CN103952373A - 非常小的胚胎样(vsel)干细胞及分离和利用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及非常小的胚胎样(VSEL)干细胞及分离和利用其的方法。当前披露的主题提供了从骨髓、外周血、和／或其它来源纯化的干细胞群。还提供了将所述干细胞用于治疗受试者中的组织和／或器官损伤的方法。

Description

非常小的胚胎样(VSEL)干细胞及分离和利用其的方法
本申请是国际申请日为2006年11月2日的国际申请PCT／US2006／042780进入中国、申请号为200680052508.X的题为“非常小的胚胎样(VSEL)干细胞及分离和利用其的方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
这个申请要求于2005年12月8日提交的美国临时专利申请系列No.60／748,685的权益；其披露的全部内容以引用方式结合于此。
技术领域
当前披露的主题总体上涉及从骨髓、脐带血、和／或其它来源分离的干细胞群并且在本文中被称为非常小的胚胎样(very smallembryonic-like)(VSEL)干细胞的鉴定、分离及应用。更具体地，当前披露的主题涉及分离所述VSEL干细胞并且(可选地在体外处理后)将其用于治疗需要其的受试者中的组织和／或器官损伤。
背景技术
干细胞和干细胞衍生物的应用已经在医药研究中，尤其在提供用于治疗由于遗传缺陷、创伤、和／或疾病过程的任何一个造成的组织损伤的试剂领域中获得提高的兴趣。理想地，能够分化为受影响的细胞类型的细胞可以被移植入需要其的受试者中，其中它们将与器官微环境相互作用并供应必须的细胞类型以修复损伤。
已经付出了相当多的努力以从大量不同的组织中分离干细胞用在再生医药中。例如，给予Tsukamoto et al.的美国专利No.5,750,397披露了据报道能够分化为淋巴系、红(erythroid)系、和粒单(myelomonocytic)系的人类造血干细胞的分离和生长。给予Bruder et al.的美国专利No.5,736,396披露了用于在合适的生长和／或分化因子的影响下分离的人类间充质干细胞的谱系(lineage)-引导的分化的方法。随后可以将所述得到的细胞引入宿主用于间充质组织再生或修复。
强烈感兴趣的一个领域涉及胚胎干(ES)细胞的应用，其已经在小鼠中显示具有分化为动物的所有不同的细胞类型的潜能。小鼠ES细胞源自胚泡期的早期小鼠胚胎的内细胞群的细胞，并且其它多能和／或全能细胞已经从胚(germinal)组织(如原始生殖细胞；PGC)分离。这些多能和／或全能干细胞以未分化状态在体外增殖、保持正常核型、以及保持分化为全部的三个胚层(内胚层、中胚层及外胚层)的衍生物的潜能的能力使得这些细胞作为细胞的潜在来源用在出生后受试者的再生治疗中是有吸引力的。
人类ES(hES)细胞的开发还不及对小鼠ES细胞进行的进展成功。Thomson et al.报道了来自低等灵长类(美国专利No.5,843,780；Thomsonet al.(1995)92Proc Natl Acad Sci USA7844-7848)、以及来自人类(Thomson et al.(1998)282Science1145-1147)的多能干细胞。Gearhartet al.产生了来自胎儿性腺组织的人类胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblottet al.(1998)95Proc Natl Acad Sci USA13726-13731；及美国专利No.6,090,622)。hES和hEG细胞均具有多能干细胞的理想特征，在于它们能够在体外增殖而不分化，它们通常维持正常的核型，并且它们仍然能够分化为多种不同的细胞类型。无性(clonally)来源的人类胚胎干细胞系在培养中长期维持多能性和增殖潜能(Amit et al.(2000)227DevBiol271-278)。
ES细胞或其它多能细胞用于受试者中再生治疗的一个重大挑战是控制细胞生长和分化为受试者治疗所需的特定细胞类型。已有许多生长因子对ES细胞分化的影响的报道。例如，Schuldiner et al.报道了八种生长因子对细胞从hES细胞分化为不同细胞类型的影响(参见Schuldineret al.(2000)97Proc Natl Acad Sci U SA11307-11312)。如其中所披露的，在开始通过胚状体样(embryoid body-like)形成的分化后，在bFGF、TGFβ1、Activin-A、BMP-4、HGF、EGF、βNGF、或视黄酸的存在下培养细胞。每种生长因子对分化途径具有独特的影响，但是没有生长因子排他地指导分化为一种细胞类型。
理想地，能够从受试者分离和纯化干细胞和／或前体细胞是有益的，所述细胞能够在被再引入受试者用于治疗目的之前被纯化和／或体外处理。受试者的自身细胞的应用将消除采用辅助免疫抑制治疗的需要，由此维持受试者免疫系统的能力。然而，用于分离ES细胞系，尤其是hES细胞系的目前的策略排除了从受试者分离细胞并将它们再引入相同的受试者。
因此，对于来自成年动物的其它干细胞类型的研究继续。例如，间充质干细胞(MSC)是一种这样的细胞类型。已经显示MSC具有分化为包括骨(Haynesworth et al.(1992)13Bone81-88)、软骨(Mackay etal.(1998)4TissueEng415-28；Yoo et al.(1998)80JBone Joint Surg Am1745-57)、脂肪组织(Pittenger etal.(2000)251Curr Top MicrobiolImmunol3-11)、腱(Young et al.(1998)16J Orthop Res406-13)、肌肉及间质(Caplan et al.(2001)7Trends Mol Med259-64)的多个谱系的潜能。
另一细胞群，多能成年祖细胞(MAPC)也已经从骨髓纯化(BM；Reyes et al.(2001)98Blood2615-2625；Reyes&Verfaillie(2001)938AnnNY Acad Sci231-235)。这些细胞已经显示能够在体外扩展为超过100群倍增(100population doubling)而没有端粒缩短或核型异常的发展。已经显示MAPC在限定的培养条件下能够分化为各种间充质细胞类型(如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞及骨骼成肌细胞)、内皮、神经外胚层细胞、以及更最近的，分化为肝细胞(Schwartz et al.(2000)109JClin Invest1291-1302)。
此外，已报道造血干细胞(HSC)能够分化为多种细胞类型。已报道BM造血干细胞能够“转分化(transdifferentiate)”为表达早期心(Orlicet al.(2003)7Pediatr Transplant86-88；Makino et al.(1999)103J ClinInvest697-705)、骨骼肌(Labarge&Blau(2002)111Cell589-601；Cortiet al.(2002)277Exp Cell Res74-85)、神经(Sanchez-Ramos(2002)69Neurosci Res880-893)、肝(Petersen et al.(1999)284Science1168-1170)、或胰腺细胞(lanus et al.(2003)111JClin Invest843-850；Lee&Stoffel(2003)111J Clin Invest799-801)标记物的细胞。在人类体内实验中还表明CD34+外周血(PB)干细胞的移植导致供体-来源的肝细胞(Korblinget al.(2002)346N Engl J Med738-746)、上皮细胞(Korbling et al.(2002)346N Engl J Med738-746)、和神经元(Hao et al.(2003)12J HematotherStem Cell Res23-32)的出现。此外，已显示人类BM-来源的细胞有助于梗塞的心肌的再生(Stamm et al.(2003)361Lancet45-46)。
这些报道已经被解释为成年干细胞的转分化或可塑性现象存在的证据。然而，成年组织特异性干细胞的转分化的概念目前在科学和医药界内是广泛争议的主题(参见，如，Lemischka(2002)30Exp Hematol848-852；Holden&Vogel(2002)296Science2126-2129)。试图再生的研究结果表明借助神经干细胞的转分化是不成功的(Castro et al.(2002)297Science1299)。还显示肌肉组织中发现的造血干／祖细胞(HSPC)起源于BM(Mckinney-Freeman et al.(2002)99Proc Natl Acad Sci USA1341-1346；Geigeret al.100Blood721-723；Kawada&Ogawa(2001)98Blood2008-2013)。此外，借助涉及单独的HPC移植入致命照射的小鼠的嵌合动物的研究表明循环HPSC和／或它们的子代的转分化和／或可塑性，如果它完全存在，是极稀有的事件(Wagers et al.(2002)297Science2256-2259)。
因此，持续存在产生适于多种应用(包括但不限于治疗多个器官和／或组织的损伤和／或疾病)的可移植细胞群的新方法的需要。
发明内容
这个总结列出了当前披露的主题的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变体和改变。这个总结仅是许多和改变的实施方式的示例。提及的给定实施方式的一个或更多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以伴随或不伴随提及的特征而存在；同样地，那些特征可以应用到当前披露的主题的其它实施方式，不管在这个，总结中是否列出。为了避免过多重复，这个总结没有列出或建议这样的特征的所有可能组合。
当前披露的主题提供了用于从非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物的群体形成胚状体样球体(embryoid body-like sphere)的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群；以及(b)在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中培养VSEL干细胞或其衍生物达足以使胚状体样球体形成的时间。在一些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物包含CD34+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-非常小的胚胎样(VSEL)干细胞。在一些实施方式中，VSEL干细胞的直径约为3-4μm，表达SSEA-1、Oct-4、Rev-1、和Nanog的至少一种，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核，并且具有开放型染色质(常染色质)。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群从人或从小鼠分离。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群从人或小鼠中选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的组的来源分离。在一些实施方式中，诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个生长因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2及其组合。在一些实施方式中，通过将VSEL干细胞或其衍生物与C2C12细胞共培养将一个或更多个因子提供给VSEL干细胞或其衍生物。
在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括通过下述方法分离包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群，所述方法包括下述步骤：(a)提供怀疑包含CD45-干细胞的初始细胞群；(b)在足以允许每个抗体与在初始细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下将所述细胞群与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触；(c)选择为CD34+或Sca-1+、并且CD45-的细胞的第一亚群；(d)在足以允许每个抗体与在细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下将所述细胞的第一亚群与对于一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，所述标记物选自由CD45R／B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119组成的组；(e)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(f)收集为CD34+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-的细胞的第二亚群，由此分离CD45-干细胞的亚群。在一些实施方式中，每个抗体包括可检测的标记。在一些实施方式中，所述可检测的标记包括荧光标记或者可以通过包含荧光标记的试剂被检测的部分。在一些实施方式中，所述分离包括FACS分类。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离为c-met+、c-kit+、和／或LIF-R+的那些细胞。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离表达选自由SSEA-1、Oct-4、Rex-1及Nanog组成的组的一个或更多个基因的那些细胞。在一些实施方式中，细胞群包括骨髓样品、脐带血样品、或外周血样品。
在当前披露的主题的一些实施方式中，在用足以将包含VSEL干细胞的CD45-干细胞从骨髓移动到受试者的外周血的量的移动剂处理受试者后，所述细胞群从受试者的外周血分离。在一些实施方式中，所述移动剂包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗剂的至少一种。在一些实施方式中，CXCR4拮抗剂是T140肽。在一些实施方式中，所述受试者是小鼠。
在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括将干细胞的亚群与结合到CXCR4的抗体接触以及从干细胞的亚群分离为CXCR4+的那些细胞。
在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离为CXCR4+和／或AC133+的那些细胞。
在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括选择为HLA-DR-、MHCI类-、CD90-、CD29-、CD105-、或其组合的那些细胞。
当前披露的主题还提供了包含多个非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的胚状体样球体。
当前披露的主题还提供了包含本文披露的胚状体样球体的细胞培养物。在一些实施方式中，本文披露的胚状体样球体在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中提供。
当前披露的主题还提供了用于将非常小的胚胎样(VSEL)干细胞分化为感兴趣的细胞类型的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体；以及(b)在包含分化诱导量的一个或更多个因子的培养基中培养胚状体样球体直到培养基中出现感兴趣的细胞类型，所述因子诱导VSEL干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型是神经元细胞或其衍生物。在一些实施方式中，神经元细胞或其衍生物选自由少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞及神经元组成的组。在一些实施方式中，所述神经元细胞或其衍生物表达选自由GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1及Olig2组成的组的标记物。在一些实施方式中，所述培养持续至少约10天。在一些实施方式中，所述培养基包括约10ng／ml rhEGF、约20ng／ml FGF-2及约20ng／ml NGF。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为内胚层细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述培养包括在包含Activin A的第一培养基中培养胚状体样球体；以及其后在包含N2补充物-A(N2supplement-A)、B27补充物(B27supplement)及约10mM烟酰胺(nicotinamide)的第二培养基中培养胚状体样球体。在一些实施方式中，在第一培养基中的培养持续约48小时。在一些实施方式中，在第二培养基中的培养持续至少约12天。在一些实施方式中，内胚层细胞或其衍生物表达选自由Nkx6.1、Pdx1及C-肽组成的组的标记物。在一些实施方式中，感兴趣的细胞类型为心肌细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述培养持续至少约15天。在一些实施方式中，所述培养基包括碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及转化生长因子β1的组合，数量足以造成胚状体样球体细胞的亚组分化为心肌细胞。在一些实施方式中，所述心肌细胞或其衍生物表达选自由Nsx2.5／Csx和GATA-4组成的组的标记物。
在当前披露的方法的一些实施方式中，所述胚状体样球体通过下述制备：(a)提供包含VSEL干细胞的CD45-细胞群；以及(b)在包含一个或更多个诱导VSEL细胞的胚状体样球体形成的因子的培养基中培养VSEL干细胞达到足以使胚状体样球体出现的时间。
当前披露的主题还提供了包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的本文披露的分化的非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的制剂。在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂用于人类中是可接受的。
当前披露的主题还提供了用于治疗受试者中组织损伤的方法。在一些实施方式中，所述方法包括给予受试者包括在药学上可接受的载体中包含VSEL干细胞的多个分离的CD45-干细胞的组合物，数量和经由的途径足以允许CD45-干细胞群的至少一部分结合(engraft)所述组织并且在其中分化，由此治疗损伤。在一些实施方式中，所述损伤选自由缺血性损伤、心肌梗塞及中风组成的组。在一些实施方式中，受试者为哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物选自由人类和小鼠组成的组。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞的分离的CD45-干细胞从选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合组成的组的来源分离。
在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分化分离的CD45-干细胞以在给予受试者所述组合物之前产生预定的细胞类型。在一些实施方式中，所述预定细胞类型选自由神经细胞、内胚层细胞、心肌细胞及其衍生物组成的组。
当前披露的主题还提供了用于产生嵌合动物的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将一个或更多个包含VSEL干细胞的CD45-干细胞群添加到胚胎，以便一个或更多个CD45-干细胞发育为胚胎的一个或更多个细胞类型。在一些实施方式中，所述添加包括将一个或更多个CD45-干细胞注射入胚泡期胚胎的囊胚腔。在一些实施方式中，所述添加包括聚集包含VSEL干细胞的一个或更多个CD45-干细胞与桑葚胚期胚胎。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括在加入一个或更多个包含VSEL干细胞的CD45-干细胞后孕育胚胎至少直到出生，以提供嵌合动物。
