CN117165521A - 用于分离及体外获得外周血单个核细胞(pbmc)的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了用于分离外周血单个核细胞(PBMC)的方法。本申请还提供了用于体外获得外周血单个核细胞(PBMC)的方法。与用于获得PBMC的传统方法相比，本申请提供的方法具有以下一种或多种效果：操作流程简易高效，试验结果稳定且可重复，解决了不同试验批次之间PBMC性能差异过大的问题等。
Description
技术领域
本申请大体涉及细胞生物学和分子生物学领域，具体而言，本申请涉及用于分离和体外获得外周血单个核细胞(PBMC)的方法。
背景技术
酶联免疫斑点试验(ELISpot)和胞内细胞因子染色试验(ICS)是评价生物大分子药物细胞免疫功能的主要平台，而保证人外周血单个核细胞(PBMC)在分离、冻存及复苏过程中细胞免疫功能的完整是ELISpot和ICS试验必要的先决条件。常用的PBMC分离方法有Ficoll分离法和Percoll分离法两种。Percoll分离法操作流程较长，手续较为繁琐；相比之下Ficoll分离法较为常用。Ficoll分离法一般是按抗凝外周血：稀释液＝1:1稀释后，将其按与Ficoll分离液体积比2:1的比例与注入到Ficoll分离液上层，常温400g条件下离心30分钟，离心后管内分为三层，上层为血浆层，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞，在上、中层界面处有一白膜层即为PBMC，吸取白膜层，洗涤两次后重悬即可。但是，Ficoll分离法存在不能回收血浆，Ficoll分离液用量大，分层不明显等缺点。因此本领域亟需开发流程简易高效、试验结果稳定且可重复的PBMC分离和获得的方法。
发明内容
第一方面，本申请提供了用于分离外周血单个核细胞(PBMC)的方法，其包括：
a)将血液样品在其采集容器中离心，获得上清液；
b)向步骤a)获得的上清液中加入洗涤缓冲液进行洗涤；
c)将洗涤后的PBMC进行离心，获得细胞团块。
第二方面，本申请提供了用于体外获得外周血单个核细胞(PBMC)的方法，其包括通过第一方面所述的方法分离外周血单个核细胞(PBMC)，以及任选地将分离的外周血单个核细胞在体外进行冻存和/或复苏。
具体实施方式
应理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
人外周血单个核细胞(PBMC)在分离、冻存及复苏过程中细胞免疫功能的完整是ELISpot和ICS试验必要的先决条件，传统的PBMC分离、冻存及复苏方法存在试验操作复杂、易造成试验批次间差异过大等问题，特别是在PBMC的分离过程中显得尤为明显。本申请提供了用于分离和获得外周血单个核细胞(PBMC)的新方法，例如在分离过程中直接在采血容器中将所采集的血液样品进行离心，避免了现有方法中的一些繁琐操作。与用于获得PBMC的传统方法相比，本申请提供的方法可以具有以下的一种或多种效果：操作流程简易高效，试验结果稳定且可重复，解决了不同试验批次之间PBMC性能差异过大的问题等。
第一方面，本申请提供了用于分离外周血单个核细胞(PBMC)的方法，其包括：
a)将血液样品在其采集容器中离心，获得上清液；
b)向步骤a)获得的上清液中加入洗涤缓冲液进行洗涤；
c)将洗涤后的PBMC进行离心，获得细胞团块。
在一些实施方案中，所述方法还任选地包括：
d)用洗涤缓冲液对步骤c)中获得的细胞团块进行重悬和洗涤；
e)将步骤d)洗涤后的PBMC进行离心，获得细胞团块。
在一些实施方案中，所述方法还任选地包括：
f)用细胞培养液重悬步骤e)获得的细胞团块，获得PBMC悬液。
本文所用的术语“外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)”是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。外周血单个核细胞主要的分离方法是聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度离心法。
在一些实施方案中，所述PBMC来源于哺乳动物。
本文所用的术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，如小鼠和仓鼠；以及兔形目的哺乳动物，如兔。哺乳动物可以来自食肉目，包括猫科(猫)和犬科(狗)。哺乳动物可以来自偶蹄目，包括牛科(牛)和猪科(猪)；或者来自奇蹄目，包括马科(马)。哺乳动物可以来自灵长目、猿目或猴目，或者来自类人猿目。优选地，哺乳动物是人。
