CN108588009A - 一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其包括以下步骤：S1、采集外周血，分离出血浆和细胞；S2、将步骤S1所得血浆放入超声清洗仪中进行破碎，得到血浆裂解物；S3、将步骤S1所得细胞进行重悬与清洗，并冷藏保存；S4、将部分步骤S2所得血浆裂解物装入第一血袋中，将剩余部分血浆裂解物与步骤S3所得细胞混合，过滤，得到极小胚胎样干细胞，再装入第一血袋中，得到激活的极小胚胎样干细胞，并排掉第一血袋中的气体后密封。本发明的步骤简单，操作方便，其分离得到的极小胚胎样干细胞纯度可达到91％，活性可达到85％。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法。
背景技术
极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells,VSEL，简称Vcell)是一种非造血干细胞，其形态学和细胞标志与胚胎干细胞有相似之处，具有胚胎干细胞多分化潜能特性，可以向包括心肌和血管内皮细胞在内的三个胚层的细胞分化，且无免疫排异，并能改善极性心肌梗死后的心功能和心脏重构。
极小胚胎样干细胞的概念是美国路易斯维尔大学Kucia等2006年首先提出的，它是从小鼠骨髓单个核细胞中成功分离出来并命名，细胞表型为Sca-1+lin-CD45-，表达原始多能干细胞标志，直径仅为2-4μm，较血小板大，比红细胞小，细胞核大，含常染色质。随后的相关研究发现在人和小鼠的骨髓、脐带血、外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等损伤后的组织器官中也存在着，但它们的数量极少，约占总的单个核细胞的0.01％-0.02％，在体外可以被诱导分化成心肌细胞、神经细胞等，应用到组织工程和临床治疗前景非常广阔。然而骨髓细胞、脐带血细胞的组成种类多，成分复杂，所以要在临床上广泛应用必须有成熟的分离方法，以获得纯度较高且数量可观的极小胚胎样干细胞。
目前，关于极小胚胎样干细胞的分离方法，大部分是针对动物，如小鼠骨髓的极小胚胎样干细胞的分离、猪骨髓的极小胚胎样干细胞的分离，其分离得到的极小胚胎样干细胞纯度较低；而且现有的技术只是对极小胚胎样干细胞进行分离，而不包含对极小胚胎样干细胞的激活，其分离出的极小胚胎样干细胞活性较低，不利于后续的应用。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其能够分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞，分离得到的极小胚胎样干细胞不仅纯度较高，而且活性较高。
为了解决上述问题，本发明按以下技术方案予以实现的：
一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，包括以下步骤：
S1、采集外周血，分离出血浆和细胞；
S2、将步骤S1所得血浆放入超声清洗仪中进行破碎，得到血浆裂解物；
S3、将步骤S1所得细胞进行重悬与清洗，并冷藏保存；
S4、将部分步骤S2所得血浆裂解物装入第一血袋中，将剩余所述血浆裂解物与步骤S3所得细胞混合，过滤，得到极小胚胎样干细胞，再装入所述第一血袋中，得到激活的极小胚胎样干细胞，并排掉所述第一血袋中的气体后密封。
进一步的，步骤S1包括以下步骤：
1)用第二血袋从人的肘部头静脉处抽取150mL外周血；
2)将步骤1)所得第二血袋放于生物安全柜中，将所述外周血均匀分装到3根50mL第一离心管中，并配平后离心；
3)将步骤2)所得血浆分别装入3根50mL第二离心管中，并配平后离心，分离出血浆和细胞。
进一步的，步骤2)相对离心力为550-650g，离心时间为25-35min。
进一步的，步骤3)相对离心力为2400-2800g，离心时间为10-20min。
进一步的，步骤S2包括：将步骤3)所得血浆分别装入3根50mL玻璃管中，并放入加有冰袋的超声清洗仪中破碎40-50min，得到所述血浆裂解物。
进一步的，步骤S3包括：将步骤3)所得细胞先分别用1mL盐水重悬，然后分别用0.5mL盐水清洗，再分别收集到1.5mL的EP管中，于2-8℃冷藏保存。
进一步的，步骤S4包括：将步骤S2得到的其中2根所述玻璃管中的所述血浆裂解物加入不含抗凝剂的所述第一血袋中，另一根所述玻璃管中的所述血浆裂解物与步骤S3所得细胞充分混合，过滤，得到所述极小胚胎样干细胞，再装入所述第一血袋中，得到所述激活的极小胚胎样干细胞，并排掉所述第一血袋中的气体后于封口机中封口。
