CN110241079A - 一种高纯度的pbmc分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高纯度的PBMC分离方法，包括以下步骤：将采集的全血离心10min；吸取上层的血浆离心30min；使用PBS将离心后的血样沉淀悬浮；在离心管中加入Lymphoprep，然后离心30min；将离心后的血样弃去上层PBS，将白膜层收集到一个新离心管内，每管约装20‑25ml；补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，取混匀的溶液离心5min，弃去上清；用含有2％自体血清的PBS重悬细胞至50ml，混匀并计数；弃去上清的溶液加合适体积的淋巴细胞冻存液重悬细胞。本发明使得分离出来的PBMC红细胞含量更少，品质更佳，更有利于下游实验的进行。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种高纯度的PBMC分离方法。
背景技术
目前通过密度梯度离心的方法来分离人外周血单个核细胞(PBMC)，普遍存在着细胞纯度低，红细胞残留量大的问题，极大地影响了下游的实验效果。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种高纯度的PBMC分离方法，以解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种高纯度的PBMC分离方法，包括以下步骤：
步骤1、从志愿者体内采集全血，将得到的血样1000g离心10min；
步骤2、吸取上层的血浆转移到一个干净的离心管里，抽取1500g离心30min；
步骤3、使用PBS将步骤2中离心后的血样沉淀悬浮；
步骤4、在50ml离心管中加入25ml Lymphoprep，然后将步骤3中的血样加到Lymphoprep上层，保证血样与Lymphoprep之间有约1cm左右的混合层，血样体积不要超过15ml；
步骤5、使用水平转子，取650g步骤4中加入Lymphoprep后的血样离心30min，温度19℃，升速设置5(慢速)，降速设置0；
步骤6、将步骤5中离心后的血样弃去上层PBS，将白膜层收集到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml；
步骤7、将步骤6中每管约装20-25ml的白膜层补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤8、将步骤7中弃去上清的溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤9、将步骤8中弃去上清的溶液用含有2％自体血清的PBS重悬细胞至50ml，混匀并计数；
步骤10、根据需要新鲜PBMC的数量，取相应体积的步骤9中的悬液转移至提前准备好的50ml离心管中并用保存液补充至50ml，放置在4℃冰箱；
步骤11、将步骤10中剩下的细胞溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤12、将步骤11中弃去上清的溶液加合适体积的淋巴细胞冻存液重悬细胞，按照不同规格分装至冻存管，1mL/管，每支冻存细胞按照冻存规格的1.3倍冻存；
步骤13、将分装好的细胞贴上标签(需要注明信息：批号，细胞密度，体积，储存条件等)；
步骤14、将细胞放至细胞程序降温盒里，立即冻存于-80℃冰箱；
步骤15、隔天将细胞转移至液氮罐中，做好细胞库信息登记以方便取用。
优选的，所述步骤3中的PBS为常温的PBS。
优选的，所述步骤10中的保存液为PBS+5％自体血清。
优选的，所述步骤1～步骤12需在II级生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。
与已公开技术相比，本发明存在以下优点：本发明通过对现有的PBMC的分离体系进行优化，使得分离出来的PBMC红细胞含量更少，品质更佳，更有利于下游实验的进行。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种高纯度的PBMC分离方法，包括以下步骤：
步骤1、从志愿者体内采集全血，将得到的血样1000g离心10min；
步骤2、吸取上层的血浆转移到一个干净的离心管里，抽取1500g离心30min；
步骤3、使用PBS将步骤2中离心后的血样沉淀悬浮；
步骤4、在50ml离心管中加入25ml Lymphoprep，然后将步骤3中的血样加到Lymphoprep上层，保证血样与Lymphoprep之间有约1cm左右的混合层，血样体积不要超过15ml；
步骤5、使用水平转子，取650g步骤4中加入Lymphoprep后的血样离心30min，温度19℃，升速设置5(慢速)，降速设置0；
步骤6、将步骤5中离心后的血样弃去上层PBS，将白膜层收集到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml；
步骤7、将步骤6中每管约装20-25ml的白膜层补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤8、将步骤7中弃去上清的溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤9、将步骤8中弃去上清的溶液用含有2％自体血清的PBS重悬细胞至50ml，混匀并计数；
步骤10、根据需要新鲜PBMC的数量，取相应体积的步骤9中的悬液转移至提前准备好的50ml离心管中并用保存液补充至50ml，放置在4℃冰箱；
步骤11、将步骤10中剩下的细胞溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤12、将步骤11中弃去上清的溶液加合适体积的淋巴细胞冻存液重悬细胞，按照不同规格分装至冻存管，1mL/管，每支冻存细胞按照冻存规格的1.3倍冻存；
