KR20230094841A - 태반-유래 줄기세포 및 이를 함유하는 신경 재생 치료용 세포치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 태반-유래 줄기세포를 포함하는 세포치료제에 관한 것으로, 본 발명의 태반-유래 줄기세포는 우수한 세포 증식능력, 다분화 능력과 함께 유전적 및 독성학적으로 안정성을 가지고 있으며, 손상된 신경 조직의 재생을 촉진시키는 효과가 있는 바, 반려동물의 복합적인 손상에 따른 신경 재생 치료와 그에 수반되는 치료 메커니즘에 대한 학술연구 및 추후 사람의 치료 연구 개발 등에 기여할 수 있다.

Description

태반-유래 줄기세포 및 이를 함유하는 신경 재생 치료용 세포치료제{Perinatal-derived stem cells and Cell therapy product for treating neural regeneration comprising thereof}

본 발명은 개과 동물의 태반-유래 줄기세포를 함유하는 세포치료제에 관한 것이다.

줄기세포는(stem cell)는 일반 체세포(somatic cell)와 달리 여러 종류의 세포를 생산할 수 있는 다분화능(multipotent)을 가진 자기복제(self-renew)가 가능한 미분화 세포로서 손상된 조직 부위의 재생과 면역 환경 조절 특성 등을 지니고 있어 의학적 활용도가 매우 높은 차세대 기술로 인식되어 알려져 있으며, 재생의학 분야에서 1999년 최초의 임상 연구가 시작된 이래, 전 세계적으로 활발한 연구가 진행되고 있다.

줄기세포는 세포의 기원에 따라 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 역분화줄기세포 등으로 구분되며, 줄기세포를 이용한 연구 및 치료는 조직 원료 획득의 용이성, 줄기세포 분리 효율, 종양 형성 및 윤리적인 문제 등을 고려하여 주로 성체 줄기세포(adult stem cells)를 이용하여 진행되고 있다.

성체 줄기세포는 골수, 지방, 제대혈(umbilical cord blood), 태반 등을 포함한 인제의 모든 조직에 분포하고 있으며, 기원 조직에 따라 줄기세포 특성의 차이가 있다고 알려져 있다.

한편, 태반 줄기세포는 제대혈, 양막 및 양수에서 유래한 줄기세포로, 다른 조직 유래 중간엽 줄기세포 중에서 가장 최근에 발견되어 연구되고 있다. 태반 줄기세포는 우수한 증식 능력을 가지고 있으며 종양형성 문제가 없고, 지방, 뼈, 근육, 간, 신경 등의 중배엽, 내배엽, 외배엽 기원 조직으로 분화할 수 있는 능력을 지니고 있다. 특히 윤리적인 문제를 극복한 유일한 줄기세포이며, 출생 시 비침습적인 방법으로 확보가 가능한 장점이 있으며, 위와 같은 결과들은 성체 줄기세포 기원 조직 중 태아와 함께 생성되어 가장 빨리 채취 가능한 조직으로 태반 줄기세포의 세포치료제로서의 가능성을 보여준다.

최근 태반 줄기세포가 손상된 조직 부위에서 상피세포의 증식을 촉진시키고 세포 사멸을 억제 효과를 확인한 연구들이 발표되었으며, 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor) 등에 의한 면역 조절 기능을 통해 면역 세포의 생존률이 감소된다는 연구 결과가 발표되었다.

KR 10-2007-0101756 A1

본 발명자들은 신경 재생용 세포치료제를 개발하고자 연구하던 중, 임신한 개의 출산 과정에서 채취한 양수로부터 태반-유래 줄기세포 주(Line)를 구축하고, 이를 이용한 세포치료제의 척추 조직 및 신경 재생 능력을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 태반-유래 줄기세포(Placenta-derived stem cells)를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 신경 재생용 세포치료제를 개발하고자 연구하던 중, 임신한 개의 출산 과정에서 채취한 양수로부터 태반-유래 줄기세포 주(Line)를 구축하고, 이를 이용한 세포치료제의 척추 조직 및 신경 재생 능력을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 본 발명의 방법에 의해 구축된 태반 유래 양수 줄기세포에 대하여, 국제 줄기세포 위원회(international society for cellular therapy, ISCT)의 기준에 의해 줄기세포 배양, 증식, 분화 특성을 분석하였으며, 신경 분화 유도에 의하여 신경 전구세포(neural precursor cell)로 분화될 수 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 방법에 의해 구축된 태반 유래 양수 줄기세포 이식을 통하여 척추가 손상된 개체에서 임상적 의의를 가지는 조직 및 신경 재생 능력을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 태반-유래 줄기세포를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 태반-유래 줄기세포(Placenta-derived stem cells)를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.

본 발명에서 "줄기세포"는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.

