CN109963573B - 细胞制剂和细胞制剂的制造方法 - Google Patents

细胞制剂和细胞制剂的制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109963573B
CN109963573B CN201780067469.9A CN201780067469A CN109963573B CN 109963573 B CN109963573 B CN 109963573B CN 201780067469 A CN201780067469 A CN 201780067469A CN 109963573 B CN109963573 B CN 109963573B
Authority
CN
China
Prior art keywords
microglia
ogd
cell
culture
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780067469.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109963573A (zh
Inventor
下畑享良
金泽雅人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Niigata University NUC
Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Original Assignee
Niigata University NUC
Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Niigata University NUC, Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe filed Critical Niigata University NUC
Publication of CN109963573A publication Critical patent/CN109963573A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109963573B publication Critical patent/CN109963573B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供制造用于促进血管新生或轴突生长、特别是用于治疗脑血管疾病、缺血性心脏病或创伤性脑损伤和脊髓损伤的细胞培养物的方法，包括：将含有小胶质细胞和/或单核细胞的细胞群在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下培养，从而制造培养物；能够通过所述方法得到的细胞制剂、以及通过使用所述细胞制剂而治疗脑血管疾病、缺血性心脏病或创伤性脑损伤和脊髓损伤的方法。

Description

细胞制剂和细胞制剂的制造方法
技术领域
本发明涉及对于因例如脑梗死等而受到损伤的组织的修复和再生有效的细胞制剂及其制造方法等。
背景技术
脑梗死是指因脑局部的缺血性坏死而引起的脑功能障碍，是需要紧急治疗的疾病，并且与癌症和心脏病一起是造成死亡的3大主因之一。脑梗死根据作用机理被分类为血栓性、栓塞性或血液动力学性，并且根据临床表现被分类为动脉粥样血栓性脑梗死、心原性脑栓塞症、或腔隙性梗死。
缺血是因由于诸如动脉硬化的脑血管病变、或心原性血栓而导致的局部脑血流阻断从而引起的，并且在缺血核心（ischemic core）因能量耗尽而引起神经细胞死亡。缺血后，神经再生差，并且在当前，慢性期中症状的恢复难，并且半数病人遭受一些后遗症。预想血管再生触发缺血核心的边缘部位处的神经再生的过程。期望开发以该神经再生过程为靶向的治疗方法。
涉及脑梗死的治疗已进行了多种尝试。但是，其并不充分，并且近年来已尝试使用活细胞的治疗方法(专利文献1和2、和非专利文献1)。
专利文献1记载了一种用于在不使用诸如肝素的抗凝剂的情况下获取包含从骨髄或血液采集的间充质干细胞的细胞、并使用该细胞来治疗诸如脑梗死等的疾病的方法。专利文献2记载了使用MUSE细胞的脑梗死的治疗方法。
此外，向小鼠的脑梗死模型静脉内给药骨髄来源的单核细胞(CD115阳性细胞)已被确认引起这些细胞向梗死区域的转移；但是效果并不充分(非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2009/034708
专利文献2：JP-A-2015-159895
非专利文献
非专利文献1：Somsak Wattananit "Monocyte-Derived MacrophagesContribute to Spontaneous Long-Term Functional Recovery after Stroke in Mice"The Journal of Neuroscience, 13 April 2016, 36(15): 4182-4195; doi: 10.1523/JNEUROSCI.4317-15.2016。
发明内容
发明要解决的问题
但是，上述专利文献1和专利文献2中记载的细胞制剂要求收集骨髄液，这对患者是沉重的负担。此外，获得间充质干细胞也有需要长期培养的问题。另外，通过如上述非专利文献1中记载那样给药骨髄来源的单核细胞，可以确认转移至梗死区域，但发生对脑梗死等的治疗效果不充分的问题。
本发明的问题是解决前述现有问题，并且实现下述目标。即，本发明的目的在于，提供对患者的负担更少、具有高安全性、并且在治疗脑梗死方面高度有效的细胞制剂和其制造方法。
用于解决问题的手段
本发明人已发现，给药经缺氧缺糖(OGD)处理的小胶质细胞或包含单核细胞（monocyte）的单个核细胞（mononuclear cell）避免了脑梗死发病后的恶化，并且通过促进血管新生和轴突生长而治疗了脑梗死，从而完成了本发明。
因此，本发明提供下述方案。
＜1＞本发明是制造用于治疗选自缺血性脑血管疾病、心肌梗死、脑出血与创伤性脑损伤和脊髓损伤中的疾病的细胞培养物的方法，其包括：将含有小胶质细胞和/或单核细胞的细胞群在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下进行培养。
＜1a＞本发明是制造用于促进血管新生或轴突生长的细胞培养物的方法，其包括：将含有小胶质细胞和/或单核细胞的细胞群在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下进行培养。
＜2＞前述中任一项所述的方法中，优选至少在低糖浓度条件下培养该细胞群。
＜3＞前述中任一项所述的方法中，优选在基础培养基中培养该细胞群。
＜4＞例如，前述含有单核细胞的细胞群是外周血细胞或其级分。
＜4a＞或者，前述含有单核细胞的细胞群是从外周血采集的包含单个核细胞的级分。
＜5＞此外，低氧浓度可以是低于1%的氧浓度。
＜6＞此外，低糖浓度可以是1.0g/L以下的糖浓度。
＜7＞此外，前述培养物的制造中，前述细胞群可以在低氧浓度且低糖浓度的条件下培养低于24小时。
＜8＞此外，前述细胞制剂的制造中，可以进一步清洗前述所制造的培养物，并将经清洗的培养物封入容器中。
＜9＞本发明是用于治疗选自缺血性脑血管疾病、心肌梗死、脑出血以及创伤性脑损伤和脊髓损伤中的疾病的细胞制剂，所述制剂包含小胶质细胞和/或单核细胞，所述小胶质细胞和/或单核细胞具有足以治疗选自缺血性脑血管疾病、心肌梗死、脑出血以及创伤性脑损伤和脊髓损伤中的疾病的促进血管新生和/或轴突生长的能力。
