示す形状のクロムマスクを用い露光後、ホットプレート上で９５℃で２分間、ポストエクスポージャーベイクを行い、ＰＭシンナーを用い現像した。現像後は、超純水を用いリンスし、スピンドライヤー等で水分をとばし乾燥させた。形成されたパターンを、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に転写し、転写後、両者を分離し、ＰＤＭＳ表面をプラズマ処理（周波数５０ｋＨｚ，出力７００Ｗ、３０秒間）により親水化した。

図１４（１）は実施例１で得られたチップの外観を示す写真で、チップの中心１１は直径５ｍｍの孔、主流路に捕捉部位が形成されていない部分１６の幅は１０ｍｍ、主流路に捕捉部位が形成されている部分１７の幅は１０ｍｍ、溝部１５の幅は１０ｍｍであった。また、主流路、捕捉部位、溝部の深さは約３０μｍであった。図１４（２）は、主流路、分岐流路、捕捉部位を拡大した写真で、主流路及び分岐流路の幅Ｆは約８μｍ、捕捉部位の中心を通る最短となる線の長さＧは約３０μｍであった。また、主流路の中心と隣の主流路の中心の距離は約６６μｍで、形成した主流路の数は７３６本、捕捉部位の数は６２６５２個であった。

＜実施例２＞
図４に示されているように、溝部を形成せず主流路を伸ばした以外は、上記実施例１と同様の手順でチップを作製した。

〔移流集積ユニットの作製〕
＜実施例３＞
移流集積ユニットは、アクリルを材料にして、切削工具（三菱マテリアル社製のドリル及びエンドミル）を用いた切削加工により作製した。図１５は実施例２で作製した移流集積ユニットをチップ１に対面する方向から撮影した写真で、シース液注入口５１、サンプル注入口５２、及びシース液吸引口５６の孔のサイズは直径２ｍｍであった。また、シース液平面部５３の２つの円弧の幅は８ｍｍ、短い円弧の長さは４．１ｍｍで、サンプル平面部５４の２つの円弧の幅は１０ｍｍ、短い円弧の長さは９．２ｍｍであった。更に、孔５５の幅は４ｍｍ、孔５５の円弧の長さは４６ｍｍであった。
＜実施例４＞
シース液を毛管力で吸引する孔５５の幅を１５０μｍ、前記孔５５を設ける平面部をシース液平面部及びサンプル平面部より約５００μｍ厚くした以外は、上記実施例３と同様の手順で移流集積ユニットを作製した。図１６は、実施例４で作製した移流集積ユニットのシース液を毛管力で吸引する孔５５部分の拡大写真である。

〔血液サンプルの作製〕
採取したヒト血液２０μｌに、１０×１０⁵個の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入ＭＫＮ−４５（人胃がん）細胞を添加して、がん患者の血液を模した血液サンプル（ＣＴＣを含む全血）を作製した。なお、がん細胞の平均粒径は２５μｍであった。

＜実施例５＞
〔血液サンプルからのＣＴＣ分離実験〕
実施例１で作製した微粒子分離用マイクロ流路チップをシステム３０の回転手段４０の上に載置し、実施例２で作製した移流集積ユニットを前記微粒子分離用マイクロ流路チップとの間隔が約５００μｍとなるようにセットした。また、移流集積ユニットの孔５５には、微粒子分離用マイクロ流路チップの溝部１５に均一に当接するようにコットンを挿入した。回転手段４０を０．３ｒｐｍで回転しながら、主流路を流れるシース液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））の速度が６００μｍ／ｓとなるようにシース液を貯めたボトルからクレンメを用いてシース液を供給する一方、シース液吸引口５６にシリコンチューブ（アズワン社製）の一端を接続し、他端をマイクロシリング（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に接続してシース液を吸引した。また、サンプルは８．３μｌ／ｓとなるように供給した。捕捉されたＣＴＣは、蛍光顕微鏡により確認した。

上記実施例５の結果を表１に示す。なお、表１中、「１視野あたりの細胞数」とは、上記〔血液サンプルの作製〕で作製したサンプルのみをチップ１上にメニスカスを発生させずに塗布し、チップ１上で選択した任意の４か所（表１中のａ〜ｄ）に含まれるＣＴＣ細胞の数を表す。「捕捉された細胞数」とは、実施例５によりメニスカスを発生させ且つシース液を流すことで血液細胞を除去しながら前記任意の４か所（ａ〜ｄ）の捕捉部位で捕捉されたＣＴＣの数を表す。表１に示すように、実施例５においては、サンプル中の約６０％のＣＴＣを捕捉することができた。従来の抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いたＣＴＣの捕捉の場合、血中のＣＴＣの１００乃至１０００分の１程度しか捕捉することができないといわれているが、本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップを用いると、非常に効率よくＣＴＣを捕捉できることが明らかとなった。

＜実施例６＞
〔主流路を流れるシース液の速度変化実験〕
実施例２で作製したチップ及び実施例４で作製した移流集積ユニットを用い、チップと移流集積ユニットのシース液平面部及びサンプル平面部の間隔が約５００μｍ、チップと移流集積ユニットの孔５５がほぼ当接するようにセットした以外は、実施例５と同様の条件で実験を行った。実験中、任意の間隔で主流路を流れるシース液の流速をビデオ撮影により測定したところ、シース液が移流集積ユニットの孔から毛管力により吸引が開始された以降は、シース液がほぼ一定の流速で主流路を流れたことを確認できた。