본 발명에서 "태반-유래 줄기세포"는 태반으로부터 수득 될 수 있는 줄기세포를 지칭한다. 구체적으로는 태반 줄기세포, 다능성(multipotent) 세포 및 전구(progenitor) 세포를 포함한다.

본 발명에서 "다능성 세포"는 포유류 신체의 약 260개 세포 유형의 임의의 하위세트로의 성장능력을 갖는 세포를 지칭한다. 만능성 세포와 달리, 다능성 세포는 모든 세포 유형을 형성하려는 능력을 갖지 않는다.

본 발명에서 "전구 세포"는 특정 유형의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직을 형성하도록 된 세포를 지칭한다.

본 발명에서 "분화"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다.

본 발명에서 "세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식·선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.

상기 태반-유래 줄기세포는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의해 얻어진 것일 수 있다.

개과 동물 모체의 출산 후 분리되는 양막낭으로부터 양수를 얻는 단계;

원심분리하여 펠렛(pellet)을 회수하는 단계;

세척 및 원심분리를 반복하여 단핵세포를 분리하는 단계; 및

소태아혈청 및 항생제가 첨가된 배지에서 배양하는 단계.

본 발명에서 "개과 동물"이란, 말과(Canidae; Genus Canina)에 속하는 포유류 동물로, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼, 승냥이 등의 잡식성 동물이며, 모두 발가락으로 걷는 지행동물이다. 상기 개과동물은 크게 개족과 여우족으로 나뉜다. 개족은 갈기늑대, 가로무늬자칼, 검은등자칼, 개, 딩고, 붉은늑대, 에티오피아늑대, 인도늑대, 코요태, 황금자칼, 게잡이여우속, 들개속, 승냥이, 아프리카들개, 작은귀개, 포클랜드늑대, 안데스여우, 다윈여우, 아르헨티나회색여우, 팜파스여우, 페루사막여우, 흰여우 등을 포함하고, 여우족은 북극여우, 붉은여우, 스위프트여우, 키트여우, 코사크여우, 케이프여우, 검은꼬리모래여우, 벵골여우, 티베트모래여우, 블랜포드여우, 흰꼬리모래여우, 페넥여우, 회색여우, 섬여우, 코즈멜여우 등을 포함하며, 기타 큰귀여우, 너구리 등이 있다.

본 발명에서 "태반"은 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 것으로, 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며 그 사이 공간에 모체의 혈액이 담겨 있어 태아에게 영양분을 공급하게 된다. 태반은 양막, 장막, 탈락막의 3층으로 구성되어 있다.

본 발명에서 "양막"은 융모막, 탈락막과 함께 삼중층의 구조로 태반을 구성하는 하나의 층이다. 상피 단층과 기질막의 이중층 구조를 갖는 얇은 무혈관 막으로 태아에 결합하여 환경을 구성하는 주머니이다.

상기 분리방법에 의해 얻어진 본 발명의 태반-유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포 마커인 CD29, CD44, CD90, 줄기세포 마커인 CD146, STRO1에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 중간엽 줄기세포 마커인 CD14, CD19, CD34, CD45, 면역 세포 마커인 MHC class II에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타낸다.

또한, 상기 분리방법에 의해 얻어진 본 발명의 태반-유래 줄기세포는 다능성을 나타내는 유전자(Oct4, c-Myc, 및 Klf4), 및 전분화능을 나타내는 유전자(Nanog, Oct4, Sox2, SSEA-1, 및 Smad1)에 대하여 모두 양성의 유전적 발현 특성을 나타낸다.

또한, 상기 분리방법에 의해 얻어진 본 발명의 태반-유래 줄기세포는 입방 형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타낸다.

또한, 상기 분리방법에 의해 얻어진 본 발명의 태반-유래 줄기세포는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가진다.

나아가, 상기 분리방법에 의해 얻어진 본 발명의 태반-유래 줄기세포는 줄기세포의 특성을 유지 한 채 50 계대 이상 배양되는 자가 증식능력을 가진다.

상기 중배엽 유래 세포는 지방세포, 골아세포, 연골세포, 근세포 및/또는 신경세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "지방세포"는 지방의 형태로 에너지를 저장하는 지방 조직을 구성하는 주된 세포이다. 이는 세포질 층으로 둘러싸인 커다란 지방 방울을 포함하는 백색지방세포와 지방 방울이 고루 흩어져있는 상당량의 세포질을 포함하는 다각형의 갈색지방세포의 두가지 형태로 존재한다. 백색지방세포는 레지스틴, 아디포넥틴 및 렙틴과 같은 아디포카인(adipokine)으로 작용하는 단백질을 분비한다.