在一些实施方案中，步骤a)中的采血容器为采血管。
在一些实施方案中，步骤a)中的采血容器为BD-CPT采血管。
在一些实施方案中，步骤a)中的离心在4-37℃下以1000-2000g进行≥30min；步骤c)中的离心在4-37℃下以100-500g进行≥15min；和/或步骤e)中的离心在4-37℃下以100-500g进行≥10min。
在一些实施方案中，使用采血容器采集完血液样品后，将血液样品在采血容器中混匀(例如，将采血容器轻轻地上下颠倒)，然后通过直接在采血容器(例如采血管)中离心，实现了简易和/或高效地分离PBMC的效果。
在一些实施方案中，所述血液样品为外周血样品或全血样品。
本文所用的术语“外周血样品”通常包含全血样品和外周血单个核细胞样品，两者均为一种细胞混合样品，包含不同的白细胞亚群。
在一些实施方案中，步骤a)、c)和e)中的离心温度为4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃或者以上任意两个数值之间的范围。
在一些实施方案中，步骤a)、c)和e)中的离心力逐渐减小；并且步骤a)、c)和e)中的离心时间也逐渐缩短。
在一些优选实施方案中，步骤a)、c)和e)中的离心温度均为25℃；离心力分别为1800g、300g和300g；以及离心时间分别为30min、15min和10min。
在一些实施方案中，步骤b)中上清液与洗涤缓冲液的比例为1:29-2:3(v/v)。
在一些实施方案中，步骤b)中的洗涤缓冲液与步骤d)中的缓冲液为相同或不同的。
在一些具体实施方案中，在使用前将步骤b)和d)中所述的洗涤缓冲液在二氧化碳培养箱中放置≥20min。
在一些优选实施方案中，步骤b)和步骤d)中的洗涤缓冲液均为可商购获得的CTL-Wash溶液。
在一些具体实施方案中，在步骤c)和e)中，离心后，通过在生物安全柜中倒掉上清液以获得细胞团块。
本文所用的术语“生物安全柜”是能防止实验操作处理过程中某些含有危险性或未知性生物微粒发生气溶胶散逸的箱型空气净化负压安全装置，其广泛应用于微生物学、生物医学、基因工程、生物制品等领域的科研、教学、临床检验和生产中，是实验室生物安全中一级防护屏障中最基本的安全防护设备。
在一些实施方案中，步骤f)中的细胞培养液为可商购获得的。
在一些具体实施方案中，在使用前将所述细胞培养液在二氧化碳培养箱中放置≥20min。
在一些优选实施方案中，所述细胞培养液为CTL-TEST溶液。
第二方面，本申请提供了用于体外获得外周血单个核细胞(PBMC)的方法，其包括通过第一方面所述的方法分离外周血单个核细胞(PBMC)，以及任选地将分离的外周血单个核细胞在体外进行冻存和/或复苏。
在一些实施方案中，利用可商购获得的试剂盒进行PBMC的冻存和/或复苏。
本文中所用的术语“细胞冻存”是指将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。
在一些实施方案中，将PBMC悬液使用无菌PBS溶液稀释。在一些实施方案中，使用无菌PBS溶液将PBMC悬液稀释10倍。在一些实施方案中，在生物安全柜中进行如上所述的稀释PBMC悬液的操作。
在一些实施方案中，对稀释后的PBMC样品进行计数。在一些实施方案中，使用荧光细胞活力分析仪对稀释后的PBMC样品进行计数。
在一些实施方案中，向细胞培养液中加入PBMC悬液。在一些优选实施方案中，所述细胞培养液为CTL-TEST溶液。在一些实施方案中，将所得PBMC悬液进行离心。在一些优选实施方案中，在温度为25℃，离心力为330g的条件下将所得PBMC悬液离心10min。
在一些实施方案中，在生物安全柜中，倒掉离心后的上清液，获得PBMC细胞团块。
在一些实施方案中，向所得PBMC细胞团块中加入细胞冻存液并混匀。
本文所述的细胞冻存液包括本领域中常用的细胞冻存液。在一些优选实施方案中，所述细胞冻存液通过CTL-CryoTMABC Kit制备。在一些优选实施方案中，将所述细胞冻存液在二氧化碳培养箱中放置一段时间。
在一些实施方案中，将混匀后的PBMC冻存悬液置于冻存盒中。在一些优选实施方案中，所述冻存盒为Nalgene程序降温冻存盒。在一些优选实施方案中，将含有PBMC冻存悬液的冻存盒置于低温保存箱中放置一段时间。在一些优选实施方案中，将PBMC冻存悬液从冻存盒中取出并迅速置于液氮冻存盒中。
本文中所用的术语“细胞复苏”是与细胞冻存相反的过程，即是细胞恢复生长的过程，是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养。当恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。与细胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