＜9a＞本发明是用于治疗选自缺血性脑血管疾病、心肌梗死、脑出血以及创伤性脑损伤和脊髓损伤中的疾病的细胞制剂，所述制剂包含通过将含有小胶质细胞和/或单核细胞的细胞群在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下培养而制造的培养物。
＜10＞本发明是用于促进血管新生或轴突生长的细胞制剂，所述制剂包含通过将含有小胶质细胞和/或单核细胞的细胞群在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下培养而制造的培养物。
＜11＞本发明是用于治疗选自缺血性脑血管疾病、心肌梗死、脑出血以及创伤性脑损伤和脊髓损伤中的疾病的方法，所述方法包括向对象给药通过将含有小胶质细胞和/或单核细胞的细胞群在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下培养而制造的含有治疗有效量的小胶质细胞和/或单核细胞的培养物。
发明的效果
根据本发明，仅通过在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下以非常短的时间培养小胶质细胞或单核细胞，可以对该细胞赋予促进血管新生和轴突生长的能力，并因此能够从发病早期起治疗缺血性脑血管疾病和心肌梗死。另外，由于不存在如间充质干细胞或骨髄干细胞的情况那样在细胞加工中心(CPC)内实施的限制，因此本发明在一般医疗机构中广泛可用。此外，由于培养不需要血清、生长因子等，因此可以以低成本安全地提供细胞制剂。
进一步，使用包含外周血来源的单核细胞的细胞群时，不需要采集骨髄液，使得脑梗死的治疗中可以减少对患者的负担并且可以提高安全性。
在患有脑出血或脑脊髄外伤的患者的情况中，在血肿去除手术后，可以从血肿周围的被破坏的白质容易地采集小胶质细胞，并因此可以通过将本发明应用于从患者的脑或脊髄直接采集的小胶质细胞来治疗前述疾病。
此外，由于在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下实施培养，因此能够进一步促进血管新生和轴突生长，并且能够提高治疗效果。
附图说明
图1示出移植经OGD预处理的小胶质细胞后在短暂性局灶性脑缺血大鼠模型中神经学预后的改善结果的一个实例。
图2示出移植经OGD预处理的小胶质细胞后在短暂性局灶性脑缺血大鼠模型中神经学预后的改善结果的另一个实例。
图3示出经OGD预处理的小鼠原代培养小胶质细胞的特性。
图4示出经OGD预处理的小鼠原代培养小胶质细胞的其他特性。
图5示出通过移植经OGD预处理的小胶质细胞而促进的脑缺血后第28天的VEGF的强度。
图6示出通过移植经OGD预处理的小胶质细胞而促进的脑缺血后第28天的MMP-9的强度。
图7示出通过移植经OGD预处理的小胶质细胞而促进的脑缺血后第28天的TGF-β的强度。
图8示出对CD31的免疫反应性(每单位体积的体积)。
图9示出对SMI31的免疫反应性(每单位体积的体积)。
图10示出缺血后第28天和缺血前的大鼠中来自大脑皮质的硫酸软骨素蛋白聚糖/神经元胶质抗原2(CSPG/NG2)的相对强度。
图11示出脑缺血后的经OGD预处理的小胶质细胞移植的机理。
图12示出细胞制剂的制造方法的流程图。
图13示出移植经OGD预处理的外周血单个核细胞(PMNC)后在短暂性局灶性脑缺血大鼠模型中神经学预后的改善结果的一个实例。图中，“#”表示相对于对照的p＜0.05。
图14示出在短暂性局灶性脑缺血大鼠模型中神经学预后的改善中的经OGD预处理的PMNC的移植细胞数依赖性。图中，“#”表示相对于对照的p＜0.05。
图15示出移植了经OGD预处理的PMNC的短暂性局灶性脑缺血大鼠模型的脑缺血病变部处的血管新生的促进。上图示出血管新生标记物CD31的免疫染色和利用DAPI的核染色的双重染色图像，并且下图是示出由该染色结果算出的血管体积的图。
图16示出移植了经OGD预处理的PMNC的短暂性局灶性脑缺血大鼠模型的脑缺血病变部处的神经轴突生长的促进。上图示出神经轴突标记物SMI31的免疫染色和利用DAPI的核染色的双重染色图像，并且下图是示出由该染色结果算出的神经轴突体积的图。
图17示出缺氧刺激(OD)、缺糖糖刺激(GD)或缺氧缺糖刺激(OGD)对人PMNC中的VEGF的产生(A)和分泌(B)的效果。(A)各刺激后的细胞提取液(上图)和培养上清液(下图)的蛋白质印迹图像(左)和VEGF的相对的带强度(右)。(B)示出各刺激后对培养上清液的ELISA的结果的图。图中，“**”表示p＜0.01，“*”表示p＜0.05。
具体实施方式
(作为本发明的基础的发现)
缺血性脑卒中患者中多于一半的存活者遭受运动功能障碍之苦。因此，需要确立在亚急性和慢性期的脑卒中患者中促进功能恢复的方法。尽管已经采取多种途径来开发治疗药物，但当前尚不存在充分的治疗药物，并且物理康复仍然是促进缺血性脑卒中患者中的功能恢复的唯一治疗选项。
使用骨髄单个核细胞或骨髄来源的间充质干细胞/基质细胞的细胞疗法可能是促进在亚急性期和慢性期的脑卒中患者中的功能恢复的另一治疗方法。使用神经祖细胞、骨髄基质细胞和间充质干细胞的基于细胞的治疗的机理之一是通过分泌VEGF或脑源性神经营养因子(BDNF)而诱导血管新生。还报告了细胞疗法后的轴突生长。但是，最近的多中心随机对照试验（multi-randomized, controlled trial）已证明静脉内给药骨髄单个核干细胞（bone marrow mononuclear stem cells）对缺血性脑卒中没有有益效果。此外，由于缺血性脑卒中患者接受抗凝剂或抗血小板疗法以预防复发，技术上难以从骨髄采集干细胞。此外，骨髄来源的细胞可能无法穿过血脑屏障(BBB)，并且可能无法转移至脑内。
因此，本发明人考虑，由于小胶质细胞是中枢神经系(CNS)中的上述生长因子的主要来源，因此使用小胶质细胞的细胞疗法可能是另一有前景的治疗方法。多个在先研究已证明，小胶质细胞在急性期中扩大脑梗死体积，但在亚急性期和慢性期中的脑缺血后，小胶质细胞已知通过组织和血管的重塑而发挥保护的作用。
该保护性小胶质细胞被称为M2小胶质细胞，并且其保护效果被认为通过分泌重塑因子而触发，所述重塑因子诸如能够促进脑缺血后的血管新生和轴突生长的VEGF和BDNF，金属蛋白酶-9(MMP-9)，转化生长因子β(TGF-β)等。此外，移植的小胶质细胞特别是在脑缺血状态下可以通过BBB而转移至脑内。
还已知血液中的单核细胞转移至脑内并分化为小胶质细胞。
基于上述发现，本发明人推测，用OGD预先进行调节并外周给药的小胶质细胞或单核细胞通过BBB而转移至脑实质内，分泌重塑因子，并且能够通过促进对亚急性期中的局灶性脑缺血的血管新生和轴突生长，从而发挥出多面性的治疗效果。
为了验证该推测，本发明人将经OGD处理的小胶质细胞或外周血单个核细胞(PMNC)对短暂性局灶性脑缺血的大鼠模型给药，并发现小胶质细胞或单核细胞通过BBB而转移至脑内，并且通过促进血管新生和轴突生长而促进脑的功能恢复。
本发明人还比较了对人PMNC用OGD处理与用缺氧(OD)或缺糖(GD)进行刺激之间，在该细胞群中作为用于血管新生的体液因子的VEGF的产生量和分泌量。其结果是表明，按OGD处理、GD处理、OD处理的顺序与无刺激相比，VEGF产生量更高，并且与用OD处理相比，经OGD处理或GD处理的VEGF的分泌量格外高。