本発明の微粒子分離用マイクロ流路チップを含む微粒子分離用システムを使用することで、サンプル中のサイズの異なる微粒子を、抗体等を用いることなく迅速かつ高効率で分離することができる。したがって、全血からのＣＴＣの分離等、臨床の場において非常に有効であることから、病院や救急センターなどの医療機関や大学医学部などの研究機関、教育機関において、がん診断のシステムとして利用が可能である。

Claims (20)

1. 基板、該基板上に形成された主流路、該主流路から分岐し再び主流路に接続する分岐流路、及び該分岐流路に形成され分岐流路の幅より大きな微粒子の捕捉部位を含み、前記主流路が基板の中心から放射状に形成されていることを特徴とする微粒子分離用マイクロ流路チップ。
2. 前記捕捉部位で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路及び前記分岐流路の幅ＦはＹ＜Ｆ＜Ｘ、前記捕捉部位の幅Ｇは１Ｘ＜Ｇ＜１０Ｘ、前記主流路、前記分岐流路及び前記捕捉部位の深さＨは１Ｘ＜Ｈ＜１０Ｘであることを特徴とする請求項１に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
3. 前記幅Ｇが１Ｘ＜Ｇ＜２Ｘ、前記深さＨが１Ｘ＜Ｈ＜２Ｘであることを特徴とする請求項２に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
4. 前記幅ＦがＹ＜Ｆ＜０．８Ｘであることを特徴とする請求項２又は３に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
5. 前記主流路、前記分岐流路及び前記捕捉部位の下方に、幅がＦ、深さＪがＹ＜Ｊの流路が更に形成されていることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
6. 基板、該基板上に形成された主流路、及び該主流路の幅より大きく且つ主流路上に形成された捕捉部位を含み、前記主流路が基板の中心から放射状に形成されていることを特徴とする微粒子分離用マイクロ流路チップ。
7. 前記捕捉部位で捕捉される微粒子の大きさをＸ、分離・除去される微粒子の大きさをＹとした場合、前記主流路の幅ＡはＹ＜Ａ＜Ｘ、前記捕捉部位の幅Ｂは１Ｘ＜Ｂ＜１０Ｘであり、前記捕捉部位の深さＣは１Ｘ＜Ｃ＜１０Ｘ、前記捕捉部位における主流路の深さＤはＹ＜Ｄであり、前記捕捉部位以外の主流路の深さＥはＥ＝Ｃ＋Ｄであることを特徴とする請求項６に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
8. 前記幅Ｂが１Ｘ＜Ｂ＜２Ｘ、前記深さＣが１Ｘ＜Ｃ＜２Ｘであることを特徴とする請求項７に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
9. 前記幅ＡがＹ＜Ａ＜０．８Ｘであることを特徴とする請求項７又は８に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
10. 前記基板上に、放射状に伸びた前記主流路の先端部分を連結する円状の溝部が形成されていることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
11. 前記捕捉部位で捕捉される微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞であることを特徴とする請求項１〜１０の何れか一項に記載の微粒子分離用マイクロ流路チップ。
12. シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニット。
13. シース液吸引パッドを装着する孔及びシース液吸引口を更に含むことを特徴とする請求項１２に記載の移流集積ユニット。
14. シース液を毛管力で吸引する孔及びシース液吸引口を更に含むことを特徴とする請求項１２に記載の移流集積ユニット。
15. 請求項１〜１１の何れか一項に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップ、
    請求項１２〜１４の何れか一項に記載されている移流集積ユニット、
    前記微粒子分離用マイクロ流路チップを回転させる回転手段、及び
    シース液吸引手段、
    を少なくとも含む微粒子分離用システム。
16. 前記微粒子分離用マイクロ流路チップに形成されている捕捉部位に捕捉された微粒子を取り出す微粒子抽出手段及び微粒子を検出する検出手段を更に含むことを特徴とする請求項１５に記載の微粒子分離用システム。
17. 核酸を増幅するＰＣＲ手段を更に含むことを特徴とする請求項１６に記載の微粒子分離用システム。
18. 前記微粒子分離用マイクロ流路チップの捕捉部位に磁場を発生させる磁場発生装置及び／又は電場を発生させる電場発生装置を更に含むことを特徴とする請求項１５〜１７の何れか一項に記載の微粒子分離用システム。
19. 請求項１〜１１の何れか一項に記載されている微粒子分離用マイクロ流路チップを、該微粒子分離用マイクロ流路チップを回転させる回転手段上に載置し、
    前記微粒子分離用マイクロ流路チップ上に、シース液注入口、サンプル注入口、シース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を少なくとも含む移流集積ユニットを配置し、
    前記回転手段を回転させながら、前記シース液注入口からシース液を注入し、前記サンプル注入口からサンプルを注入することで前記微粒子分離用マイクロ流路チップとシース液移流集積用平面部及びサンプル移流集積用平面部を相対移動させ、相対移動により発生したメニスカスにより目的とする微粒子を前記微粒子分離用マイクロ流路チップに形成された捕捉部位に捕捉し、
    シース液吸引手段によりシース液を吸引することで、除去される微粒子をシース液とともに微粒子分離用マイクロ流路チップから除去することを特徴とする微粒子分離方法。
20. 前記捕捉部位で捕捉される微粒子がＣＴＣで、除去される微粒子が血球細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の微粒子分離方法。