在一些实施方案中，将冻存的PBMC融化。在一些优选实施方案中，将冻存的PBMC置于水浴锅中温育一段时间。
在一些实施方案中，向融化后的PBMC中加入洗涤缓冲液进行洗涤。在一些优选实施方案中，所述洗涤缓冲液为CTL-Anti-Aggregate Wash溶液。
在一些优选实施方案中，将洗涤后的PBMC进行离心。在一些优选实施方案中，在温度为25℃，离心力为330g的条件下将洗涤后的PBMC离心10min。在一些实施方案中，在生物安全柜中倒掉离心后的上清，获得PBMC细胞团块。
在一些实施方案中，用细胞培养液重悬以上获得的PBMC细胞团块。
在一些优选实施方案中，所述细胞培养液为CTL-TEST溶液。在一些具体实施方案中，在使用前将所述细胞培养液在二氧化碳培养箱中放置≥20min。
本文中所用的术语“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”和“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分或步骤或其他要素，也可以仅包括或包含列出的组分或步骤或其他要素。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
实施例
提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。
实验材料和来源
除非另有说明，本申请中所用的培养基、试剂、装置等均是本领域技术人员熟知的，并且可商购获得的。除非另有说明，本申请中所用的实验条件和操作为本领域技术人员众所周知的，并且基于现有技术容易获得的。
试验试剂的准备
(1)准备CTL-TEST溶液：使用前按照相关使用量，将装有CTL-TEST溶液的离心管管盖拧松，置于37℃，9％CO2的二氧化碳培养箱中保持至少20min。
(2)准备CTL-Wash溶液(PBMC分离过程使用)：使用前按照相关使用量，将装有CTL-Wash溶液的离心管管盖拧松，置于37℃，9％ CO2的二氧化碳培养箱中保持至少20min。
(3)准备程序降温冻存盒(PBMC冻存过程使用)：将约250mL异丙醇溶液加入Nalgene程序降温冻存盒中，拧紧盒盖，置于室温状态备用。
(4)准备CTL-Anti-Aggregate Wash溶液(PBMC复苏过程使用)：使用前按照相关使用量，将装有CTL-Anti-Aggregate Wash溶液的离心管管盖拧松，置于37℃，9％CO2的二氧化碳培养箱中保持至少20min。
实施例1：PBMC的分离
本实施例提供了一种分离PBMC的方法，其具体包括以下步骤：
(1)采血及离心：使用BD-CPT采血管进行全血样本采集，每支采集6mL，然后将每个采血管轻轻地180度上下颠倒混匀，持续8-10次；将离心机的温度调整为25℃、离心力调整为1800g，离心机升降速调至最低，精密配平后离心30分钟；离心后每个BD-CPT采血管再次轻轻地180度上下颠倒混匀，持续5-6次。
(2)采血后首次洗涤PBMC：在生物安全柜中，将离心后采血管中的上清液每两支倒入一支50mL无菌离心管中，贴好标签(或用记号笔做好标记)，再将CTL-Wash溶液加入上述50mL离心管中至约30mL刻度处，然后将每个离心管轻轻地180度上下颠倒混匀，持续5-6次。
(3)离心：将来自步骤(2)的50mL离心管放入相应的离心机转子中，使用天平配平，将离心机的温度调整为25℃，离心力调整为300g，离心机升降速调至最大，离心15分钟。
(4)采血后再次洗涤PBMC：在生物安全柜中，倒掉离心后的上清，在每支盛放PBMC的50mL离心管中，先用1mL移液器加入1mL CTL-Wash溶液并缓慢吹打混匀离心后的PBMC细胞团块，再用电动助吸器向50mL离心管中加入约19mL CTL-Wash溶液，然后将每个离心管轻轻地180度上下颠倒混匀，持续5-6次。
(5)离心：将来自步骤(4)的50mL离心管放入相应的离心机转子中，使用天平配平，将离心机的温度调整为25℃，离心力调整为300g，离心机升降速调至最大，离心10分钟。
(6)重悬PBMC：在生物安全柜中，倒掉离心后的上清，并从二氧化碳培养箱中取出CTL-TEST溶液，并向每支离心管中加入1000μL，缓慢吹打混匀细胞，然后将两支50mL离心管中重悬的细胞悬液合并混匀。若PBMC在10min内不使用，应将含有重悬PBMC的离心管松开盖子，置于37℃，9％CO2的二氧化碳培养箱中保存，PBMC在此环境下可保存24h。
实施例2：PBMC的冻存