本发明提供用于促进血管新生或促进轴突生长的细胞培养物、特别是用于治疗诸如脑血栓、脑梗死等缺血性脑血管疾病(脑梗死)，或诸如脑内出血、蛛网膜下出血等出血性脑病(脑出血)，诸如心肌梗死等缺血性心脏病，或者创伤性脑损伤和脊髓损伤的细胞培养物的制造方法(以下也称为“本发明的制造方法”)。该方法包括：通过将含有小胶质细胞和/或单核细胞的细胞群在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下进行培养而制造前述培养物。
本发明的制造方法中使用的细胞群只要含有小胶质细胞或单核细胞，则对其来源没有特别限制，并且可以从人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、狗、猫、猴、牛、猪等)适当采集。对于含有小胶质细胞的细胞，例如将诸如大脑等神经组织分散，并在粘附性的细胞培养容器中使用添加了血清的培养液培养。其结果是，胶质细胞、主要是星形胶质细胞在培养容器表面上增殖而形成单层。其后，小胶质细胞的增殖状态容易被识别。通过采集并培养小胶质细胞，能够制作小胶质细胞培养试验体系。采集细胞时，常采用振荡培养容器的方法。这包括施加物理刺激以释放粘附于单层星形胶质细胞培养细胞上的小胶质细胞，并且可以采集更多的细胞。还可以由诸如大脑等神经组织的分散液直接提纯小胶质细胞，或者可以通过以CD115为指标的使用抗CD115抗体的MACS或FACS来提纯通过上述方法得到的小胶质细胞细胞级分。还可以通过由诸如单核细胞、造血干细胞等祖细胞或干细胞进行分化而得到。
在应用于人时，例如在因脑出血或脑外伤而需要外科手术的患者中，在血肿去除后，可以使用神经内窥镜切除血肿周围的被破坏的白质，并可以分离并使用转移至该白质内的小胶质细胞。尽管从人采集小胶质细胞是高度侵入性的并且固有地困难，但上述情况中，由于使用通过手术而必然获得的被破坏的白质作为来源，因此是充分容许的。
作为含有单核细胞的细胞群，可以使用通过已知的方法得到的骨髄来源的单个核细胞级分或外周血来源的单个核细胞级分。考虑到低侵入性，并且在缺血性疾病的情况中，由于通常实施抗凝固/抗血栓疗法以避免复发，从而难以进行骨髄液采集，更优选外周血来源的单个核细胞级分。单个核细胞级分可以从骨髄液或外周血中例如利用Ficoll密度梯度离心而通过本身已知的方法来进行分离和纯化。进一步，例如还可以通过使用抗CD14抗体的MACS或FACS来生成并使用单核细胞。还可以通过从造血干细胞或多能性干细胞进行分化而使用单核细胞。
本申请中的缺氧缺糖处理(OGD处理)是指通过在与正常的培养条件相比低氧和低糖条件下的培养基中培养上述细胞群的处理。尽管OGD处理条件根据本发明中使用的含有小胶质细胞或单核细胞的细胞群的种类而适当选择，但其可以使用VEGF、TGF-β、MMP-9的产生量作为指标，并在其表达水平最大化的条件前后进行选择。例如，在CD115阳性的大鼠小胶质细胞级分中，在实施例中使用的条件下，即，在将培养室密闭，且在无氧氛围下在含有1.0g/L葡萄糖的DMEM培养基中培养时，低氧室内的氧浓度1小时内减少至小于1%，4小时内减少至0.1~0.4%，并且在整个实验中得到维持。OGD下培养24小时引起细胞死亡，通过基于碘化丙啶测定和乳酸脱氢酶测定的评价，OGD下培养18小时未引起细胞死亡。此外，M2小胶质细胞的检测在开始OGD培养后12小时开始，24小时内增加至最大，并且其后大幅降低。因此，上述的条件下约18小时(例如18±6小时)的OGD处理是期望的。
本发明中，“低氧浓度”优选是指模仿局部脑梗死中的氧浓度的浓度，例如为低于1%、更优选为0.1~0.4%。在大于1%的低氧浓度(例如2~10%)下培养已被报告为对维持ES细胞的未分化状态和改进iPS细胞的建立效率是有效的。但是，本发明中优选的缺氧(OD)处理是在24小时后引起小胶质细胞和单核细胞的细胞死亡的严苛低氧条件下实施。该低氧条件可以通过例如将培养室内的大气用诸如含5%CO2的氮气等无氧惰性气体置换而制作。
本发明中，“低糖浓度”优选是指模仿局部脑梗死中的糖浓度的浓度，例如为1.0g/L以下。为了提供本发明的效果，1.0g/L以下的糖浓度即是充分的，并且超过必要地降低糖浓度可能有时对于细胞的存活而言被证明是不期望的。该低糖条件可以通过例如将包含小胶质细胞或单核细胞的细胞群在具有低糖浓度的培养基中培养而制作。作为培养基，可以使用公知惯用的基础培养基，诸如Eagle培养基、最小必须培养基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、RPMI培养基(例如RPMI1630、RPMI1640)、Fischer培养基、Ham培养基(例如F10、F12)、MCDB培养基(例如MCDB104、MCDB107)等、或它们的混合物。取决于各基础培养基的糖浓度，可以在适当降低要添加的糖量以满足本发明中的低糖浓度后使用培养基。DMEM的情况中，例如低葡萄糖培养基(1.0g/L)和高葡萄糖培养基(4.5g/L)是商业可获得的。可以选择使用低葡萄糖培养基。不含葡萄糖的培养基也是商业可获得的，并且可以向其添加糖至期望的低糖浓度。糖只要小胶质细胞和单核细胞可以利用，则没有特别限制，并且可以使用葡萄糖、半乳糖、果糖等，通常可以使用葡萄糖。
上述基础培养基可以额外含有公知惯用的培养基添加剂，诸如5~20%的血清(例如胎牛血清)或血清替代物(例如Knockout Serum Replacement(敲除血清替代物))、生长因子(例如EGF、PDGF、IGF-I、IGF-II、胰岛素、IL-1、IL-6)、白蛋白、转铁蛋白、蛋白酶抑制剂(例如α1-抗胰蛋白酶)、细胞粘附因子(例如纤连蛋白、层粘蛋白)、脂质(例如胆固醇、亚油酸、类固醇)、微量元素(铁、锌、亚硒酸、锰、铜)等。本发明即使不添加诸如血清、生长因子等的动物来源成分，也能够对小胶质细胞和单核细胞赋予充分的血管新生和/或轴突生长促进能力。在一个优选的实施方式中，作为培养基，可以使用实质上仅由基础培养基组成且不含血清或生长因子的培养基。由于培养基不含昂贵且存在被病毒等污染的风险的动物来源成分，因此能够提供廉价且安全的细胞制剂。
总结这些OGD的条件，低氧浓度是低于1%的氧浓度，低糖浓度是1.0g/L以下的糖浓度，并且培养时间是低于24小时。此外，使用单核细胞或外周血单个核细胞级分时，优选将培养时间设定为18小时以下。
如上所述地得到的细胞培养物可以直接使用，或者与药学可接受的载体一起进行制剂。药学可接受的载体的实例包括用于注射的水性液体，诸如生理盐水、含有葡萄糖或其他辅剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)的等渗溶液等。本发明的含有细胞培养物的细胞制剂可以含有例如缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、无痛剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等。
如后述的实施例所示，通过对包含小胶质细胞或单核细胞的细胞群进行OGD处理而得到的培养物与在正常的氧浓度和糖浓度条件下处理的培养物(或者OGD处理前的该细胞群)相比，特征性地具有下述特性：
(a)VEGF的分泌量显著高，
(b)MMP-9的分泌量显著高，和
(c)TGF-β的分泌量显著高。
由于VEGF、MMP-9和TGF-β具有血管新生和轴突生长促进作用，因此给药通过OGD处理而得到的培养物可以诱导因缺血或出血而受到损伤或破坏的神经组织的再生。
此外，通过对包含小胶质细胞或单核细胞的细胞群进行OGD处理而得到的培养物与在正常的氧浓度和糖浓度条件下处理的培养物(或者OGD处理前的该细胞群)相比，特征性地具有下述特性：
(d)TGF-β的分泌量与TNF-α的分泌量之比显著高，和/或
(e)IL-6的分泌量显著低。
