CN114732833B - 一种含有prp的干细胞生物制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种含有PRP的干细胞生物制剂及其应用。本发明提供的含有PRP的干细胞生物制剂是将富血小板血浆与极小胚胎样干细胞液放入细胞培养袋中培养24h，取出液体，过70目筛网，离心，去除大部分上清液，将试管底部液体与试管底部沉淀充分混悬制成。制备得到的含有富血小板血浆和极小胚胎样干细胞的含有PRP的干细胞生物制剂对慢性肾炎、尿毒症具有较好的治疗效果。

Description

一种含有PRP的干细胞生物制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种含有PRP的干细胞生物制剂及其应用。

背景技术

慢性肾小球肾炎简称为慢性肾炎，慢性肾炎是由各种因素导致肾脏异常而引起的功能性障碍的疾病。通常临床表型为水肿、血尿、蛋白尿等。慢性肾炎病有：糖尿病肾病，肾小管间质疾病，原发性与继发性肾小球炎等，起病因素各不同，随着病情延发，病变加重，导致不同程度肾功能减退，经过长时间拖延，最终将发展为尿毒症。

目前，慢性肾炎的治疗给药主要有环磷酰胺、环孢素、利尿剂等，通过激素利尿剂、抑制免疫介导炎症、减轻肾脏硬化，以延缓肾功能恶化、控制水肿、缓解临床症状目的，但是这些治疗存在着副作用大、疗程长、成本高等副作用，而且肾并无修复功能，治愈率低。因而急需技术人员开发副作用小，疗效强、使用安全的药物，以满足临床需求。

富含血小板的血浆，亦可称为富血小板血浆(Pla telet RichPlasma，PRP)，其是通过离心全血而得到提取出富含高浓度血小板，含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factor，IGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肿瘤转化因子β(tumor transformationfactor-β，TGF-β)等。且各生长因子的比例与体内正常比例相符，使生长因子之间有良好的协同作用，避免了单一生长因子刺激创伤面修复不佳的缺点。

自从上世纪80年代David R.Knighton等人发现血小板细胞能促进血管增生、胶原合成后，人们便致力于将富血小板血浆(PRP)应用于临床，渴望解决修复能力低下的器官组织的损伤修复问题。PRP对患者的损伤小且制作简单，能有效降低医疗成本，促进患者的创面愈合，PRP含有大量纤维蛋白，为修复细胞提供良好的支架，还可以收缩创面，具有促凝血的作用，可刺激软组织再生，促进伤口早期闭合和防止感染

极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells,VSEL，简称Vcell)是一类体积非常小、数量非常少的非造血干细胞，其形态学和细胞标志与胚胎干细胞有相似之处，具有胚胎干细胞多分化潜能特性，可以向包括心肌和血管内皮细胞在内的三个胚层的细胞分化，如血细胞、骨细胞、肌细胞和神经细胞等，且无免疫排异、无伦理问题。极小胚胎样干细胞最先是美国路易斯维尔大学Kucia等人2006年首先发现并命名的，他们从小鼠骨髓单个核细胞发现且成功分离出来，细胞表型为Sca-1+lin-CD45-，随后进一步研究发现人很多组织中同样存在，如骨髓、脐带血、外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等，细胞表型为SSEA-4+/Oct-4+/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45-，直径为4-6μm。但是数量极少，约占总的单个核细胞的0.01％-0.02％，在体外可以被诱导分化成心肌细胞、神经细胞等，在再生医学和临床治疗前景广阔。

因此，研究和开发出一种有效的慢性肾炎的药物制剂仍是目前亟需解决的难点。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明提供一种含有PRP的干细胞生物制剂及其应用，该含有PRP的干细胞生物制剂对慢性肾炎、尿毒症具有较好的治疗效果。

本发明提供了一种含有PRP的干细胞生物制剂，该含有PRP的干细胞生物制剂的制备方法为：

将富血小板血浆与极小胚胎样干细胞液放入细胞培养袋中培养24h，取出液体，过70目筛网，在2500g的条件下离心8～12min，去除大部分上清液，剩试管底部10ml液体，将试管底部液体与试管底部沉淀充分混悬，即得；

所述富血小板血浆与极小胚胎样干细胞液的体积为1:5。

进一步地，所述富血小板血浆和极小胚胎样干细胞液来自患者外周血。

进一步地，所述患者为肾炎患者、慢性肾炎患者或尿毒症患者，抽取患者外周血后在200g条件下离心28～32min。

进一步地，所述富血小板血浆经0.22nm蓝色过滤器过滤得到。

进一步地，所述极小胚胎样干细胞液经5.0nm过滤器过滤得到。

另外，本发明提供了所述的含有PRP的干细胞生物制剂在制备治疗肾炎药物中的用途。

进一步地，本发明提供了所述的含有PRP的干细胞生物制剂在制备治疗慢性肾炎药物中的用途。

进一步地，本发明提供了所述的含有PRP的干细胞生物制剂在制备治疗尿毒症药物中的用途。

自体极小胚胎样干细胞(VSEL)具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控、自我更新、分泌蛋白等特点。发明人在研究自体极小胚胎样干细胞时发现，其可以向包括心肌和血管内皮细胞在内的三个胚层的细胞分化，具备很好肾脏修复作用。而富血小板血浆含有大量的生长因子，大量纤维蛋白，为修复细胞提供良好的支架，还可以收缩创面，具有促凝血的作用，可刺激软组织再生，促进伤口早期闭合和防止感染。

发明人首次提出将富血小板血浆与自体极小胚胎样干细胞联合使用用于治疗慢性肾炎和尿毒症的疾病，意外地发现，富血小板血浆与自体极小胚胎样干细胞具有很好的组织协同修复作用，具体为：可以有效降低患者的尿蛋白、尿潜血、肌酐和尿酸的含量，减轻脸部、踝部等水肿情况，降低疼痛感，二者联合使用可以大大缩短慢性肾炎和尿毒症患者的病程，提高治愈率。

与现有技术相比，本发明提供的含有PRP的干细胞生物制剂对慢性肾炎、尿毒症等症状具有很好的缓解作用，可以极大的减轻患者的痛苦。同时该含有PRP的干细胞生物制剂副作用小，用药周期短，效果显著，是一种较为理想的治疗慢性肾炎、尿毒症的药物制剂。

附图说明：

图1为实施例1步骤S3制得的极小胚胎样干细胞的显微镜图；

图2为实施例1步骤S3制得的极小胚胎样干细胞的流式细胞仪中的检测结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1、一种含有PRP的干细胞生物制剂

S1样品前处理：

抽取确诊为慢性肾炎的患者外周血100ml，用15ml离心管均分成12管，接着将12管血在200g条件下离心30min；

S2富血小板血浆制备：

取4管经步骤S1离心后的外周血，抽出上清血浆，避免混入下层的红细胞，平均放置于2个15ml试管中，接着在2500g的条件下离心15min，丢弃上清液，剩试管底部3ml液体，将试管底层的沉淀与剩余的3ml液体充分振荡混匀，加入另一个15ml试管中，放置在37℃的超声仪中作用30min，接着再将上述试管在2000g的条件下离心10min，用10ml注射器将试管中的6ml上清液吸出，丢弃沉淀，即得；

S3极小胚胎样干细胞液制备：

取8管经步骤S1离心后的外周血，抽出上清血浆，避免混入下层的红细胞，平均放置于一个50ml离心管中，接着在800g的条件下离心15min，将上清血浆吸出，置于另一个50ml离心管，避免吸入底部的沉淀，用5.0纳米过滤器将上述上清血浆过滤进另一个50ml离心管中，所得的上清液里蕴含极小胚胎样干细胞；

S4混合培养处理：

将步骤S2抽出的6ml上清液，使用0.22纳米过滤器过滤，得过滤液I，取步骤S3经5.0纳米过滤器过滤后的滤液30ml与过滤液I混匀，接着将混合后的液体注射进入细胞培养袋中培养24h，取出液体过70目筛网过滤，接着在2500g的条件下离心10min离心，去除所不需要的上清液，剩底部10ml液体，将试管底部沉淀和底部10ml液体充分混悬，即得。

试验例一、极小胚胎样干细胞检测

1、试验方法：

分别取实施例1步骤S3制得的极小胚胎样干细胞液放于显微镜和流式细胞仪中进行观察。

2、试验结果：

试验结果如图1和图2所示，其中：图1为实施例1步骤S3制得的极小胚胎样干细胞的显微镜图，图2为实施例1步骤S3制得的极小胚胎样干细胞的流式细胞仪中的检测结果图。采用流式细胞仪检测CD45-PE,由图可见通过初选，CD45–PE细胞为非淋巴细胞，占全部激活后细胞的96％，进而Lin-APC也表达阴性的细胞占总数的91％，即极小胚胎样干细胞纯度为91％。

试验例二、含有PRP的干细胞生物制剂效果试验

1、试验方法：

从广东省实验动物中心采购已建好尿毒症模型大鼠80只，随机分为4组，每组20组，分别命名为实施例1组，对比例1组，对比例2组和对照组，各组的给药方式如下：

对照组：注射等体积的生理盐水；

实施例1组：尾静脉注射实施例1制得的含有PRP的干细胞生物制剂0.3mL/kg；

对比例1组：尾静脉注射实施例1中步骤S2制得的富血小板血浆液0.3mL/kg；

对比例2组：尾静脉注射实施例1中步骤S3制得的极小胚胎样干细胞液0.3mL/kg；

所有大鼠在光照时间为12h，室温24℃，湿度60％同级环境中饲养4周，一周注射一次药物，4周后检测尿毒症模型大鼠的相关指标。

2、试验结果：

试验结果如表1所示。

表1含有PRP的干细胞生物制剂效果试验数据

	对照组	实施例1组	对比例1组	对比例2组
					尿素氮(umol/L)	75.31±20.41	5.02±0.65	70.24±18.22	40.43±15.16
肌酐(umol/L)	301±45.32	40.26±9.21	289±40.15	150±29.85
					尿蛋白(umol/L)	75.32±18.64	8.37±1.45	66.30±15.87	42.45±15.03
ALB(g/L)	20.22±5.21	34.13±5.01	23.56±4.93	27.53±4.75
					TP(g/L)	57.61±12.66	79.12±7.43	60.32±10.65	64.67±9.21
TG(g/L)	7.01±1.31	1.56±0.37	6.26±1.09	5.34±0.89
					CHOL(mmol/L)	5.54±0.26	1.93±0.14	4.03±0.30	3.55±0.26
Cys-c(mg/L)	0.96±0.18	0.25±0.01	0.79±0.09	0.50±0.06
					P(mmol/L)	3.43±1.23	2.60±0.16	3.26±1.04	3.01±1.02
Ca(mmol/L)	2.18±0.15	2.54±0.16	2.32±0.18	2.48±0.18
					GFR(ml/min)	95.14±21.42	366.84±16.24	112.15±19.87	200.08±18.44

由表1可知，本发明制得的含有PRP的干细胞生物制剂可以有效地治疗肾功能损伤，对大鼠血Cys-c、P、Ca、肾小球滤过率功能具有明显改善作用，还可以降低了尿蛋白、尿潜血、肌酐和尿酸的含量，改善血清白蛋白、总蛋白、甘油三酯、胆固醇含量情况。而对比例1和对比例2组的治疗效果均明显下降，说明本发明将PRP与极小胚胎样干细胞联合使用相互协同增强其治疗肾功能损伤的作用。

试验例三、临床试验

1、试验方法：

选取5名确诊的慢性肾炎的自愿者患者进行测定，具体信息如表2所示：

表2自愿者信息

让上述自愿者使用实施例1制得的含有PRP的干细胞生物制剂，治疗方式为穴位直接注射实施例1制得的含有PRP的干细胞生物制剂进人体，具体穴位注射操作为：一次注射水分、气海、三焦俞、足三里、肾俞和阴陵泉6个穴位，其中三焦俞、足三里、肾俞和阴陵泉，每个穴位分为左右两个，即一次注射10个穴位，每个穴位0.5mL，一次需注射5mL，7天一次，连续注射3个月后，检测自愿者的症状情况。

2、试验结果：

3个月后，自愿者A、自愿者B、自愿者C、自愿者D和自愿者E的所有症状恢复良好，检查范围全部都正常，停药半年，复查无异常，具体数据如表3所示。

表3治疗前后临床数据对比

由表3可知，本发明制得的含有富血小板血浆和极小胚胎样干细胞的含有PRP的干细胞生物制剂可以有效降低患者的尿蛋白、尿潜血、肌酐和尿酸的含量，减轻脸部、踝部等水肿情况，降低疼痛感，二者联合使用可以大大缩短慢性肾炎和尿毒症患者的病程，提高治愈率。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.一种含有PRP的干细胞生物制剂，其特征在于，该含有PRP的干细胞生物制剂的制备方法为：

将富血小板血浆与极小胚胎样干细胞液放入细胞培养袋中培养24h，取出液体，过70目筛网，在2500g的条件下离心8~12min，去除大部分上清液，剩试管底部10ml液体，将试管底部液体与试管底部沉淀充分混悬，即得；

所述富血小板血浆与极小胚胎样干细胞液的体积为1:5。

2.如权利要求1所述的含有PRP的干细胞生物制剂，其特征在于，所述富血小板血浆和极小胚胎样干细胞液来自患者外周血。

3.如权利要求1所述的含有PRP的干细胞生物制剂，其特征在于，所述富血小板血浆经0.22nm蓝色过滤器过滤得到。

4.如权利要求1所述的含有PRP的干细胞生物制剂，其特征在于，所述极小胚胎样干细胞液经5.0nm过滤器过滤得到。

5.如权利要求1~4任一所述的含有PRP的干细胞生物制剂在制备治疗肾炎药物中的用途。

6.如权利要求1~4任一所述的含有PRP的干细胞生物制剂在制备治疗慢性肾炎药物中的用途。

7.如权利要求1~4任一所述的含有PRP的干细胞生物制剂在制备治疗尿毒症药物中的用途。