本实施例提供了一种冻存PBMC的方法，其具体包括以下步骤：
(1)稀释PBMC悬液：在生物安全柜中，将分离重悬的PBMC使用无菌PBS溶液稀释10倍，稀释后用移液器缓慢吹打混匀细胞。
(2)细胞计数：取稀释后的PBMC样本，使用荧光细胞活力分析仪进行计数操作，然后根据计数结果计算出PBMC冻存所需的各种试剂的使用量，使最终PBMC细胞冻存管中细胞悬液的浓度为1×107个/mL，体积为500μL。
(3)冻存液的准备：在生物安全柜中，按照使用量将CTL-CryoTMA试剂和CTL-CryoTMB试剂按照4:1的比例在15mL离心管(或50mL离心管)中混合，混合时将1体积的CTL-CryoTMB试剂缓慢加入4体积的CTL-CryoTMA试剂中，混匀，制备AB Mix溶液；再按照使用量将CTL-CryoTMC试剂单独加入另一支15mL离心管(或50mL离心管)中，并和制备好的AB Mix溶液一起，将离心管拧松管盖，放入37℃，9％CO2的二氧化碳培养箱中，至少5min(CTL-CryoTMA试剂、CTL-CryoTMB试剂及CTL-CryoTMC试剂均来源于CTL-CryoTMABC Kit)。
(4)离心：将盛有使用CTL-TEST溶液重悬的PBMC细胞悬液的15mL离心管放入相应的离心机转子中，使用天平配平，将离心机的温度调整为25℃，离心力调整为330g，离心机升降速调至最大，离心10分钟。
(5)重悬PBMC：在生物安全柜中，倒掉离心后的上清，并从二氧化碳培养箱中取出CTL-CryoTMC试剂，向每个样本的15mL离心管中加入已计算好对应体积的CTL-CryoTMC试剂。
(6)制备PBMC冻存悬液：将AB Mix溶液从二氧化碳培养箱中取出，在生物安全柜中，将AB Mix溶液等体积滴加入用CTL-CryoTMC试剂重悬的细胞悬液中，加入每滴AB Mix溶液后，用手轻微震荡混匀离心管中溶液，待全部加入AB Mix溶液后，用1mL移液器缓慢吹打混匀细胞冻存悬液3-5次。
(7)PBMC程序降温：在生物安全柜中，将混匀后的PBMC冻存悬液按500μL/管规格，分装至已贴好标签的细胞冻存管中，拧紧冻存管盖，然后将其放入已准备好的Nalgene程序降温冻存盒里。再迅速放入实验室的医用低温保存箱(-60～-90℃)中，放置12～48小时。
(8)转运PBMC冻存管至液氮罐：将放置12至48小时后的Nalgene程序降温冻存盒从医用低温保存箱(-60～-90℃)中取出放入盛有干冰的容器中并运输至液氮罐处，再将程序降温冻存盒内的细胞冻存管取出并迅速放入液氮罐细胞冻存盒中，然后将其置于液氮罐冻存盒中保存。
实施例3：PBMC的复苏
本实施例提供了一种复苏PBMC的方法，其具体包括以下步骤：
(1)融化PBMC细胞：先将恒温水浴锅温度调至37℃，待水浴锅温度稳定后，再将装有PBMC的细胞冻存管从液氮中取出，迅速置入37℃恒温水浴锅中，温育8min。
(2)融化后首次洗涤PBMC：在生物安全柜中，将融化后的1支PBMC细胞冻存管内的全部细胞冻存悬液用1mL移液枪吸取，并转移至1支做好标记的15mL无菌离心管中；然后向此细胞冻存管中加入1mL CTL-Anti-Aggregate Wash溶液缓慢吹吸洗涤冻存管，并将洗涤后的溶液缓慢加入上述15mL无菌离心管中；再用电动助吸器将约8mL CTL-Anti-AggregateWash溶液加入上述15mL离心管中(前3mL缓慢加入，约每5秒加入1mL，然后加入剩余的5mL溶液)；最后将上述15mL离心管拧紧管盖，轻轻地180度颠倒混匀，持续5-6次。每支细胞冻存管内的PBMC均按照上述步骤进行首次洗涤。
(3)离心：将洗涤PBMC后的15mL离心管放入相应的离心机转子中，使用天平配平，将离心机的温度调整为25℃，离心力调整为330g，离心机升降速调至最大，离心10分钟。
(4)融化后再次洗涤PBMC：在生物安全柜中，倒掉离心后的上清，先用1mL移液器向每支盛放PBMC的15mL离心管中加入1mL CTL-Anti-Aggregate Wash溶液并缓慢吹打混匀离心管底部的PBMC细胞团块，再用电动助吸器向15mL离心管中加入约9mL CTL-Anti-Aggregate Wash溶液，将上述15mL离心管拧紧管盖，轻轻地180度颠倒混匀，持续5-6次。每支细胞冻存管内的PBMC均按照上述步骤进行再次洗涤。
(5)离心：将洗涤PBMC后的15mL离心管放入相应的离心机转子中，使用天平配平，将离心机的温度调整为25℃，离心力调整为330g，离心机升降速调至最大，离心10分钟。