본 발명에서 "골(아)세포"는 촘촘한 골조직에 가장 풍부한 별모양의 세포로 핵과 세포질의 얇은 고리를 포함한다. 골모세포가 스스로 분비한 기질에 갇혀 골세포를 형성한다. 골세포는 간극결합을 통해 영양분과 폐기물을 교환하는데 사용되는 소관계라 불리는 작은 관을 채우는 긴 세포질 신장을 통해 서로 연결된다. 한편, 골세포는 합성 능력이 감소되어 유사분열하지 않으며 중간엽에서 생성되고, 수산화인회석, 탄산칼슘, 및 인산칼슘이 세포 주위에 축적된다.

본 발명에서 "연골세포"는 연골에서 발견되는 유일한 세포이다. 연골세포는 주로 콜라겐과 프로테오글리칸으로 구성되는 연골기질을 생산하고 유지한다. 연골 내에서 연골세포의 구성은 연골의 형태 및 조직의 위치에 따라 달라진다.

본 발명에서 "신경세포"는 전기적 그리고 화학적 신호전달에 의해 정보를 처리하고 전달하는 전기적으로 활성화시킬 수 있는 세포이다. 화학적 신호전달은 다른 세포와의 분화된 연결인 시냅스를 통해 이루어진다. 신경세포는 망을 형성하여 서로 연결되어있다. 신경세포는 뇌, 척수 및 말초 신경절을 포함하는 신경계의 핵심요소이다.

본 발명의 태반-유래 줄기세포는 배양 조건에 따라 각각 지방, 골, 연골, 신경세포로 분화하는 능력을 가짐을 확인하였다(실시예 3 참조).

상기 본 발명의 태반-유래 줄기세포로부터 분화된 상기 신경세포는 NEFL, GFAP, NSE, βⅢ-tubulin에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타낸다.

본 발명의 세포치료제는 바람직하게는 신경 조직 형성 또는 신경계 질환 치료 용도로 사용될 수 있다.

상기 본 발명의 세포치료제는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 "약학적으로 허용되는" 이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 세포치료제는 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 세포치료제는 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 경우에 따라서는 줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서 본 발명의 세포치료제는 국소(협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구(피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구로, 가장 바람직하게는 발병부위에 직접 투여한다. 일 양태로서 줄기세포는 적합한 희석제에 약 1Х10³ 내지 5Х10⁶ 세포/ml의 농도로 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 혈장, 뇌척수액, 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 세포치료제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 세포치료제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개과 동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "치료"는 본 발명의 세포치료제의 투여로 개과 동물의 질환 예컨대, 근육, 연골, 또는 지방조직, 및 신경의 손상 또는 결핍에 의해 유도되는 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 상기 치료 방법은 상술한 세포치료제를 사용하므로, 세포치료제의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.

본 발명은 태반-유래 줄기세포를 포함하는 세포치료제에 관한 것으로, 본 발명의 태반-유래 줄기세포는 우수한 세포 증식능력, 다분화 능력과 함께 유전적 및 독성학적으로 안정성을 가지고 있으며, 손상된 신경 조직의 재생을 촉진시키는 효과가 있는 바, 반려동물의 복합적인 손상에 따른 신경 재생 치료와 그에 수반되는 치료 메커니즘에 대한 학술연구 및 추후 사람의 치료 연구 개발 등에 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 관찰된, 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 형태학적 특성(X50) 나타낸다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 유세포 분석을 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 다능성을 확인한 결과이다. (도 2a: MSC Positive, 도 2b: MSC Negative)
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 면역세포화학 염색을 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 다능성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 다능성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 지방세포(A: 분화 유도 전(X100), D: 배양 7일 후(X100)), 연골세포(B: 분화 유도 전(X100), E: 배양 7일 후(X100)), 및 골아세포(C: 분화 유도 전(X100), F: 배양 7일 후(X100))로의 분화 능력을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, 세포학적 형태 변화를 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 신경세포로의 분화 능력을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 신경세포로의 분화 능력을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, 유세포 분석을 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 신경세포로의 분화 능력을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, 면역세포화학 염색을 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 신경세포로의 분화 능력을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, 척추 손상 후 본 발명의 줄기세포를 이식한 개의 행동학적 분석을 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 신경 재생 효능 유효성을 평가한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라, 척추 손상 후 본 발명의 줄기세포를 이식한 개의 척추 MRI 분석을 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 신경 재생 효능 유효성을 평가한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라, 척추 손상 후 본 발명의 줄기세포를 이식한 개의 척추 조직 면역조직화학 염색을 통해 본 발명의 양수 유래 줄기세포의 신경 재생 효능 유효성을 평가한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 태반 유래 세포의 분리 및 배양

임신이 확인된 암컷 개의 분만 시, 모체와 분리되어 새끼를 감싸고 있는 양막낭 파열 전 18G의 50cc 멸균 주사기로 양수를 채취하였다. 채취된 양수 50mL를 시험관으로 옮긴 후, 약 4 ℃를 유지한 채로 실험실로 운반하였다. 채집된 양수를 UV 살균한 무균 작업대 안에서 100 μM 셀 스트레이너(cell strainer)로 거른 후 5% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 PBS(phosphate Buffered Saline)와 1:1로 섞어 2500rpm, 10분 동안 원심 분리하여 펠렛(pellet)을 회수하였다. 회수한 펠렛으로부터 상기 세척(5% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 PBS) 및 원심 분리(2500rpm, 10분) 과정을 2회 진행하여 단핵세포를 분리하였다.