步骤13、将分装好的细胞贴上标签(需要注明信息：批号，细胞密度，体积，储存条件等)；
步骤14、将细胞放至细胞程序降温盒里，立即冻存于-80℃冰箱；
步骤15、隔天将细胞转移至液氮罐中，做好细胞库信息登记以方便取用。
实施例2
一种高纯度的PBMC分离方法，包括以下步骤：
步骤1、从志愿者体内采集全血，将得到的血样1000g离心10min；
步骤2、吸取上层的血浆转移到一个干净的离心管里，抽取1500g离心30min；
步骤3、使用PBS将步骤2中离心后的血样沉淀悬浮；
步骤4、在50ml离心管中加入25ml Lymphoprep，然后将步骤3中的血样加到Lymphoprep上层，保证血样与Lymphoprep之间有约1cm左右的混合层，血样体积不要超过15ml；
步骤5、使用水平转子，取650g步骤4中加入Lymphoprep后的血样离心30min，温度19℃，升速设置5(慢速)，降速设置0；
步骤6、将步骤5中离心后的血样弃去上层PBS，将白膜层收集到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml；
步骤7、将步骤6中每管约装20-25ml的白膜层补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤8、将步骤7中弃去上清的溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤9、将步骤8中弃去上清的溶液用含有2％自体血清的PBS重悬细胞至50ml，混匀并计数；
步骤10、根据需要新鲜PBMC的数量，取相应体积的步骤9中的悬液转移至提前准备好的50ml离心管中并用保存液补充至50ml，放置在4℃冰箱；
步骤11、将步骤10中剩下的细胞溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤12、将步骤11中弃去上清的溶液加合适体积的淋巴细胞冻存液重悬细胞，按照不同规格分装至冻存管，1mL/管，每支冻存细胞按照冻存规格的1.3倍冻存；
步骤13、将分装好的细胞贴上标签(需要注明信息：批号，细胞密度，体积，储存条件等)；
步骤14、将细胞放至细胞程序降温盒里，立即冻存于-80℃冰箱；
步骤15、隔天将细胞转移至液氮罐中，做好细胞库信息登记以方便取用。
优选的，所述步骤3中的PBS为常温的PBS。
优选的，所述步骤10中的保存液为PBS+5％自体血清。
优选的，所述步骤1～步骤12需在II级生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。
与已公开技术相比，本发明存在以下优点：本发明通过对现有的PBMC的分离体系进行优化，使得分离出来的PBMC红细胞含量更少，品质更佳，更有利于下游实验的进行。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.一种高纯度的PBMC分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、从志愿者体内采集全血，将得到的血样1000g离心10min；
步骤2、吸取上层的血浆转移到一个干净的离心管里，抽取1500g离心30min；
步骤3、使用PBS将步骤2中离心后的血样沉淀悬浮；
步骤4、在50ml离心管中加入25ml Lymphoprep，然后将步骤3中的血样加到Lymphoprep上层，保证血样与Lymphoprep之间有约1cm左右的混合层，血样体积不要超过15ml；
步骤5、使用水平转子，取650g步骤4中加入Lymphoprep后的血样离心30min，温度19℃，升速设置5(慢速)，降速设置0；
步骤6、将步骤5中离心后的血样弃去上层PBS，将白膜层收集到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml；
步骤7、将步骤6中每管约装20-25ml的白膜层补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤8、将步骤7中弃去上清的溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤9、将步骤8中弃去上清的溶液用含有2％自体血清的PBS重悬细胞至50ml，混匀并计数；
步骤10、根据需要新鲜PBMC的数量，取相应体积的步骤9中的悬液转移至提前准备好的50ml离心管中并用保存液补充至50ml，放置在4℃冰箱；
步骤11、将步骤10中剩下的细胞溶液放入到一个新的50ml离心管内，每管约装20-25ml，再补加含有2％自体血清的PBS至50ml并上下颠倒混匀，在4℃的温度下、取400g混匀的溶液离心5min，然后弃去上清；
步骤12、将步骤11中弃去上清的溶液加合适体积的淋巴细胞冻存液重悬细胞，按照不同规格分装至冻存管，1mL/管，每支冻存细胞按照冻存规格的1.3倍冻存；
步骤13、将分装好的细胞贴上标签(需要注明信息：批号，细胞密度，体积，储存条件等)；
步骤14、将细胞放至细胞程序降温盒里，立即冻存于-80℃冰箱；
步骤15、隔天将细胞转移至液氮罐中，做好细胞库信息登记以方便取用。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度的PBMC分离方法，其特征在于：所述步骤3中的PBS为常温的PBS。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度的PBMC分离方法，其特征在于：所述步骤10中的保存液为PBS+5％自体血清。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度的PBMC分离方法，其特征在于：所述步骤1～步骤12需在II级生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190917 |