当前披露的主题还提供了用于从CD45-干细胞群纯化非常小的胚胎样(VSEL)干细胞用于感兴趣的细胞类型的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞的CD45-干细胞群；(b)鉴定表达VSEL干细胞的标记物的CD45-干细胞的亚群；以及(c)纯化所述亚群。在一些实施方式中，所述群和所述亚群除了为CD45-，均为CD34+／CXCR4+／lin-或Sca-1+／lin-。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞的CD45-干细胞群从选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合组成的组的来源分离。在一些实施方式中，感兴趣的细胞类型选自由骨骼肌细胞、肠上皮细胞、胰腺细胞、内皮细胞、表皮细胞、黑色素细胞、神经元细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰腺细胞、内皮细胞、上皮细胞、视网膜色素细胞及内胚层细胞组成的组。在一些实施方式中，所述标记物选自由GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、Myf5、MyoD、成肌蛋白(myogenin)、Nsx2.5／Csx、GATA-4、甲胎蛋白(α-fetoprotein)、CK19、Nkx2-3、Tcf4、Nkx6.1、Pdx1、VE-钙粘蛋白、Krt2-5、Krt2-6a、BNC、DCT、TYR及TRP组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为心肌细胞，所述标记物选自由Nkx2.5／Csx、GATA-4、MEF2C组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为内皮细胞，所述标记物选自由VEGFR2、VE-钙粘蛋白、血管性血友病因子(yon Willebrand factor)及TIE2组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为骨骼肌细胞，所述标记物选自由Myf5、MyoD及成肌蛋白组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为肝细胞，所述标记物选自由甲胎蛋白和CK19组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为神经细胞，所述标记物选自由βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、GFAP及巢蛋白组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为胰腺细胞，所述标记物选自由Nkx6.1和Pdx1组成的组。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为黑色素细胞，所述标记物选自由DCT、TYR及TRP组成的组。
当前披露的主题还提供了用于鉴定胚状体样球体形成的诱导剂的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)从已知包含诱导剂的细胞制备包含多个cDNA克隆的cDNA文库；(b)用cDNA文库转化不包含诱导剂的多个细胞；(c)在足以造成VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体的条件下，在转化的多个细胞存在下，培养多个VSEL干细胞或其衍生物；(d)分离包含诱导剂的转化的细胞；(e)从转化的细胞回收cDNA克隆；以及(f)鉴定由回收的cDNA克隆编码的多肽，由此鉴定胚状体样球体形成的诱导剂。在一些实施方式中，已知包括诱导剂的细胞为C2C12细胞。在一些实施方式中，多个cDNA克隆包括位于克隆载体(cDNA克隆被插入其中)中cDNA克隆位点的至少一侧的侧翼的至少一个引物结合位点。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括利用杂交到位于cDNA克隆位点的两侧的侧翼的引物位点的引物扩增转化的细胞中存在的cDNA克隆。在一些实施方式中，所述鉴定是通过对cDNA克隆测序。
当前披露的主题还提供了用于从脐带血或其部分分离包含VSEL干细胞的CD45-干细胞的亚群的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)在足以允许每个抗体与细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下，将脐带血或其部分与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触；(b)选择为CD34+或Sca-1+、并且为CD45-的细胞的第一亚群；(c)在足以允许每个抗体与细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下，将细胞的第一亚群与对于选自由CD45R/B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119组成的组的一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触；(d)从细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(e)收集为CD34+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-/CD45-的细胞的第二亚群，由此分离包含VSEL干细胞的CD45-干细胞的亚群。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括在低张溶液中孵育脐带血或其部分或任何亚群达到足以基本上裂解可能存在的所有红细胞(erythocyte)的时间。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离对于CXCR4、c-met、c-kit、或LIF-R的至少一个为阳性的那些细胞。
因此，当前披露的主题的一个目的是提供新的干细胞群，以及制备和应用其的方法。这个目的和其它目的全部或部分通过当前披露的主题实现。
当前披露的主题的一个目的已经在上面陈述，其他目的将随着结合下述实施例和附图的说明的继续而变得显而易见。
附图说明
图1A和1B描绘了Sca-1+／lin-／CD45-和Sca-1+／lin-／CD45+细胞的透射电子显微镜(TEM)图像。
图1A显示Sca-1+／lin-／CD45-细胞较小并且测量的直径为3-4μm。它们具有由细胞质的窄缘围绕的较大细胞核。在超微水平上，细胞质的窄缘具有一些线粒体、分散的核糖体、内质网的小轮廓、以及一些囊泡。细胞核被包含在具有核孔的核膜内。染色质松散的包装(packed)并由常染色质构成。图1B显示与之相反，Sca-1+／lin-／CD45+细胞表现为异源形态并且较大。它们的平均测量直径为8-10μm，并具有分散的染色质和突出的核仁。
图2描绘了荧光显微图像，描绘了对Sca-1+／lin-／CD45-细胞的表达研究的结果并表明Sca-1+／lin-／CD45-细胞是SSEA-1+并表达Oct-4和Nanog。如左侧所示，通过FACS分离的Sca-1+／lin-／CD45-细胞被评估SSEA-1、Oct-4及Nanog的表达。所有的图像在Plan Apo60XA／1.40油性物镜(Nikon，Japan)下采集。右侧示出了在CS软件(Adobe System Incorporated，San Jose，California，United States ofAmerica)中进行的代表性细胞(箭头)的10x放大的图像。阴性染色对照未示出。对从四个独立类别分离的细胞进行染色。示出了代表性数据。
图3A-3C描绘了对Sca-1+／lin-／CD45-的CXCR4、c-met和LIF-R的表达研究的结果。
图3A描绘了RT-PCR产物在其上分离并用溴化乙锭染色的凝胶的图像，并描绘了Sca-1+／lin-／CD45-中对于CXCR4(泳道(lane)1)、c-Met(泳道3)和LIF-R(泳道5)的mRNA的表达结果。RT-PCR进行30个循环。阴性RT-PCR反应(DNA代替cDNA：泳道2、4和6)。示出了来自三个独立的类别的代表性结果。图3B描绘了通过FACS分离并通过免疫组织化学染色评估CXCR4、c-Met和LIF-R的表达的Sca-1+／lin-／CD45-细胞的荧光显微图像(在Plan Apo60XA／1.40油性物镜(Nikon，Japan)下采集图像)。未示出阴性染色对照。示出了来自四个独立的实验的代表性结果。图3C是描绘了通过包含SDF-1或不包含SDF-1(阴性对照)的滴状物的Sca-1+/lin-／CD45-细胞的化学引诱研究结果。示出了每100μm的滴状物周长的化学引诱的Sca-1+／lin-／CD45-细胞的数量。从三个独立的实验收集数据。*与对照相比p<0.00001。
图4A和4B描绘了FACS分类从不同年龄的动物分离的Sca-1+／lin-／CD45-细胞的结果。
图4A是从源自3周大(上侧)和1岁大的小鼠(下侧)的BMMNC分类的细胞的FACS点图。左侧描绘了鼠BMMNC的点图。作为Sca-1+／lin-(中侧)的来自淋巴门(lymphoid gate)的细胞通过对于CD45表达的FACS进行分类(右侧)。进行三个独立的分类实验(对于每类8只小鼠的BM被收集)。示出了代表性类别。图4B是条形图，描绘了在通过FACS分离来自3周大和1岁大的小鼠的Sca-1+／lin-／CD45-细胞中PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达，并通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR进行比较。进行四个独立的分类实验(对于每类收集8只小鼠的BM)。数据是平均数±SD。*p<0.01vs.来自年老动物的细胞。
图5是条形图，描绘了来自具有相对长的生命期的小鼠品系(C57BL／6)的细胞数量与具有相对短的生命期的小鼠品系(DBA／2J)的细胞数量的比较结果。所述图示出了与C57BL／6小鼠相比，DBA/2J小鼠中Sca-1+／lin-／CD45-细胞的数量减少。通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR比较通过FACS从三周大DBA/2J和C57BL／6小鼠分离的Sca-1+／lin-／CD45-细胞中PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达。进行三个独立的分类实验(对于每类6只小鼠的BM被收集)。数据是平均数±SD。*p<0.01vs.来自年老DBA／2J小鼠的细胞。
图6A和6B描绘了骨髓单核细胞(BMMNC)的侧群(SP)的分类。
图6A是描绘BMMNC的SP的FACS分类的点图。图6B是条形图，描绘了通过FACS从3周大的小鼠分离的BMMNC、SP、SP Sca-1+／lin-／CD45-、SP Sca-1+／lin-／CD45+、Sca-1+／lin-／CD45-和Sca-1+／lin-／CD45+细胞中的PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达，并通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR进行比较。进行三个独立的分类实验(对于每类，8只小鼠的BM被收集)。数据以平均数±SD表示。*p<0.01vs.来自年老动物的细胞。
图7是四个点图，描绘了细胞的多个亚群的移植结果和这些细胞对长期血细胞生成的贡献。Sca-1+／lin-／CD45-细胞不会有助于长期血细胞生成。Ly5.2小鼠被移植以来自Ly5.1小鼠的104个Sca-1+／lin-／CD45+或2×104个Sca-1+／lin-／CD45-细胞，并且与106个BMMNC Ly5.2细胞一起移植入Ly5.2受体小鼠，在移植后8个月通过FACS评估Ly5.1细胞的存在。上侧描绘了来自外周血的MNC的分析。下侧描绘了来自骨髓的MNC的分析。示出了代表性结果。
图8A和8B描绘了荧光显微图像，描绘了具有对于SSEA-1(图8A；4个图板)或Oct-4(图8B)特异的抗体的Sca-1+／lin-／CD45-BM细胞的ES样球体的染色。
图9A和9B描绘了在C2C12细胞上的GFP+Sca-1+／lin-／CD45-BM细胞的胚状体样球体的形成。
图9A描绘了在实施例20所述的条件下，共培养Sca-1+／lin-／CD45-BM细胞与C2C12细胞后胚状体(EB)-样球体的显微图像。图9B是描绘Sca-1+／lin-／CD45-细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达的荧光显微图像，表明这些胚状体源自从绿色免疫荧光阳性(GFP+)小鼠(购自TheJackson Laboratory,Bar Harbor,Maine,United States of Americ的C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb／J小鼠)分离的纯化Sca-1+／lin-／CD45-BM细胞，并且不是C2C12细胞。
图10是从鼠淋巴结分离的碘化丙啶(propidium iodide)染色的细胞、HSC(造血干细胞；Sca-1+/lin-/CD45+)或VSEL干细胞(Sca-1+/lin-／CD45-)的一系列点图。
图11A-11G是鼠骨髓细胞的FACS分析的系列点图。
图11A是低张裂解后鼠骨髓MNC的点图。图11B是示出了来自R1门(R1gate)用于谱系标记物表达和CD45抗原的细胞的染色的点图。在这个图中，R2示出了谱系-和CD45阴性BM MNC。分析来自R1和R2的细胞的Sca-1的表达和HLA-DR(参见图11C)、MHC I类(参见图11D)、CD29(参见图11E)、CD90(参见图11F)及CD105(参见图11G)抗原的共表达。
图12是来自VSEL干细胞衍生的球体(VSEL-DS)的碘化丙啶染色的细胞的系列点图。示出了三个独立的代表性实施例。
图13描绘了对从D3胚胎干细胞(ED-D3；顶侧)形成的胚状体和从VSEL干细胞(底侧)形成的胚状体样球体进行碱性(alpkaline)磷酸酶(AP)染色的图。
图14描绘了荧光显微图像，表明VSEL干细胞衍生的胚状体样球体表达早期胚胎发育标记物如SSEA-1、GATA-6、GATA-4、FOXD1及Nanog。
图15描绘了在VSEL干细胞衍生的胚状体样球体中存在的细胞的透射电子显微镜图，表明这些细胞在尺寸上大于它们来源的初始VSEL干细胞(图15，上侧)，但仍具有非常原始的包含常染色质的细胞核。图15的中侧描绘了在用SDF-1、HGF／SF及LIF刺激从VSEL干细胞-衍生的胚状体样球体分离的细胞后MAPKp42／44的磷酸化研究结果，表明相应的受体(分别为SDF-1、HGF／SF及LIF)在这些细胞的表面表达。并且最后，图15的下侧描绘了从来自VSEL干细胞衍生的胚状体样球体的细胞的连续传代分离的细胞的RT-PCR分析结果，其揭示了调节胚状体的原肠胚形成的基因(如GATA-6、Cdx2、Sox2、HNF3及AFP)的mRNA的表达增加。
图16A-16C和图17A-17D描绘了荧光显微镜图像，描绘了ES样球体分化为少突胶质细胞(图16A-16C)或神经元(图17A-17D)。细胞用针对巢蛋白的抗体染色，其利用Alexa Fluor594-标记的山羊抗-小鼠IgG第二抗体检测，其给予红色荧光。用抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor488结合物检测细胞中存在的GFP(绿色荧光)，并且细胞核用DAPI染色(蓝色荧光)。
图18A-18C描绘了荧光显微镜图像，描绘了ES样球体分化为表达胰腺细胞的标记物(C-肽)的内胚层细胞。
图19A-19C和20A-20D描绘了荧光显微图像，描绘了ES样球体分化为心肌细胞。这些细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)，表明心肌细胞源于由GFP+Sca-1+／lin-／CD45-BM细胞形成的胚状体。细胞用针对肌钙蛋白I或α横纹肌辅肌动蛋白的抗体染色(分别为图19和20)，其利用Alexa Fluor594-结合的第二抗体检测，其给予红色荧光。用抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor488结合物检测细胞中存在的GFP(绿色荧光)，细胞核用DAPI染色(蓝色荧光)。
图21A-21C描绘了对来自单VSEL干细胞衍生的球体的细胞进行RT-PCR的结果，其表明这些细胞可以分化为心肌细胞(中胚层；参见图21A)、神经细胞和少突胶质细胞(外胚层；参见图21B)及胰腺或肝细胞(内胚层；参见图21C)。
图22A-22I描绘了表明培养的细胞中心脏-特异性抗原的表达的免疫荧光和透射共聚焦显微镜照片。
图22A-22C和22D-22F描绘了其中Sca-1+／lin-／CD45-BMMNC被培养的培养板的图像。具有Sca-1+／lin-／CD45-细胞的板中的许多细胞对于心脏-特异的肌球蛋白重链是阳性的(图22B、22C、22E及22F；绿色荧光)。这些心脏-特异性肌球蛋白重链-阳性的细胞中的许多对于心脏肌钙蛋白I也是阳性的(图22D和22F[箭头]；红色荧光)。图22G-22I是其中Sca-1+／lin-／CD45+细胞被培养的培养板的图像。这些细胞对于前述心脏-特异性抗原的表达基本上是阴性的(参见图22H)。通过DAPI染色鉴定图22A-22I中的每个的细胞核(蓝色荧光)。比例尺(Scale bar)=20μm。
图23描绘了Sca-1+／lin-／CD45-细胞的FACS分类结果，表明能够被分类的这些细胞的产量随着供体动物的年龄而降低。
图24是描绘作为年龄的函数的小鼠骨髓中存在的VSEL干细胞(左侧)和HSC(右侧)的百分数的两幅图。
图25是两幅图，描绘了从较老的小鼠分离的VSEL干细胞形成胚状体样球体的能力下降(左侧)以及根据小鼠(细胞从其分离)的年龄的VSEL干细胞的培养物中CD45+细胞的百分数增加(右侧)。
图26为从5周大的小鼠(左侧)与2.5岁大的小鼠(右侧)分离的VSEL干细胞的不同表达模式。在左侧中，示出了免疫荧光和透射共聚焦显微镜图像，表明来自5周大的小鼠的培养的细胞中不同造血抗原的表达。在右侧中，示出了在从2.5岁大的小鼠分离的VSEL干细胞中，CD45被表达并且所述细胞能够在甲基纤维素培养基中的第二培养基中生长造血集落。
图27A-27B描绘了人类脐带血的FACS分类结果。
图27A示出了人类CB包含表达CXCR4(0.037+0.02％，n=9)、CD34(0.118+0.028％，n=5)及CD133(0.018+0.008％，n=5)的lin-／CD45-MNC群。图27B表明这些CXCR4+／CD133+／CD34+／lin-／CD45-细胞非常小(约3-5μm；图27B，上侧)，而CB-来源的lin-／CD45+造血细胞较大(>6μm；图27B，下侧)。
图28A-28C描绘了对来自人类脐带血的分类的细胞的基因表达研究结果。
图28A和28B是条形图，显示通过FACS分类的CB-来源的CXCR4+／CD133+／CD34+／lin-／CD45-细胞、以及CXCR4+/lin-／CD45-、CD34+／lin-／CD45-、以及CD133+/lin-／CD45-／细胞高度富集由多能胚胎细胞表达的转录因子如Oct-4和Nanog的mRNA。图28C示出了确认FACS分析的RT-PCR结果。
图29描绘了CB-VSEL干细胞的免疫荧光染色结果，表明高度纯化的CB-来源的CXCR4+/lin-／CD45-细胞在它们的表面上表达SSEA-4并且在细胞核内表达Oct-4和Nanog转录因子。
图30描绘了三种不同的CB-VSEL干细胞的光学显微(photomicroscopic)图片，表明这些细胞非常小～3-5μm，并包含相对大的细胞核和具有许多线粒体的细胞质的窄缘。这些细胞的细胞核中的DNA包含作为多能胚胎干细胞的特征的开放型常染色质。
图31A-31C描绘了光学显微图片，表明来源于GFP+小鼠的VSEL干细胞-DS如果被平铺在补充有IL-3+GM-CSF的甲基纤维素培养基中可以形成小的第二球体(图31A和31B)。通过从初始甲基纤维素培养基的甲基纤维素溶解回收的这些第二球体制备的单细胞悬浮液，如果再次平铺在甲基纤维素培养基(图31B)或血浆凝块(图31C)中并由IL-3和GM-CSF刺激，形成造血集落。这些为造血集落的证据通过FACS分析来自甲基纤维素中生长的溶解集落的细胞的CD45表达或通过免疫荧光染色来自血浆凝块培养基中生长的集落的细胞的CD45而获得。
图32是用于从人类脐带血分离VSEL干细胞的基于FACS的策略的略图。
序列表的简单描述
SEQ ID Nos：1-64是可以用于扩增多个鼠核酸序列的32个引物对的核苷酸序列，总结于表1中。
表1
用于实时RT-PCR的鼠引物的序列
SEQ ID Nos：65-80是可以用于扩增多种人类核酸序列的8个引物对的核苷酸序列，总结于表2中。
表2
用于实时RT-PCR的人类引物的序列
具体实施方式
本主题现在将参照所附的实施例在下文中更充分地描述，其中示出了当前披露的主题的代表性实施方式。然而，当前披露的主题可以体现在不同的形式中并且不应当被视为限制本文阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式以便这个披露将是彻底和完全的，并且将向本领域技术人员充分传达当前披露的主题的范围。