进一步的，步骤S4使用孔径为5μm的滤器过滤。
进一步的，将步骤S4所得激活的极小胚胎样干细胞放入流式细胞仪中检测，检测到所述极小胚胎样干细胞的纯度达到91％。
进一步的，将步骤S4所得激活的极小胚胎样干细胞用BrdU抗体进行标记后，通过流式细胞仪检测到BrdU+细胞的比例达到85％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其包括分离人外周血极小胚胎样干细胞和利用血浆裂解物后续激活两部分，通过离心分离出血浆及细胞，通过将血浆进行破碎得到血浆裂解物，通过将细胞过滤得到极小胚胎样干细胞，再通过将极小胚胎样干细胞加入血浆裂解物中，得到激活的极小胚胎样干细胞。本发明的步骤简单，操作方便，其分离得到的极小胚胎样干细胞不仅纯度较高，而且活性较高。
(2)本发明提供的所述分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其分离得到的极小胚胎样干细胞纯度可达到91％，活性可达到85％。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明所述分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法的流程图；
图2为实施例1与对比例1所得极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中的活性测试对比图；
图3为实施例2与对比例1所得极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中的活性测试对比图；
图4为实施例1所得极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中的检测结果图；
图5为实施例1所得极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中的检测结果图；
图6为实施例2所得极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中的检测结果图；
图7为实施例2所得极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中的检测结果图；
图8为对比例2所得极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中的检测结果图；
图9为对比例2所得极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中的检测结果图。
具体实施方式
各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，包括以下步骤：
S1、采集外周血，分离出血浆和细胞，包括以下步骤：
1)用第二血袋从人的肘部头静脉处抽取150mL外周血；
2)将步骤1)所得第二血袋放于生物安全柜中，将外周血均匀分装到3根50mL第一离心管中，并配平后在相对离心力为600g下离心30min；
3)将步骤2)离心得到的血浆分别装入3根50mL第二离心管中，并配平后在相对离心力为2600g下离心15min，分离出血浆和细胞。
S2、将步骤S1所得血浆分别装入3根50mL玻璃管中，并放入加有冰袋的超声清洗仪中破碎45min，得到血浆裂解物；
S3、将步骤S1所得3根第二离心管中的细胞先分别用1mL盐水重悬，然后分别用0.5mL盐水清洗，再分别收集到1.5mL的EP管中，于4℃冷藏保存；
S4、将步骤S2所得的其中2根玻璃管中的血浆裂解物装入倒出抗凝剂的第一血袋中，将剩余一根玻璃管中的血浆裂解物与步骤S3所得细胞混合，并在5μm孔径的滤器中过滤，得到极小胚胎样干细胞，再装入第一血袋中，得到激活的极小胚胎样干细胞，并排掉第一血袋中的气体后于封口机中封口。
将步骤S4所得激活的极小胚胎样干细胞放入流式细胞仪中检测，检测到所述极小胚胎样干细胞的纯度为91％。
将步骤S4所得激活的极小胚胎样干细胞用BrdU抗体进行标记后，通过流式细胞仪检测到BrdU+细胞的比例为85％。
注：血袋为一次性使用塑料血袋，可供采取200mL血，其内装有28mL血液保存液Ⅲ，每1000mL血液保存液Ⅲ含26.3g枸橼酸纳、3.27g枸橼酸、31.9g葡萄糖、0.275g腺嘌呤、2.22g磷酸二氢钠。