분리된 양수 유래 단핵세포의 초기 배양을 위하여, 15% FBS(fetal bovine serum), 1% Glutamax 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(dulbecco Modified Eagle Medium) 배양 배지를 사용하였다. 이때, 세포 부착성을 높이기 위해 6-웰 배양 접시를 0.1% 젤라틴으로 코팅하여 배양하였으며, 개과(Canidae) 동물의 체온과 같은 38.5 ℃에서 5% CO₂ 환경의 인큐베이터에 넣고 배양하였다.

세포가 배양 접시 바닥에 부착된 것이 관찰된 후, 48시간 간격으로 배양 배지를 교체하였으며, 배양 배지 바닥의 80% 이상 세포가 부착되면 계대 또는 동결하여 보관하였다.

그 결과, 양수 유래 세포들은 평균 약 5 일 후 부착된 형태로 관찰할 수 있었으며, 도 1에서 확인할 수 있듯이, 세포의 형상은 섬유아세포와 유사한 입방(spindle)형으로 관찰되었으며, 이는 다른 중간엽 줄기세포에서 나타나는 형상과 유사하다.

실시예 2. 태반 유래 줄기세포의 다능성 확인

국제 줄기세포 위원회(International society for cellular therapy, ISCT)에서 제시한 개과(Canidae) 동물의 중간엽 줄기세포에서의 양성 발현 마커, 음성 발현 마커, 면역 관련 마커 및 전분화능(Pluripotency) 특이 마커에 대한 분석을 수행하였다.

1) 유세포 분석(Flow cytometry analysis)

FITC(fluorescein isothiocyanate) 또는 PE(phycoerythrin)와 결합된 다양한 조합의 항체 또는 순수한 1차 항체를 양수 유래 줄기세포에 붙인 뒤 형광이 붙어있는 2차 IgG 항체를 사용하여 유세포 분석을 통해 세포 표지 인자를 분석하였다. 2차 IgG 항체를 기준으로 상대적인 발현 양상 비교를 위해 사용된 항체는 다음과 같다: CD14, CD19, CD29, CD34, CD44, CD45, CD90, MHC class II 및 IgG-FITC. 시료 당 약 5~8x10⁵ 개의 세포가 하나의 항체를 분석하는 데 사용되었으며, Cellquest 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석(FACScan, BD Biosciences, USA)을 실시하였다.

그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, 중간엽 줄기세포의 양성 발현 마커인 CD29, CD44, CD90에는 양성의 면역학적 표현형을 나타내었으며, 중간엽 줄기세포의 음성 발현 마커인 CD14, CD19, CD34, CD45, 면역 세포 특이적 마커인 MHC class II에는 음성의 면역학적 표현형을 나타내었다. 이는, 본 발명의 양수 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포의 특성을 가지고 있음을 시사한다.

2) 면역세포화학(immunocytochemistry) 염색

FITC(fluorescein isothiocyanate) 또는 PE(phycoerythrin)와 결합된 다양한 조합의 항체 또는 순수한 1차 항체를 양수 유래 줄기세포에 붙인 뒤 형광이 붙어있는 2차 IgG 항체를 사용하여 세포 표면에서 발현하는 항원 인자를 형광 염색하여 발현 양상을 관찰하였다. 8-웰 챔버 슬라이드에 세포를 배양한 뒤, 세포 밀도가 80% 이상일 때 형광 염색을 진행하였다. 세포 핵 염색은 DAPI 염색을 통해 진행되었다. 사용된 항체는 다음과 같다: ____.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 전분화능 마커인 Nanog, Oct4, SSEA-1, Smad1와 줄기세포의 양성 발현 마커인 CD44, CD90, CD146, STRO1에서 모두 발현하였으며, 줄기세포의 음성 발현 마커인 CD14, CD19, CD34, CD45, 면역 세포 특이적 마커인 MHC class II에서는 발현하지 않았다. 이는, 본 발명의 양수 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포의 특성을 가지고 있음을 시사한다.

3) 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)

Total RNA는 제조사의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 준비하였다 (Qiagen, Cat. No. 74104). RNA 시료(Total RNA 1㎕)는 iScript 역전사효소(BIO-RAD)를 사용하여 올리고 dT 프라이머 및 랜덤(random) 프라이머로 cDNA를 합성하였다. 구체적인 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

PCR에 사용된 프라이머

유전자명	프라이머 서열		크기	Accession No.
CD14	F	GGTGCAACAAGCTGAACAGA(서열번호 1)	121	XM_843653.6
	R	GTCGTCGGGTTTTCTTGGTA(서열번호 2)
CD34	F	ATTACACGGAGAACGGTGGA(서열번호 3)	158	NM_001003341.1
	R	AGCCACCATGTGTTGTCTTG(서열번호 4)
CD45	F	AGGCCCAAGGGATGAAACTG(서열번호 5)	191	XM_038670787.1
	R	GGCATCTTTTGTGCTCGGTG(서열번호 6)
MHC class II	F	GGCTGACCATGTTGCCTACT(서열번호 7)	130	XM_038682718.1
	R	CCGCCAGACAGTTTCCTTCT(서열번호 8)
Nanog	F	GAATAACCCGAATTGGAGCAG(서열번호 9)	141	XM_038437912.1
	R	AGCGATTCCTCTTCACAGTTG(서열번호 10)
Oct-4	F	GAGTGAGAGGCAACCTGGAG(서열번호 11)	274	XM_038682857.1
	R	GTGAAGTGAGGGCTCCCATA(서열번호 12)
Sox-2	F	AGTCTCCAAGCGACGAAAAA(서열번호 13)	142	XM_038445642.1
	R	GCAAGAAGCCTCTCCTTGAA(서열번호 14)
βⅡ-MG (Microglobulin)	F	TCTACATTGGGCACTGTGTCAC(서열번호 15)	136	NC_006612
	R	TGAAGAGTTCAGGTCTGACCAAG(서열번호 16)

RT-PCR은 95 ℃에서 4분간 변성 후, 95 ℃에서 30초, 56 ℃에서 30초, 및 72 ℃에서 30초를 34 회 반응시켰다. 73 ℃에서 5분간 최종 연장하였다. Housekeeping gene(βⅡ-Microglobulin, βⅡ-MG) RT-PCR 반응은 34 회 및 60 ℃에서의 프라이머 어닐링(annealing)으로 변형하여 수행하였다. 표적 유전자의 RT-PCR 특이적 증폭은 DNA 염기서열 분석으로 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 전분화능을 나타내는 유전자(Oct4, Sox2, Nanog)가 모두 발현되고, 중간엽 줄기세포의 음성 마커인 CD14, CD34, CD45, 면역 세포 특이적 마커인 MHC class II는 모두 발현되지 않는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 태반 유래 줄기세포의 분화 능력 확인

양수 유래 중간엽 줄기세포의 분화 능력을 확인하기 위하여, StemPro Differentiation Kit(Gibco, USA)를 사용하여 각각 계통에 맞는 배지에서 지방세포, 연골세포, 골세포로 분화를 유도하였다.

1) 지방세포 분화(Adipogenic differentiation)

StemPro Adipogenesis Differentiation Kit를 이용하여 6-웰 배양 접시에 200,000 cell/well의 밀도로 분주하고, 38.5 ℃, 5 % CO₂의 인큐베이터에 넣고 배양하였다. 2일에 한 번씩 배지를 교환하였다. 오일 레드 오(Oil Red O)로 염색하여 분화 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이, 분화 유도 전에는 양수 줄기세포의 염색 음성 반응이 나타났으나(X100, 도 5의 A), 배양 약 7일 후 양막 유래 중간엽 줄기세포 모두 섬유아세포 형태에서 둥근 모양으로 세포의 형태가 변화하였으며, 지질 방울 형성으로 인한 염색을 관찰할 수 있었다(X100, 도 5의 D).

2) 연골세포 분화(Chondrogenic differentiation)

StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit를 이용하여 1,000 cells/μL의 농도로 행잉 드롭(hanging drop)하고, 세포가 구 형태로 자라도록 38.5 ℃, 5 % CO₂의 인큐베이터에 넣고 배양하였다. 3일에 한 번씩 배지를 추가 또는 교환하였다. 알시안 블루(alcian blue)로 염색하여 분화 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이, 분화 유도 전에는 양수 줄기세포의 염색 음성 반응이 나타났으나(X100, 도 5의 B), 배양 약 14 일 후 연골세포 분화로 인한 염색을 관찰할 수 있었다(X100, 도 5의 E).

3) 골아세포 분화(Osteogenic differentiation)

StemPro Osteogenesis Differentiation Kit를 이용하여 6-웰 배양 접시에 200,000 cell/well의 밀도로 분주하고, 38.5 ℃, 5 % CO₂의 인큐베이터에 넣고 배양하였다. 2일에 한 번씩 배지를 교환하였다. 알리자린 레드 에스(alizarin red S)로 염색하여 분화 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이, 분화 유도 전에는 양수 줄기세포의 염색 음성 반응이 나타났으나(X100, 도 5의 C), 배양 약 7일 후 양막 유래 중간엽 줄기세포 모두 섬유아세포 형태에서 입방형으로 세포의 형태가 변화한 것을 알 수 있었으며, 배양 약 21일 후 세포 외 기질(extracellular matrix)에 칼슘(calcium) 침전으로 인한 염색을 관찰할 수 있었다(X100, 도 5의 F).

실시예 4. 태반 유래 줄기세포의 신경세포 분화 능력 확인

신경 전구세포 분화 유도

상기 실시예 1에서 준비된 ____ 계대의 태반 유래 줄기세포를 10 % FBS, 1x N2-supplement, 10 ng/mL FGF(Fibroblast growth factors), 10 ng/mL EGF(Epidermal growth factor) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 L-DMEM(Low Glucose Dulbecco Modified Eagle Medium) 1차 분화 유도 배지를 사용하여 38.5 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2일간 배양하였다. 그 다음, 0.5 % FBS, 1x N2 supplement, 1 mM N6.20-0-dibutyryl cyclic adenosine monophosphate(db-cAMP), 200 lM butylated hydroxyanisole(BHA), 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 L-DMEM 2차 분화 유도배지에서 3일간 추가 배양하였다.

1) 세포 형태 변화

광학현미경을 통하여 분화된 신경 전구세포의 형태학적 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 6에서 확인할 수 있듯이, 분화 유도 전에는 섬유아세포 형태의 태반 줄기세포 모양이었으나(도 6의 A), 분화 유도 후 세포핵이 커지고 신경 세포에서 나타나는 입방 형태로 변화된 것을 알 수 있었다(도 6의 B).

2) 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)

상기 실시예 2-3)과 동일한 방법으로 수행하였으며, 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다.

PCR에 사용된 프라이머

유전자명	프라이머 서열		크기	Accession No.
NEFL	F	GAAGAAGCTGCCAAGGAAGA(서열번호 17)	202	NC_006607
	R	GTTGACCTGATTTCGGGAGA(서열번호 18)
GFAP	F	ACCTGGCCAGTTATCGACAG(서열번호 19)	206	NC_006591
	R	TCTTAGGGCTGCTGTGAGGT(서열번호 20)
NSE	F	GAGAACAGTGAAGCCTTGGA(서열번호 21)	298	NC_006609
	R	ACCAATCTGGTTGACCTTGA(서열번호 22)
βⅢ-tubulin	F	GCACACTGCTCATCAACAAG(서열번호 23)	227	NC_006587
	R	TCTTGCTCTCCTTCATGGAC(서열번호 24)
βⅡ-MG (Microglobulin)	F	TCTACATTGGGCACTGTGTCAC(서열번호 15)	136	NC_006612
	R	TGAAGAGTTCAGGTCTGACCAAG(서열번호 16)

그 결과, 도 7에서 확인할 수 있듯이, 분화 유도 전에는 신경세포에서 특이적으로 발현되는 유전자(NEFL, GFAP, NSE, βⅢ-tubulin)가 발현되지 않거나 적게 발현되었으나, 분화 유도 후에는 GFAP를 제외한 모든 신경세포 유전자가 발현되는 것을 알 수 있었다. 이는, 본 발명의 양수 유래 줄기세포는 신경 전구세포로 분화될 수 있음을 시사한다.

3) 유세포 분석(Flow cytometry analysis)

상기 실시예 2-1)과 동일한 방법으로 수행하였으며, 사용된 항체는 다음과 같다: Nestin, Tyrosine hydroxylase(TH), βⅢ-tubulin 및 IgG-FITC.

그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이, 분화 유도 전에는 신경세포에서 특이적으로 발현되는 유전자가 발현되지 않거나 적게 발현되었으나, 분화 유도 후에는 신경 세포 특이적 마커인 Nestin, TH, βⅢ-tubulin의 발현이 IgG 항체를 기준으로 각 32.22 %, 43.04 %, 69.7 % 증가된 것을 알 수 있었다.

4) 면역세포화학(immunocytochemistry) 염색

상기 실시예 2-2)와 동일한 방법으로 수행하였으며, 사용된 항체는 다음과 같다: ____.

그 결과, 도 9에서 확인할 수 있듯이, 분화 유도 전에는 신경세포에서 특이적으로 발현되는 유전자가 발현되지 않거나 적게 발현되었으나, 분화 유도 후에는 신경세포 유전자(Nestin, TH, βⅢ-tubulin)가 모두 발현되는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. 태반 유래 줄기세포의 신경 재생 효능 유효성 평가

1) 척추 손상(spinal cord injury) 동물 모델

1-2세령의 건강한 비글견 암컷 2두(____)에 대하여, 충남대학교 동물실험윤리위원회 설치·운영 규정에 의거하여(승인번호, ____) 충남대학교 수의과대학에서 유효성 평가를 진행하였다. 각 실험 동물은 표준규격의 사육 케이지 내에서 사육하였고 사료는 1일 2회 체중에 비례하여 급여하였으며, 음수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 척추 손상을 위하여 마취제(80 mg/kg ketamine)를 복강 내 투여하여 마취하고 외과적 수술을 통해 Lumbar 1 및 2 부분의 척추 손상을 유도하였다. 척추 손상 모델 동물은 2주동안 매일 진통제(____ mg/kg intramuscularly; Meiji Seika Kaisha, Ltd,Tokyo, Japan)를 복용하였다.

2) 줄기세포 이식

상기 실시예 1에서 준비된 5 계대의 태반 유래 줄기세포를 15 % FBS, 1 % Glutamax 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배양 배지를 사용하여 배양하였다. 배양 접시 내의 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 0.05% Typsin-EDTA를 이용하여 세포를 기저면에서 분리시킨 뒤 ____ rpm, ____분간 원심분리를 통해 얻어진 5,000,000개의 세포 펠렛을 척추 손상된 부위에 이식하였으며, 척추 손상 후 아무것도 처리하지 않은 그룹을 음성 대조군(Negative control)으로 설정하였다.

3) 결과 - 신경 재생 확인

행동 변화

척추 손상 후 본 발명의 태반 유래 줄기세포 이식에 따른 운동 능력 재생을 확인하기 위하여, 이식 후 3개월 동안 뒷다리의 보행 능력 시험(olby scoring test)을 통한 행동학적 분석을 실시하였다. 보행 능력 시험은 뒷다리를 통한 보행을 0~15 단계의 측정을 통하여 점수화 한 것이다.

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있듯이, 대조군과 비교하여 척추 손상 및 세포 이식 4주 후부터 태반 줄기세포 이식 개체에서 보행 능력이 향상되는 것을 알 수 있었다.

자기공명영상(Magnetic resonance imaging, MRI)

척추 손상 후 본 발명의 태반 유래 줄기세포 이식에 따른 척추 재생의 구조적 분석을 위하여, 줄기세포 이식 후 1주, 16주에 0.25 Tesla MRI scanner(vet-MR Grande, Esaote, Italy)를 통하여 MRI를 측정하였다. MRI는 T1-weighted imaging(repetition time(TR)/echo time(TE)=4400.0ms/96.0ms)과 T2-weighted imaging(TR/TE=4400.0/96.0) 조건에서 4~5mm 두께의 척추 횡단면을 촬영하였으며, 이미지 분석 프로그램(ImageJ, version 1.38; National Institutes of Health, USA)을 통해 분석하였다.

그 결과, 도 11에서 확인할 수 있듯이, 대조군과 비교하여 척추 손상 및 세포 이식 16주 후에 태반 줄기세포 이식 개체에서 척수의 미엘린 수초가 재생되는 것을 알 수 있었다.

조직 염색

척추 손상 후 본 발명의 태반 유래 줄기세포 이식에 따른 척추 재생 과정 관찰하기 위하여, 줄기세포 이식 후 6개월에 손상된 척추 조직을 채취하여 10% 포르말린(formalin) 용액으로 고정 후 파라핀(paraffin) 블록을 제작하였다. 제작된 파라핀 블록에서 4 μm 두께의 피부 조직 절편 슬라이드를 H&E(Hematoxylin and eosin)과 신경 특이 마커 Nestin, βⅢ-tubulin 염색을 통해 슬라이드 스캐너를 통하여 척추 조직의 구조 및 신경 재생을 평가하였다.

그 결과, 도 12에서 확인할 수 있듯이, 대조군과 비교하여 태반 줄기세포 이식 개체에서 척추 조직이 재생되었으며, 신경 특이적 마커인 βⅢ-tubulin, Nestin 발현이 증가된 것을 알 수 있었다.

[서열목록]

<110> mkbiotech.co.ltd

The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC)

<120> Perinatal-derived stem cells and Cell therapy product for

treating neural regeneration comprising thereof

<130> MK1215

<160> 24

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD14-F

<400> 1

ggtgcaacaa gctgaacaga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD14-R

<400> 2

gtcgtcgggt tttcttggta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD34-F

<400> 3

attacacgga gaacggtgga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD34-R

<400> 4

agccaccatg tgttgtcttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD45-F

<400> 5

aggcccaagg gatgaaactg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD45-R

<400> 6

ggcatctttt gtgctcggtg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MHC class II-F

<400> 7

ggctgaccat gttgcctact 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MHC class II-R

<400> 8

ccgccagaca gtttccttct 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanog-F