贯穿说明书和权利要求书，给定的化学式或名称将包括全部的光学异构体和离体异构体及外消旋混合物(其中这样的异构体和混合物存在)。
I.总则
从相对容易地可获得的来源如骨髓(BM)、流动的外周血(mPB)、或脐带血(cord blood)(CB)分离的造血干细胞(HSC)可以随后用作各种固体器官(如心、脑、肝或胰腺)的再生必须的其它干细胞的前体，这个概念造成了科学界的兴奋。已经假定HSC具有胚层-非限制性的可塑性并且可以转分化为来自所有非-造血谱系的干细胞。遗憾的是，第一个有希望的报道表明“HSC”对不同组织再生的巨大贡献没有被其它研究人员再现。
响应于此，科学界在对于干细胞可塑性的观点方面变得极化。已经提议了先前报道的数据的许多可选解释。迅速被接受的第一概念是通过细胞融合现象解释干细胞的可塑性。提出了数据，即，供体-来源的HSC和／或单核细胞可以与受者组织中存在的分化细胞融合，导致在它们的细胞核中具有双倍数量的染色体并表达源自两个“亲代”细胞的细胞表面和细胞质标记物的融合细胞的形成。
干细胞可塑性的另一解释是基于暴露于外部刺激(如，器官损伤、非生理的培养条件、和／或其它应激)的细胞中的外遗传改变的出现。然而，细胞融合和外遗传改变均极罕见，随机存在事件似乎不能充分解释先前公布的阳性“转-去分化”数据。此外，在许多最近公布的研究中，融合被排除作为对观察到的供体来源的嵌合性的主要贡献者。
BM可能包含异质干细胞群的概念令人吃惊地不被认为是涉及干细胞可塑性的讨论的一部分。本文披露的是BM干细胞是异质的并被预期为多能性的直接证据。已经显示BM包含内皮-、骨-、骨骼肌-、心-、肝-、和神经-组织定向干细胞。
然而，这些潜在候选细胞还没有在单细胞水平被很好的表征。如本文披露的，鼠骨髓(BM)包含表达非造血干细胞的标记物的稀有(BMMNC的-0.02％)Sca-1+／lin-／CD45-细胞群。更重要地，这些稀有细胞在体外培养中能够分化为心肌细胞、胰腺细胞及生长神经球(growneurospheres)。这些Sca-1+／lin-／CD45-细胞具有未分化的胚胎样干细胞的形态并表达未分化的胚胎样干细胞的多个标记物。
本文披露的是从鼠骨髓(BM)鉴定和纯化稀有CD34+／lin-／CD45-(人类)或Sca-1+／lin-／CD45-(小鼠)细胞的亚群，在本文中称为“非常小的胚胎样(VSEL)干细胞”。除了为Sca-1+/lin-／CD45-或CD34+／lin-／CD45-，VSEL干细胞还表达多能干细胞(PSC)的标记物，如SSEA-1、Oct-4、Nanog及Rex-1。直接电子显微镜分析表明VSEL干细胞较小(约3-4μm)，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核，并包含开放型染色质(常染色质)，其为典型的胚胎干细胞。VSEL干细胞的数量在来自年轻(～1月大)小鼠的BM中最多，并随着年龄减少。与长寿命的C57BL／6动物相比，它在短寿命的DBA／2J小鼠中也显著减少。VSEL干细胞在体外强烈地响应于SDF-1、HGF／SF及LIF，并表达CXCR4、c-met及LIF-R。这个表达多能-和组织定向干细胞标记物的VSEL干细胞群可以为用于组织和／或器官再生的多能干细胞的来源。
II.定义
本文所用的所有技术和科学术语，除非下面另外定义，意图具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。本文所用的技术参考文献意图涉及本领域通常理解的技术，包括对于本领域技术人员显而易见的那些技术的变体或等效技术的替换。虽然相信下面的术语可以被本领域普通技术人员很好的理解，但是陈述下面的定义以促进当前披露的主题的解释。
根据长期存在的专利法惯例，术语“a”、“an”及“the”用在这个申请(包括权利要求书)中时意味着“一个或更多个”。因此，短语“a stem cell”指的是一个或更多个干细胞，除非上下文清楚地表明其它含义。
本文所用的术语“靶组织”和“靶器官”指的是VSEL干细胞和／或体外分化的VSEL干细胞衍生物在给予受试者后聚集的预定位点。例如，在一些实施方式中，当前披露的主题的方法涉及已经被例如缺血或其它损害损伤的靶组织或靶器官。
本文所用的术语“对照组织”指的是怀疑基本上缺乏给予的细胞的聚集的位点。例如，根据当前披露的主题的方法，未被损害或损伤的组织或器官是代表性的对照组织，其是不同于预定靶组织的组织或器官。例如，如果要被治疗的损伤是心肌梗塞，那么预定的靶组织将是心脏，受试者中基本上所有其它组织和器官可以被认为是对照组织。
本文所用的术语“靶向”(targeting)和“瞄准”(homing)用于描述细胞(例如，VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物)在给予受试者后的体内活性，指的是与对照组织相比细胞在靶组织中的优先移动和／或聚集。
本文所用的术语“选择性靶向”和“选择性瞄准”指的是细胞(例如，VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物)的优先定位，其导致给予的VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在靶组织中的聚集，在一些实施方式中，其是给予的VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在对照组织中的聚集的约2倍，在一些实施方式中，其是给予的VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在对照组织中的聚集的约2倍，在一些实施方式中，给予的VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物的聚集是对照组织中的约5倍或更多，在一些实施方式中，给予的VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物的聚集是对照组织中的约10倍或更多。术语“选择性靶向”或“选择性瞄准”还指的是VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在靶组织中的聚集，伴随在对照组织中的聚集的缺乏，在一些实施方式中，伴随在所有对照组织中的聚集的缺乏。
术语“靶向的缺乏”在本文中用于描述在其中聚集如果存在将是可检测的条件下，基本上没有VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在一个或更多个对照组织中的结合或聚集。所述短语还意图包括在这样的条件下，VSEL干细胞和／或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在一个或更多个对照组织中最小的、背景聚集。
本文所用的术语“受试者”(subject)指的是任何无脊椎动物或脊椎动物物种的成员。因此，术语“受试者”意图包括动物界的任何成员，包括而不限于脊索动物门(即Osteichythyes(多骨鱼)、Amphibia(两栖类)、Reptilia(爬行类)、Aves(鸟类)及Mammalia(哺乳类)纲的成员)，以及其中包括的所有目和科。
类似地，本文披露的所有基因、基因名称、和基因产物意图相应于来自任何物种(对于其本文披露的组合物和方法是可用的)的同源物。因此，所述术语包括而不限于来自人类和小鼠的基因和基因产物。可以理解当来自特定物种的基因或基因产物被披露时，这个披露仅是示意性的，而不被解释为限制，除非其中它出现的上下文清楚地表示。因此，例如，对于表1和2(其分别披露了对于鼠和人类核酸序列的编号Nos.)中列出的基因，意图包括来自其它动物的同源基因和基因产物，所述其它动物包括而不限于其它哺乳动物、鱼、两栖动物、爬行动物及鸟类。
当前披露的主题的方法尤其用于温血脊椎动物。因此，当前披露的主题涉及哺乳动物和鸟类。更具体地预期是分离、处理及利用来自下述哺乳动物的VSEL干细胞，所述哺乳动物如人类和其它灵长类动物，以及由于濒临绝种而重要的那些哺乳动物(如西伯利亚虎)、对于人类经济上重要的那些哺乳动物(农场饲养用于人类消费的动物)和／或社会上重要的那些哺乳动物(作为宠物或在动物园中保留的动物)，例如除了人类外的食肉类(如猫和狗)、猪(swine)(猪(pig)、肉猪(hog)及野猪)、反刍类(如畜牛(cattle)、牛、羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛及骆驼)、啮齿类(如小鼠、大鼠、和兔)、有袋类、以及马。还提供了所披露的方法和组合物对于鸟类的应用，包括处于危险中、置于动物园中、以及禽类的那些种类的鸟类，更具体地为驯养的禽类，如家禽，如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，因为它们对于人类也是经济上重要的。因此，还预期的是来自牲畜的VSEL干细胞的分离、处理及应用，所述牲畜包括而不限于驯养的猪(swine)(猪(pig)和肉猪(hog))、反刍动物、马、家禽等。
本文所用的术语“约”在涉及可测量值如重量、时间、剂量等的量时，意味着包括在一些实施方式中偏离特定量±20％的变化、在一些实施方式中偏离特定量±10％的变化、在一些实施方式中偏离特定量±5％的变化、在一些实施方式中偏离特定量±1％的变化、在一些实施方式中偏离特定量±0.1％的变化，因为这样的变化适于进行所披露的方法。
术语“分离的”在核酸或多肽(包括，例如，肽)的上下文中使用时，表明所述核酸或多肽远离它的天然环境而存在。分离的核酸或多肽可以以纯化形式存在或者可以存在于非天然环境中。
术语“核酸分子”和“核酸”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其聚合物。除非明确地限制，所述术语包括包含具有与参考天然核酸类似的性质的天然核酸的已知类似物的核酸。术语“核酸分子”和“核酸”也可以用于替换“基因”、“cDNA”及“mRNA”。核酸可以被合成，或者可以源于任何生物来源，包括任何有机体。
术语“分离的”在细胞(包括，例如VSEL干细胞)的上下文中使用时，表明所述细胞远离其天然环境而存在。分离的细胞也可以以纯化形式存在或者存在于非天然环境中。
如本文所用的，细胞在已经从存在于其天然环境中的所有其它细胞分离时，而且当那种细胞在细胞混合物中的比例大于在其天然环境中发现的比例时，以“纯化形式”存在。换句话说，当被讨论的细胞群代表富集的感兴趣的细胞群时，细胞被认为处于“纯化形式”，即使其它细胞或细胞类型也存在于所述富集群中。当细胞包括在一些实施方式中至少约10％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约20％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约25％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约30％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约40％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约50％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约60％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约70％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约75％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约80％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约90％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约95％的混合细胞群，在一些实施方式中至少约100％的混合细胞群时，它被认为是处于“纯化形式”，条件是所述细胞包括“纯化”群中更大百分比的总细胞群，大于纯化前在所述群中的百分比。在这方面，术语“纯化的”和“富集的”可以被认为是同义的。
III.非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的分离
III.A.概述
当前披露的主题提供了从细胞群分离CD45-干细胞的亚群的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供怀疑包含CD45-干细胞的细胞群；(b)在足以允许每个抗体与在细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下将所述细胞群与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触；(c)选择为CD34+或Sca-1+、并且CD45-的细胞的第一亚群；(d)在足以允许每个抗体与在细胞群的每个细胞上的它的靶标(如果存在)结合的条件下将所述细胞的第一亚群与对于一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，所述标记物选自包括而不限于CD45R／B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119的组；(e)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(f)收集为CD34+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-的细胞的第二亚群，由此分离CD45-干细胞的亚群。
如本文所用的，术语“CD45”指的是酪氨酸磷酸酶，也称为白细胞共同抗原(LCA)，并具有基因记号PTPRC。这个基因相应于Accession Nos.NP_002829(人类)、NP_035340(小鼠)、NP_612516(大鼠)、XP_002829(狗)、XP_599431(牛)及AAR16420(猪)。另外的CD45同源物的氨基酸序列也存在于数据库中，包括那些来自多种鱼类和多种非人类灵长类的同系物。
如本文所用的，术语“CD34”指的是存在于一些造血和非造血干细胞上的细胞表面标记物，并具有基因记号CD34。数据库披露了来自人类(如，AAB25223)、小鼠(NP_598415)、大鼠(XP_223083)、猫(NP_001009318)、猪(MP_999251)、牛(NP_776434)及其它的CD34的氨基酸和核酸序列。
在小鼠中，一些干细胞还表达干细胞抗原Sca-1(编号No.NP_034868)，也称为淋巴细胞抗原Ly-6A.2。
因此，CD45-干细胞的亚群表示存在于分离步骤前的细胞群中的所有CD45-细胞的亚群。在一些实施方式中，CD45-干细胞的亚群来自人类，并且是CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-。在一些实施方式中，CD45-干细胞的亚群来自小鼠，并且是Sca-1+／lin-／CD45-。
所披露的亚群的分离可以利用可以基于CD45、CXCR4、CD34、AC133、Sca-1、CD45R／B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119标记物的一种或多种的表达或表达缺乏来分离细胞的任何方法进行，包括而不限于荧光活化的细胞分类(FACS)。
如本文所用的，lin-指的是不表达下列标记物的任何一种的细胞：CD45R/B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119。这些标记物存在于下述细胞上：从早期Pro-B到成熟B细胞的B细胞谱系的细胞(CD45R/B220)；骨髓谱系的细胞，如在骨髓发育期间的单核细胞、骨髓粒细胞及外周中性白细胞(Gr-1)；胸腺细胞、外周T细胞及肠上皮内皮淋巴细胞(TCRαβ和TCRγδ)；骨髓细胞、NK细胞、一些活化的淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞、B1细胞及树突细胞的亚类(CD11b)；以及成熟的红细胞和红系前体细胞(erythroid precursor cell)(Ter-119)。
所述分离步骤可以作为一系列步骤以逐步方式或同时进行。例如，每个标记物的存在或缺乏可以单独地评估，在每个步骤基于是否存在单独的标记物产生两个亚群。因此，感兴趣的亚群可以被选择并基于下一标记物的存在或缺乏而被进一步分开。
可选地，所述亚群可以通过仅分离出具有特定标记物特征的那些细胞而产生，其中短语“标记物特征”指的是两种或更多种标记物的存在或缺乏的总结。例如，混合的细胞群可以包含CD34+和CD34-细胞。类似地，相同的混合细胞群可以包含CD45+和CD45-细胞。因此，这些细胞中的一些将是CD34+／CD45+，另一些将是CD34+／CD45-，另一些将是CD34-／CD45+，其它将是CD34-／CD45-。这些标记物的单独的组合的每种代表不同的标记物性质。随着另外的标记物被加入，所述性质可以变得更复杂并对应最初的混合细胞群的越来越小的百分比。在一些实施方式中，当前披露的主题的细胞具有CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-的标记物性质，在一些实施方式中，当前披露的主题的细胞具有Sca-1+／lin-／CD45-的标记物性质。
在当前披露的主题的一些实施方式中，对于由感兴趣的细胞类型表达的标记物(如，在CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-细胞的表面上表达的多肽)特异的抗体用于分离和／或纯化具有感兴趣的标记物特征的BM细胞的亚群。可以理解基于感兴趣的标记物特征，所述抗体可以用于阳性或阴性地选择群体的部分，其在一些实施方式中随后被进一步分开。
在一些实施方式中，采用具有不同特异性的多个抗体、抗体衍生物、和／或抗体片段。在一些实施方式中，每个抗体、或其片段或衍生物，对于选自包括而不限于Ly-6A／E(Sca-1)、CD34、CXCR4、AC133、CD45、CD45R、B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b、Ter-119、c-met、LIF-R、SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog的组的标记物是特异性的。在一些实施方式中，表达一个或更多个选自包括而不限于SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog的组的基因的细胞被分离和／或纯化。
当前披露的主题涉及细胞群，其在一些实施方式中表达下面的抗原：CXCR4、AC133、CD34、SSEA-1(小鼠)或SSEA-4(人类)、胎儿碱性磷酸酶(AP)、c-met及LIF-受体(LIF-R)。在一些实施方式中，当前披露的主题的细胞不表达下面的抗原：CD45、谱系标记物(即，细胞为lin-)HLA-DR、MHC I类、CD90、CD29及CD105。因此，在一些实施方式中，当前披露的主题的细胞可以被表征如下：CXCR4+／AC133+／CD34+／SSEA-1+(小鼠)或SSEA-4+(人类)／AP+／c-met+／LIF-R+／CD45-／lin-／HLA-DR-／MHC I类-／CD90-／CD29-／CD105-。
在一些实施方式中，每个抗体、其片段或衍生物包括可检测的标签。结合于不同标记物的不同的抗体、其片段或衍生物可以包括不同的可检测标签或可以采用同样的可检测标签。
各种可检测标签对于本领域技术人员是已知的，用于将可检测标签结合到生物分子如抗体和其片段和／或衍生物的方法也是已知的。如本文所用的，短语“可检测标签”指的是可以加入到抗体、或其片段或衍生物的任何部分，其允许抗体的检测。代表性的可检测部分包括而不限于：共价附着的生色团、荧光部分、酶、抗原、具有特异反应性的基团、化学发光部分及电化学可检测的部分等。在一些实施方式中，抗体被生物素化。在一些实施方式中，利用第二抗体检测生物素化的抗体，所述第二抗体包括抗生物素蛋白或链霉亲和素(streptavidin)基团并且还结合于包括而不限于Cy3、Cy5及Cy7的荧光标签。在一些实施方式中，抗体、其片段或衍生物用荧光标签如Cy3、Cy5、或Cy7直接标记。在一些实施方式中，所述抗体包括生物素-结合的大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(Sca-1；克隆E13-161.7)、链霉亲和素-PE-Cy5结合物、抗-CD45-APCCy7(克隆30-F11)、抗-CD45R／B220-PE(克隆RA3-6B2)、抗-Gr-l-PE(克隆RB6-8C5)、抗-TCRαβPE(克隆H57-597)、抗-TCRγδPE(克隆GL3)、抗-CD11b PE(克隆M1／70)及抗-Ter-119PE(克隆TER-119)。在一些实施方式中，所述抗体、片段、或其衍生物用荧光标签直接标记并且结合于抗体的细胞通过荧光-活化的细胞分类被分离。另外的检测策略对于本领域技术人员是已知的。
虽然FACS扫描是用于纯化细胞亚群的便利方法，但是可以理解也可以采用其它方法。可以采用的示例性方法是采用特异性结合于CD45、CXCR4、CD34、AC133、Sca-1、CD45R／B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119的一种或多种的抗体，所述抗体包含这样的部分(如生物素)，对于所述部分高亲和力结合试剂是可获得的(如抗生物素蛋白或链霉亲和素)。例如生物素部分可以附着于对于每种标记物的抗体，对于所述标记物，在细胞表面上的存在是理想的(如，CD34、Sca-1、CXCR4)，具有结合的抗体的细胞群可以与包含抗生物素蛋白或链霉亲和素部分的亲和试剂接触(如包含抗生物素蛋白或链霉亲和素的柱)。结合于柱的那些细胞将被回收并按希望的进一步分开。可选地，结合于所述群中要去除的那些细胞上存在的标记物(如，CD45R／B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119)的抗体可以用生物素标记，不与亲和试剂结合的细胞可以被回收并进一步纯化。
还应理解在纯化过程的一个或更多个步骤中不同的分离技术(如亲和性纯化和FACS)可以一起采用。
包含当前披露的主题的CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-或Sca-1+/lin-／CD45-细胞的细胞群可以从任何受试者或从包含它们的受试者内的任何来源分离。在一些实施方式中，所述细胞群包括骨髓样品、脐带血样品、或外周血样品。在一些实施方式中，在用足以将CD45-干细胞从骨髓移动到受试者的外周血的量的移动剂处理受试者后，所述细胞群从受试者的外周血分离。如本文所用的，短语“移动剂”指的是这样的化合物(如肽、多肽、小分子、或其它试剂)，其在给予受试者时导致VSEL干细胞或其衍生物从受试者的骨髓移动到外周血。换句话说，将移动剂给予受试者导致受试者外周血中存在比在给予移动剂之前直接存在于其中的VSEL干细胞和／或VSEL干细胞衍生物的数量增加的VSEL干细胞和／或VSEL干细胞衍生物。然而，可以理解移动剂的效果不需要是即时的，通常包括延迟时间，在此期间移动剂对受试者中的组织或细胞类型起作用以便产生其效果。在一些实施方式中，所述移动剂包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗剂(如，T140肽；Tamamura etal.(1998)253Biochem Biophys Res Comm877-882)的至少一种。
在一些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物还表达选自包括而不限于c-met、c-kit、LIF-R及其组合的组的标记物。在一些实施方式中，所披露的分离方法进一步包括分离为c-met+、c-kit+、和／或LIF-R+的那些细胞。
在一些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物还表达SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog，并且在一些实施方式中，所披露的分离方法进一步包括分离表达这些基因的那些细胞。
当前披露的主题还提供了通过当前披露的方法分离的CD45-干细胞群。
III.B.CD45 - 干细胞群的进一步分开
本文披露的是CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-细胞的亚群的分离和／或纯化。这些细胞包括包含多能和组织-定向干细胞的异质细胞群。本文还披露了用于纯化披露的亚群的策略。
在一些实施方式中，异质亚群被进一步分开以富集一些谱系的VSEL干细胞。如本文披露的，CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-亚群包括对于各种组织的VSEL干细胞，所述组织包括而不限于神经细胞、骨骼肌细胞、心脏细胞、肝细胞、肠上皮细胞、胰腺细胞、内皮细胞、表皮细胞及黑色素细胞。这些细胞可以通过从CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-亚群纯化表达与这些谱系相关的一个或更多个标记物的那些细胞而被分开。例如，对于神经组织的VSEL干细胞可以利用检测胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白、βIII微管蛋白、少突胶质细胞转录因子1(Olig1)、和／或少突胶质细胞转录因子2(Olig2)的表达的试剂而被分开。类似地，对于骨骼肌的VSEL干细胞可以利用检测Myf5、MyoD、和／或成肌蛋白的表达的试剂被分开。可以采用的另外的VSEL干细胞类型和标记物包括而不限于：心肌细胞VSEL干细胞(Nsx2.5／Csx，GATA-4)、肝细胞VSEL干细胞(甲胎蛋白，CK19)、肠上皮VSEL干细胞(Nkx2-3，Tcf4)、胰腺细胞TCSC(Nkx6.1，Pdx1，C-肽)、内皮细胞VSEL干细胞(VE-钙粘蛋白)、上皮细胞VSEL干细胞(Krt2-5，Krt2-6a，BNC)及黑色素细胞VSEL干细胞(DCT、TYR、TRP)。
IV.分化VSEL干细胞的方法
IV.A.胚状体(EB)样球体的产生
当前披露的主题还提供了分化VSEL干细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法包括首先产生胚状体样球体。如本文所用的，短语“胚状体样球体”和“胚状体样”指的是在合适的体外培养条件下形态上表现的与由ES细胞形成的胚状体类似的细胞的聚集。如本文所用的，所述短语与“胚状体”可互换地使用，指的是当形成胚状体的细胞为利用当前披露的技术分离和／或纯化的CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-或Sca-1+/lin-／CD45-细胞时这样的聚集。产生来自ES细胞的EB的方法在本领域是已知的(参见，例如，Martin&Evans(1975)in Teratomas and Differentiation(M.I.Sherman&D.Solter,Eds.),pp.169-187,AcadernicPress，New York，New York，United States of America；Doetschman et al.(1985)87J Embryol Exp Morphol27-45)。本文披露的是从其它多能和多潜能细胞制备EB样球体的方法，包括CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-细胞。
在一些实施方式中，从非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物的群体形成胚状体样体的方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群；(b)在体外在培养基中培养VSEL干细胞或其衍生物达到足以使胚状体样体出现的时间，所述培养基包含一个或更多个诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样体形成的因子。
如本文所用的，术语“一个或更多个诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样体形成的因子”指的是一个生物分子或多个生物分子，其在与多个VSEL干细胞或其衍生物接触时诱导VSEL干细胞或其衍生物形成一个或更多个胚状体(EB-样)样球体。在一些实施方式中，诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样形成的一个或更多个因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2及其组合。在一些实施方式中，所述一个或更多个因子通过VSEL干细胞或其衍生物与C2C12细胞的共培养提供给VSEL干细胞或其衍生物。
IV.B.分化VSEL干细胞或其衍生物的方法
一旦产生EB-样球体，其中的细胞可以通过在合适的条件下培养细胞而体外分化。在一些实施方式中，在体外将非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型的方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样；以及(b)在培养基中培养所述胚状体样直到感兴趣的细胞类型在体外培养物中出现，所述培养基包含分化诱导量的诱导VSEL干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型的一个或更多个因子。
如本文所用的，短语“分化-诱导量”指的是生长因子或其它活化剂的量，其在体外分化培养基中存在时，导致VSEL干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型。在一些实施方式中，生长因子或其它活化剂包括而不限于表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGFβ1)及其组合，和／或其它补充剂，包括而不限于N2-补充剂-A、B27补充剂及烟酰胺(可以从StemCell Technologies Inc.，Vancouver，British Columbia，Canada获得)。还参见Fraichard et al.(1995)108J Cell Sci3181-3188。
生长因子和／或其它补充剂的选择依赖于希望EB-样球体分化成为的细胞类型。在一些实施方式中，EB样球体可以分化为神经元衍生物，包括而不限于神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经胶质细胞。如实施例22中披露的，EB样球体可以通过在包含补充有rhEGF、FGF-2及NGF的Basal Medinm(Stem Cell Technologies Inc.，Vancouver，British Columbia，Canada)的培养基中培养它们而分化为神经元衍生物。EB样球体可以通过在包含Activin A的培养基中培养它们而分化为内胚层衍生物(参见实施例23)。并且，EB样球体可以通过在包含bFGF、VEGF及TGFβ1的培养基中培养它们而分化为心肌细胞(参见实施例24)。
可以从干细胞如ES细胞在体外产生的其它细胞类型包括而不限于肝细胞(Yamada et al.(2002)20Stem Cells146-154)、造血细胞及胰腺细胞。
V.利用VSEL干细胞用于治疗的方法和组合物
V.A.受试者
当前披露的主题还提供了用于治疗受试者的组织或器官损伤的方法，所述方法包括给予受试者药物组合物，其中所述药物组合物包括药学上可接受的载体中包含VSEL干细胞的多个分离的CD45-干细胞，量和经由的途径足以允许包含VSEL干细胞的CD45-干细胞群的至少一部分结合到组织并在其中分化，由此治疗损伤。
如本文所用的，短语“治疗受试者中的组织或器官的损伤”指的是设计为改善受试者中损伤的原因的症状的干涉(如在疾病过程起始后)以及设计为防止疾病在受试者中发生的干涉。换句话说，术语“治疗”和其语法变体意图宽泛地解释为包括涉及降低疾病的严重性和／或治疗疾病的含义，以及涉及预防的含义。在这个后面的方面，“治疗”指的是“防止”或以另外的方式提高受试者抵抗疾病过程的能力。
V.B.制剂
当前披露的主题的组合物在一些实施方式中包括包含载体的组合物，尤其是药学上可接受的载体，如，但不限于人类中药学上可接受的载体。任何合适的药物制剂可以用于制备用于给予受试者的组合物。
例如，合适的制剂可以包括含水和无水无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素、以及为制剂提供与预定的受者的体液等张的溶质。
应当理解除了上面特别提及的成分，当前披露的主题的制剂可以包括本领域中关于讨论的制剂类型的常见的其它试剂。例如，可以使用无菌不合致热原的含水和无水溶液。
当前披露的主题的治疗方案和组合物可以与另外的佐剂或生物反应修饰剂一起使用，所述修饰剂包括而不限于细胞因子和其它免疫调节化合物。
V.C.给药
用于给予当前披露的主题的细胞的合适的方法包括而不限于静脉内注射和直接递送到靶组织或器官。在一些实施方式中，给药方法包括用于细胞在需要治疗的部位区域化递送或聚集的特征。在一些实施方式中，所述细胞被直接递送入要被治疗的组织或器官。在一些实施方式中，通过细胞的静脉内注射完成当前披露的细胞的选择性递送，其中它们靶向(home to)靶组织或器官并结合于其中。在一些实施方式中，当前披露的细胞由于靶组织或器官产生SDF-1梯度而靶向靶组织或器官，其作为对于本文披露的CXCR4+细胞的趋化引诱剂。
V.D.剂量
有效剂量的当前披露的主题的组合物被给予需要其的受试者。“治疗有效量”或“治疗量”是足以产生可测量的反应(如被治疗的受试者中的生物或临床相关反应)的治疗组合物的量。可以改变当前披露的主题的组合物中的活性成分的实际剂量水平以便给予可以有效实现对于特定受试者的理想治疗反应的活性化合物的量。所选的剂量水平将依赖于治疗组合物的活性、给药途径、与其他药物或治疗的组合、要治疗的状况的严重性、以及要治疗的受试者的状况和先前药物史。然而，化合物的开始剂量在低于实现理想的治疗效果所需的水平并逐渐提高剂量直到实现理想的效果，这在本领域的技术范围内。组合物的效能可以变化，因此“治疗有效量”可以变化。然而，利用本文所述的实验方法，本领域的技术人员可以容易地评估当前披露的主题的候选化合物的效能和功效并因而调整治疗方案。
在阅览本文呈现的当前披露的主题的披露内容后，考虑特定剂型、所述组合物所用的给药方法及要治疗的特定疾病，本领域的普通技术人员可以调整给予个体受试者的剂量。剂量的进一步计算可以考虑受试者的身高和体重、症状的严重性和阶段及另外的有害身体状况的存在。这样的调整或改变，以及何时和怎样进行这样的调整或改变的评估对于医药领域中的普通技术人员是熟知的。
VI.产生具有VSEL干细胞的嵌合动物的方法
VSEL干细胞(如，当前披露的主题的CD34+／CXCR4+／lin-／CD45-或Sca-1+/lin-／CD45-细胞)和／或其衍生物还可以利用适用于ES细胞领域中已知的技术用于产生嵌合动物(参见，例如，Nagy et al.(2003)Manipulating the Mouse Embryo.A Laboratory Manual,Third Edition.Cord Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，United States of Amrica；Robertson(1991)44Biol Reprod238-45；Jaenisch(1988)240Science1468-1474；Robertson et al.(1986)323Nature445-447；Bradley et al.(1984)309Nature255-258。还参见美国专利Nos.5,650,550；5,777,195)。例如，所述细胞可以被注射入胚泡或与桑葚胚期胚泡聚集。在一些实施方式中，通过将VSEL干细胞或其衍生物引入受者产生的嵌合体为可以将VSEL干细胞的基因组传递到随后的世代的种系(germline)嵌合体。
VII.其它应用
VII.A.基因表达研究
本文披露的VSEL干细胞及其衍生物还可以用于监测细胞在靶组织中(如嵌合动物中)的分化。例如，嵌合动物可以利用纯化的VSEL干细胞的亚群(如，纯化的心肌细胞VSEL干细胞的亚群)产生，并且可以观察嵌合体中VSEL干细胞的衍生物的分化和／或发展。在一些实施方式中，VSEL干细胞包括可检测的标记物(如编码可操作地连接到在被监测的细胞类型中可操作的启动子的GFP的编码序列)，以促进区别VSEL干细胞衍生物与源自VSEL干细胞被引入的宿主动物的细胞。
此外，本文披露的VSEL干细胞及其衍生物还可以用于基因表达研究。例如，可以确定VSEL干细胞及其衍生物(包括而不限于纯化的VSEL干细胞的亚群)的基因表达性质，其可以随后与其它细胞类型比较，其它细胞类型包括而不限于比VSEL干细胞更多或更少分化的细胞类型。换句话说，由于VSEL干细胞比全能细胞分化得多，而比终端分化的细胞分化得少，因此VSEL干细胞及其衍生物可以用于产生并比较沿着从全能细胞到终端分化的细胞的分化途径的各种细胞类型中的基因表达性质，由此鉴定在细胞从全能细胞分化到VSEL干细胞再到终端分化的细胞时什么基因被下调和上调。可选地或此外，可以比较VSEL干细胞与ES细胞之间的基因表达性质以鉴定这些干细胞类型之间表达不同的基因。
VII.B.鉴定胚状体样球体形成的诱导剂的方法
当前披露的细胞和方法还可以用于鉴定胚状体样球体形成的诱导剂。如本文所用的，短语“胚状体样球体形成的诱导剂”指的是这样的分子(例如，生物分子，包括而不限于多肽、肽、或脂质)，其在其中VSEL干细胞及其衍生物不另外的形成一个或更多个胚状体样球体的条件下引起多个VSEL干细胞及其衍生物形成一个或更多个胚状体样球体。在一些具体实施方式中，这样的条件包括而不限于：在其中缺乏诱导剂的培养基中培养VSEL干细胞或衍生物不形成一个或更多个胚状体样球体，但是当将诱导剂加入到同样的培养基时，导致VSEL干细胞或其衍生物形成一个或更多个胚状体样球体。
在一些实施方式中，本(instant)方法包括(a)制备包括来自已知包含诱导剂的细胞的多个cDNA克隆的cDNA文库；(b)用cDNA文库转化不包含诱导剂的多个细胞；(c)在足以引起VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体的条件下，在转化的多个细胞的存在下，培养多个VSEL干细胞或其衍生物；(d)分离包含诱导剂的转化的细胞；(e)从转化的细胞回收cDNA克隆；以及(f)鉴定由回收的cDNA克隆编码的多肽，由此鉴定胚状体样形成的诱导剂。在一些实施方式中，多个cDNA克隆存在于cDNA克隆载体内，所述载体包括在载体中克隆位点(cDNA克隆被插入其中)的至少一侧的侧翼的至少一个核苷酸序列，其可以结合引物如测序引物。在一些实施方式中，两条引物-结合核苷酸序列存在于克隆位点的每一侧的侧翼，允许cDNA插入以利用聚合酶链反应(PCR)进行扩增。因此，在一些实施方式中，本方法进一步包括利用杂交到引物位点(在cDNA克隆位点的两侧的侧翼)的引物扩增转化的细胞中存在的cDNA克隆，在一些实施方式中，通过直接对cDNA克隆测序或通过对扩增的PCR产物测序进行所述鉴定步骤。
然而，可以理解还可以采用普通技术人员的技术范围内的其他方法来鉴定诱导剂。例如，在一些实施方式中，已知包含诱导剂的细胞是C2C12细胞。可以检测C2C12-调节的培养基以测定C2C12培养基中存在的诱导剂是否是可扩散分子(例如，肽、多肽、或生物活性脂质)。如果所述诱导剂为可扩散的分子，C2C12-调节的培养基可以被热处理以确定诱导剂是热不稳定的(如肽或多肽)或不是热不稳定的(如生物活性脂质)。包括而不限于蛋白质组学(proteomic)分析和／或脂质色谱分析的分馏(fractionation)研究可以随后用于鉴定推断的诱导剂。
如果C2C12-调节的培养基不包含诱导剂，意味着所述诱导剂存在于C2C12细胞上。可以用于鉴定存在于C2C12细胞上的膜-结合的诱导剂的技术包括而不限于利用单克隆抗体和／或siRNA。可选地或此外，可以采用基因表达分析，包括，例如，利用基因阵列、差别显示等。
当鉴定推断的诱导剂时，其作为诱导剂的状态可以通过用编码诱导剂的核苷酸序列转化不包含诱导剂的细胞系并确认转化的细胞系支持由VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体来确认。
可选地，VSEL干细胞及其衍生物可以用于鉴定能够诱导胚状体样球体形成的其它细胞和细胞系。可以被检测的示例性的细胞系包括而不限于胎鼠成纤维细胞(murine fetal fibroblast)及其它鼠和人类恶性肿瘤细胞系(如畸胎瘤和肉瘤)。
实施例
下面的实施例提供了示意性的实施方式。根据本发明披露的内容和本领域的一般技术水平，本领域的技术人员将认识到下面的实施例仅是示例性的并且可以采用各种变化、修改及改变而不偏离当前披露的主题的范围。
实施例1
骨髓细胞
从来自无病原体、3周、1月及1岁大的雌性C57BL／6或DBA/2J小鼠(从The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，United States ofAmerica获得)的股骨获得的BM分离鼠单核细胞(MNC)。用低张溶液(Lysing Buffer，BD Biosciences，San Jose，California，United States ofAmerica)去除红细胞。
可选地，从来自无病原体、4-6周大的雌性Balb／C小鼠(JacksonLaboratory)的股骨获得的鼠BM分离MNC并进行Ficoll-Paque离心以获得轻密度MNC。通过采用顺磁小型珠(Miltenyi Biotec，Auburn，California，United States of America)根据制造商的方案分离Sca-1+细胞。
从四个尸体BM供体(年龄为52-65岁)获得轻密度人类BMMNC，如果必要，去除粘附细胞和T淋巴细胞(A-T-MNC)，如Ratajczak etal.(2004a)103Blood2071-2078和Majka et al.(2001)97Blood3075-3085中所述。通过免疫亲和性选择，借助MINIMACSTM顺磁珠(MiltenyiBiotec)，根据制造商的说明，分离CD34+细胞，如Ratajczak etal.(2004a)103Blood2071-2078和Majka et al.(2001)97Blood3075-3085中所述。通过FACS分析测定分离的CD34+细胞的纯度为>98％。
实施例2
骨髓-来源的细胞的分类
对于鼠BM细胞，利用FACSVANTAGETMSE(Becton Dickinson，Mountain View，California，United States of America)，通过多参数、活性无菌细胞分类，从鼠BMMNC的悬浮液分离Sca-1+/lin-／CD45-和Sca-1+／lin-／CD45+细胞。简短地，BMMNC(100×106个细胞／ml)被重新悬浮在细胞分类培养基(CSM)中，包含不合酚红的1×Hank’sBalanced Salt Solution(GIBCO，Grand Island，New York,United States ofAmerica)、2％热失活的胎牛血清(FCS；GIBCO)、10mM HEPES缓冲剂(GIBCO)及30U／ml的庆大霉素(GIBCO)。下面的单克隆抗体(mAb)用于对这些细胞染色：生物素-结合的大鼠抗-小鼠Ly-6A／E(Sca-1；克隆E13-161.7)、链霉亲和素-PE-Cy5结合物、抗-CD45-APCCy7(克隆30-F11)、抗-CD45R/B220-PE(克隆RA3-6B2)、抗-Gr-l-PE(克隆RB6-8C5)、抗-TCRαβPE(克隆H57-597)、抗TCRγδPE(克隆GL3)、抗-CD11b PE(克隆M1／70)及抗-Ter-119PE(克隆TER-119)。所有的mAB以饱和浓度加入并且在冰上孵育细胞30分钟，冲洗两次，随后以5×106个细胞／ml的浓度重新悬浮在CSM中用于分类。
可选地，将全部鼠BM在室温下在BD裂解液(BD Biosciences，SanJose，California，United States ofAmirica)中裂解15分钟，并在PBS中冲洗两次。单细胞悬浮液被染色用于与PE结合的谱系标记物(CD45R／B220(克隆RA3-6B2)、Gr-1(克隆RB6-8C5)、TCRαβ(克隆H57-597)、TCRγδ(克隆GL3)、CD11b(克隆M1／70)、Ter-119(克隆TER-119))、与PE-Cy5结合的CD45(克隆30-F11)、生物素结合的大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(Sca-1)(克隆E13-161.7)、链霉亲和素-APC和MHCI类(克隆CTDb)、HLA-DR(克隆YE2／36HLK)、CD105／Endoglin、与FITC结合的CD29和CD90(Thy1)，在冰上进行30分钟。冲洗后，通过FACS(BD Biosciences，San Jose，California)分析它们。获得至少106个事件并通过利用Cell Quest软件进行分析。代表示例性的系列分类的系列点图在图11中示出。
对于人类BM细胞，通过采用FITC-标记的抗-CD45和PE-标记的抗-CXCR4单克隆抗体(来自BD Biosciences Pharmingen(Palo Alto，California,United States of Ametica))和MOFLOTM细胞分类器(DakoCytomation California Inc.,Carpinteria，California，United States ofAmerica)分离CXCR4+／CD45+、CXCR4+／CD45-、CXCR4-／CD45+、CXCR4-／CD45-BMMNC，如Ratajczak et al.(2004b)18Leukemia29-40中所述。简短地，细胞在4℃被染色30分钟，冲洗两次、分类及在分类后立即离心(spun down)以利用Qiagen RNA分离试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，California，United States of America)，根据制造商的方案分离RNA。
实施例3
侧群(side population)(SP)细胞分离
根据Goodell et al.(2005)Methods Mol Biol343-352的方法从骨髓分离SP细胞。简短地，将BMMNC以106个细胞／ml重新悬浮在预热的DMEM／2％FBS中并在37℃预先孵育30分钟。随后在DMEM／2％FBS中用5μg／ml Hoechst33342(Sigma Aldrich，St.Louis，Missouri，UnitedStates ofAmerica)标记细胞并在37℃孵育90分钟。染色后，细胞被沉淀(pelleted)，重新悬浮在冰冷的细胞分类培养基中，随后在冰上维持直到它们的分类。利用FACSVANTAGETM(Becton Dickinson，MountainView，California，United States of America)进行分析和分类。在350nm处激发Hoechst染料并且用424／44带通(BP)滤光器(Hoechst蓝)和675／20BP滤光器(Hoechst红)收集其荧光发射。利用列表模式的线性放大收集所有参数并以Hoechst蓝对Hoechst红点图显示以可视化SP。随后，利用生物素-结合的大鼠抗-小鼠Ly-6A／E(Sca-1；克隆E13-161.7)、链霉亲和素-PE-Cy5结合物、抗-CD45-APC-Cy7(克隆30-F11)、抗-CD45R/B220-PE(克隆RA3-6B2)、抗-Gr-l-PE(克隆RB6-8C5)、抗-TCRαβPE(克隆H57-597)、抗-TCRγδPE(克隆GL3)、抗-CD11b PE(克隆M1／70)及抗-Ter-119PE(克隆TER-119)抗体从SP悬浮液分离Sca-1+／lin-／CD45-和Sca-1+／lin-／CD45+细胞。
实施例4
趋化分离
在鼠BM-、PB-及脾-来源的MNC的分离后，细胞被重新悬浮在无血清培养基中并在37℃平衡10分钟。Costar Transwell24孔板的下室(6.5-mm直径，5μM孔滤器)(Costar Corning，Cambridge，Massachusetts，United States of America)填充有650μl的无血清培养基和包含SDF-1(200ng／ml)、HGF(10ng/ml)、或LIF(50ng/ml)的0.5％BSA，或仅填充有培养基(对照)，如Rataiczak et al.(2004b)18Leukemia29-40和Kucia et al.(2004a)32Blood Cells Mol Dis52-57中所述。
在一些涉及心肌梗塞模型的实验中(参见实施例25)，采用来自梗塞的组织匀浆的上清液(LV前壁)或对照(LV后壁)心肌。将细胞悬浮液(100μl)加入上室。所述板在37℃、95％湿度、5％CO2下孵育5小时，并在倒置显微镜下评估。收集来自下室的细胞并通过FACS分析(FACSCANTM，Becton Dickinson)计数它们的数量，如Ratajczak et al.(2004a)103Blood2071-2078和Majkaet al.(2001)97Blood3075-3085中所述。
实施例5
透射电子显微镜(TEM)分析
对于透射电子显微镜，将Sca-1+／lin-／CD45-和Sca-1+／lin-／CD45+细胞在0.1M卡可酸盐缓冲液(pH7.4)中的3％戊二醛中4℃固定10小时、在四氧化锇(osmium tetride)中后固定、并脱水。固定的细胞随后被包埋在LX112中并以800A切片、用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色并在Philips CM10电子显微镜(在60kV运行)上观察。
实施例6
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
利用Mini Kit(Qiagen Inc.，Valencia，California，UnitedStates of America)分离总RNA。利用一步RT-PCR(Qiagen Inc.)，根据制造商的说明书逆转录mRNA(10ng)。利用DNA聚合酶(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States of America)扩增获得的cDNA片段。所用的引物对于CXCR4编号No.BC031665)，正向引物5’-GACGGACAAGTACCGGCTGC-3’(SEQ IDNO：59)和反向引物5’-GACAGCTTAGAGATGATGAT-3’(SEQ IDNO：60)；对于Met受体编号No.NM_008591)，正向引物5’-CGCGTCGACTTATTCATGG-3’(SEQ ID NO：61)和反向引物(5’-CACACATTGATTGTGGCACC-3’(SEQ ID NO：62)；以及对于LIF-R编号No.NM_013584)，正向引物5’-GAGCATCCTTTGCTATCGGAAGC-3’(SEQ ID NO：63)和反向引物5’-CGTTATTTCCTCCTCGATGATGG-3’(SEQ ID NO：64)。获得的PCR产物的正确尺寸通过琼脂糖凝胶上的分离确定。
实施例7
实时定量RT-PCR(RQ-PCR)
为了Oct4、Nanog、Rex1、Dppa3、Rif1、Myf5、MyoD、成肌蛋白、GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、甲胎蛋白、CK19、Nsx2.5／Csx、GATA-4、VE-钙粘蛋白、DCT、TYR、TRP、Nkx2-3、Tcf4、Krt2-5、Krt2-6a、BNC、Nkx6.1及Pdx1mRNA水平的分析，用Mini Kit(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States ofAmerica)从细胞分离总mRNA。利用Reverse TranscriptionReagents(Applied Biosystems，Foster City，California，United States ofAmerica)逆转录mRNA。通过实时RT-PCR，利用ABI7000Sequence Detection System(ABI，Foster City，California，United States ofAmerica)，采用表1中披露的引物，进行Oct4、Nanog、Rex1、Dppa3、Rifl、Myf5、MyoD、成肌蛋白、GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、甲胎蛋白、CK19、Nsx2.5／Csx、GATA-4、VE-钙粘蛋白、DCT、TYR、TRP、Nkx2-3、Tcf4、Krt2-5、Kn2-6a、BNC、Nkx6.1及Pdx1和R2-微球蛋白mRNA水平的检测。25μl反应混合物包含12.5μlGreen PCR Master Mix、10ng的cDNA模板及正向和反向引物。用PRIMER软件(Applied Biosystems，Foster City，California，United States of America)设计引物并列于表1中。
随后测定阈值周期(Ct)，即，扩增的感兴趣的基因到达固定阈值的量的周期数。用比较Ct方法计算Oct4、Nanog、Rex1、Dppa3、Rif1、Myf5、MyoD、成肌蛋白、GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、甲胎蛋白、CK19、NsX2.5／Csx、GATA-4、VE-钙粘蛋白、DCT、TYR、TRP、Nkx2-3、Tcf4、Krt2-5、Krt2-6a、BNC、Nkx6.1及Pdx1mRNA表达的相对量。靶标的相对量值，标准化为内源性对照β2-微球蛋白基因并相对于校准器，表达为2-ΔΔCt(倍数差别(fold difference))，其中ΔCt=靶基因的Ct(Oct4的Myf5、Nanog、Rex1、Dppa3、Rif1、Myf5、MyoD、成肌蛋白、GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、甲胎蛋白、CK19、Nsx2.5／Csx、GATA-4、VE-钙粘蛋白、DCT、TYR、TRP、Nkx2-3、Tcf4、Krt2-5、Krt2-6a、BNC、Nkx6.1、Pdx1)-内源性对照基因(β2-微球蛋白)的Ct，ΔΔCt=靶基因的样品的ΔCt-靶基因的校准器的ΔCt。
为了避免扩增污染DNA的可能性，i)用于实时RTR-PCR的所有引物用要扩增的cDNA内的内含子序列设计，ii)利用合适的阴性对照(无模板的对照)进行反应，iii)通过分析扩增产物的熔解曲线(解离图)重新检查产物的均匀扩增，iv)熔解温度(Tm)为57-60℃，探针Tm比引物Tm至少高10℃，最后，v)进行凝胶电泳以确认扩增的正确尺寸和非特异性带的缺乏。
代表性分析的结果在表3和4中示出。
表3
VSEL干细胞标记物的RQ-PCR分析*
·数据表达为相较于输入BMMNC中表达的表达的倍数增加(平均数+／-SD)。(n＝3独立的类别，对于每一类从12个供体收集BM)。*p<0.00001。
表4
PSC标记物的RQ-PCR分析*
PSC标记物 Sca-1+／lin-／CD45+ Sca-1+／lin-／CD45-
Oct4 0.85±0.01 174.49±12.43*
Nanog 0.51±0.02 145.14±29.36*
Rex1 0.96±0.07 140.91±16.68*
Dppa3 0.24±0.03 39.25±4.49*
Rif1 15.17±0.45 66.04±7.83*
·数据表达为相较于输入BMMNC中表达的表达的倍数增加(平均数+／-SD)。(n=3个独立的类别，对于每一类从12个供体收集BM)。*p<0.00001
实施例8
分类的细胞的荧光染色
检测来自四个独立的类别的细胞中每个抗原的表达。Sca-1+／lin-／CD45-细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对CXCR4(1：100，兔多克隆IgG；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz,California，UnitedStates of America)、Met(1：100，兔多克隆IgG；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz,California，United States of America)、LIF受体gp190(1：200，小鼠单克隆IgG；BD Biosciences)、Oct4(1：200，小鼠单克隆IgG；Chemicon Int.，Temecula，California，United States of America)、SSEA-1(1：200，小鼠单克隆IgM；Chemicon Intl.，Temecula，California，United States ofAmerica)及Nanog(1：200，山羊多克隆IgG；Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz,California，United States of America)的抗体染色。利用合适的第二Alexa Fluor488山羊抗-兔IgG、Alexa Fluor594山羊抗-小鼠IgG、Alexa Fluor594山羊抗-小鼠IgG、Alexa Fluor488山羊抗-小鼠IgM和Alexa Fluor594兔抗-山羊IgG(1：400；Molecular Probes，Eugene,Oregon，United States of America)。
在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。用DAPI染色细胞核(Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)。荧光图像用附着于Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300的TE-FMEpi-Fluorescence系统收集并由COOLSNAPTMHQ数字B／W CCD(RoperScientific,Tucson，Arizona，United States of America)照相机捕获。
实施例9
造血实验
对于细胞增殖实验，在用于集落形成单位-粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)集落的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)+白介素(IL)-3、用于爆式形成单位(burst forming unit)-红系(erythroid)(BFU-E)集落的促红细胞生成素(EPO)+干细胞因子(SCF)、以及用于CFU-巨核细胞集落的血小板生成素(thrombopoietin)(TPO)的存在下，将鼠或人分类的BMMNC平铺在无血清甲基纤维素培养基中，如Rataiczak et al.(2004a)103Blood2071-2078和Majka et al.(2001)97Blood3075-3085中所述。利用倒置显微镜，在7天时计数鼠造血集落，在12天时计数人造血集落。
对于CFU-S实验，周致命剂量的γ-射线(900cGy)照射雌性Balb／C小鼠(4-6周大)。24小时后，小鼠经由尾静脉注射被移植以从同系小鼠获得的1×104个分类的BMMNC。在12天时，去除脾并固定在Tellysyniczky's固定剂中，利用放大镜计数脾表面上CFU-脾集落，如Rataiczak et al.(2004a)103Blood2071-2078中所述。
对于长期再群体化(repopulation)实验，用致命剂量的γ-射线(900cGy)照射C57BL／6(Ly5.2)小鼠。24小时后，小鼠被移植(通过尾静脉注射)以106个从C57BL／6(Ly5.2)分离的BMMNC以及来自C57BL／6(Ly5.1)小鼠的2×104个Sca-1+／lin-／CD45-细胞或2×104个Sca-1+／lin-／CD45+。移植的小鼠从后-眼血管丛(retro-orbital plexus)以各种间隔喂养以获得Ly5表型的样品。在移植后8个月评估供体-来源的嵌合体的最后分析。
实施例10
嵌合性实验
在FACSVANTAGETM(Becton Dickinson，Mountain View，California，United States of America)上分析PBMNC和BMMNC的样品。用FITC-结合的抗-CD45.2(克隆104)和PE-结合的抗-CD45.1(克隆A20)对细胞染色。在扣除背景后从两个分离的测量(Ly5.1-阳性和Ly5.2-阴性)计算供体结合的百分比。
实施例11
“ 滴状物(drop)”的体外迁移实验
为了研究细胞迁移，简单地，将浓度为200ng/ml的SDF-1或HGF／SF(10ng/ml)或LIF(100ng/ml)溶解在4℃的Growth Factor ReducedMatrix(BD Bioscience，Bedford，Massachusetts，UnitedStates of America)中。没有化学引诱物的Growth Factor ReducedMatrix用作对照。的滴状物被转移到玻璃底孔(Willco Wells BV，Amsterdam，The Netherlands)上并在37℃孵育30分钟以聚合。随后将Sca-1+／lin-／CD45-细胞重新悬浮在DMEM中，加入0.5％BSA，密度为2×103／孔。
所述板在37℃、95％湿度、5％CO2下孵育12小时。随后用Hoechst33342(Sigma Aldrich，St.Louis，Misouri，United States of America)将Sca-1+／lin-／CD45-细胞染色，利用附着于Nikon Inverted MicroscopeEclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统，通过计数可见细胞的数量／100μm的滴状物周长，定量迁移到SDF-1剃度的细胞数量，并通过cool snap HQ数字B／W CCD(Roper Scientific，Tucson.Arizona,United States of America)照相机捕获。
实施例12
统计分析
在Macintosh computer PowerBase180上，利用Instat1.14(GraphPad，San Diego，California，United States of America)软件计算我们的FACS数据的算术平均数和标准差。利用用于未配对样品的Student t检验或用于多个比较的ANOVA分析数据。统计显著性限定为p<0.05。
实施例13
骨髓来源的Sca-1 + ／lin - ／CD45 - 细胞类似未分化的胚胎干细胞
本申请的共同发明人先前表明BM包含造血Sca-1+／lin-／CD45+群和非造血Sca-1+／lin-／CD45-干细胞群(Kucia et al.(2005b)19Leukemia1118-1127)，并且后面的细胞高度富集用于早期VSEL干细胞的标记物的mRNA。参见Kuciaet al.(2005b)33Exp Hematol613-623和Kucia etal.(2004b)Circ Res1191-1199。这里披露的是通过采用透射电子显微镜(TEM)评估这些细胞的形态学。
如图1A和1B所示，Sca-1+／lin-／CD45-(图1A)细胞与Sca-1+／lin-／CD45+(图1B)细胞相比尺寸上更小(3-4μm vs.8-10μm)，包含相对大的细胞核，并且具有细胞质的窄缘。此外，这些小Sca-1+／lin-／CD45-细胞的细胞核中的DNA包含作为多能胚胎干细胞的特征的开放型常染色质(参见图1A)。因此，本文首次披露了成年BM中存在胚胎样细胞的形态学证据。
实施例14
骨髓来源的Sca-1 + /lin - ／CD45 - 细胞表达多个多能干细胞(PSC)标记物
Sca-1+／lin-／CD45-细胞表达对于VSEL干细胞典型的mRNA。如本文所披露的，评估用于神经组织、骨骼和心肌、肝、胰腺、表皮、黑色素细胞及肠上皮的VSEL干细胞的多个标记物的基因的扩展的组(参见表3)。
有趣地是，确定这些细胞还表达通常与PSC相关的mRNA，包括Oct-4、Nanog、Rex1及Dppa3，并富集用于端粒酶蛋白Rif1的mRNA(参见表4)。此外，本申请披露的内容提供了纯化的Sca-1+／lin-／CD45-细胞在蛋白水平表达多个胚胎干细胞标记物(包括SSEA-1、Oct-4及Nanog)的证明(参见图2)。如其中所示出的，SSEA-1、Oct-4及Nanog分别在Sca-1+／lin-／CD45-细胞的57±7％、43±6％及28±4％上是可检测的，表明PSC蛋白在从BM新鲜分离的限定的细胞群中表达。
实施例15
骨髓-来源的Sca-1 + ／lin - ／CD45 - 表达CXCR4、c-met、和LIF-R
先前的研究表明表达VSEL干细胞标记物的BM-来源的细胞可以通过利用对于间质来源的因子-1(SDF-1)、肝细胞生长因子／扩散因子(HGF／SF)或白血病抑制因子(LIF)梯度的趋化性从BMMNC的悬浮液分离(Ratajczak et al.(2004b)18Leukemia29-40)。如本文所披露的，检测通过FACS纯化的Sca-1+／lin-／CD45-细胞的相应群的相应受体(CXCR4、c-met及LIF-R)的表达。图3A示出：通过FACS分类的Sca-1+／lin-／CD45-细胞表达用于所有这些受体的mRNA。此外，如图3B所示，这些受体的表达还通过免疫染色确认。这些受体以纯化的Sca-1+/lin-／CD45-细胞的82+6％(CXCR4)、61±8％(c-met)、和43±5％(LIF-R)上存在。此外，在直接趋化性研究中，确定这些高度纯化的细胞强烈地相应于SDF-1(参见图3C)、HGF／SF及LIF梯度。
实施例16
Sca-1 + ／lin - ／CD45 - 细胞在来自年轻小鼠的BM中富集
由共同发明人产生的先前的RQ-PCR数据表明来自年轻小鼠的BM包含多于来自年老小鼠的BM的PSC和／或VSEL干细胞(Kucia et al.(2005b)Leukemia1118-1127)。如图4所示，通过采用源自1月大和1岁大的小鼠的BMMNC的FACS分析，已经确定Sca-1+／lin-／CD45-细胞的数量减少约6-10倍(图4A，下侧)。此外，本文披露的FACS分析符合从年老动物分离的BMMNC中的PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA表达的显著降低，如通过RQ-PCR评估的(图4B)。
实施例17
Sca-1 + ／lin - ／CD45 - 细胞在短寿命DBA／2J小鼠中减少
本文还披露了这样的发现，即Sca-1+／lin-／CD45-细胞的数量随着鼠品系而变化。尤其是，显示与长寿命C57BL／6小鼠相比，这些细胞的数量在短寿命DBA/2J小鼠中减少。图5中显示的数据表明实际上，在从来自3周大的DBA／2J小鼠的BMMNC分离的mRNA中，多个PSC／VSEL干细胞的mRNA显著减少。
实施例18
Sca-1 + ／lin - ／CD45 - 细胞存在于BM细胞的侧群中
已知BMMNC的侧群(SP)高度富集干细胞(参见，例如，Goodellet al.(1996)183JExp Med1797-1806；Jackson et al.(2001)107J ClinInvest1395-1402；Macpherson et al.118J Cell Sci2441-2450)。为了明确通过本文披露的技术鉴定的胚胎样干细胞是否存在于BMMNC的SP中，BMMNC的侧群从BM分离(参见图6A)。为了比较，Sca-1+／lin-／CD45-细胞从相同的骨髓样品分离(参见图4A)。
随后，Sca-1+／lin-／CD45+(SP Sca-1+／lin-／CD45+)和Sca-1+／lin-／CD45-(SP Sca-1+／lin-／CD45-)细胞均从SP BMMNC分离。所有的这些细胞群与未纯化的BMMNC一起比较来自早期PSC／VSEL干细胞的mRNA的表达。如图6B所示，SP高度富集PSC／VSEL干细胞的标记物的mRNA。然而，从相同数量的BMMNC分离的Sca-1+／lin-／CD45-细胞的总产量的计算表明：与从BMMNC的淋巴门直接分类的这些细胞相比，从SP再分类的Sca-1+／lin-／CD45-细胞的数量约低两个数量级。此外，消除Sca-1+／lin-／CD45-群的SP细胞不表达PSC／VSEL干细胞的mRNA，其表明SP Sca-1+／lin-／CD45-细胞可能负责SP细胞的多能性。
实施例19
Sca-1 + ／lin - ／CD45 - 田胞与Sca-1 + /lin - ／CD45 + 细胞对比是非造血的
采用多个实验来评估从BM分离的胚胎样细胞是否具有造血潜能。首先，确定这些细胞是否能在体外造血集落中生长，但是没有检测到这些细胞的克隆形成(clonogenic)活性。其次，与Sca-1+／lin-／CD45+细胞相比，Sca-1+／lin-／CD45-不辐射防护致命照射的小鼠或在致命照射的同系受者中形成CFU-S集落。
为了明确这些细胞是否富集一些长期造血再群体化(repopulating)干细胞，通过采用供体／受者动物(在Ly.5基因座同源异基因(congenic))研究这些细胞在移植给致命照射的小鼠后对造血系统的长期再群体化的贡献。104个来自Ly5.1小鼠的Sca-1+／lin-／CD45+细胞与106个Ly5.2的BMMNC细胞一起移植入Ly5.2受者小鼠导致在移植后8个月评估时约17±3％的小鼠嵌合性(n=6)。在类似的实验中，在与106个BMMNC共移植的2×104个Sca-1+/lin-／CD45-细胞的移植后观察到供体细胞对造血没有贡献(参见图7)。在类似的实验中将绿色免疫荧光阳性(GFP+)Sca-1+／lin-／CD45-和Sca-1+／lin-／CD45-细胞移植到致命照射的同系受体中后获得类似的结果。
实施例1-19的讨论
BM-来源的细胞对组织再生的贡献已经由一些研究者解释，涉及HSC的转-去分化现象。然而，共同发明人已经确定BM包含稀有Sca-1+／lin-／CD45-细胞群，其表达非造血干细胞的多个标记物并且能够在体外培养中分化为中胚层-来源的心肌细胞和外胚层-来源的神经细胞。这些细胞已经被称为非常小的胚胎样(VSEL)干细胞。VSEL干细胞在器官发生和快速身体生长／扩展期间循环是可能的。由于VSEL干细胞对应SDF-1梯度，因此单独或与其它化学引诱剂结合的SDF-1-CXCR4轴可以在年轻BM中这些细胞的积聚中扮演关键角色。
本文披露的是这些高度纯化的BM-来源的Sca-1+／lin-／CD45-细胞(～0.02％的BMMNC)在mRNA和蛋白水平表达多个胚胎干细胞标记物，如表面标记物SSEA-1和转录因子Oct-4、Nanog及Rex-1。在直接TEM研究中，观察到这些细胞非常小(3-4μm)并且表现出非常不成熟的形态(例如，它们具有相对大的细胞核并包含不成熟的开放型常染色质)。这些细胞中的开放型染色质不仅与胚胎干细胞的mRNA的存在相关，还与多个VSEL干细胞的mRNA的存在相关，如那些能够分化为骨骼肌、心肌、神经、肝、肠上皮、皮肤表皮、黑色素细胞及内分泌胰腺的那些VSEL干细胞。因此，本文首次披露了成年BM中胚胎样细胞群在形态学水平的鉴定。
此外，这些细胞的一些在蛋白水平表达神经、心脏、或骨骼肌的早期发育标记物，表明尽管它们的类似的同源形态，这些细胞表现出一定程度的组织定向并且是异源的。有趣的是，注意到干细胞的多个潜在化学引诱剂(例如，SDF-1、HGF／SF及LIF)的表达在损伤的器官中上调，并且缺氧调节的／诱导的转录因子(HIF-1)在它们的表达中扮演重要角色(Ceradini et al.(2004)10Nat Med858-864；Pennacchietti et al.(2003)3Cancer Cell347-361)。为了支持这个观点，SDF-1、HGF／SF及LIF的启动子包含多个功能性HIF-1结合位点。因此，SDF-1-CXCR4、HGF／SF-c-met及LIF-LIF-R轴可以引导干细胞的转运(trafficking)。
为了支持这个观点，本文披露了证明：高度纯化的Sca-1+／lin-／CD45-细胞在蛋白水平表达CXCR4、c-met及LIF-R，并且通过趋化性分别强烈地响应于SDF-1、LIF及HGF／SF梯度。这个观察与下述事实一致，即，鼠胚胎干细胞还在它们的表面上表达功能性CxCR4、c-met及LIF-R，并且SDF-1、HGF／SF及LIF影响这些细胞的活动性(Kucia et al.(2005c)23StemCells879-894；Guo et al.(2005)23Stem Cells1324-1332)。
还可以期待如果Sca-1+／lin-／CD45-BMMNC群富集胚胎样PSC，那么这些细胞还应该能够沿着造血谱系分化。然而，在移植入致命照射的受者后，既不保护致命照射的小鼠，也不有助于长期的造血。因此，CD45-细胞群似乎仅限于异源非造血VSEL干细胞。然而，还可能在本文披露的标准实验中，没有检测到Sca-1+／lin-／CD45-BMMNC的潜在多能性并且在注射入发育中的胚泡后获得对它们的造血潜能的最终答案。
鉴定的胚胎样干细胞的数量在年轻动物的BM中更高，并且它们的数量随着年龄减少。此外，Sca-1+／lin-／CD45+细胞在相当于50岁老人的1岁大的小鼠中几乎不能检测到。BM中VSEL干细胞的这个年龄依赖含量可以解释为什么再生过程在较年轻的个体中更有效。还注意到长寿命和短寿命小鼠品系之间的BMMNC中Sca-1+／lin-／CD45-细胞的含量差别。与较短寿命(DBA/2J)小鼠相比，长寿命(例如，C57BL/6)的BM中这些细胞的浓度高得多。
最后，VSEL干细胞是高度活动的并响应于SDF-1梯度及附着于BM-来源的成纤维细胞。时间-推移研究表明这些细胞快速附着于、迁移于之下、和／或经历这些细胞中的伸入运动(emperipolesis)。在与CXCR4拮抗剂T140预孵育后，VSEL干细胞与BM-来源的成纤维细胞的相互作用被有效抑制。由于成纤维细胞分泌SDF-1和其它化学引诱剂，它们可以为这些细胞创造靶向环境。它们与BM-来源的成纤维细胞的强烈的相互作用具有重要的含义-表明分离的BM间质细胞可能被这些小胚胎样PSC／VSEL干细胞“污染”。
似乎本文披露的Sca-1+／lin-／CD45-细胞代表BM-来源的干细胞的新的亚群。例如，间充质干细胞(MSC)具有与成纤维细胞类似的形态。造血细胞为CD45+。MSC也是CXCR4-和CD34-，并且从没有在单细胞水平被鉴定。类似地，推定的多能成年祖细胞(MAPC)还没有在单细胞水平被明确地鉴定，USSC细胞或MIAMI细胞也没有。这些细胞的存在仅基于观察到的脐带血或骨髓细胞体外分化为不同的组织而被推定。
此外，应该考虑Sca-1+／lin-／CD45-PSC／VSEL干细胞非常小这个事实，尤其是在基于用于从BM、mPB及CB分离干细胞的梯度或速度离心的方案中。非常可能PSC／VSEL干细胞由于它们非常小的尺寸而在这些分离过程中被丢失。
实施例20
胚状体样球体的形成
在具有4mM L-谷氨酰胺、4.5g／l葡萄糖、5％热失活的FBS、10ng／mlrhEGF、10ng／ml FGF-2的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium中，将从C57BL／6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb／J小、鼠(可以从The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine,United States of America获得)的BMMNC分离的GFP+Sca-1+／lin-／CD45-(5×104／35mm玻璃底板)与C2C12细胞(1.5×106／35mm玻璃底板)一起培养，其是可以从American Type CultureCollection(ATCC；Manassas，Virginia，United States of America)商购获得的小鼠成肌细胞细胞系的亚克隆。每日将生长因子加入培养基中。每72小时更换培养基。在开始共培养后约5-7天开始出现胚状体样球体。
用碘化丙啶对来自VSEL干细胞-来源的球体(VSEL-DS)的细胞进行染色并进行FACS分析以评估细胞的多倍性。三个独立的实施例示于图12中。
将胚状体在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对SSEA-1(1：200，小鼠单克隆IgM；Chemicon Intl.，Temecula，California，United States ofAmerica；参见图8A)或Oct4(1：200，小鼠单克隆IgG；Chemicon Int.；参见图8B)的抗体染色。利用合适的第二Alexa Fluor594抗-小鼠IgM和Alexa Fluor594山羊抗-小鼠IgG(1：400；Molecular Probes，Eugene,Oregon，United States of America)。在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。用DAPI(Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States ofAmerica)标记细胞核。通过抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor488结合物(1：400；Molecular Probes，Eugene，Oregon,United States of America；参见图9A和9B)，绿色荧光蛋白被可视化。荧光图像用附着于Nikon InvertedMicroscope Eclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统收集并由coolsnap HQ数字B／W CCD(Roper Scientific，Tucson，Arizona，United Statesof America)照相机捕获。
实施例21
VSEL干细胞平铺在C2C12细胞上
鼠C2C12细胞是原始成肌细胞细胞系，用作用于肌样(myogeneic)分化的模型。为了将VSEL干细胞分化／扩展为肌原(myogenic)谱系，通过FACS纯化的BM-来源的Sca-1+／lin-／CD45-VSEL干细胞被平铺在C2C12细胞上。5-10％的平铺的VSEL干细胞开始增殖并形成轻微地附着／漂流的包含圆形细胞的胚状体样球体。
为了排除这些胚状体样球体由C2C12细胞形成的可能性，从GFP+小鼠分离VSEL干细胞，如实施例20那样形成胚状体样球体。确定胚状体样球体由GFP+VSEL干细胞形成。
通过DNA倍数性分析，排除C2C12细胞和VSEL干细胞之间融合的可能性。简短地，用碘化丙啶对从鼠淋巴结分离的细胞、HSC(造血干细胞；Sca-1+／lin-／CD45+)或VSEL干细胞(Sca-1+／lin-／CD45-)染色并进行FACS分析。通过用碘化丙啶对细胞染色并随后进行FACS分析测定每个细胞的DNA含量(参见图10)。
有趣地是，胚状体样球体表达胚胎干细胞特异性碱性磷酸酶(参见图13)。
胚状体样球体的进一步表征表明它们表达早期胚胎发育标记物，如SSEA-1、GATA-6、GATA-4、FOXD1及Nanog(参见图14)。透射电子显微镜表明存在于VSEL干细胞-来源的胚状体样球体中的细胞在尺寸上大于它们来源的原始VSEL干细胞(图15，上侧)，但仍具有包含常染色质的非常原始的细胞核。
VSEL干细胞的发育迁移可以通过SDF-1、HGF／SF及LIF结合(orchestrated)。进一步确定从VSEL干细胞-来源的胚状体样球体分离的细胞通过MAPKp42／44的强烈磷酸化响应于这些因子的刺激，其表明这些因子可在它们的发育和迁移中起作用。进一步确定相应的受体(分别为CXCR4、c-met及LIF-R)在VSEL干细胞-来源的胚状体样球体的表面上表达(图15，中侧)。
此外，来自VSEL干细胞-来源的胚状体样球体(VSEL-DS)的细胞，在C2C12细胞上再平铺后，可以再生长新的胚状体样球体(一直到至少5-7个另外的传代)。然而，这些胚状体样球体的数量和大小随着每次传代而变得更小。从来自连续传代的胚状体样球体分离的细胞的RT-PCR分析表明调节胚状体的原肠胚形成的基因的mRNA的表达增加，如GATA-6、Cdx2、Sox2、HNF3、AFP(图15，下侧)。
实施例22
胚状体样球体的神经元分化
为了产生神经元衍生物(神经元、少突胶质细胞、神经胶质细胞)，将10-50个胚状体样球体／35mm玻璃底板平铺在补充有10ng/ml的rhEGF、20ng／ml FGF-2及20ng/ml NGF的NeuroCult Basal Medium(StemCell Technologies，Vancouver，British Columbia，Canada)中。将细胞培养10-15天。每24小时加入生长因子，每2-3天更换培养基。
分化15天时，将细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断、并随后用针对βIII微管蛋白(1：100，兔多克隆IgG；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California,United States ofAmerica)、巢蛋白(1：200，小鼠单克隆IgG1；Chemicon Int.，Temecula,Califomia，United States of America)、或O4(1：200,少突胶质细胞标记物4，小鼠单克隆IgM；Chemicon Intl.)的抗体染色。利用合适的第二Alexa Fluor594山羊抗-兔IgG、Alexa Fluor594山羊抗-小鼠IgG、和Alexa Fluor594山羊抗-小鼠IgM(1：400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)。在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。
图16A-16C和17A-17D总结了源于VSEL干细胞的少突胶质细胞(图16A-16C)和神经元(17A-17D)的染色。在图16和17中，蓝色表示细胞核的DAPI染色(分子探针；蓝色)，巢蛋白染色表现为红色，绿色荧光蛋白(GFP)由抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor488结合物(1：400；Molecular Probes，Eugene，Oregon,United States of America)可视化。GFP存在于分离的细胞中，其是从GFP+小鼠(购自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，United States of America的C57BL／6-Tg(ACTbEGFP)1Osb／J小鼠)分离的。荧光图像用附着于Nikon Inverted MicroscopeEclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统收集并由cool snap HQ数字B／W CCD(Roper Scientific，Tucson，Arizona，United States of America)照相机捕获。
实施例23
胚状体样球体的内胚层分化
开始分化前，在PBS中简单冲洗胚状体样球体。将10-50个胚状体样球体／35mm玻璃底板平铺在补充有4mM L-谷氨酰胺、4.5g／l葡萄糖、1％热失活的FBS及50ng／ml的重组人Activin A的DMEM／F12Medium中。48小时后，更换培养基并在N2补充物-A、B27补充物及10mM烟酰胺(购自Stem Cell Technologies Inc.，Vancouver，British Columbia，United States ofAmerica)的存在下，在具有4mM L-谷氨酰胺、4.5g／l葡萄糖、5％热失活的FBS的DMEM／F12Medium中进行分化。每隔一天更换培养基。在培养12-17天后出现岛样集簇。
分化17天时，将细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对胰腺C-肽(1：100，豚鼠IgG，Linco Research，Inc.，St.Charles，Missouri，UnitedStates of America)的抗体染色。利用合适的第二Alexa Fluor594抗-豚鼠IgG(1：400；Molecular Probes，Eugene,Oregon，United States ofAmerica)。在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。
图18A-18C总结了源于VSEL干细胞的内胚层细胞的染色。在图18A-18C中，蓝色表示细胞核的DAPI染色(Molecular Probes，Eugene，Oregon,United States of America；蓝色)，C-肽染色表现为红色，绿色荧光蛋白(GFP)由抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor488结合物(1：400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)可视化。GFP存在于分离的细胞中，其是从GFP+小鼠(购自The JacksonLaboratory，Bar Harbor,Maine，United States of America的C57BL／6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb／J小鼠)分离的。荧光图像用附着于Nikon InvertedMicroscope Eclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统收集并由coolsnap HQ数字B／W CCD(Roper Scientific，Tucson，Arizona，United Statesof America)照相机捕获。
实施例24
胚状体样球体的心肌细胞分化
将10-50个胚状体样球体／35mm玻璃底板平铺在具有4mM L-谷氨酰胺、4.5g／l葡萄糖、10％热失活的FBS及10ng／ml bFGF、10ng／mlVEGF及10ng／ml TGFβ1的DMEM中。每24小时加入生长因子，每2-3天更换培养基。在分化约15-17天后心肌细胞分化。
分化17天时，将细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对肌钙蛋白I(1：200，小鼠单克隆IgG2b；Chemicon Intl.，Temecula，California，UnitedStates of America)及α-横纹肌(sarcomeric)辅肌动蛋白(1：100，小鼠单克隆IgM，Abcam，Inc.，Cambridge，Massachusetts，United States ofAmerica)的抗体染色。利用合适的第二Alexa Fluor594山羊抗-小鼠IgG和Alexa Fluor594抗-小鼠IgM(1：400；Molecular Probes，Eugene,Oregon，United States ofAmerica)。在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。
图19A-19C和20A-20D总结了源于VSEL干细胞的心肌细胞的染色。在图19A-19C中，蓝色表示细胞核的DAPI染色(Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States ofAmerica；蓝色)，肌钙蛋白I染色表现为红色，绿色荧光蛋白(GFP)由抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor488结合物(1：400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)可视化。在图20A-20D中，红色对应α横纹肌辅肌动蛋白的染色。GFP存在于分离的细胞中，其是从GFP+小鼠(购自The Jackson Laboratory，BarHarbor,Maine，United States of America的C57BL／6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb／J小鼠)分离的。荧光图像用附着于Nikon Inverted MicroscopeEclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统收集并由cool snap HQ数字B／W CCD(Roper Scientific,Tucson，Arizona，United Stares of America)照相机捕获。
实施例21-24的讨论
为了支持下述假定：从单独的VSEL干细胞生长的胚状体样球体中存在的细胞能够分化为全部三个胚层，来自单独的VSEL-DS的细胞被平铺在支持心肌细胞、神经元细胞及胰腺细胞的分化培养基上。组织化学染色及RT-PCR分析(图21A-21C)表明：来自单独的VSEL干细胞-来源的球体的细胞分化为心肌细胞(中胚层)、神经细胞和少突胶质细胞(外胚层)及胰腺β-岛(内胚层)产胰岛素细胞。细胞形态和谱系特异性蛋白的表达的这些变化与组织特异性基因的上调平行(参见图21)。
实施例25
心肌梗基的研究
利用购自Jackson Laboratory的两组(n=24／组)野生型小鼠(C57BL／6、129品系，体重25-35g，年龄12-16周)。实验准备已经描述在Guoetal.(1998)275Am J Physiol H1375-1387和Guo et al.(1999)96Proc Natl Acad Sci.USA11507-11512中。小鼠用戊巴比妥钠(50mg／kgi.p.)麻醉、插管、利用小啮齿动物通气机通气。实验中体温、心率及动脉pH被小心地维持在生理范围内。利用无菌技术，通过中线胸骨切开术打开胸腔。在从左心耳的心尖左前向下冠状动脉2-3mm下用锥形针穿过8-0尼龙缝合线，将非-外伤性气囊阻塞物用在动脉上。通过膨胀气囊阻塞物诱导冠状动脉梗塞。组I的小鼠经历30分钟冠状动脉梗塞，随后再灌注，而组II中的小鼠经历假手术(1小时开胸状态)。参见Guo et al.(1998)275Am J Physiol H1375-1387和Guo et al.(1999)96Proc NatlA cad Sci.U SA11507-11512。在再灌注开始后6小时、24小时、48小时、或96小时处死小鼠(在每个时间点每个组中n=6只小鼠)。
安乐死后，将血液样品(对于每只小鼠1.0-1.5ml)收集在肝素-冲洗的注射器中用于外周血单核细胞(PBMNC)的分离。从缺血和非-缺血区收集心肌组织样品并立即冷冻在液氮中用于mRNA提取。
实施例26
心脏标记物的体外表达
测试培养基中骨髓-来源的Sca-1+／lin-／CD45-MNC分化为心肌细胞表型的能力。由于在单独培养时Sca-1+／lin-／CD45-细胞不能存活，Sca-1+/lin-／CD45-和Sca-1+／lin-／CD45+BMMNC在分离的板中与为细胞存活提供有益环境的未纯化的骨髓细胞一起培养。21天后，免疫染色这些细胞以检测心脏-特异性肌球蛋白重链和心脏肌钙蛋白I的表达。Sca-1+／lin-／CD45-BMMNC被加入的板中培养的细胞(图22A-22C和22D-22F)与Sca-1+／lin-／CD45+细胞被加入的板相比，表现出不同的表型。在具有Sca-1+／lin-／CD45-细胞的板中的多个细胞对于心脏-特异性肌球蛋白重链是阳性的(图22B、22C、22E及22F；绿色荧光)。这些心脏-特异性肌球蛋白重链-阳性细胞中的许多对于心脏肌钙蛋白I也是阳性的(图22D和22F[箭头]；红色荧光)。
相反，Sca-1+／lin-／CD45+细胞被加入其中的板中培养的细胞(图22G-22I)对于这些心脏-特异性抗原的表达主要是阴性的(图22H)。在图22A-22I，通过DAPI鉴定细胞核(蓝色荧光)。这些结果表明Sca-1+／lin-／CD45-细胞能够在培养基中分化为心肌细胞表型。
实施例27
免疫组织化学
通过免疫组织化学检验PSC／VSEL干细胞中心脏-特异性标记物(GATA-4和Nkx2.5／Csx)的表达。鼠对照(未纯化的)BMMNC和化学吸引于SDF-1、HGF及LIF的BMMNC、或通过FACS分类的Sca-1+／lin-／CD45-和Sca-1+／lin-／CD45+BM来源的细胞在1％多聚甲醛中固定30分钟、被0.5％Triton×100渗透、在4℃与兔多克隆抗-GATA-4(SantaCruz)和兔多克隆抗-Nkx2.5／Csx(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California，United States of America)初始抗体整夜孵育。FITC-和TRITC-标记的第二抗体分别用于检测GATA-4和Nkx2.5／Csx。利用共聚焦显微镜(Zeiss LSM510，Carl Zeiss，Thornwood，New York，United States ofAmerica)计数对于心脏标记物阳性的细胞并表达为总MNC的百分数。
实施例28
功能性多能VSEL干细胞数量随着年龄减少
还研究了年轻与年老小鼠中VSEL干细胞的数量。观察到可以通过FACS分类的Sca-1+／lin-／CD45-细胞的产量随着年龄减少(图23和24)。进一步确定VSEL-DS可以在与C2C12细胞的共培养中仅由从年轻小鼠分离的VSEL干细胞形成(图25)。有趣的是，来自2.5-岁大的动物的VSEL干细胞在与C2C12共培养时形成圆形细胞的细胞集簇。这些圆形细胞表达CD45抗原并且能够在甲基纤维素的第二培养基中中生长造血集落(图26)。
实施例29
VSEL干细胞从脐带血的分离
脐带血(CB)来源的VSEL干细胞的染色和分离
在室温下将全人脐带CB在BD裂解缓冲液(BD Biosciences，SanJose，California，United States ofAmerica)中裂解并在PBS中冲洗两次。单细胞悬浮液被染色用于与FITC结合的多个谱系标记物(CD2克隆RPA-2.10；CD3克隆UCHT1；CD14克隆M5E2；CD66b克隆G10F5；CD24克隆ML5；CD56克隆NCAM16.2；CD16克隆3G8；CD19克隆HIB19；以及CD235a克隆GA-R2)、与PE结合的CD45(克隆HI30)、与APC结合的CXCR4(克隆12G5)、CD34(克隆581)或CD133(CD133／1)的组合，在冰上进行30分钟。冲洗后，通过FACS(BD Biosciences，SanJose,California，United States of America)分析细胞。获得至少106个事件并通过利用Cell Quest软件分析。
通过多参数、活性无菌细胞分类从CB MNC的悬浮液分类CXCR4+／lin-／CD45-、CD34+lin-／CD45-、或CD133+／lin-／CD45-细包(MOLFOTM，Dako A／S，Fort Collins，Colorado，United States of America，或BD FACSARIATMCell-Sorting System，BD Biosciences，San Jose，California,United States of Ametica)。
透射电子显微镜(TEM)分析。对于透射电子显微镜，CXCR4+／lin-／CD45-细胞在0.1M卡可酸盐缓冲液(pH7.4)中3％戊二醛中4℃固定10小时，在四氧化锇(osmium tetride)中后-固定及脱水。随后将固定的细胞包埋在LX112树脂(Ladd Research Industries，Inc.，Burlington，Vermont，United States of America)中并以800A切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色、并在Philips CM10电子显微镜(Philips，Eindhoven，theNetherlands)(在60kV运行)上观察。
RT-PCR。利用Mini Kit(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States of America)分离总RNA。根据制造商的说明，采用一步RT-PCR(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States of America)逆转录mRNA(10ng)。利用DNA聚合酶(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States of America)扩增获得的cDNA片段。用于Oct4的引物序列为正向引物：5’-TTG CCA AGC TCC TGA AGCA-3’(SEQ ID NO：65)和反向引物：5’-CGT TTG GCT GAA TAC CTTCCC-3’(SEQ ID NO：66)，用于Nanog的引物序列为正向引物：5’-CCCAAA GCT TGC CTT GCT TT-3’(SEQ ID NO：67)和反向引物：5’-AGACAG TCT CCG TGT GAG GCA T-3’(SEQ ID NO：68)。PCR产物的正确尺寸通过琼脂糖凝胶上的分离确认。
实时RT-PCR(RQ-PCR)。为了分析Oct4、Nanog、Nkx2.5／Csx、VE-钙粘蛋白及GFAP mRNA水平，借助Mini Kit(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States of America)从细胞分离总mRNA。借助Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems，FosterCity，California，United States of America)逆转录mRNA。利用ABI7000Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，California，United States of America)，通过实时RT-PCR进行Oct4、Nanog、Nkx2.5／Csx、VE-钙粘蛋白、GFAP及β2-微球蛋白mRNA水平的检测。25μl反应混合物包含12.5μl SYBR Green PCR Master Mix、10ng的cDNA模板、用于Oct4的5’-GAT GTG GTC CGA GTG TGG TTC T-3’(SEQ IDNO：69)正向和5’-TGT GCA TAG TCG CTG CTTGAT-3’(SEQ ID NO：70)的反向引物；用于Nanog的5’-GCA GAAGGC CTC AGC AC|TA-3’(SEQ ID NO：71)正向和5’-AGGTTC CCA GTC GGG TTCA-3’(SEQ ID NO：72)反向引物；用于Nkx2.5／Csx的5’-CCC CTG GAT TTT GCA TTC AC-3’(SEQ ID NO：73)正向和5’-CGT GCG CAA GAA CAA ACG-3’(SEQ ID NO：74)反向引物；用于VE-钙粘蛋白的5’-CCG ACA GTT GTA GGC CCT GTT-3’(SEQ ID NO：75)正向和5’-GGC ATCTTC GGG TTG ATC CT-3’(SEQ ID NO：76)反向引物；用于GFAP的5’-GTG GGC AGG TGG GAG CTT GAT TCT-3’(SEQ ID NO：77)正向和5’-CTG GGG CGG CCT GGT ATG ACA-3’(SEA ID NO：78)反向引物；用于2微球蛋白的5’-AATGCGGCATCTTCAAAC CT-3’(SEQ ID NO：79)正向和5’-TGA CTT TGT CAC AGC CCA AGA TA-3’(SEQ ID NO：80)反向引物。借助PRIMER软件(Applied Biosystems，Foster City，California，United States ofAmerica)设计引物。
随后测定阈值周期(Ct；即，扩增的感兴趣的基因到达固定阈值的量的周期数)。用比较Ct方法计算Oct4和Nanog mRNA表达的相对定量。靶标的相对定量值，标准化为内源性对照β2-微球蛋白基因并相对于校准器，表达为2-ΔΔCt(倍数差别)，其中ΔCt=靶基因(Oct4、Nanog、Nkx2.5／Csx、VE-钙粘蛋白、GFAP)的Ct-内源性对照基因(β2-微球蛋白)的Ct，ΔΔCt=靶基因的样品的ΔCt-靶基因的校准器的ΔCt。
为了避免扩增污染DNA的可能性，用于实时RTR-PCR的所有引物用要扩增的cDNA内的内含子序列设计，利用合适的阴性对照(无模板的对照)进行反应，通过分析扩增产物的熔解曲线(解离图)复查产物的均匀扩增，熔解温度(Tm)为57-60℃，产物Tm比引物Tm至少高10℃，并且，进行凝胶电泳以确认扩增产物的正确尺寸和非特异性带的缺乏。
CB-来源的VSEL干细胞的荧光染色。检测来自四个独立的实验的细胞中每个抗原的表达。CXCR4+／lin-／CD45-细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对SSEA-4(克隆MC-813-70；1：100；小鼠单克隆IgG，Chemicon Intl.，Temecula，California，United States of America)、Oct-4(克隆9E3；1：100；小鼠单克隆IgG；Chemicon Intl.，Temecula，California，United States ofAmerica)、以及Nanog(1：200，山羊多克隆IgG；SantaCruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，California，United States of America)的抗体染色到。利用合适的第二Alexa Fluor488山羊抗-小鼠IgG、AlexaFluor594山羊抗-小鼠IgG及Alexa Fluor594兔抗-山羊(1：400；Molecular Probes，Eugene,Oregon，United States of America)。
在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。用DAPI标记细胞核(Molecular Probes，Eugene,Oregon，United States of America)。荧光图像用附着于Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300的TE-FMEpi-Fluorescence系统收集并由cool snap HQ数字B／W CCD(RoperScientific，Tucson，Arizona，United States of Ametica)照相机捕获。
统计分析。在Macintosh computer PowerBase180上，利用Instat1.14(GraphPad，San Diego，Califormia，United States of America)软件计算FACS数据的算术平均数和标准差。利用用于未配对样品的Student t检验或用于多个比较的ANOVA分析数据。统计显著性限定为p<0.05。
还利用实施例2中描述的通常的FACS方法从人类脐带血分离VSEL干细胞。对于人类细胞，采用直接针对CXCR4(用别藻蓝蛋白(APC)标记)、CD45(用藻红蛋白(PE)标记)、CD19、CD16、CD2、CD14、CD3、CD24、CD56、CD66b及CD235a的抗体。用荧光素异硫氰酸盐(FITC)标记针对谱系标记物的抗体。分离的VSEL干细胞是CXCR4+／lin-／CD45-，在TEM下看起来类似鼠VSEL干细胞(即，直径约3-4μm，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核、并包含开放型染色质(常染色质))，通过实时RT-PCR富集多能干细胞的标记物(参见实施例7)。
实施例29的讨论
CD34 + CD133 + CXCR4 + lin - ／CD45 - 细胞群存在于CB中
进行多参数分析(在图32中绘出)以确定人类CB单核细胞(CBMNC)是否包含类似于VSEL干细胞的细胞群。为了从CB分离MNC，不采用Ficoll-Paque离心，通过低张裂解去除红细胞。此外，假定CB-VSEL干细胞，类似它们在成年鼠BM中的相对物，将是小的并且是lin-／CD45-。
因此，研究小(<5μm)lin-／CD45-CB MNC群。还研究这些细胞如同它们的鼠BM-来源的相对物那样表达CxCR4。此外，检测所述细胞的其它人类干细胞抗原如CDl33和CD34的表达。
图27A示出了人类CB包含表达CxCR4(0.037±0.02％，n=9)、CD34(0.018±0.028％，n=5)及CD133(0.018±0.008％，n=5)的lin-／CD45-MNC群。这些CXCR4+／CD133+／CD34+／lin-／CD45-细胞通过FACS以类似于VSEL干细胞的方式分类、不在体外生长造血集落、并且还类似于鼠VSEL干细胞，非常小(约3-5μm；图27B，上侧)。相反，CB-来源的lin-／CD45+造血细胞较大(>6μm；图27B，下侧)。此外，在CB-来源的小lin-／CD45-细胞中观察到CXCR4、CD34及CD133抗原的共表达的显著重叠，确定lin-／CD45-细胞的0.015±0.005％为CXCR4+／CD133+／CD34+。
通过FACS分类的CB-来源的CXCR4+／CD133+／CD34+／lin-／CD45-细胞，以及CXCR4+／lin-／CD45-、CD34+／lin-／CD45-及CD133+／lin-／CD45-／细胞高度富集由多能胚胎细胞表达的转录因子如Oct-4和Nanog的mRNA(图28A和28B)。随后通过常规RT-PCR确认这些标记物的表达(图28C)。此外，这些细胞，如本文对于BM-来源的VSEL干细胞披露的，还富集对于不同器官／组织的多个发育基因如Nkx2.5／Csx、VE-钙粘蛋白及GFAP的mRNA，其分别是心脏-、内皮-及神经组织定向干细胞(TCSC)的标记物。
CB-来源的CXCR4 + lin - ／CD45 - 细胞在蛋白水平表达SSEA-4、Oct-4 及Nanog。鼠BM-来源的VSEL干细胞在蛋白水平表达SSEA-1、Oct-4及Nanog。因此，进行免疫荧光染色以评估CB-VSEL干细胞是否也表达类似的胚胎干细胞标记物。图29示出了染色的实例，表明高度纯化的CB-来源的CXCR+／lin-／CD45-细胞在它们的表面上表达SSEA-4并在细胞核中表达Oct-4和Nanog转录因子。
CB-来源的CXCR4 + ／lin - ／CD45 - ／细胞的透射电子显微镜分析。通过透射电子显微镜(TEM)分析CXCR4+／CD34+／CD133+／lin-／CD45-细胞。图30表明CB-VSEL干细胞非常小～3-5μm并包含相对大的细胞核和具有许多线粒体的细胞质的窄缘。这些细胞的细胞核中的DNA包含作为多能胚胎干细胞的特征的开放型常染色质。因此，当前披露的主题首次提供了成年CB中存在非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的独特群的形态学证据。
实施例30
VSEL-DS可以分化为造血细胞(hematopoietic cell)
观察到从源自GFP+小鼠的VSEL-DS分离的细胞如果平铺在补充有IL-3+GM-CSF的甲基纤维素培养基中时，形成小的第二球体(图31A和31B)。通过从初始甲基纤维素培养基的甲基纤维素溶解回收的这些第二球体制备的单细胞悬浮液，如果再次平铺在甲基纤维素培养基(中侧)或血浆凝块(plasma clot)(右侧)中并由IL-3和GM-CSF刺激，形成造血集落(hematopoietic colony)。这些为造血集落的证据通过FACS分析来自甲基纤维素中生长的溶解集落的细胞的CD45表达或通过免疫荧光染色来自血浆凝块培养基中生长的集落的细胞的CD45而获得(图31C)。
平行地，通过采用实时RT-PCR分析从甲基纤维素中生长的集落分离的细胞的造血基因(hematopoietic gene)的表达。在IL-3+GM-CSF的存在下，在扩展期间，通过常规RT-PCR并通过RQ-PCR观察到造血转录因子如c-myb、PU-1及SCL的mRNA的上调。因此，VSEL干细胞可能是BM中最原始的HSC的来源。
实施例31
VSEL-DS体外分化为造血细胞
VSEL-DS被胰蛋白酶化(trypsynized)并平铺在基于甲基纤维素的培养基(StemCell Technologies Inc.，Vancouver，British Columbia，Canada)中。在甲基纤维素培养基中培养5天时，细胞增殖并形成小球体。这些球体通过抽吸从甲基纤维素培养基回收、被冲洗并trypsinized以获得单细胞悬浮液，并重新平铺在基于甲基纤维素的培养基中，所述基于甲基纤维素的培养基包含用于造血集落形成的细胞因子和生长因子的所选组合。
为了CFU-GM集落生长，加入鼠白介素-3(mlL-3)+鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子m(GM-CSF)。同时，将这些细胞的等分试样平铺在血浆凝块培养基中。为此的原因是这些培养基适于通过免疫荧光和免疫组织化学染色分析。在第4-6天在甲基纤维素和血浆凝块条件中均形成造血集落。回收来自甲基纤维素中生长的集落的细胞用于mRNA分离或FACS分析。
参考文献
下面列出的参考文献及说明书中列出的所有参考文献，包括专利、专利申请、杂志文章及所有数据库条目(如Accession Nos.，包括数据库中存在的与披露的序列相关的任何注解)，以引用方式并入本文中到这样的程度，即它们补充、解释、为本文所用的方法、技术、和／或组合物提供背景、或教导本文所用的方法、技术、和／或组合物。
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将理解可以改变所描述的主题的各种细节而不偏离所描述的主题的范围。此外，前面的描述仅是为了示意，而非为了限制。

Claims (73)

1.一种用于从非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物的群体形成胚状体样球体的方法，所述方法包括：
(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群；以及
(b)在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中培养VSEL干细胞或其衍生物达足以使胚状体样球体形成的时间。
2.权利要求1所述的方法，其中所述VSEL干细胞或其衍生物包含CD34+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-非常小的胚胎样(VSEL)干细胞。
3.权利要求1所述的方法，其中所述VSEL干细胞的直径约为3-4μm，表达SSEA-1、Oct-4、Rev-1、和Nanog的至少一种，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核，并且具有开放型染色质(常染色质)。
4.权利要求1所述的方法，其中所述包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群从人或从小鼠分离。
5.权利要求4所述的方法，其中所述包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群从人或小鼠中选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的组的来源分离。
6.权利要求1所述的方法，其中所述诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个生长因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2及其组合。
7.权利要求1所述的方法，其中通过将所述VSEL干细胞或其衍生物与C2C12细胞共培养将所述一个或更多个因子提供给所述VSEL干细胞或其衍生物。
8.权利要求1所述的方法，进一步包括通过包含下列步骤的方法分离包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45-细胞群：
(a)提供怀疑包含CD45-干细胞的初始细胞群；
(b)在足以允许每个抗体与，如果存在时，在初始细胞群的每个细胞上的它的靶标结合的条件下将所述初始细胞群与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触；
(c)选择为CD34+或Sca-1+、并且还是CD45-的细胞的第一亚群；
(d)在足以允许每个抗体与，如果存在时，在所述细胞群的每个细胞上的它的靶标结合的条件下将所述细胞的第一亚群与对于一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，所述标记物选自由CD45R／B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119组成的组；
(e)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的所述抗体的至少一个的那些细胞；以及
(f)收集为CD34+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-的细胞的第二亚群，由此分离CD45-干细胞的亚群。
9.权利要求8所述的方法，其中每个抗体包括可检测的标记。
10.权利要求9所述的方法，其中所述可检测的标记包括荧光标记或者可以通过包含荧光标记的试剂被检测的部分。
11.权利要求8所述的方法，其中所述分离包括FACS分类。
12.权利要求8所述的方法，进一步包括分离为c-met+、c-kit+、和／或LIF-R+的那些细胞。
13.权利要求8所述的方法，进一步包括分离表达选自由SSEA-1、Oct-4、Rex-1及Nanog组成的组的一个或更多个基因的那些细胞。
14.权利要求8所述的方法，其中所述细胞群包括骨髓样品、脐带血样品、或外周血样品。
15.权利要求14所述的方法，其中在用足以将包含VSEL干细胞的CD45-干细胞从骨髓移动到受试者的外周血的量的移动剂处理所述受试者后，所述细胞群从所述受试者的外周血分离。
16.权利要求15所述的方法，其中所述移动剂包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗剂的至少一种。
17.权利要求16所述的方法，其中所述CXCR4拮抗剂是T140肽。
18.权利要求15所述的方法，其中所述受试者是小鼠。
19.权利要求8所述的方法，进一步包括将所述干细胞的亚群与结合到CXCR4的抗体接触以及从所述干细胞的亚群分离为CXCR4+的那些细胞。
20.权利要求8所述的方法，进一步包括分离为CXCR4+和／或AC133+的那些细胞。
21.权利要求8所述的方法，进一步包括选择为HLA-DR-、MHCI类-、CD90-、CD29-、CD105-、或其组合的那些细胞。
22.一种包含多个非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的胚状体样球体。
23.一种包含权利要求22所述的胚状体样球体的细胞培养物，所述胚状体样球体在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中。
24.一种将非常小的胚胎样(VSEL)干细胞分化为感兴趣的细胞类型的方法，所述方法包括：
(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体；以及
(b)在包含分化诱导量的一个或更多个因子的培养基中培养所述胚状体样球体直到所述培养物中出现所述感兴趣的细胞类型，所述因子诱导所述VSEL干细胞或其衍生物分化为所述感兴趣的细胞类型。
25.权利要求24所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型选自由神经元细胞、内胚层细胞及心肌细胞及其衍生物组成的组。
26.权利要求25所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型是神经元细胞或其衍生物。
27.权利要求26所述的方法，其中所述神经元细胞或其衍生物选自由少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞及神经元组成的组。
28.权利要求26所述的方法，其中所述神经元细胞或其衍生物表达选自由GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1及Olig2组成的组的标记物。
29.权利要求26所述的方法，其中所述培养持续至少约10天。
30.权利要求26所述的方法，其中所述培养基包括约10ng／mlrhEGF、约20ng／ml FGF-2及约20ng／ml NGF。
31.权利要求25所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为内胚层细胞或其衍生物。
32.权利要求31所述的方法，其中所述培养包括在包含Activin A的第一培养基中培养所述胚状体样球体；以及其后在包含N2补充物-A、B27补充物及约10mM烟酰胺的第二培养基中培养所述胚状体样球体。
33.权利要求32所述的方法，其中在所述第一培养基中的培养持续约48小时。
34.权利要求32所述的方法，其中在所述第二培养基中的培养持续至少约12天。
35.权利要求32所述的方法，其中所述内胚层细胞或其衍生物表达选自由Nkx6.1、Pdx1及C-肽组成的组的标记物。
36.权利要求25所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为心肌细胞或其衍生物。
37.权利要求36所述的方法，其中所述培养持续至少约15天。
38.权利要求36所述的方法，其中所述培养基包括碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及转化生长因子β1的组合，数量足以造成所述胚状体样球体细胞的亚组分化为心肌细胞。
39.权利要求36所述的方法，其中所述心肌细胞或其衍生物表达选自由Nsx2.5／Csx和GATA-4组成的组的标记物。
40.权利要求24所述的方法，其中所述胚状体样球体通过下述制备：
(a)提供包含VSEL干细胞的CD45-细胞群；以及
(b)在包含一个或更多个诱导所述VSEL细胞的胚状体样球体形成的因子的培养基中培养所述VSEL干细胞达到足以使胚状体样球体出现的时间。
41.一种包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的权利要求24所述的分化的非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的制剂。
42.权利要求41所述的制剂，其中所述药学上可接受的载体或赋形剂用于人类中是可接受的。
43.一种用于治疗受试者中组织损伤的方法，所述方法包括给予所述受试者包括在药学上可接受的载体中的包含VSEL干细胞的多个分离的CD45-干细胞的组合物，数量和经由的途径足以允许CD45-干细胞群的至少一部分结合所述组织并且在其中分化，由此治疗所述损伤。
44.权利要求43所述的方法，其中所述损伤选自由缺血性损伤、心肌梗塞及中风组成的组。
45.权利要求43所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
46.权利要求45所述的方法，其中所述哺乳动物选自由人类和小鼠组成的组。
47.权利要求43所述的方法，其中所述包含VSEL干细胞的分离的CD45-干细胞从选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合组成的组的来源分离。
48.权利要求43所述的方法，进一步包括分化所述分离的CD45-干细胞以在给予所述受试者所述组合物之前产生预定的细胞类型。
49.权利要求48所述的方法，其中所述预定细胞类型选自由神经细胞、内胚层细胞、心肌细胞及其衍生物组成的组。
50.一种产生嵌合动物的方法，所述方法包括将一个或更多个包含VSEL干细胞的CD45-干细胞群添加到胚胎，以便所述一个或更多个CD45-干细胞发育为所述胚胎的一个或更多个细胞类型。
51.权利要求50所述的方法，其中所述添加包括将所述一个或更多个CD45-干细胞注射入胚泡期胚胎的所述囊胚腔。
52.权利要求50所述的方法，其中所述添加包括聚集包含所述VSEL干细胞的所述一个或更多个CD45-干细胞与桑葚胚期胚胎。
53.权利要求50所述的方法，进一步包括在加入一个或更多个包含所述VSEL干细胞的所述CD45-干细胞后孕育所述胚胎至少直到出生，以提供嵌合动物。
54.一种从CD45-干细胞群纯化非常小的胚胎样(VSEL)干细胞用于感兴趣的细胞类型的方法，所述方法包括
(a)提供包含VSEL干细胞的CD45-干细胞群；
(b)鉴定表达VSEL干细胞的标记物的所述CD45-干细胞的亚群；以及
(c)纯化所述亚群。
55.权利要求55所述的方法，其中所述群和所述亚群除了为CD45-，均为CD34+／CXCR4+／lin-或Sca-1+／lin-。
56.权利要求55所述的方法，其中包含VSEL干细胞的所述CD45-干细胞群从选自由骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合组成的组的来源分离。
57.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型选自由骨骼肌细胞、肠上皮细胞、胰腺细胞、内皮细胞、表皮细胞、黑色素细胞、神经元细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰腺细胞、内皮细胞、上皮细胞、视网膜色素细胞及内胚层细胞组成的组。
58.权利要求58所述的方法，其中所述标记物选自由GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、Myf5、MyoD、成肌蛋白、Nsx2.5／Csx、GATA-4、甲胎蛋白、CK19、Nkx2-3、Tcf4、Nkx6.1、Pdx1、VE-钙粘蛋白、Krt2-5、Krt2-6a、BNC、DCT、TYR及TRP组成的组。
59.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为心肌细胞，所述标记物选自由Nkx2.5／Csx、GATA-4、MEF2C组成的组。
60.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为内皮细胞，所述标记物选自由VEGFR2、VE-钙粘蛋白、血管性血友病因子及TIE2组成的组。
61.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为骨骼肌细胞，所述标记物选自由Myf5、MyoD及成肌蛋白组成的组。
62.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为肝细胞，所述标记物选自由甲胎蛋白和CK19组成的组。
63.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为神经细胞，所述标记物选自由βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、GFAP及巢蛋白组成的组。
64.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为胰腺细胞，所述标记物选自由Nkx6.1和Pdx1组成的组。
65.权利要求55所述的方法，其中所述感兴趣的细胞类型为黑色素细胞，所述标记物选自由DCT、TYR及TRP组成的组。
66.一种鉴定胚状体样球体形成的诱导剂的方法，所述方法包括：
(a)从已知包含所述诱导剂的细胞制备包含多个cDNA克隆的cDNA文库；
(b)用所述cDNA文库转化不包含所述诱导剂的多个细胞；
(c)在所述转化的多个细胞存在下，培养多个VSEL干细胞或其衍生物，其培养条件足以造成所述VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体；
(d)分离包含所述诱导剂的所述转化的细胞；
(e)从所述转化的细胞回收cDNA克隆；以及
(f)鉴定由回收的所述cDNA克隆编码的多肽，由此鉴定胚状体样球体形成的诱导剂。
67.权利要求66所述的方法，其中已知包括所述诱导剂的所述细胞为C2C12细胞。
68.权利要求66所述的方法，其中所述多个cDNA克隆包括位于所述cDNA克隆被插入其中的克隆载体中cDNA克隆位点的至少一侧的侧翼的至少一个引物结合位点。
69.权利要求68所述的方法，进一步包括利用杂交到位于所述cDNA克隆位点的两侧的侧翼的引物位点的引物扩增所述转化的细胞中存在的所述cDNA克隆。
70.权利要求66所述的方法，其中所述鉴定是通过对所述cDNA克隆测序进行的。
71.一种从脐带血或其部分分离包含VSEL干细胞的CD45-干细胞的亚群的方法，所述方法包括：
(a)在足以允许每个抗体与，如果存在时，在所述细胞群的每个细胞上的它的靶标结合的条件下，将所述脐带血或其部分与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触；
(b)选择为CD34+或Sca-1+、并且为CD45-的细胞的第一亚群；
(c)在足以允许每个抗体与，如果存在时，在所述细胞群的每个细胞上的它的靶标结合的条件下，将所述细胞的第一亚群与对于选自由CD45R／B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119组成的组的一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触；
(d)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的所述抗体的至少一个的那些细胞；以及
(e)收集为CD34+／lin-／CD45-或Sca-1+／lin-／CD45-的细胞的第二亚群，由此分离包含VSEL干细胞的CD45-干细胞的亚群。
72.权利要求71所述的方法，进一步包括在低张溶液中孵育所述脐带血或其部分或所述亚群的任何一个达到足以基本上裂解可能存在的所有红细胞的时间。
73.权利要求71所述的方法，进一步包括分离对于CXCR4、c-met、c-kit、或LIF-R的至少一个为阳性的那些细胞。
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