即，与炎性细胞因子相比优先分泌抗炎性的细胞因子可以在缺血/出血部位提供炎症抑制效果。
因此，含有通过对包含小胶质细胞或单核细胞的细胞群进行OGD处理而得到的培养物的细胞制剂能够用于治疗缺血性脑血管疾病或缺血性心脏病，并且期望促进血管新生并提供抗炎症的作用。本发明中的缺血性脑血管疾病是指所谓脑血管疾病，并且包括脑梗死(脑血栓、脑栓塞)、以及出血性脑病(脑内出血、蛛网膜下出血)。优选的应用包括脑梗死。此外，含有通过对包含单核细胞的细胞群进行OGD处理而得到的培养物的细胞制剂也可以用于缺血性疾病，诸如缺血性心脏病(例如心肌梗死)等。或者，还可以用于创伤性的脑脊髄神经病。
作为将通过本发明的方法制造的细胞制剂递送至患部的方法，可以考虑例如利用外科手段的局部移植、静脉内给药、局部注射给药、皮下给药、皮内给药、腹腔内给药、肌肉内给药、脑内给药、脑室内给药、动脉内给药等。
通过向患者注射细胞而进行移植例如在用于修复神经系统时，包括将要移植的细胞使用人工脑脊髄液、生理盐水等而以悬浮状态储存在注射器中，暴露因手术而受损伤的神经组织，并向该损伤部位用注射针直接注射细胞。还可以将细胞移植至损伤部位附近，并且还可以通过注入脑脊髄液中而期待效果。进一步，还可以通过静脉内注射而期待效果。因此，以常规输注方式进行移植变得可能，其在可以在医院病房内进行移植操作方面是优选的。
本发明的细胞制剂的剂量在例如向脑梗死患者静脉内给药PMNC时，以单个核细胞数计为105~108个、优选为5×105~107个细胞。单个核细胞中的单核细胞的比例预期为约1/3~1/15。因此，对于单核细胞数，考虑给药通过将上述单个核细胞数乘以该比例而得到的数。小胶质细胞的剂量也包括相当于单核细胞的剂量的细胞数。
实施例
以下，通过参照本发明的实施例而详细说明本发明。本发明不以任何方式被实施例限制。下述实施例严格按照美国国立卫生研究院关于实验室动物的管理和使用的指南推荐进行，并且被日本新泻大学动物实验伦理委员会批准后实施。
(局灶性脑缺血)
短暂性局灶性脑缺血使用雄性的Sprague-Dawley大鼠(体重290~320克)和硅酮涂布尼龙单丝而诱导。
具体而言，通过吸入70%一氧化氮和30%氧气的混合物中的1.5%氟烷，将大鼠麻醉。将直径0.148mm的尼龙单丝用于血管闭塞。用热使尼龙单丝的前端成圆。将缝合线的末端(11mm)用硅酮涂布(直径0.350mm)。经由颈外动脉向颈内动脉插入栓塞线，使大脑中动脉(MCA)闭塞。缺血90分钟后，取出栓塞线以恢复血流。
这导致了由微管结合蛋白2(MAP2)的存在而确定的缺血核心和半暗带(penumbra)区域的形成。此外，通过再灌注而挽救半暗带的组织的治疗时间范围是90分钟。
(免疫荧光染色和共聚焦显微镜)
对脑缺血后第1天、第3天、第7天、第14天、和第28天存活的大鼠用生理盐水进行心脏内灌注后，用冷的0.1M的磷酸缓冲生理盐水(PBS；pH7.4)中的冷的4%多聚甲醛灌注，并通过过量剂量的氟烷而安乐死。
取出脑，并包埋在石蜡中。从石蜡块切出连续切片(4μm厚)，并用抗体进行染色。制作漂片(50μm厚)并染色。用Vectashield 4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行核染色。在共聚焦激光扫描显微镜下检查切片。通过MAP2染色，确定与缺血核心或半暗带对应的大脑皮质组织。
(利用免疫染色的脑组织结构的定量分析)
为了实施脑组织结构的定量分析，将组织切片用针对分化簇(CD)31(内皮细胞和血管新生的标记物)、MAP2(神经元树突标记物)、SMI31和生长相关蛋白43(GAP43)(神经元轴突标记物)、VEGF、TGF-β、和MMP-9的抗体进行免疫染色，并计数。
(小胶质细胞的原代培养细胞)
采集原代小鼠小胶质细胞。具体而言，用木瓜蛋白酶消化大脑皮质后，在补充有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养细胞悬浮液10天，从而从出生后的C57BL/6小鼠的大脑皮质中分离混合胶质细胞。10天后，将培养瓶振荡15分钟，从而分离小胶质细胞。利用流式细胞术中的Mac-1(CD11b/CD18)免疫反应性的评价显示，这些小胶质细胞的培养物的纯度为99%。
(外周血单个核细胞)
将大鼠或人外周血与PBS混合至总体积35mL，覆盖在50mL锥形管中的15mL Ficoll(GE Healthcare Japan Ficoll-Paque Premium 1.084)上，以400×g离心30分钟，并分离在Ficoll层上出现的PMNC层。
(OGD：缺氧缺糖刺激，OD：低氧刺激，GD：低糖刺激)
为了诱导OGD，首先将含血清的培养基用PBS彻底清洗2次，从而去除血清成分。然后，将培养基用低糖培养基置换，将低氧室用95%N2和5%CO2的混合气体置换1小时，并且其后将所述室封闭18小时。作为低糖培养基，使用DMEM(Dulbecco改良Eagles培养基)，并将其糖浓度设为1.0g/L。
低氧室内的氧浓度在1小时内减少至低于1%，在4小时内减少至0.1~0.4%，并且在整个实验中得到维持。
OD除了使用不含血清的高葡萄糖(4.5g/L)DMEM替代低糖培养基之外，以与OGD相同的方式实施。GD除了室内氛围为5%CO2、95%大气之外，以与OGD相同的方式实施。
OGD下培养24小时引起细胞死亡，通过基于碘化丙啶测定和乳酸脱氢酶测定的评价，OGD下培养18小时未引起细胞死亡。此外，M2小胶质细胞的检测在开始OGD培养后12小时开始，24小时内增加至最大，并且其后大幅降低。因此，本实施例中，选择18小时的OGD。
OGD下培养的小胶质细胞在下文中是指经OGD预处理的小胶质细胞。此外，为了与经OGD预处理的小胶质细胞进行对比，将正常氧浓度(例如约20%)下培养的小胶质细胞称为正常氧小胶质细胞。
(细胞移植)
本实施例中，为了创建相同的生理学状态，将脑缺血后第7天为平均体重-2SD以下的大鼠除外。将1×106个的小胶质细胞或1×105个或1×106个大鼠PMNC用300μL的PBS稀释。脑缺血后第7天，将经受短暂性的MCAO(大脑中动脉闭塞术)的大鼠随机分配至下述组。这些组是由缓慢地经由颈外动脉(ECA)的残端移植小胶质细胞或PMNC 3分钟的大鼠组成的细胞处理组、和由注射相同体积的PBS的大鼠组成的无细胞对照组。细胞处理组包括由移植了经OGD预处理的小胶质细胞或PMNC的大鼠组成的经OGD预处理的小胶质细胞或PMNC移植组、和由移植了正常氧小胶质细胞或PMNC的大鼠组成的正常氧小胶质细胞或PMNC移植组。经OGD预处理的PMNC移植组取决于移植细胞数，包括1×105个PMNC移植组、和1×106个PMNC移植组。
(感觉运动评价)
感觉运动评价在脑缺血前和脑缺血后第1天、第4天、第7天、第10天(移植后第3天)、第14天(移植后第7天)、第21天(移植后第14天)、和第28天(移植后第21天)，通过角落试验(corner test)而实施。角落试验中，实施20次试验，其中大鼠从角落通过向左转或向右转而逃脱，并且数出从右侧逃脱的次数。
(绿色荧光蛋白(GFP)小鼠)
为了确定所移植的小胶质细胞在动脉内给药后是否能够从血液转移至脑实质从而发挥出其有益效果，本实施例中，使用来自GFP小鼠的原代小胶质细胞。用OGD预处理来自GFP小鼠的原代小胶质细胞，并且动脉内给药该细胞。其后，在从脑缺血7天后实施的移植起第3天和第21天，实施共聚焦显微镜检查。
(ELISA和蛋白质印迹)
将人PMNC用OGD、GD或OD刺激18小时，并且分离细胞和培养上清液。使细胞提取液和培养上清液分别经受SDS-聚丙烯酰胺电泳，并且通过使用小鼠抗人VEGF抗体和标记的抗小鼠IgG抗体的蛋白质印迹来对VEGF定量。作为内标物，分别使用β-肌动蛋白(对于细胞提取液)或转铁蛋白(对于培养上清液)。对于培养上清液，还实施利用ELISA的VEGF的定量。