实施例2
一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，包括以下步骤：
S1、采集外周血，分离出血浆和细胞，包括以下步骤：
1)用第二血袋从人的肘部头静脉处抽取150mL外周血；
2)将步骤1)所得第二血袋放于生物安全柜中，将外周血均匀分装到3根50mL第一离心管中，并配平后在相对离心力为650g下离心25min；
3)将步骤2)离心得到的血浆分别装入3根50mL第二离心管中，并配平后在相对离心力为2800g下离心10min，分离出血浆和细胞。
S2、将步骤S1所得血浆分别装入3根50mL玻璃管中，并放入加有冰袋的超声清洗仪中破碎40min，得到血浆裂解物；
S3、将步骤S1所得3根第二离心管中的细胞先分别用1mL盐水重悬，然后分别用0.5mL盐水清洗，再分别收集到1.5mL的EP管中，于4℃冷藏保存；
S4、将步骤S2所得的其中2根玻璃管中的血浆裂解物装入倒出抗凝剂的第一血袋中，将剩余一根玻璃管中的血浆裂解物与步骤S3所得细胞混合，并在5μm孔径的滤器中过滤，得到极小胚胎样干细胞，再装入第一血袋中，得到激活的极小胚胎样干细胞，并排掉第一血袋中的气体后于封口机中封口。
将步骤S4所得激活的极小胚胎样干细胞放入流式细胞仪中检测，检测到所述极小胚胎样干细胞的纯度为89％。
将步骤S4所得激活的极小胚胎样干细胞用BrdU抗体进行标记后，通过流式细胞仪检测到BrdU+细胞的比例为83％。
对比例1
一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，包括以下步骤：
S1、采集外周血，分离出细胞，包括以下步骤：
1)用第二血袋从人的肘部头静脉处抽取150mL外周血；
2)将步骤1)所得第二血袋放于生物安全柜中，将外周血均匀分装到3根50mL第一离心管中，并配平后在相对离心力为600g下离心30min；
3)将步骤2)离心得到的血浆分别装入3根50mL第二离心管中，并配平后在相对离心力为2600g下离心15min，分离出细胞。
S2、将步骤S1所得3根第二离心管中的细胞先分别用1mL盐水重悬，然后分别用0.5mL盐水清洗，再分别收集到1.5mL的EP管中，于4℃冷藏保存；
S3、将步骤S2所得细胞在5μm孔径的滤器中过滤，得到极小胚胎样干细胞。
对比例2
现有技术对猪骨髓的极小胚胎样干细胞的分离方法：常规消毒、麻醉后穿刺猪髂后上棘获取骨髓，采用红细胞裂解法：使用红细胞裂解液从猪骨髓从分离出单个核细胞，然后采用免疫磁珠分离法进行分选，得到猪骨髓的极小胚胎样干细胞。
效果试验例1
将实施例1、实施例2制备的激活的极小胚胎样干细胞分别与对比例1制备的未激活的极小胚胎样干细胞进行活性对比，先分别将所得的极小胚胎样干细胞用BrdU-FITC进行标记，再放入流式细胞仪中检测，检测结果如图2、3所示。
根据流式细胞仪的基本原理：101右侧的区域为阳性区域，该区域里是BrdU-FITC标记高表达的细胞，即是有增值能力的活性细胞。
由图2可以看出，实施例1所制得的激活的极小胚胎样干细胞经过BrdU抗体标记后，经过流式细胞仪检测，BrdU+细胞的比例为85％，对比例1所制得的未激活的极小胚胎样干细胞经过BrdU抗体标记后，经过流式细胞仪检测，BrdU+细胞的比例为30％。
由图3可以看出，实施例2所制得的激活的极小胚胎样干细胞经过BrdU抗体标记后，经过流式细胞仪检测，BrdU+细胞的比例为83％，对比例1所制得的未激活的极小胚胎样干细胞经过BrdU抗体标记后，经过流式细胞仪检测，BrdU+细胞的比例为31％。
综上所述，本发明的方法制备得到的极小胚胎样干细胞的活性较高。
效果试验例2
将实施例1、实施例2与对比例2所制备的极小胚胎样干细胞进行纯度对比，先分别将所得极小胚胎样干细胞用带绿光(FITC)的Sca-1抗体、带紫光(APC)的Lin抗体、带红光(PE)的CD45抗体进行标记，再分别放于流式细胞仪中检测，检测结果如图4-9所示。
图4、5为实施例1所制得的极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中检测得到的结果图，因为极小胚胎样干细胞的细胞表型为Sca-1+lin-CD45-，由图中可见，Sca-1表达阳性而CD45表达阴性的细胞占总数的96％，进而Lin也表达阴性的细胞占总数的91％，即实施例1分离得到的极小胚胎样干细胞的纯度为91％。
图6、7为实施例2所制得的极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中检测得到的结果图，因为极小胚胎样干细胞的细胞表型为Sca-1+lin-CD45-，由图中可见，Sca-1表达阳性而CD45表达阴性的细胞占总数的93％，进而Lin也表达阴性的细胞占总数的89％，即实施例2分离得到的极小胚胎样干细胞的纯度为89％。
图8、9为对比例2所制得的极小胚胎样干细胞在流式细胞仪中检测得到的结果图，因为极小胚胎样干细胞的细胞表型为Sca-1+lin-CD45-，由图中可见，Sca-1表达阳性而CD45表达阴性的细胞占总数的38％，进而Lin也表达阴性的细胞占总数的34％，即对比例2分离得到的极小胚胎样干细胞的纯度为34％。
综上所述，本发明的方法分离得到的极小胚胎样干细胞的纯度较高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采集外周血，分离出血浆和细胞；
S2、将步骤S1所得血浆放入超声清洗仪中进行破碎，得到血浆裂解物；
S3、将步骤S1所得细胞进行重悬与清洗，并冷藏保存；
S4、将部分步骤S2所得血浆裂解物装入第一血袋中，将剩余所述血浆裂解物与步骤S3所得细胞混合，过滤，得到极小胚胎样干细胞，再装入所述第一血袋中，得到激活的极小胚胎样干细胞，并排掉所述第一血袋中的气体后密封。
2.根据权利要求1所述的分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：
1)用第二血袋从人的肘部头静脉处抽取150mL外周血；
2)将步骤1)所得第二血袋放于生物安全柜中，将所述外周血均匀分装到3根50mL第一离心管中，并配平后离心；
3)将步骤2)所得血浆分别装入3根50mL第二离心管中，并配平后离心，分离出血浆和细胞。
3.根据权利要求2所述的分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于：步骤2)相对离心力为550-650g，离心时间为25-35min。
4.根据权利要求2所述的分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于：步骤3)相对离心力为2400-2800g，离心时间为10-20min。
5.根据权利要求2所述的分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于，步骤S2包括：将步骤3)所得血浆分别装入3根50mL玻璃管中，并放入加有冰袋的超声清洗仪中破碎40-50min，得到所述血浆裂解物。
6.根据权利要求2所述的分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于，步骤S3包括：将步骤3)所得细胞先分别用1mL盐水重悬，然后分别用0.5mL盐水清洗，再分别收集到1.5mL的EP管中，于2-8℃冷藏保存。
7.根据权利要求5所述的分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于，步骤S4包括：将步骤S2得到的其中2根所述玻璃管中的所述血浆裂解物加入不含抗凝剂的所述第一血袋中，另一根所述玻璃管中的所述血浆裂解物与步骤S3所得细胞充分混合，过滤，得到所述极小胚胎样干细胞，再装入所述第一血袋中，得到所述激活的极小胚胎样干细胞，并排掉所述第一血袋中的气体后于封口机中封口。
8.根据权利要求1～7任一项所述的分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于：步骤S4使用孔径为5μm的滤器过滤。
9.根据权利要求1～7任一项所述的分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于：将步骤S4所得激活的极小胚胎样干细胞放入流式细胞仪中检测，检测到所述极小胚胎样干细胞的纯度达到91％。
10.根据权利要求1～7任一项所述的分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其特征在于：将步骤S4所得激活的极小胚胎样干细胞用BrdU抗体进行标记后，通过流式细胞仪检测到BrdU+细胞的比例达到85％。
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