<400> 9

gaataacccg aattggagca g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanog-R

<400> 10

agcgattcct cttcacagtt g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oct-4-F

<400> 11

gagtgagagg caacctggag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oct-4-R

<400> 12

gtgaagtgag ggctcccata 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sox-2-F

<400> 13

agtctccaag cgacgaaaaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sox-2-R

<400> 14

gcaagaagcc tctccttgaa 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> βⅡ-MG-F

<400> 15

tctacattgg gcactgtgtc ac 22

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> βⅡ-MG-R

<400> 16

tgaagagttc aggtctgacc aag 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NEFL-F

<400> 17

gaagaagctg ccaaggaaga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NEFL-R

<400> 18

gttgacctga tttcgggaga 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFAP-F

<400> 19

acctggccag ttatcgacag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFAP-R

<400> 20

tcttagggct gctgtgaggt 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NSE-F

<400> 21

gagaacagtg aagccttgga 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NSE-R

<400> 22

accaatctgg ttgaccttga 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> βⅢ-tubulin-F

<400> 23

gcacactgct catcaacaag 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> βⅢ-tubulin-R

<400> 24

tcttgctctc cttcatggac 20

<110> mkbiotech.co.ltd The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Perinatal-derived stem cells and Cell therapy product for treating neural regeneration comprising thereof <130> MK1215 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD14-F <400> 1 ggtgcaacaa gctgaacaga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD14-R <400> 2 gtcgtcgggt tttcttggta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD34-F <400> 3 attacacgga gaacggtgga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD34-R <400> 4 agccaccatg tgttgtcttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45-F <400> 5 aggcccaagg gatgaaactg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45-R <400> 6 ggcatctttt gtgctcggtg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC class II-F <400> 7 ggctgaccat gttgcctact 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC class II-R <400> 8 ccgccagaca gtttccttct 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog-F <400> 9 gaataacccg aattggagca g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog-R <400> 10 agcgattcct cttcacagtt g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4-F <400> 11 gagtgagagg caacctggag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4-R <400> 12 gtgaagtgag ggctcccata 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox-2-F <400> 13 agtctccaag cgacgaaaaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox-2-R <400> 14 gcaagaagcc tctccttgaa 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> βⅡ-MG-F <400> 15 tctacattgg gcactgtgtc ac 22 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> βⅡ-MG-R <400> 16 tgaagagttc aggtctgacc aag 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEFL-F <400> 17 gaagaagctg ccaaggaaga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEFL-R <400> 18 gttgacctga tttcgggaga 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP-F <400> 19 acctggccag ttatcgacag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP-R <400> 20 tcttagggct gctgtgaggt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSE-F <400> 21 gagaacagtg aagccttgga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSE-R <400> 22 accaatctgg ttgaccttga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> βⅢ-tubulin-F <400> 23 gcacactgct catcaacaag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> βⅢ-tubulin-R <400> 24 tcttgctctc cttcatggac 20

Claims (8)

1. 태반-유래 줄기세포(Placenta-derived stem cells)를 포함하는 세포치료제.
2. 제 1항에 있어서, 상기 태반-유래 줄기세포는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의해 얻어진 것인, 세포치료제:
   개과 동물 모체의 출산 후 분리되는 양막낭으로부터 양수를 얻는 단계;
   원심분리하여 펠렛(pellet)을 회수하는 단계;
   세척 및 원심분리를 반복하여 단핵세포를 분리하는 단계; 및
   소태아혈청 및 항생제가 첨가된 배지에서 배양하는 단계.
3. 제 2항에 있어서, 상기 개과 동물은 개, 이리(회색 늑대), 카니스 루푸스(붉은 늑대), 카니스 라트란스(코요테), 자칼, 여우, 부쉬독, 너구리, 아프리카 들개, 갈기 늑대, 오스트리아 딩고, 및 승냥이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 세포치료제.
4. 제 1항에 있어서, 상기 태반-유래 줄기세포는 다음과 같은 특성을 가지는 것인, 세포치료제:
   a) CD29, CD44, CD90, CD146, STRO1, Nanog, Oct4, Sox2, SSEA-1, Smad1에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD14, CD19, CD34, CD45, MHC class II에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄;
   b) 입방 형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄;
   c) 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및
   d) 줄기세포의 특성을 유지 한 채 50 계대 이상 배양되는 자가 증식능력을 가짐.
5. 제 4항에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근세포, 또는 신경세포인, 세포치료제.
6. 제 5항에 있어서, 상기 신경세포는 NEFL, GFAP, NSE, βⅢ-tubulin에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것인, 세포치료제.
7. 제 1항에 있어서, 상기 세포치료제는 신경 조직 형성용 또는 신경계 질환 치료용인, 세포치료제.
8. 제 1항의 세포치료제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개과 동물을 치료하는 방법.

Images