(结果)
说明经OGD预处理的小胶质细胞移植对局灶性脑缺血的治疗效果。
为了对比经OGD预处理的小胶质细胞移植对局灶性脑缺血的治疗效果，通过局灶性脑缺血后的感觉运动评价，在无细胞对照组与经OGD预处理的小胶质细胞移植组之间分析神经学预后。
图1示出移植经OGD预处理的小胶质细胞后神经学预后的改善结果的一个实例。
在经OGD预处理的小胶质细胞移植组的大鼠中，在实施20次的角落试验中，与无细胞对照组的大鼠相比，大幅改善了功能恢复。即，脑缺血后第28天实施20次的角落试验中，经OGD预处理的小胶质细胞移植组中的大鼠以约50%的比例向右转，并且无细胞对照组中的大鼠以约10%的比例向右转。这表明，经OGD预处理的小胶质细胞移植组中神经病变的改善较无细胞对照组中显著更好。这些组之间，在脑缺血前和脑缺血后第7天、第14天、第21天和第28天，在体重方面没有发现显著差异。
接着，通过局灶性脑缺血后的感觉运动评价，比较OGD预处理的有无对小胶质细胞的治疗效果。
图2示出移植经OGD预处理的小胶质细胞后神经学预后的改善结果的另一个实例。
经OGD预处理的小胶质细胞移植后的大鼠在实施20次的角落试验中显示出与正常氧小胶质细胞移植后的大鼠(norm)相比大幅改善了功能恢复。即，脑缺血后第28天实施20次的角落试验中，经OGD预处理的小胶质细胞移植组中的大鼠以约40%的比例向右转，并且正常氧小胶质细胞移植组中的大鼠以约10%的比例向右转。这表明，经OGD预处理的小胶质细胞移植组中神经病变的改善较正常氧小胶质细胞移植组中显著更好。这些组之间，在脑缺血前和脑缺血后第7天、第14天、第21天和第28天，在体重方面没有发现显著差异。
在此，通过共聚焦显微镜检查，在动脉内给药来自GFP小鼠的小胶质细胞后，即移植后第21天，未观察到该小胶质细胞，但在移植后第3天，在缺血核心与半暗带之间的边界区域观察到该小胶质细胞。即，通过共聚焦显微镜检查确认了小胶质细胞从血液转移至脑实质。
图3示出经OGD预处理的小鼠原代培养小胶质细胞的特性。具体而言，图3示出正常氧条件(norm)和OGD下小鼠原代培养小胶质细胞分泌至培养基的分泌水平。图3(a)示出血管内皮生长因子(VEGF)的分泌水平，(b)示出脑源性神经营养因子(BDNF)的分泌水平，(c)示出MMP-9的分泌水平。
如图3(a)所示那样，发现经OGD预处理的小胶质细胞的培养基中的VEGF分泌水平显著高于正常氧小胶质细胞中的分泌水平。
另一方面，如图3(b)所示那样，OGD和正常氧条件中的小胶质细胞的培养基之间的BDNF的分泌水平没有差异。但是，如图3(c)所示那样，发现经OGD预处理的小胶质细胞的培养基中的MMP-9的分泌水平高于正常氧小胶质细胞中的分泌水平。
图4示出经OGD预处理的小鼠原代培养小胶质细胞的其它特性。具体而言，图4与图3类似，示出正常氧条件(norm)和OGD下小鼠原代培养小胶质细胞的培养基中的分泌水平。图4(a)和(b)示出诸如转化生长因子β(TGF-β)和白介素10(IL-10)的抗炎性细胞因子的分泌水平。图4(c)、(d)和(e)示出诸如IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-1β的炎性细胞因子的分泌水平。图4(f)示出TGF-β与TNF-α之比。
为了确定经OGD预处理的小胶质细胞的细胞因子谱（cytokine profile）的变化，如图4所示那样，在正常氧条件与OGD之间，比较来自小胶质细胞的多种细胞因子的水平。一般而言，M1小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，并且脑保护性M2小胶质细胞分泌IL-10和TGF-β。
如图4(a)所示那样，由经OGD预处理的小胶质细胞分泌的抗炎性细胞因子TGF-β的分泌水平比由正常氧小胶质细胞分泌的分泌水平高25倍。此外，如图4(c)所示那样，发现由经OGD预处理的小胶质细胞分泌的炎性细胞因子IL-6的分泌水平是由正常氧小胶质细胞分泌的分泌水平的一半。
相反，如图4(b)所示那样，由经OGD预处理的小胶质细胞和正常氧小胶质细胞分泌的抗炎性细胞因子IL-10的分泌水平没有显示出差异。另一方面，如图4(d)和(e)所示那样，由经OGD预处理的小胶质细胞分泌的炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌水平比由正常氧小胶质细胞分泌的分泌水平高3倍或4倍。
如图4(f)所示那样，来自经OGD预处理的小胶质细胞的、表示M1小胶质细胞与M2小胶质细胞之间的偏重的TGF-β与TNF-α之比比来自正常氧小胶质细胞的该比高6倍。该TGF-β与TNF-α之比的增加表明OGD预处理后向M2小胶质细胞的偏重。换言之，这些结果证明了最优OGD的预处理导致小胶质细胞变为抗炎症M2亚型主导。
接着，说明通过移植经OGD预处理的小胶质细胞的VEGF、MMP-9、和TGF-β的表达。
实施分析以确认移植经OGD预处理的小胶质细胞后的改善结果是否是由脑实质中的重塑因子(VEGF、MMP-9、和TGF-β)的升高所引起。即，使用针对VEGF、MMP-9和TGF-β的抗体，对脑缺血后第28天的经移植的大鼠的脑进行免疫组织化学分析。VEGF、MMP-9和TGF-β的表达无法在缺血前的大鼠的脑中检测到。其表达在脑缺血后第28天(移植后第21天)的缺血核心与半暗带内的边界区域被观察到。
图5~图7示出通过移植经OGD预处理的小胶质细胞而促进的、脑缺血后第28天的各种促进重塑的因子的表达。图5示出VEGF的强度，图6示出MMP-9的强度，并且图7示出TGF-β的强度。
图5~图7中示出的免疫反应性的强度的分析证明，这些重塑因子的表达在经OGD预处理的小胶质细胞移植组中比在无细胞对照组中更加显著。
VEGF和MMP-9的表达不仅在小胶质细胞中，而且在缺血性大鼠的周皮细胞（pericyte）、内皮细胞、和神经细胞中也被观察到。TGF-β的表达不仅在小胶质细胞中，而且在缺血大鼠的周皮细胞和神经细胞中也被观察到。
然后，确认了移植经OGD预处理的小胶质细胞促进了脑缺血后第28天的缺血核心内的边界区域中的血管新生、和缺血性半暗带中的轴突生长。
首先，说明通过移植经OGD预处理的小胶质细胞而促进血管新生。
本发明人推测，通过移植经OGD预处理的小胶质细胞而表达VEGF、MMP-9和TGF-β促进了血管新生。因此，本发明人在脑缺血后第28天，通过使用血管新生标记物抗CD31抗体的大脑皮质的免疫荧光染色，检验了移植经OGD预处理的小胶质细胞对血管新生的效果。
图8示出每单位体积的CD31免疫反应性。具体而言，该CD31免疫反应性被表述为缺血后第28天中的无细胞对照组和经OGD预处理的小胶质细胞移植组各自的缺血核心的每1μm3的体积(μm3)，即表述为体积比率。
在利用共聚焦显微镜的评价中，如图8所示那样，表明在脑缺血后第28天(移植后第21天)，OGD小胶质细胞移植组中的CD31免疫反应性远高于无细胞对照组中的CD31免疫反应性。该CD31免疫反应性是含有缺血核心的边界区域中的每单位体积的CD31免疫反应性。这些组之间，缺血性半暗带中的每单位体积的CD31免疫反应性没有发现显著差异。
接着，说明通过移植经OGD预处理的小胶质细胞促进轴突生长。
本发明人在脑缺血后第28天，通过使用针对神经丝的蛋白质标记物抗SMI31抗体的缺血性皮质的免疫荧光染色，检验移植经OGD预处理的小胶质细胞对轴突生长的效果。