(6)重悬PBMC：在生物安全柜中，倒掉离心后的上清，并从二氧化碳培养箱中取出CTL-TEST溶液，并向每支离心管中加入500μL，缓慢吹打混匀细胞。若PBMC在10min内不使用，应将含有重悬PBMC的离心管松开盖子，置于37℃，9％ CO2的二氧化碳培养箱中保存，PBMC在此环境下可保存24h。
(7)稀释PBMC悬液：在生物安全柜中，将复苏重悬的PBMC使用无菌PBS溶液稀释10倍，稀释后用移液器缓慢吹打混匀细胞。
(8)细胞计数及细胞浓度调整：取稀释后的PBMC样本，使用荧光细胞活力分析仪进行计数操作，然后根据计数结果计算出稀释PBMC所需的试剂使用量，并在使用前将PBMC稀释成工作液。
总之，通过实施例1-3中所述的PBMC分离、冻存和复苏方法实现了以下一种或多种效果：通过所述方法获得的PBMC的性能稳定且活力高；所述方法具有较好的重复性；所述方法解决了不同试验批次之间PBMC性能差异过大的问题等。
可以理解，尽管本申请以上述具体形式描述了所涉及的发明，但这些发明并不局限于这些具体形式描述的特定内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请所描述的发明精神的前提下，还可对其中所涉及的发明包含的技术特征进行各种等同变化，这些变化都应该属于所述发明的范围之内。
Claims (10)
1.用于分离外周血单个核细胞(PBMC)的方法，其包括：
a)将血液样品在其采集容器中离心，获得上清液；
b)向步骤a)获得的上清液中加入洗涤缓冲液进行洗涤；
c)将洗涤后的PBMC进行离心，获得细胞团块。
2.如权利要求1所述的方法，其还任选地包括：
d)用洗涤缓冲液对步骤c)中获得的细胞团块进行重悬和洗涤；
e)将步骤d)洗涤后的PBMC进行离心，获得细胞团块。
3.如权利要求2所述的方法，其还任选地包括：
f)用细胞培养液重悬步骤e)获得的细胞团块，获得PBMC悬液。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述PBMC来源于哺乳动物，优选来源于人。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的采集容器为采血管，例如BD-CPT采血管。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤a)中的离心在4-37℃下以1000-2000g进行≥30min；步骤c)中的离心在4-37℃下以100-500g进行≥15min；和/或步骤e)中的离心在4-37℃下以100-500g进行≥10min，优选地步骤a)、c)和e)中的离心温度均为25℃；离心力分别为1800g、300g和300g；以及离心时间分别为30min、15min和10min。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤b)中上清液与洗涤缓冲液的比例为1:29-2:3(v/v)。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤b)中的洗涤缓冲液与步骤d)中的缓冲液为相同或不同的，任选地，在使用前将所述洗涤缓冲液在二氧化碳培养箱中放置≥20min，优选地步骤b)和步骤d)中的缓冲液为可商购获得的，更优选地，步骤b)和步骤d)中的缓冲液均为CTL-Wash溶液。
9.如权利要求3所述的方法，其中步骤f)中的细胞培养液为可商购获得的，优选地所述细胞培养液为CTL-TEST溶液。
10.用于体外获得外周血单个核细胞(PBMC)的方法，其包括如权利要求1-9中任一项所述的方法分离外周血单个核细胞(PBMC)，以及任选地将分离的外周血单个核细胞在体外进行冻存和/或复苏，例如利用可商购获得的试剂盒进行冻存和/或复苏。
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| CN112458051A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-03-09 | 海南优尼科尔生物科技有限公司 | 一种外周血单个核细胞的提取收集方法 |
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| 王菁等: "使用Thermo Scientific ST16 & Multifuge X1 新型离心机从血液样本中分离PBMCs", 《实验室产品部技术通讯》, no. 3, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 29 - 30 * |
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