TW202220678A - 幹細胞製劑透過對腎俞穴投藥用於治療腎臟疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種幹細胞製劑用於治療腎臟疾病的用途，其中該腎臟疾病是藉由對一帶有腎臟疾病的個體的一腎俞穴(BL23)穴位投藥該幹細胞製劑而被治療。

Description

幹細胞製劑透過對腎俞穴投藥用於治療腎臟疾病的用途

本發明是有關於一種幹細胞製劑透過對腎俞穴投藥用於治療腎臟疾病的用途。

臨床常見的腎臟疾病包括急性或慢性腎絲球炎、腎結石、急性或慢性腎衰竭、尿毒症、腎病症候群(起因多為原發性腎絲球炎、紅斑狼瘡等免疫疾病、糖尿型腎病等)。當腎臟無法行使正常功能時，會導致廢物(毒素)及水份堆積在體內，可能造成腎小管擴張、腎小球硬化、蛋白尿，甚至腎臟間質纖維化，最後引發腎衰竭。急性腎衰竭(acute kidney injury, AKI; acute renal failure, ARF)起因為腎血流量的減少(腎缺血(ischemia))、暴露於對腎有害的物質(nephrotoxicity)、腎發炎的過程或阻塞尿流量的尿路阻礙，常在7天內腎臟突然失去正常功能。慢性腎衰竭(chronic kidney disease, CKD)則是腎臟受損超過三個月，腎功能緩慢與漸進性的損壞呈進行性惡化；患者需要接受飲食控制、藥物治療，嚴重者需使用替代性療法來取代腎臟的功能，例如腎臟移植、血液透析等。

目前急性腎臟損傷的治療方法為進行血液透析(hemodialysis)、腎臟替換療法(renal replacement therapy)或是支持性療法為主，但都會大量耗費醫療資源，也無法對腎臟損傷進行有效的治療，因此這方面的研究，都導向以脂肪幹細胞或其他種類的幹細胞為基礎的新治療方式；但已經有研究指出若單獨使用幹細胞作為治療材料，可能會因為腎臟在受損後會產生強烈的免疫反應(immune response)、氧化壓力(oxidative stress)及細胞凋亡(apoptosis)的情形，導致幹細胞進入後無法有效的進行治療，如何改善此窘境成為近幾年來研究的焦點。

為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出新穎且更有效治療腎臟疾病而不會產生前述缺點的醫藥品以造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明之目的為提供一種幹細胞製劑用於製備一治療腎臟疾病之醫藥品的用途，其中該腎臟疾病是藉由對一帶有腎臟疾病的個體的一腎俞穴(BL23)穴位投藥該幹細胞製劑而被治療。

在本發明的一實施例中，該腎臟疾病是急性腎臟損傷。

在本發明的一實施例中，該幹細胞製劑包含一選自於下列所組成之群組中的組分：一幹細胞、一血小板濃縮物，及其組合。

在本發明的一實施例中，該幹細胞為胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞。

在本發明的一實施例中，該成體幹細胞是選自於下列所組成的群組：一臍帶血幹細胞、一周邊血幹細胞、一神經幹細胞、一表皮幹細胞、一肌肉幹細胞、一眼角膜幹細胞、一肝臟幹細胞、一腸上皮幹細胞、一脂肪間葉幹細胞(adipose-derived stem cell, ADSC)、一骨髓間葉幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cell)，及其組合。

在本發明的一實施例中，該血小板濃縮物是一富血小板纖維蛋白釋放液(platelet rich fibrin releasate, PRFr)。

在本發明的一實施例中，該脂肪間葉幹細胞的濃度為至少10 ⁶細胞/mL。

在本發明的一實施例中，該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。

在本發明的一實施例中，該急性腎臟損傷為因任何病因導致腎血流量之減少(腎缺血(ischemia))、暴露於對腎有害之物質(nephrotoxicity)、腎發炎之過程，或阻塞尿流量之尿路阻礙。

在本發明的一實施例中，該帶有腎臟疾病的個體為一帶有腎臟疾病的哺乳類動物。

綜上所述，本發明幹細胞製劑的功效在於：以腎俞穴(BL23)穴位注射本發明之幹細胞製劑可用於修復受損的腎臟細胞並降低血清肌酸酐(creatinine, CRE)及尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)值，為腎臟疾病(特別是腎臟損傷)的治療提供了一種新穎的潛在治療方案。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

依據本發明，用語“脂肪間葉幹細胞(adipose-derived stem cell, ADSC)”是從脂肪中分離出的一種間葉幹細胞，屬於多潛能幹細胞(multipotent stem cell)，具有高可塑性(plasticity)，經過誘導後可以分化成很多不同組織的細胞。