图9示出每单位体积的SMI31免疫反应性。具体而言，SMI31免疫反应性被表述为缺血后第28天中的无细胞对照组和OGD-小胶质细胞移植组各自的缺血半暗带的每1μm3的体积(μm3)，即表述为比率。
经OGD预处理的小胶质细胞移植组中的缺血性半暗带中的SMI31的表达显著高于无细胞对照组中的表达。
经OGD预处理的小胶质细胞移植组中，缺血性半暗带的另一轴突生长标记物GAP43的表达显著高于无细胞对照组中的表达。相对地，这些组之间，缺血性半暗带中的MAP2的表达没有发现显著差异。
为了确定移植经OGD预处理的小胶质细胞促进轴突生长的机理，本发明人评价了硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)的表达。这是因为其抑制轴突生长，并通过MMP-9而被切断和降解。
为了确认通过移植经OGD预处理的小胶质细胞而增加MMP-9的表达诱导了CSPG的表达的减少并引起轴突生长的假设，本发明人使用抗CSPG/NG2抗体实施免疫荧光染色(NG2为CSPG的主成分)。
图10示出伪手术组大鼠中缺血后第28天的来自大脑皮质的硫酸软骨素蛋白聚糖/神经元胶质抗原2(CSPG/NG2)的相对强度。该大脑皮质包括无细胞对照组的皮质、和经OGD预处理的小胶质细胞移植组的皮质。
如图10所示那样，在脑缺血后第28天的移植的大鼠和伪手术组的大鼠之间对比CSPG/NG2的水平。利用共聚焦显微镜的评价中，表明在移植后第21天(脑缺血后第28天)，经OGD预处理的小胶质细胞移植组的缺血性半暗带中的CSPG/NG2的表达显著低于伪手术组和无细胞对照组中的表达。
图11示出脑缺血后移植经OGD预处理的小胶质细胞的机理。
经OGD预处理的小胶质细胞移植引起VEGF、TGF-β和MMP-9的直接分泌。这些因子可能是由于通过经OGD预处理的小胶质细胞分泌的重塑因子而由驻留细胞分泌的旁分泌引起的。这些因子在缺血核心直接促进血管新生。缺血核心被定义为MAP2-免疫阴性部位，其由不可逆的血管新生阴性缺血核心和示出血管新生的血管新生阳性缺血核心组成。
来自小胶质细胞的MMP-9减少轴突生长抑制因子CSPG的表达。因此，可以容易地诱导轴突生长。VEGF、TGF-β和MMP-9可以直接诱导轴突生长。
单核细胞从脑血管穿过BBB达至脑实质，并且分化为小胶质细胞。由于单核细胞能够容易地由外周血采集，因此能够比小胶质细胞更低侵入性地获得。因此，通过使包含单核细胞的外周血单个核细胞(PMNC)级分经受OGD处理是否可以得到与小胶质细胞相同的效果通过移植了大鼠PMNC(1×106个)的局灶性脑缺血大鼠模型中的感觉运动评价而验证。
结果示于图13。无OGD刺激的PMNC给药组(normoxia)中发现与细胞非给药组(PBS对照)相比没有显著差异，但在OGD刺激PMNC给药组(OGD)中，在缺血处理后第28天观察到显著的症状改善。
接着，通过改变要移植的PMNC数来调查OGD刺激的效果对细胞数的依赖性。
结果示于图14。OGD刺激PMNC给药组中，在缺血处理后第28天，以细胞数依赖性的方式观察到显著的症状改善。
接着，为了评价通过移植OGD刺激PMNC的脑缺血病变部中的血管新生和神经轴突生长，对该病变部和其附近的组织切片进行免疫染色。作为一抗，分别将抗CD31抗体用于评价血管新生，并且将抗SMI31抗体用于评价轴突生长。
结果示于图15和16。1×106个OGD刺激PMNC给药组(OGD-PMNC 10＾6)示出与无OGD刺激的PMNC给药组(norm)相比显著促进了血管新生和轴突生长。
接着，使用人PMNC并使用VEGF的产生量和分泌量作为指标来评价OGD刺激相对于仅缺氧刺激(OD)和仅缺氧刺激(GD)的优越性。将人PMNC用OD、GD或OGD刺激18小时，并且通过蛋白质印迹对细胞中的VEGF量和培养上清液中的VEGF量(分泌量)进行定量。对于培养上清液，还通过ELISA来对VEGF进行定量。
结果示于图17。即使仅OD刺激，细胞的VEGF产生量也与无OGD刺激的PMNC给药组(norm)相比倾向于增加。仅GD刺激时的水平更高，OGD刺激示出更高的水平，并且相对于无OGD刺激的PMNC给药组(norm)，VEGF产生量显著增加。另一方面，培养基中的分泌量通过仅OD刺激没有显示出相对于对照的明显差异，而即使通过仅GD刺激，也发现相对于对照的增加倾向。通过OGD刺激，VEGF分泌量进一步增加，并且不仅相对于对照，而且相对于仅OD刺激，也显示出显著差异。
接着，示出脑出血的治疗方案的一个实例，其中从在脑出血患者的血肿去除手术过程中移除的血肿周围的被破坏的白质中分离小胶质细胞，并将该小胶质细胞用OGD刺激，并再移植给该患者。
在神经内窥镜观察下抽吸去除血肿后，鉴定出血血管并实施止血。清洗血肿腔，并用镊子采集被破坏的白质。解离该白质的细胞后，通过使用抗CD115抗体的MACS或FACS，分离小胶质细胞。所得小胶质细胞用OGD刺激18小时，将1×106个小胶质细胞悬浮在PBS中，并对患者静脉内给药。
(总结)
如上所述，在上述实施例中，可以通过将包含小胶质细胞或单核细胞的细胞群在OGD条件下培养，从而制造包含用于治疗脑梗死、促进血管新生或促进轴突生长的培养物的细胞制剂。此外，可以通过OGD来改善治疗效果。
由使用人PMNC的实施例可清楚看出，为了对小胶质细胞和单核细胞赋予促进血管新生和/或轴突生长的能力，仅需要对细胞群施加使该细胞群接近缺血状态的刺激。因此，可以在低氧浓度或低糖浓度的条件下培养细胞群。优选在至少低糖浓度的条件下培养细胞群，并且更优选在OGD的条件下、即低氧浓度和低糖浓度的条件下培养细胞群。
由使用大鼠和人PMNC的实施例可清楚看出，由于从血管转移至脑实质的单核细胞变为小胶质细胞，因此可以与小胶质细胞一起或替代小胶质细胞，将包含单核细胞的细胞群在OGD的条件下培养。细胞群包含单核细胞时，该细胞群可以是包含外周血细胞或其细胞级分例如从外周血采集的单个核细胞的级分。由于没有必要采集脊髓液用于制造细胞制剂，因此能够减轻治疗脑梗死中的患者的负担，并且能够提高安全性。上述专利文献1的情况中，由于采集间充质干细胞，因此无法获得充分数量的细胞，并且需要增殖该细胞，其不仅增加了培养时间，而且还要求诸如细胞加工中心(CPC)等特殊设施。但是在本发明中，由于单核细胞可以容易地从外周血采集，不需要增殖，可以缩短培养时间，并且可以在不具有CPC的实施移植的医疗机构内制备移植细胞。
上述实施例中，通过在OGD中使低氧室内的氧浓度在1小时内减少至低于1%、在4小时内减少至0.1~0.4%并维持该浓度，可以对小胶质细胞和PMNC赋予对于脑缺血大鼠模型中的脑功能恢复而言充分的血管新生和轴突生长促进活性。这意味着培养氛围中的低于1%至0.4%的平均氧浓度对于实现本发明的效果而言是充分的。类似地，上述实施例中，通过将糖浓度设为1.0g/L，能够对小胶质细胞和PMNC赋予上述活性。这意味着培养基中的1.0g/L以下的糖浓度对于实现本发明的效果而言是充分的。
上述实施例中，在OGD的条件下培养细胞群18小时。但是，这样的培养时间是一个实施方式，并且可以低于24小时。这是因为，如上所述，M2小胶质细胞在24小时内增加到最大，然后显著减少，并进一步在24小时内引起细胞死亡。
根据上述实施例而制备的细胞制剂典型地是用于治疗脑梗死的细胞制剂。该细胞制剂只要小胶质细胞或单核细胞能够到达缺血部位，则不仅对脑梗死，而且对任何缺血性疾病都显示出治疗效果。例如，它还对心肌梗死、肺梗死或肾梗死等显示出治疗效果。
根据本发明的一个实施方案的用于制造细胞制剂的方法可以包括培养物的清洗等。
图12是示出细胞制剂的制造方法的流程图。
通过将含有小胶质细胞和/或单核细胞的细胞群在低氧浓度和/或低糖浓度的条件下进行培养，从而制造培养物(步骤S1)。然后，清洗该培养物(步骤S2)。具体而言，将因OGD而被杀死的粒细胞或残骸通过离心力而与培养物分离，并清洗该培养物。然后，将该培养物封入袋中，从而制造细胞制剂(步骤S3)。
本发明还可以是通过将根据图12的流程图制造的细胞制剂向患者给药，从而治疗缺血性疾病(例如脑梗死)的方法。该情况中，在图12的步骤S3中，例如将约1×108个细胞封入40mL的袋中。通过将该细胞制剂静脉内给药例如30分钟至1小时，从而实施移植。细胞制剂可以不仅静脉内给药，还可以动脉内或脑脊髄腔内等给药。此外，还可以腰椎穿刺给药、脑内给药、脑室内给药或者局部给药。
治疗人的方法中，在图12所示的步骤S1前，从患者采集外周血，并从该外周血中分离包括单核细胞的细胞群。即，该细胞群是从外周血采集的包含单核细胞的级分。或者，该细胞群是从外周血采集的包含单个核细胞的级分。然后，通过将该细胞群在OGD的条件下培养从而制造细胞制剂，并向患者给药。该情况中，对作为患者的人的负担极小，并且提供了高安全性的效果。此外，不需要生长单核细胞和添加药物。进一步，由于培养时间短，因此能够从发病早期起进行治疗。此外，即使从发病起已经过一段时间，也可期待治疗效果。进一步，该治疗以低成本完成，并且即使通过静脉内给药也是有效的。
在用于治疗除了人之外的动物的方法中，在图12所示的步骤S1前，例如，如上述实施例(原代细胞培养)所示那样，从除了人之外的动物的脑采集小胶质细胞，并将包含该小胶质细胞的细胞群在OGD的条件下培养。通过该培养而制造细胞制剂，并且对作为患者的除了人之外的动物给药。本说明书中，当简单记载为患者时，该患者是指人和非人动物。
此外，根据上述实施例而制造的细胞制剂中包含的培养物是在OGD的条件下培养的小胶质细胞和/或单核细胞。以该方式培养的小胶质细胞或单核细胞即使考虑申请时的公知技术常识，也无法以结构的形式来规定，或者至少以结构的形式来规定是不现实的。因此在随附的权利要求书的范围内，可以通过制造方法来鉴定该小胶质细胞或单核细胞。
尽管已基于实施例说明了根据本发明的一个实施方式所述的细胞制剂、该细胞制剂的制造方法、和治疗方法，但本发明不限于该实施例。只要不偏离本发明的主旨，则本领域技术人员进行了各种改变的实施例也包括在本发明中。此外，本文中引用的所有出版物和专利文献均以参考的方式整体并入本文中。
工业实用性
本发明的细胞制剂对缺血性疾病的功能恢复有显著效果，并且可以用作该疾病的药物。

Claims (10)

1.制造用于促进血管新生或轴突生长的细胞制剂的方法，其包括：将含有小胶质细胞和/或单核细胞的细胞群在低于1%的低氧浓度和1.0g/L以下的低糖浓度的条件下培养12小时以上且小于24小时，由此制造具有促进血管新生和轴突生长的能力的小胶质细胞和/或单核细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞制剂用于治疗脑血管疾病、缺血性心脏病或创伤性脑损伤和脊髓损伤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述含有单核细胞的细胞制剂是外周血细胞或其细胞级分。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述含有单核细胞的细胞群是从外周血采集的含有单个核细胞的级分。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，低氧浓度是0.1-0.4%的氧浓度。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述培养期为约18小时。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括：清洗所述培养物，并将其封入容器中。
8.用于治疗脑血管疾病、缺血性心脏病或创伤性脑损伤和脊髓损伤的细胞制剂，其包含通过根据权利要求1~7中任一项所述的方法制造的培养物。
9.用于促进血管新生和轴突生长的细胞制剂，其包含通过根据权利要求1~7中任一项所述的方法制造的培养物。
10.在低于1%的低氧浓度和1.0g/L以下的低糖浓度的条件下培养12小时以上且小于24小时的小胶质细胞和/或单核细胞在制备细胞制剂中的用途，该细胞制剂用于治疗脑血管疾病、缺血性心脏病或创伤性脑损伤和脊髓损伤。
CN201780067469.9A 2016-08-30 2017-08-30 细胞制剂和细胞制剂的制造方法 Active CN109963573B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016168543 2016-08-30
JP2016-168543 2016-08-30
PCT/JP2017/031246 WO2018043596A1 (ja) 2016-08-30 2017-08-30 細胞製剤および細胞製剤の製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109963573A CN109963573A (zh) 2019-07-02
CN109963573B true CN109963573B (zh) 2022-08-30

Family

ID=61300937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780067469.9A Active CN109963573B (zh) 2016-08-30 2017-08-30 细胞制剂和细胞制剂的制造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11311579B2 (zh)
EP (1) EP3508207B1 (zh)
JP (1) JP7089283B2 (zh)
KR (1) KR20190042684A (zh)
CN (1) CN109963573B (zh)
WO (1) WO2018043596A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113243332B (zh) * 2020-02-07 2023-07-28 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种广泛脑区神经元树突发育障碍动物模型的制备与应用
IT202100006569A1 (it) * 2021-03-18 2022-09-18 Hemera S R L Metodo per ottenere macrofagi rigenerativi educati dal tumore e loro uso nella medicina rigenerativa
CN117500915A (zh) * 2021-03-29 2024-02-02 公益财团法人神戸医疗产业都市推进机构 细胞制剂的制造方法及用于其的低氧刺激用容器

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102641293A (zh) * 2011-02-21 2012-08-22 杨子江 用于治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102087366B1 (ko) 2007-09-11 2020-03-10 훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠 조직 복구 및 재생을 위한 세포 증식 방법 및 약제학적 제제