依據WHO於西元1993年公佈的標準針灸經穴名稱(standard acupuncture nomenclature)，腎俞穴之標準定位編號(國際代碼)為BL23。

如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指緩解(alleviating)、減少(reducing)、改善(ameliorating)、減輕(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明的醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明的醫藥品可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥學上可接受的載劑。例如，該醫藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。

台灣社會傳統觀念認為有腎臟病就應該要避免吃中藥，其來源已難考據，但這種觀念卻使得中醫難以介入腎臟疾病的照護。2015年當時台灣腎臟病醫學會主委、高醫附醫黃尚志主任在國際知名腎臟醫學期刊Kidney International發表健保資料庫分析結果，其內容指出經過提煉濃縮的科學中藥對腎臟疾病是有幫助的，甚至某些科學中藥對腎臟具有保護作用(Lin MY, Chiu YW, Chang JS, Lin HL, Lee CT, Chiu GF, Kuo MC, Wu MT, Chen HC, Hwang SJ. Kidney Int. 2015;88(6):1365-1373)。在台灣中醫介入腎病照護早有先例，北榮臨床毒物與職業醫學科楊振昌主任分析健保資料庫發現服用中醫師處方中藥的腎臟病患者能減少四成死亡率，此結果在2014年發表於世界權威醫學期刊BMJ (Hsieh CF, Huang SL, Chen CL, Chen WT, Chang HC, Yang CC. Non- aristolochic acid prescribed Chinese herbal medicines and the risk of mortality in patients with chronic kidney disease: Results from a population-based follow-up study. BMJ Open. 2014;4(2):e004033)，顯示西醫與中醫聯手治療慢性腎臟疾病的確能有效改善病友的相關症狀，甚至降低死亡率。現代醫學對腎臟疾病病理機轉與疾病發展過程有相當詳細的資料，民眾逐漸瞭解原來腎臟疾病是可以透過中醫藥照護而獲得改善。此外，基於穴位療法(acupoint therapy)是中國傳統醫學循經取穴的一種治療方式，包括針灸、電、藥灸及穴位注射等，此類輔助療法亦可改善腎功能與慢性腎病的臨床症狀。

慢性腎臟疾病是造成心血管疾病的危險因素。近幾年幹細胞相關研究蓬勃發展，科學家成功在體外培養多功能幹細胞，期待這些細胞能分化成各種的組織和器官，進而能修復人體中壞掉的部分。間葉幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)代表了重要的基質細胞群，具有體外自我更新及多能分化的能力，骨髓間葉幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)特色為侵入式取得，穿刺部位有疼痛、感染及出血等副作用，可在體外培養增殖，但生長緩慢，產量低。脂肪來源的脂肪間葉幹細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是用於各種治療目的具吸引力的自體細胞來源，可使用常規吸脂術從皮下脂肪組織中收集，易於分離，來源相對豐富，無爭議性以及可於體外培養增殖。ADSCs及BMSCs细胞表型相似且產量及增殖速率均高於BMSCs，ADSCs分泌具有營養旁分泌(paracrine)作用的多種細胞因子和生長因子，可以介導並刺激組織修復及再生。目前仍有些挑戰需要克服，即使能在體外培養幹細胞，但是在誘導這些幹細胞分化的過程中，沒辦法產生完整功能的組織，有些組織需要立體空間的結構，有些需要分泌的功能，倘若能找到誘導幹細胞能分化成結構正確以及功能正常的組織，便能移植到體內解決疾病的問題。

此外，用於局部浸潤的血小板濃縮物(包括富含血小板的血漿(platetet-rich plasma, PRP)及富含血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin, PRF))已經在大多數醫學領域中用作外科手術佐劑或再生醫學製劑，特別是在整形外科、心血管外科、手術重建、運動醫學、牙科及口腔植體。這個概念是在我們的血液中有生長因子、癒合蛋白、細胞信號及免疫細胞，它們是正常癒合過程的一部分，可以被濃縮並應用或注射到傷口或手術部位以潛在地增強癒合。PRP包含關鍵的生長因子及介質，在組織再生的過程中顯示可增強幹細胞的增殖、遷移及分化，已被確認為可用於組織再生的生物材料。ADSCs與PRP移植結合具有多種功效，可促進組織再生。另一種濃縮血小板的製劑稱為富含血小板纖維蛋白(PRF)，因纖維蛋白凝膠的聚合作用在凝塊中聚集血小板並釋放細胞因子。據此，纖維蛋白凝塊中的生長因子參與血小板和纖維蛋白的聚合過程中並隨時間逐漸釋放。而PRF凝塊被擠壓以提取釋放的PRF (以凝塊表現的血清滲出物)則稱為PRF釋放物或釋放液(即富血小板纖維蛋白釋放液(platelet rich fibrin releasate, PRFr))，富含血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、表皮生長因子(epithelial growth factor, EGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor, IGF)、纖維細胞生長因子(fibroblastgrowth factor, FGF)、神經生長因子(nerve growth factor, NGF)等生長因子、白血球、脂質以及蛋白質如玻連蛋白及纖維連接蛋白。該滲出物可用於水合移植物材料，會透過引起細胞轉化促進細胞增殖、增加基質形成、骨質生成、膠原蛋白的合成，刺激肉芽形成，血管生成及誘導細胞分化來加速傷口癒合和組織再生，從而導致壞死組織的消除。PRF釋放物(PRFr)是富含生長因子的上清液，通過靜止及離心過程與PRF凝膠分離。基於許多體外測試表明PRF在生長因子釋放方面優於PRP，因此PRFr的使用似乎是一種更有前途的方法來刺激與細胞相關的活性。

針灸治療慢性腎病透過行氣調血調理腎功能促進腎病恢復。腎俞為膀胱經的背部俞穴，針刺此穴能調暢腎臟氣機用以治療腎臟相關疾病。Zhang等人提出電針腎俞穴可能透過降低腎組織

-鏈蛋白(

-catenin)的表達，抑制Wnt/

-鏈蛋白信號通路的信號轉導，抑制慢性腎衰竭(chronic kidney disease, CKD)病程進展，進而恢復腎功能。

再生醫學是利用健康細胞來修復、取代已受損或壞死的細胞，以及因疾病、外傷而受損的組織或器官。幹細胞(stem cell)具備自我增生並可分化成一到數種細胞潛能的特性，而高濃度富含血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)因富含生長因子與細胞激素，具有刺激細胞再生及組織恢復的功能。近年來，幹細胞技術是當前最受矚目也最具發展潛力的醫療技術。本發明以脂肪間葉幹細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)具備自我增生及可分化成一到數種細胞潛能的特性，並利用高濃度PRFr富含生長因子與細胞激素，如PDGF、TGF、VEGF、EGF、IGF、FGF、NGF等，具有刺激細胞再生與組織恢復等功能，成功建立以PRFr結合幹細胞製劑，開發以注射的方式導入ADSCs與PRFr，治療由缺血後再灌流(ischemia reperfusion, IR)引起的急性腎臟損傷，模擬因血流動力學改變引起的腎功能變化誘發動物急性腎衰竭模式，刺激細胞再生與組織恢復能力、減緩急性腎臟損傷的惡化並改善因急性腎臟損傷所造成的腎功能異常，藉由檢驗血清中肌酸酐(creatinine, CRE)以及尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)濃度與組織學作為評估療效之依據，提供幹細胞創新治療方式的另一項選擇。

本發明利用幹細胞及生長因子的協同作用穴選腎俞穴(BL23)，對缺血後再灌流造成之紐西蘭白兔急性腎損傷注射ADSCs及/或PRFr，期望能對腎臟疾病導致功能衰竭帶來治療新契機。

在當前的腎損傷研究中，本發明為第一份以BL23穴位治療方式進行ADSCs與PRFr對急性腎臟損傷發揮治療作用的研究。基於ADSCs具備自我增生及可分化成一到數種細胞潛能的特性，併合PRFr富含生長因子與細胞激素，作為幹細胞的載體，建立以中國傳統醫學涉及穴位及經絡的治療方式提供腎損傷模型幹細胞治療之新選擇，可克服多能幹細胞移導移植的侷限性與手術風險，相較於PRP能釋放更多之生長因子刺激與細胞相關的活性。

在本發明中，使用典型的方法取得脂肪間葉幹細胞(ADSCs)，並在用於實驗之前將ADSCs細胞培養了四代。光學顯微鏡顯示這些細胞具有典型的紡錘形形態，並用CMFDA (5-氯甲基螢光素二乙酸酯(5-chloromethylfluorescein diacetate))很好地標記。自腎俞穴(BL23)注射PRFr及ADSCs細胞移植到受傷的腎臟，這種募集增強微血管及腎小管的修復，從而改善腎功能，增加生存率，促進實質細胞的增殖，旁分泌及內分泌效應可能有助於保護腎臟。Gharaibeh等人亦提出植入幹細胞的最後分化能力不是細胞再生潛能的主要決定因素，而移植細胞所賦予的旁分泌作用在再生過程中起著更大的作用(Gharaibeh B, Lavasani M, Cummins JH, Huard J. Terminal differentiation is not a major determinant for the success of stem cell therapy-cross-talk between muscle-derived stem cells and host cells. Stem Cell Res Ther. 2011;2:31)。Xing等人亦指出間葉幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的作用可能基於幹細胞的多能能力包括旁分泌因子分泌增加，血管生成和抗炎活性提高以及抗凋亡作用所致(Xing L, Cui R, Peng L, Ma J, Chen X, Xie RJ, Li B. Mesenchymal stem cells, not conditioned medium, contribute to kidney repair after ischemia-reperfusion injury. Stem Cell Res Ther. 2014;5(4):101)。觀察腎損傷造模後1週血清CRE及BUN值急遽升高，治療組PRFr+ADSCs的CRE及BUN值自移植的第二週即顯著降低( p＜ 0.01)，經過7週的治療，修復腎功能效果依序為PRFr+ADSCs最佳，優於單獨使用ADSCs ( p＜ 0.01)，以及單獨使用PRFr ( p＜ 0.05)。觀察PRFr+ADSCs治療組修復之組織學切片，腎小球形態趨完整，腎小管上皮細胞無水腫及空泡樣改變，周圍無明顯的炎性細胞，腎小管腔內無管型阻塞。以兔急性腎損傷缺血後再灌流模式，幹細胞穴位療法可顯著修復受損的細胞，其中以PRFr+ADSCs之效果最為顯著。

以下實施例的統計方法如下：使用SPSS statistics 21統計分析，數據以平均值±標準差表示。損傷恢復評估、血清及尿液檢測等，採用學生 t-檢定(Student’s t-test)對各組之間進行比較， p＜ 0.05具統計學差異， p＜ 0.01代表極顯著差異。

圖1為人體穴位示意圖，其中腎俞穴靠近腎臟位置，是腎氣注輸之處。取穴：第二腰椎棘突下，左右旁開1.5寸。肚臍水平線與脊柱相交椎體處，脊突下緣旁開2橫指處。

以下實施例使用紐西蘭白兔，以缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)方式建立腎衰竭的動物模型。經麻醉後以手術切口在側腹中暴露出腎臟，利用前端套有塑膠細導管的止血鉗將腎動脈夾住45分鐘後鬆開，再將傷口縫合。選穴的治療方案：兔的腎俞穴BL 23 (如圖2A及圖2B)，以ADSCs混合PRFr進行多次注射。此外，若以人為例，腎俞穴為第2腰椎棘突下，左右各1.5寸。

以下實施例選用的實驗動物如下：台灣大學實驗動物照護與使用委員會批准了動物實驗方案和手術的程序(NTU105-EL-00065)。共使用27隻紐西蘭白兔(10週齡，體重約2 kg/隻)。所有實驗均按照國際實驗動物科學理事會關於實驗動物的護理及使用準則進行。在一實施例中，實驗動物也可為其他哺乳類動物，例如人類及大鼠，本發明並無限制。

在以下實施例中，選用脂肪間葉幹細胞(adipose-derived stem cell, ADSC)作為幹細胞的例示說明。在一實施例中，幹細胞也可為胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞，其中成體幹細胞可選自於下列所組成的群組：一臍帶血幹細胞、一周邊血幹細胞、一神經幹細胞、一表皮幹細胞、一肌肉幹細胞、一眼角膜幹細胞、一肝臟幹細胞、一腸上皮幹細胞、一骨髓間葉幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cell)，及其組合。

在以下實施例中，選用急性腎臟損傷動物模型作為腎臟疾病的例示說明，急性腎臟損傷可為因任何病因導致腎血流量之減少(腎缺血(ischemia))、暴露於對腎有害之物質(nephrotoxicity)、腎發炎之過程，或阻塞尿流量之尿路阻礙。在一實施例中，腎臟疾病也可為其他病因所引起的腎臟疾病。 實施例 1. 脂肪間葉幹細胞 (adipose-derived stem cells, ADSCs) 的分離、培養、鑑定及特性分析

ADSCs取自紐西蘭白兔的雙側腹股溝脂肪，先用磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌、剪碎，將細胞外基質以0.2%第一型膠原蛋白酶(C-0130,Sigma-AldrichCo., USA)消化(37°C，30分鐘)，經100

m膜過濾及離心，獲得基質血管片段(stromal vascular fraction, SVF)。將沉澱懸浮於DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, 119995-092, Gibco)含10%胎牛血清(FBS, 26140-079, Gibco)及1%青黴素-鏈黴素(penicillin-streptavidin, 15140-122, Gibco)，於37°C 5% CO ₂進行細胞培養，每兩日更換一次培養基。為富集ADSCs，以CD-90進行細胞選擇，將第二代ADSCs與小鼠-抗兔CD90-FITC (fluorescein isothiocyanate)單株抗體(MA1-80648，CD90 / Thy-1monoclonal antibody, Thermo)在冰上作用15分鐘。洗滌並離心後，使用流式細胞儀(FACS Aria,Becton Dickinson)分選細胞。收集並擴增CD90陽性細胞，後續實驗將使用第4至5代細胞。當細胞培養量達到60~70%，收集細胞並與二抗在4ºC下作用30分鐘，再以PBS含2%FBS洗滌兩次。所有細胞分選及分析實驗均在FACS上進行；鑑定CD31 (ab9498, Abcam)、CD44 (ab119335, Abcam)、CD45 (MCA808GA, Bio-Rad)及CD90 (554895, BD Biosciences)的細胞表面標記。ADSCs對CD44及CD90呈陽性，對CD31及CD45呈陰性。

關於ADSCs的特性顯示於圖3A至圖3C，其中圖3A顯示初代培養的ADSCs，放大倍率為100x (左圖)及200x (右圖)。圖3B顯示經流式細胞儀分析，ADSCs具有CD44+CD90+CD31-CD45-的表型。圖3C顯示繼代培養的ADSCs，放大倍率為100x (左圖)及200x (右圖)。ADSCs經培養增殖，初代培養的細胞樣形態呈紡錘外貌，如圖3A所示，經流式細胞儀分析，在P2 ADSCs中鑑定出CD44 + CD90 + CD34-CD45-細胞表面標誌物的表型，如圖3B所示。純化後繼代培養的ADSCs如圖3C所示。 實施例 2. 富血小板纖維蛋白釋放液 (platelet rich fibrin releasate, PRFr) 的製備

PRFr的製備流程如下。抽血前先將兔子施以肌肉注射唑拉西泮(Zolazepam)(一種鎮靜劑)(12.5 mg/kg, Zoletil ^®50, Virbac Laboratories, France)及鹽酸二甲苯胺噻嗪(Xylazine)(一種動物專用鎮靜、鎮痛、麻醉及肌肉鬆弛劑)(10 mg/kg, Balanzine, Health-Tech Pharmaceutical Co, Taiwan)混合液(1：1)，劑量0.25 ml/kg進行全身麻醉。將頸部附近的兔毛剃除乾淨並充分消毒，自右頸靜脈抽取每管6 mL血液，收集在帶有凝膠與凝塊促進劑採血管(367988，BDVacutainer ^®SST™)中。將真空採血管緩慢旋轉30秒，然後使用實驗室離心機以3000 rpm (1066 g)的速度離心10分鐘，將形成的果凍狀黃色膠狀物PRF與凝膠凝塊分離。離心後，在上層透明黃色血清層取出纖維蛋白凝塊(PRF)，以鑷子將PRF凝塊轉移到15 mL無菌離心管中，使果凍狀PRF靜置至少5小時。將PRF在5,000 rpm (2,962 g)下離心10分鐘後，將上清液富血小板纖維蛋白釋放液(PRFr)收集在無菌小瓶中，並保存在-20°C下直至手術期間使用。所有準備及遞送步驟均在標準消毒程序下進行。通常，1 mL全血產生約0.2 mL的PRFr。 實施例 3. 穴位注射螢光標記 ADSCs 之追蹤

首先，幹細胞之螢光標記的實驗流程如下。螢光染料可用於標記細胞並追蹤細胞的移動，為追蹤穴位注射後的脂肪間葉幹細胞(ADSCs)，取2

10 ⁶細胞/ml ADSCs並在10

M細胞螢光追蹤探針CellTracker™ Green CMFDA (5-氯甲基螢光素二乙酸酯(5-chloromethylfluorescein diacetate), C7025, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)中於37°C標記30分鐘。進一步離心後，將細胞重懸於PBS中並保持在冰上直至輸注(infusion)。

接著，將兔子施以肌肉注射唑拉西泮(12.5 mg/kg, Zoletil ^®50)及鹽酸二甲苯胺噻嗪(10 mg/kg, Balanzine)混合液(1：1)，劑量0.25 ml/kg進行全身麻醉。將腎俞穴(BL23)部位兔毛剃除並充分消毒，注射0.5 ml標記有5-氯甲基螢光素二乙酸酯(CMFDA)的ADSCs (2

10 ⁶細胞/ml)(參見圖4)。並於BL23穴位注射24小時後，透過過量靜脈注射治得舒靜脈注射液(Citosol)(Shinlin Sinseng Pharmaceutical Co Ltd, Taiwan)犧牲取腎臟組織進行冷凍切片，切片再做DAPI (藍色，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole), D9542, Sigma-Aldrich)染色標示細胞核。進一步於螢光顯微鏡(Axiovert 40 CFLMicroscope, Carl Zeiss, Germany)觀察，螢光細胞是否由穴位進入腎臟組織。

用CellTracker™Green CMFDA染色的ADSCs呈紡錘形，如圖5A所示。實驗大白兔(n =3)接受腎俞穴注射具螢光標記CMFDA的ADSCs (1

10 ⁶細胞)，分別於4、24、48小時後犧牲，取左腎臟組織進行冷凍切片，以雷射掃描共軛焦顯微鏡(TCS SP5 II confocal microscope, Wetzlar, Germany)擷取螢光影像，CMFDA綠色用以標示及定位ADSCs幹細胞。圖5B為注射CMFDA-ADSCs之三組實驗兔的腎臟切片，注射時間與綠螢光留置之細胞呈正相關，48小時有較多的綠色螢光表現，代表腎俞穴注射CMFDA-ADSCs確實可達腎臟組織。 實施例 4. 穴位注射 ADSCs 及 / 或 PRFr 對帶有腎臟疾病之實驗動物的腎功能的影響

首先，建立缺血後再灌流引起急性腎臟損傷兔子模型(renal ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) rabbit models)。將紐西蘭白兔(10週齡，體重約2公斤)施以肌肉注射唑拉西泮(12.5 mg/kg, Zoletil ^®50)及鹽酸二甲苯胺噻嗪(10 mg/kg, Balanzine)混合液(1：1)，劑量0.25 ml/kg進行全身麻醉。腹部剃毛消毒後，以解剖刀自兔的腹部從中間白線切開皮膚及腹膜，將腎臟曝露出來。找到腎動脈後，利用前端套有塑膠細導管的止血鉗將其夾住45分鐘後鬆開(參見圖6)，再以3個零之縫線(Vicryl 3.0, Ethicon Inc., Somerville, NJ, USA)將傷口縫合，最後將腹部皮膚缺口以間斷縫法將皮膚缺口閉合，擦上碘酒並包紮傷口，即完成兔急性腎臟損傷手術。

目前臨床常用AKI診斷標準由改善全球腎臟病預後組織(Kidney Disease: Improving Global Outcomes, KDIGO)制訂，認為符合以下情況之一者即可診斷為AKI，(1) 48小時後血清肌酸酐值增加

0.3 mg/dL；(2)發病前7天血清肌酸酐值增加

1.5倍；(3)尿量

0.5 ml/kg/h，持續6小時以上。由於既往文獻中未提出兔急性腎臟損傷的診斷標準，基於物種不同無法直接引用，本發明採用KDIGO標準(1) 48小時肌酸酐值增加

0.3 mg/dL及(2)建立急性腎臟損傷模式1週，血清肌酸酐值平均值增加7倍，認定成功建立兔急性腎臟損傷模式。

接著，觀察穴位注射ADSCs及/或PRFr治療急性腎臟損傷的效果。24隻急性腎臟損傷紐西蘭白兔隨機分為4組，分別為對照組(control)(PBS, 0.5 mL)、治療組PRFr (0.5 mL)、ADSCs (2

10 ⁶細胞/PBS, 0.5 mL)及PRFr+ADSCs (2

10 ⁶細胞/PRFr, 0.5 mL)。於術後一週後開始施打，連續4週，每週一次接受BL23穴位注射(第二腰椎左右各一吋之位置)，之後再持續觀察其生理狀況至術後7週。

之後，進行血清肌酸酐(creatinine, CRE)及尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)生化分析。每週穴位注射前先自兔的耳動脈採血，檢視血清中CRE以及BUN濃度，以了解治療的成效。將兔子保定，酒精棉消毒兔耳背，以肝素(heparin)潤洗過的24G翼狀針(Meditop top scalp vein set)於耳動脈平行下針，輕拍下針處幫助血液流出，待血液流出後，以15 mL離心管(含10%肝素)盛裝2 mL。採集到的血液經3,000 rpm離心10分鐘後，收集血清保存於-80 °C待測。將收集好的血清以全自動生化分析儀(Johnson & Johnson Vitros 350 Chemistry Analyzer, CA, USA)分析CRE及BUN含量。

檢測尿素氮(BUN)及肌酸酐(CRE)可知腎臟過濾機能的好壞，是評估腎功能的指標。血液中的尿素所含的氮，就稱為尿素氮，是在體內當作能源使用的蛋白質殘渣，在生理學上和尿素一樣。尿素氮在腎臟的絲球體這個器官過濾後排泄到尿中，如果腎臟的排泄機能變差，血液中尿素氮的濃度會增加。因此，尿素氮就成為瞭解腎臟機能是否正常的重要指標。肌酸酐是肌肉中肌酸(creatine)代謝後的產物釋放到血液中，當腎損傷初期，腎絲球過濾肌酸酐的能力雖然受損，但是腎小管還有主動分泌排出肌酸酐的能力，所以腎病變初期血中肌酸酐不會立即升高，當肌酸酐值超過正常範圍時，腎功能已經下降一半以上了，因此只看肌酸酐數值並不能早期反應腎功能的變化。兔子生理學BUN參考值為17.0~23.5 mg/dL，CRE參考值為0.8~1.8 mg/dL (摘自The biology and medicine of rabbits and rodents，1983，僅提供參考，不代表任一族群之正常值)。本發明術前24隻實驗兔之平均BUN為12.8

2.0 mg/dL，平均CRE為0.6

0.2 mg/dL。表1及表2為急性腎臟損傷紐西蘭白兔(n = 24)經隨機分配於四組，對照組不進行治療，治療組以穴位注射PRFr、ADSCs及PRFr+ADSCs，經四次注射共7週療程之BUN (參見表1)及CRE (參見表2)變化值。圖7A (BUN趨勢)及圖7B (CRE趨勢)顯示在1~7週的療程中間，單獨使用ADSCs的治療效果較單獨使用PRFr效果佳；PRFr+ADSCs修復腎臟功能的能力又明顯較單獨使用ADSCs優異。PRFr治療組對對照組的BUN及CRE降幅均有顯著差異( p＜ 0.05)，ADSCs及PRFr+ADSCs組與對照組相較具極顯著差異( p＜ 0.01)，治療效果顯著。 表1

治療週數	平均尿素氮(BUN)值(mg/dL)(n=6)
對照組	PRFr	ADSCs	PRFr+ADSCs
0	13.2  2.4	12.8  0.8	11.7  1.5	13.5  2.7
1	43.3  5.0	43.3  4.5	44.2  7.2	46.0  6.4
2	44.5  4.5	43.8  6.8	44.8  7.9	30.5  3.8
3	48.8  7.1	45.2  6.5	43.5  6.6	24.3  3.5
4	51.5  5.1	44.8  4.9	34.5  9.1	18.0  3.1
5	47.5  4.0	41.8  3.8	27.2  7.1	16.2  2.1
6	41.2  5.2	37.2  6.8	26.8  6.3	17.5  1.4
7	39.0  8.5	35.0  9.7	28.2  5.8	16.5  2.3

表2

治療週數	平均肌酸酐(CRE)值(mg/dL)(n=6)
對照組	PRFr	ADSCs	PRFr+ADSCs
0	0.7  0.2	0.5  0.1	0.6  0.1	0.7  0.1
1	4.0  0.6	4.3  0.6	4.2  0.6	4.2  0.4
2	4.2  0.7	4.1  0.3	4.9  1.2	2.0  0.3
3	4.7  0.7	4.3  0.5	4.8  1.0	1.5  0.4
4	4.8  1.0	4.2  0.8	3.8  1.3	1.3  0.6
5	4.2  0.8	3.8  0.9	3.5  1.3	1.2  0.6
6	4.4  1.0	3.8  0.7	3.0  1.1	1.2  0.4
7	4.1  0.7	3.6  0.9	2.8  1.0	1.2  0.4

實施例 5. 腎臟組織的病理觀察

距最後一次注射後的三週，即所有動物治療七週後犧牲。自中間做對半切開的縱剖面腎臟在固定於10%中性福馬林後，再以組織修片刀進行修整，隨即將固定之組織脫水，再以石臘包埋。包埋之組織切成大約4

m製作成切片，進行H&E染色，在光學顯微鏡下觀察腎臟內部形態之變化。

圖8顯示四組腎損傷修復後切片的組織學圖像。經H&E染色可見PRFr+ADSCs治療組腎小球形態完整，腎小管上皮細胞無水腫及空泡樣改變，周圍無明顯的炎性細胞，腎小管腔內無管型阻塞。ADSCs治療組治療組腎小球結構完整，少部分腎小管腔內有管型阻塞，少部分腎小管上皮局部水腫增厚。PRFr治療組腎小球部分皺縮，腎小管上皮局部水腫增厚，空泡樣改變，部分上皮變性壞死。對照組腎小球皺縮，炎性細胞滲出，腎小管上皮水腫、空泡樣變壞死，腎小管管型阻塞，部分腎小管結構崩解。

綜上所述，本發明以脂肪間葉幹細胞ADSCs具備自我增生及可分化成一到數種細胞潛能的特性，併合高濃度富血小板纖維蛋白釋放液(PRFr)富含生長因子與細胞激素，作為幹細胞的載體，基於中國傳統醫學涉及穴位和經絡的治療方式提供腎臟疾病模型幹細胞治療之新選擇，且以腎俞穴(BL23)穴位注射本發明之幹細胞製劑可用於修復受損的腎臟細胞並降低血清肌酸酐(CRE)及尿素氮(BUN)值，為腎臟疾病(特別是腎臟損傷)的治療提供了一種新穎的潛在治療方案。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

無

圖1為人體穴位示意圖。 圖2A為顯示兔子的穴位之一示意圖(由佛羅里達中獸醫學院(CHI institute)鄭漢文獸醫師提供)。 圖2B為顯示兔子的穴位之另一示意圖(由佛羅里達中獸醫學院(CHI institute)鄭漢文獸醫師提供)。 圖3A顯示初代培養的ADSCs，放大倍率為100x (左圖)及200x (右圖)。 圖3B顯示經流式細胞儀分析，ADSCs具有CD44+CD90+CD31-CD45-的表型。 圖3C顯示繼代培養的ADSCs，放大倍率為100x (左圖)及200x (右圖)。 圖4顯示以螢光標記之ADSCs穴位注射腎俞穴BL23。 圖5A顯示體外培養之CMFDA (5-氯甲基螢光素二乙酸酯(5-chloromethylfluorescein diacetate))螢光標記ADSCs樣態，放大倍率100x。 圖5B顯示BL23穴位注射CMFDA-ADSCs，紐西蘭白兔腎臟細胞以雷射掃描共軛焦顯微鏡(TCS SP5 II confocal microscope)擷取CMFDA幹細胞之螢光成像(n = 3)。分別於注射CMFDA-ADSCs後之4、24、48小時犧牲，取左腎臟組織進行冷凍切片，三圖中可顯見注射時間與綠螢光留置之細胞作用量呈正相關，脂肪間葉幹細胞經穴位注射能進入腎臟並參與作用，槓(Bar) = 25

m。 圖6顯示兔急性腎臟損傷缺血後再灌流模式手術，利用前端套有塑膠細導管的止血鉗將腎動脈夾住45分鐘後鬆開(n = 2)。 圖7A顯示急性腎損傷紐西蘭白兔經隨機分配於四組(n = 6)，對照組注射PBS，治療組以穴位注射PRFr、ADSCs及PRFr+ADSCs，經四次注射共7週療程之BUN變化趨勢。 圖7B顯示急性腎損傷紐西蘭白兔經隨機分配於四組(n = 6)，對照組注射PBS，治療組以穴位注射PRFr、ADSCs及PRFr+ADSCs，經四次注射共7週療程之CRE變化趨勢。 圖8顯示四組腎損傷修復後切片的組織學圖像，放大倍率100x，槓(Bar) = 100

m。

Claims (10)

1. 一種幹細胞製劑用於製備一治療腎臟疾病之醫藥品的用途，其中該腎臟疾病是藉由對一帶有腎臟疾病的個體的一腎俞穴(BL23)穴位投藥該幹細胞製劑而被治療。
2. 如請求項1的用途，其中該腎臟疾病是急性腎臟損傷。
3. 如請求項1的用途，其中該幹細胞製劑包含一選自於下列所組成之群組中的組分：一幹細胞、一血小板濃縮物，及其組合。
4. 如請求項3的用途，其中該幹細胞為胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞。
5. 如請求項4的用途，其中該成體幹細胞是選自於下列所組成的群組：一臍帶血幹細胞、一周邊血幹細胞、一神經幹細胞、一表皮幹細胞、一肌肉幹細胞、一眼角膜幹細胞、一肝臟幹細胞、一腸上皮幹細胞、一脂肪間葉幹細胞(adipose-derived stem cell, ADSC)、一骨髓間葉幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cell)，及其組合。
6. 如請求項3的用途，其中該血小板濃縮物是一富血小板纖維蛋白釋放液(platelet rich fibrin releasate, PRFr)。
7. 如請求項5的用途，其中該脂肪間葉幹細胞的濃度為至少10 ⁶細胞/mL。
8. 如請求項1的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。
9. 如請求項2的用途，其中該急性腎臟損傷為因任何病因導致腎血流量之減少(腎缺血(ischemia))、暴露於對腎有害之物質(nephrotoxicity)、腎發炎之過程，或阻塞尿流量之尿路阻礙。
10. 如請求項1的用途，其中該帶有腎臟疾病的個體為一帶有腎臟疾病的哺乳類動物。

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