JP5725509B2 (ja) 2009-04-07 2015-05-27 国立大学法人旭川医科大学 単核球由来の新規血管再生細胞群及びその分化誘導法
JP6519038B2 (ja) 2014-02-26 2019-05-29 株式会社生命科学インスティテュート 脳梗塞治療のための多能性幹細胞
JP6583830B2 (ja) 2014-10-29 2019-10-02 国立大学法人山口大学 末梢血単核球又は末梢血単核球より分泌される因子を伴う線維芽細胞を含む細胞シート

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102641293A (zh) * 2011-02-21 2012-08-22 杨子江 用于治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Differential cytokine expression by brain microglia/macrophages in primary culture after oxygen glucose depriviation and their protective effects on astrocytes during anoxia;Barakat et al.;《Fluids and Barriers of the CNS》;20150228;摘要、Figure 1、Conclusion *
Microglia preconditioned by oxygen-glucose depriviation promote functional recovery in ischemic rats;Kanazawa et al.;《Scientific Reports》;20170214;全文 *
Neuroprotection by NGF in the PC12 in vitro OGD model: involvement of mitogen-activated protein kinases and gene expression;Tabakman et al.;《Annals of the New York Academy of Sciences》;20050831;全文 *
The good and bad of microglia/macrophages: new hope in stroke therapeutics;Huang et al.;《Acta Pharmacologica Sinica》;20121224;第6页右栏第一段、第7页左栏、中栏 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3508207A4 (en) 2020-03-18
US20190216856A1 (en) 2019-07-18
WO2018043596A1 (ja) 2018-03-08
EP3508207B1 (en) 2021-08-11
CN109963573A (zh) 2019-07-02
JP7089283B2 (ja) 2022-06-22
JPWO2018043596A1 (ja) 2019-08-08
KR20190042684A (ko) 2019-04-24
US11311579B2 (en) 2022-04-26
EP3508207A1 (en) 2019-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8119398B2 (en) Adipose-derived stem cells for tissue regeneration and wound healing
Wang et al. Stem cell therapies in age-related neurodegenerative diseases and stroke
Guan et al. Subretinal transplantation of rat MSCs and erythropoietin gene modified rat MSCs for protecting and rescuing degenerative retina in rats
RU2535966C2 (ru) Клеточная терапия ишемической ткани
US20080131405A1 (en) Composition for treating a disease caused by neuronal insult comprising a human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell as an active ingredient
CN109963573B (zh) 细胞制剂和细胞制剂的制造方法
US20200030380A1 (en) Stimulation of therapeutic angiogenesis by t regulatory cells
JP2015159895A (ja) 脳梗塞治療のための多能性幹細胞
Zhu et al. Transplantation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth decreases cognitive impairment from chronic cerebral ischemia by reducing neuronal apoptosis in rats
DE10347436A1 (de) In vitro Verfahren zur Diagnose der kardiovaskulären Funktionalität von Knochenmarks-Vorläuferzellen (BMP) und/oder Blut-abgeleiteter zirkulierender Vorläuferzellen (BDP)
Usach et al. Systemic transplantation of bone marrow mononuclear cells promotes axonal regeneration and analgesia in a model of Wallerian degeneration
AU2015284180B2 (en) Gonad-derived side population stem cells
US10874723B2 (en) Cell therapy for the treatment of neurodegeneration
JP2018111722A (ja) 脳梗塞治療のための多能性幹細胞
WO2014057097A1 (en) Modulated mesenchymal stem cells for cardiac cell therapy
KR20240012562A (ko) 소규모 뇌졸중에 대한 세포 치료법 및 치료 방법
JP6203273B2 (ja) 虚血血清を含む幹細胞活性化促進用組成物及び幹細胞の活性化促進方法
Jendelova et al. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury
WO2005097170A1 (ja) 血管新生促進剤および血管新生療法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant