JP6539385B2 - ニューロンの軸索退縮を予防するための幹細胞の使用 - Google Patents
ニューロンの軸索退縮を予防するための幹細胞の使用 Download PDFInfo
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Description
脊髄損傷の後、CNS再生の主な障害となるグリア瘢痕が形成される(SilverおよびMiller、2004年)。瘢痕組織を形成する領域では、再生軸索の末端が伸長しなくなり、腫脹し歪んで、何年間も軸索路にとどまることができる様々な異形の「成長円錐」となる(Ramon y Cajal、1928年;LiおよびRaisman、1995年;HouleおよびJin、2001年;Kwonら、2002年)。CNS内の損傷した軸索は、最初の損傷後、数時間から数週間の間に軸索切断部位から退縮する。軸索退縮の性質、その原因、程度およびタイミングに関して異なる報告があり、さらには軸索退縮が受動的プロセスであるか、能動的プロセスであるかについても考察されている(FayazおよびTator、2000年)。
in vitroグリア瘢痕モデル
瘢痕組織を形成する領域では、コンドロイチン/ケラタン硫酸プロテオグリカン(PG)として知られる細胞外マトリックス(ECM)分子群を含めた、数種類の成長阻害分子が上方制御される(FitchおよびSilver、1997年;Morgensternら、2002年;Jonesら、2003年;Tangら、2003年)。PGは、病変の周辺の濃度が最も低く、その中心の濃度が最も高い大まかな勾配で組織されている(Daviesら、1999年;Fitchら、1999年)。この阻害性ECM成分は、反応性グリア細胞がラミニンを介して軸索再生を支持する潜在能力を遮断する(McKeonら、1991年)。微量移植(microtransplantation)実験において、成体の感覚ニューロンは、病変から離れて位置する強い再生能を有することが示される。再生線維は、損傷部位の近くに達すると、病変周辺をはい進むことができるが、PG濃度が最も高い領域に深く浸入すると最終的に伸長しなくなり、ジストロフィーになる(Daviesら、1999年;GrimpeおよびSilver、2004年)。
脊髄病変の環境は極めて複雑である。高度に硫酸化されたプロテオグリカン、eph、slit、およびミエリン膜断片(SilverおよびMiller、2004年;YiuおよびHe、2006年;BuschおよびSilver、2007年)などのグリア瘢痕の成分ならびに神経炎症のプロセス(DonnellyおよびPopovich、2007年)はすべて再生不全に寄与する。炎症細胞は病変内に蓄積する(Fitchら、1999年)。星状細胞は、病変の中心から離れ、肥大し、切断された線維においてジストロフィー性の終末球の形成を次には引き起こす阻害性コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の産生を上方制御する(Tomら、2004年)。病変内にあるオリゴデンドロサイトは死滅して脱髄をもたらし、それにより高濃度の阻害性ミエリン分解産物が生じる(YiuおよびHe、2006年;XieおよびZheng、2008年)。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
軸索退縮に関連するニューロン損傷を治療するための方法であって、幹細胞または前記幹細胞から分泌される因子を、軸索退縮を低減し、前記軸索退縮に関連する神経損傷を低減するために、前記損傷に十分に近接して十分な時間、十分な量で投与することを含む方法。
(項目2)
軸索退縮をもたらすであろうジストロフィー軸索へのED−1+細胞の接着を低減するための方法であって、幹細胞または前記幹細胞から分泌される因子を、前記接着を低減するために、前記ジストロフィー軸索および/または前記ED−1+細胞に十分に近接して十分な時間、十分な量で投与することを含む方法。
(項目3)
幹細胞または前記幹細胞から分泌される因子を、軸索退縮を低減するために、有効な量で十分な時間投与することにより、被験体における軸索退縮を低減するための方法。
(項目4)
前記ED−1+細胞がマクロファージおよび/またはミクログリアである、項目1から3のいずれかに記載の方法。
(項目5)
幹細胞または前記幹細胞から分泌される因子を、軸索再生を促進するために、有効な量で十分な時間投与することにより、被験体における軸索再生を促進するための方法。
(項目6)
前記分泌因子が、前記幹細胞を細胞培養培地中で培養することによって馴化した前記細胞培養培地中に存在する、項目1から5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記幹細胞が、胚性幹細胞、ならびに複数の胚性胚葉の細胞型に分化し、かつ/またはoct4、テロメラーゼ、rex−1、rox−1、sox−2およびSSEA4の1つまたは複数を発現する能力を有する非胚性幹細胞からなる群から選択される、項目1から6のいずれかに記載の方法。
(項目8)
前記非胚性幹細胞が組織特異的幹細胞である、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記組織特異的幹細胞が造血幹細胞、神経幹細胞または間葉系幹細胞である、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記ニューロン損傷が、脊髄損傷、脳損傷、脳卒中、多発性硬化症、てんかんまたは神経変性疾患の結果である、項目1から9のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症およびクロイツフェルト・ヤコブ病である、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記分泌因子が投与される、項目1から3または5のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記分泌因子が、前記幹細胞を培地中で培養することによって馴化した前記培地中に存在する、項目12に記載の方法。
「1つの(a)」または「1つの(an)」は本明細書において、1つまたは複数;少なくとも1つを意味する。複数形は、本明細書において使用される場合、一般に単数を含む。
本発明は、好ましくは、ヒト、非ヒト霊長類、家畜(domestic animals)、家畜(livestock)、他の非ヒト哺乳類などの脊椎動物種の幹細胞を用いて実施することができる。これらの幹細胞としては、それだけには限定されないが、以下に記載する細胞が挙げられる。
胚性幹細胞(ESC)は、無制限な自己再生および複能性分化能を有するので、最も詳細に研究されている幹細胞となっている。これらの細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から得る。または移植後胚の始原生殖細胞から得ることもできる(胚性生殖細胞すなわちEG細胞)。ESおよびEG細胞は、最初にマウスから、それより後になって多くの異なった動物から得られ、さらに最近になって非ヒト霊長類およびヒトからも得られた。マウス胚盤胞または他の動物の胚盤胞に導入された際に、ESCは、動物のすべての組織に寄与できる。SSEA1(マウス)およびSSEA4(ヒト)に対する抗体で陽性染色することによって、ESおよびEG細胞を同定することができる。例えば、米国特許第5,453,357号、同第5,656,479号、同第5,670,372号、同第5,843,780号、同第5,874,301号、同第5,914,268号、同第6,110,739号、同第6,190,910号、同第6,200,806号、同第6,432,711号、同第6,436,701号、同第6,500,668号、同第6,703,279号、同第6,875,607号、同第7,029,913号、同第7,112,437号、同第7,145,057号、同第7,153,684号および同第7,294,508号を参照のこと。これらのそれぞれは、胚性幹細胞およびそれらを作製し増殖させる方法の教示のために、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、ESCおよびそれらを単離し増殖させる方法は当技術分野で周知である。
幹細胞はほとんどの組織で同定されている。おそらく最も詳細に特徴付けられているのは、造血幹細胞(HSC)である。HSCは、細胞表面マーカーおよび機能的特性を用いて精製できる中胚葉由来の細胞である。HSCは、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児肝、および卵黄嚢から単離されている。HSCは、造血作用を開始し、複数の造血系列を生成する。致死線量照射動物に移植された場合、HSCは、赤血球系、好中球マクロファージ、巨核球、およびリンパ球系の造血細胞プールの再増殖を可能にする。いくつかの自己再生細胞分裂を行うようにHSCを誘導することもできる。例えば、米国特許第5,635,387号、同第5,460,964号、同第5,677,136号、同第5,750,397号、同第5,681,599号および同第5,716,827号を参照のこと。米国特許第5,192,553号は、ヒト新生児または胎児の造血幹細胞または前駆細胞を単離する方法を報告している。米国特許第5,716,827号は、Thy−1+前駆体であるヒト造血細胞と、in vitroでそれらを再生させるのに適した増殖培地とを報告している。米国特許第5,635,387号は、ヒト造血細胞およびそれらの前駆体を培養する方法およびデバイスを報告している。米国特許第6,015,554号は、ヒトリンパ系細胞および樹状細胞を再構成する方法を記載している。したがって、HSCおよびそれらを単離し増殖させる方法は当技術分野で周知である。
核移植、細胞融合、培養誘発再プログラム化などのいくつかの異なった戦略が、分化細胞から胚状態への転換を誘導するのに用いられている。核移植は、除核された卵細胞に体細胞核を注入するものであり、代理母内への移植によって、クローンを生み出すことができ(「生殖的クローニング」)、または、培養における外植によって、遺伝学的に一致した胚性幹(ES)細胞を生み出すことができる(「体細胞核移植」、SCNT)。ES細胞と体細胞の細胞融合は、多能性ES細胞のすべての特徴を示すハイブリッドの生成をもたらす。培養における体細胞の外植は、多能性または複能性であり得る不死化細胞株を選択する。現在のところ、精原幹細胞は、出生後動物から得ることができる多能性細胞の唯一の供給源である。特定の因子を用いた体細胞の形質導入によって、多能性状態への再プログラム化を開始させることができる。これらの実験的なアプローチは広範に総説されている(HochedlingerおよびJaenisch、Nature、441巻、1061〜1067頁(2006年)、およびYamanaka, S.、Cell Stem Cell、1巻、39〜49頁(2007年))。
体細胞核移植(SCNT)とも呼ばれる核移植(NT)は、ヒツジのドリーなどのクローン動物を生成するための、ドナー体細胞から、除核された卵母細胞への核の導入を指す(Wilmutら、Nature、385巻、810〜813頁(1997年)。NTによる生きた動物の生成は、最終分化細胞のものを含めた体細胞の後成的状態が、安定ではあるが不可逆的に固定されておらず、新規の生物の発生を指示できる胚状態に再プログラムできることを実証した。胚発生および疾患に関与する基本的な後成的作用機序を解明するための興味深い実験的アプローチの提供に加えて、核クローニング技術は、患者特異的な移植薬のための潜在的関心対象でもある。
体細胞と胚性幹細胞との融合
未分化状態への体細胞性核の後成的再プログラム化は、体細胞との胚性細胞の融合によって産生されたマウスハイブリッドで実証された。様々な体細胞と胚性癌腫細胞(Solter, D.、Nat Rev Genet、7巻、319〜327頁(2006年))、胚性生殖細胞(EG)またはES細胞(ZwakaおよびThomson、Development、132巻、227〜233頁(2005年))との間のハイブリッドは、親の胚性細胞と多くの特徴を共有しており、多能性表現型がそのような融合産物で優性であることを示している。マウス(Tadaら、Curr Biol、11巻、1553〜1558頁(2001年))と同様に、ヒトES細胞は、融合後に体細胞核を再プログラムする能力を有する(Cowanら、Science、309巻、1369〜1373頁(2005年);Yuら、Science、318巻、1917〜1920頁(2006年))。Oct4などのサイレント多能性マーカーの活性化または不活性な体細胞X染色体の再活性は、ハイブリッド細胞内の体細胞ゲノムの再プログラム化の分子的証拠を提供した。融合の2日後に最初に観察されるDNA複製が多能性マーカーの活性化に必須であること(DoおよびScholer、Stem Cells、22巻、941〜949頁(2004年))、および神経幹細胞に融合する際に、ES細胞内のNanogの強制的過剰発現が多能性を促進すること(Silvaら、Nature、441巻、997〜1001頁(2006年))が示唆されている。
培養誘導再プログラム化
多能性細胞は、割球および胚盤胞の内部細胞塊(ICM)などの胚供給源(ES細胞)、エピブラスト(EpiSC細胞)、始原生殖細胞(EG細胞)および出生後精原幹細胞(「maGSCsm」「ES様」細胞)から得られている。以下の多能性細胞は、それらのドナー細胞/組織と共に以下の通りである:マウス卵母細胞から単為生殖(parthogenetic)ES細胞が得られている(Narasimhaら、Curr Biol、7巻、881〜884頁(1997年));割球から胚性幹細胞が得られている(Wakayamaら、Stem Cells、25巻、986〜993頁(2007年));内部細胞塊細胞(供給源は該当しない)(Egganら、Nature、428巻、44〜49頁(2004年));始原生殖細胞から胚性生殖細胞および胎生期癌細胞が得られている(Matsuiら、Cell、70巻、841〜847頁(1992年));精原幹細胞からGMCS、maSSCおよびMASCが得られている(Guanら、Nature、440巻、1199〜1203頁(2006年);Kanatsu−Shinoharaら、Cell、119巻、1001〜1012頁(2004年);およびSeandelら、Nature、449巻、346〜350頁(2007年));エピブラストからEpiSC細胞が得られている(Bronsら、Nature、448巻、191〜195頁(2007年);Tesarら、Nature、448巻、196〜199頁(2007年));ヒト卵母細胞から単為生殖ES細胞が得られている(Cibelliら、Science、295L819頁(2002年);Revazovaら、Cloning Stem Cells、9巻、432〜449頁(2007年));ヒト胚盤胞からヒトES細胞が得られている(Thomsonら、Science、282巻、1145〜1147頁(1998年));骨髄からMAPCが得られている(Jiangら、Nature、418巻、41〜49頁(2002年);PhinneyおよびProckop, Stem Cells、25巻、2896〜2902頁(2007年));臍帯血細胞(臍帯血から得られる)(van de Venら、Exp Hematol、35巻、1753〜1765頁(2007年));神経細胞から得られる神経球由来細胞(Clarkeら、Science、288巻、1660〜1663頁(2000年))。PGCまたは精原幹細胞などの生殖細胞系列から得られるドナー細胞は、in vivoで単能性であることが公知であるが、長期のin vitro培養後に多能性のES様細胞(Kanatsu−Shinoharaら、Science、119巻、1001〜1012頁(2004年)またはmaGSC(Guanら、Nature、440巻、1199〜1203頁(2006年)が単離できる。これらの多分化能細胞型の大部分はin vitro分化および奇形腫形成が可能であったが、ES、EG、EC、および精原幹細胞由来のmaGCSまたはES様細胞のみが、出生後キメラを形成して生殖系列に寄与することができたので、より厳格な判定規準で多能性であった。最近、成体マウスの精巣精原幹細胞から多能性成体精原幹細胞(MASC)が得られ、これらの細胞は、ES細胞の発現プロファイル(Seandelら、Nature、449巻、346〜350頁(2007年))とは異なるが、移植後マウス胚のエピブラストから得られたEpiSC細胞に類似した発現プロファイルを有していた(Bronsら、Nature、448巻、191〜195頁(2007年);Tesarら、Nature、448巻、196〜199頁(2007年))。
特定の転写因子による再プログラム化
TakahashiおよびYamanakaは、体細胞をES状態に戻す再プログラム化を報告している(TakahashiおよびYamanaka, Cell、126巻、663〜676頁(2006年))。彼らは、4つの転写因子Oct4、Sox2、c−mycおよびKlf4のウイルス媒介形質導入と、それに続くOct4標的遺伝子Fbx15の活性化との後に、マウス胎児線維芽細胞(MEF)および成体線維芽細胞を多能性のES様細胞に再プログラムすることに成功した(図2A)。活性化されたFbx15を有した細胞が新しく作り出されたiPS(人工多能性幹)細胞であり、生きているキメラを生成することはできなかったが、奇形腫を形成するそれらの能力によって多能性であることが示された。この多能性状態は、導入されたOct4およびSox2遺伝子の継続的なウイルス性発現に依存していたが、内因性のOct4およびNanog遺伝子は、発現されなかったか、またはES細胞より低レベルで発現されており、それらのそれぞれのプロモーターは、大幅にメチル化されていることが見出された。これは、Fbx15−iPS細胞はES細胞には相当しなかったが、再プログラム化の不完全な状態を表したものであり得るという結論と一致している。Oct4およびSox2が多能性に必須であることは遺伝的実験によって確立されたが(ChambersおよびSmith, Oncogene、23巻、7150〜7160頁(2004年);Ivanonaら、Nature、442巻、5330538頁(2006年);Masuiら、Nat Cell Biol、9巻、625〜635頁(2007年))、再プログラム化における2つの発癌遺伝子c−mycおよびKlf4の役割はそれほど明確でない。低効率ではあるが、c−myc形質導入の非存在下でマウスおよびヒト両方のiPS細胞が得られたので、これらの発癌遺伝子のいくつかは、実際に、再プログラム化に不要であり得る(Nakagawaら、Nat Biotechnol、26巻、191〜106頁(2008年);Werningら、Nature、448巻、318〜324頁(2008年);Yuら、Science、318巻、1917〜1920頁(2007年))。
MAPCは、「複能性成体前駆細胞」(非ES、非EG、非生殖)を表す頭字語である。MAPCは、3種の原始胚葉(外胚葉、中胚葉および内胚葉)すべてなど、少なくとも2つの細胞型に分化する能力を有する。ES細胞において見出された遺伝子はMAPCでも見出された(例えば、テロメラーゼ、Oct3/4、rex−1、rox−1、sox−2)。Oct3/4(ヒトではOct3A)はES細胞および生殖細胞に特異的なようである。MAPCは、MSCよりも原始的な前駆体細胞集団を表し、上皮、内皮、神経、筋、造血、骨形成、肝、軟骨形成および脂肪系列を包含する分化能を示す(Verfaillie, C.M., Trends Cell Biol、12巻、502〜8頁(2002年)、Jahagirdar, B.N.ら、Exp Hematol、29巻、543〜56頁(2001年);Reyes, M.およびC.M. Verfaillie、Ann N Y Acad Sci、938巻、231〜233頁(2001年);Jiang, Yら、Exp Hematol、30896〜904頁(2002年);およびJiang, Y.ら、Nature、418巻、41〜9頁(2002年))。
MAPCの単離方法は当技術分野で公知である。例えば米国特許第7,015,037号および米国特許出願第10/467,963号を参照のこと。これらの方法は、MAPCの特徴付け(表現型)と共に、参照により本明細書に組み込まれる。MAPCは、限定されるものではないが、骨髄、胎盤、臍帯および臍帯血、筋、脳、肝臓、脊髄、血液または皮膚を含めた複数の供給源から単離できる。したがって、骨髄穿刺液、脳または肝生検、および他の臓器を取得し、細胞を、これらの細胞で発現される(または発現されない)遺伝子に依拠して、当業者に利用可能なポジティブまたはネガティブ選択技法を用いて単離することが可能である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、上記で参照した出願に開示されているものなどの機能的または形態学的アッセイによって)。
米国特許第7,015,037号に記載のヒト骨髄由来のMAPC
MAPCは、共通白血球抗原CD45または赤芽球特異グリコホリンA(Gly−A)を発現しない。細胞の混成集団をFicoll Hypaque分離にかけた。次いで、抗CD45および抗Gly−A抗体を用いて細胞をネガティブ選択にかけ、CD45+かつGly−A+細胞の集団を枯渇させ、次いで、残っている約0.1%の骨髄単核細胞を回収した。細胞は、フィブロネクチンコーティングされたウェルにプレーティングし、CD45+かつGly−A+の細胞を下記の通り2〜4週間培養することもできる。接着骨髄細胞の培養では、多くの接着間質細胞が細胞倍加約30で複製老化を起こし、より均質な細胞集団が増殖を続けて、長いテロメアを維持する。
本明細書に記載の通りに単離されたMAPCは、米国特許第7,015,037号および本明細書で開示の方法を用いて培養できる。これらの方法に関して、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
追加実験では、MAPCが培養される密度は、約200細胞/cm2から約1500細胞/cm2まで、約2000細胞/cm2までを含めた、約100細胞/cm2または約150細胞/cm2から約10,000細胞/cm2まで変動し得る。密度は、種相互で異なり得る。さらに、最適密度は、細胞の培養条件および供給源に応じて異なり得る。培養条件と細胞との所与のセットについて最適な密度を決定することは当業者の技能の範囲内にある。
一般に、本発明に有用な細胞は、当技術分野で利用可能であり、かつ周知の培養培地中で維持され、増殖させることができる。そのような培地としては、それだけには限定されないが、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(登録商標)(DMEM)、DMEM F12 medium(登録商標)、Eagle’s Minimum Essential Medium(登録商標)、F−12K medium(登録商標)、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(登録商標)およびRPMI−1640 medium(登録商標)が挙げられる。多くの培地は、ピルビン酸ナトリウム含有または非含有の低グルコース処方で利用可能である。
ある実施形態では、精製された細胞集団は、送達に適合させたおよび適当な、すなわち、生理的に適合性の組成物内に存在する。したがって、幹細胞集団の組成物は、しばしば、1つまたは複数の緩衝液(例えば、中性に緩衝された生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、静菌剤、EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)、製剤を受容者の血液と等張に、低張にまたはわずかに高張にする溶質、懸濁化剤、増粘剤および/または防腐剤をさらに含むはずである。
組成物は、投薬量でおよび医学および獣医学分野の当業者に周知の技術によって、年齢、性別、体重、および特定の患者の状態、および投与される製剤(例えば、液体に対して固体)などの因子を考慮に入れて、投与することができる。ヒトまたは別の哺乳動物のための用量は、過度の実験を行うことなく、この開示、本明細書において引用されている文献、および当技術分野における知識から、当業者が決定することができる。
「グリア瘢痕モデル」アグリカン−ラミニン対立スポット勾配(Tomら、2004年;Steinmetzら、2005年)。グリア瘢痕モデルを教示するこれらの参考文献は、参照により組み込まれる。このモデルは、in vitroでの接着/退縮の低減における細胞、タンパク質、培地などの有効性についてのアッセイを実現する。
軸索退縮およびマクロファージ
要約
in vivoにおいて、後柱圧壊脊髄損傷後の切断された軸索の末端のジストロフィー退縮クラブとED−1+細胞との間に密接な相関が認められた(図3)。グリア瘢痕のin vitroモデル(Tomら、2004年;Steinmetzら、2005年)を適用して、軸索とED−1+細胞との間の相互作用を実時間で検討した。ジストロフィー成長円錐とED−1+マクロファージとの間の直接的な細胞間接触が長距離の軸索退縮を誘発した(図4、5)。in vivoでのマクロファージ枯渇のためにクロドロネートリポソームを用いたこと(Popovichら、1999年)の結果は、対照と比較してクロドロネート処理動物における軸索退縮の有意な減少であった。これらのデータは、ED−1+細胞が物理的細胞間相互作用により損傷脊髄軸索の退縮に直接関与していることを示している。
1.上行後柱感覚軸索が脊髄損傷後に大幅に退縮する
本発明者らは、活性化マクロファージの浸潤が軸索の退縮に直接的な役割を果たす可能性があると考えた。亜急性および慢性脊髄病変内で活性化マクロファージと再生軸索の末端との間に密接な関連性が認められ、これらの2つの細胞型間の直接的な物理的相互作用の可能性が見越された。後柱圧壊損傷後の感覚軸索退縮の程度を特徴付け、病変へのマクロファージの浸潤と相関させた。成体雌Sprague−Dawleyラットの後柱をC8のレベルで圧壊し、損傷ニューロンの副次集団を坐骨神経のデキストラン−テキサスレッド標識により追跡した。病変後2、4、7、14および28日目に脊髄組織を採取し、標識線維の末端と病変の中心との間の距離を測定した。病変後2日目までに、軸索は既に平均距離343±46.92μm(平均値±SD)退縮していたが、この早期の退縮は、ニューロン自体の内部の内因性メカニズムに起因していた可能性が最も高い(Kerschensteinerら、2005年)。損傷後2日目に病変は、常在性ミクログリア細胞であった可能性が最も大きい、反応性星状細胞(GFAP+)およびいくつかのED−1+細胞から主として構成されていたことに留意することは重要である。病変後2日目から7日目までに病変内のED−1+細胞の数の劇的な増加があり、その大多数が浸潤性マクロファージであった可能性が最も大きい(Popovichら、1997年;DonnellyおよびPopovich、2007年)。後柱内の上行感覚線維の第2段階の縮退は、最初の週にわたって最も速やかに起こり、その後、次の数週間にわたり徐々に起こった。病変後28日目までに、軸索は病変中心から平均距離774±70.26μmの位置に退縮した。これらのデータから、上行感覚軸索の退縮の時期が病変内のED−1+細胞の浸潤および蓄積と時空的に一致していることがわかる。
in vivoでの第2段階の軸索縮退の大部分は、マクロファージの浸潤と時間的に一致する病変後2日目から7日目までに上行後柱感覚軸索で起こる。in vivoでの軸索縮退へのマクロファージの関与をさらに実証するために、循環単球/マクロファージを枯渇させるために動物をクロドロネートリポソームで処理した(van Rooijenら、1997年;Popovichら、1999年)。循環単球/マクロファージを枯渇させるために動物にクロドロネートリポソームの注射を損傷の1日前に開始して1日おきに行った。次いで、病変後2日目、4日目および7日目に動物を軸索縮退について評価した(図3)。クロドロネートリポソームの注射を施した動物は、病変後4日目および7日目に対照リポソームの投与を施した動物(それぞれ586±42.89μmおよび806±62.71μm)と比較して病変後4日目および7日目に退縮の有意な減少を示した(それぞれ402±81.85μmおよび439±46.33μm)。退縮の減少は、空リポソーム対照と比較してクロドロネート投与動物の病変のED−1+細胞数の有意な減少と相関していた。クロドロネートリポソームの処理は、マクロファージの枯渇が空洞化の減少につながるという以前の所見(Popovichら、1999年)と関連性がある、病変コアにおけるGFAP+星状細突起の増加ももたらした。重要なことに、病変後2日目にクロドロネート処理および対照リポソーム処理動物で示された退縮の量の差はなかった。この時点ではマクロファージの浸潤はまだ起こっておらず、このことは、軸索縮退の最初の段階はマクロファージ非依存性であり、内因性ニューロンメカニズムまたは、場合によっては活性化常在性ミクログリア細胞との相互作用におそらく起因することを示唆する。循環マクロファージ/単球のクロドロネート媒介枯渇によって、通常病変後4日目および7日目に認められた軸索退縮が妨げられ、この第2段階の退縮が浸潤性マクロファージによって引き起こされたことがわかった。クロドロネート投与動物における有意な再生(すなわち、病変の中心を超える軸索の伸長)の証拠はなかった。
in vivoでのED−1+細胞と損傷した軸索とに密接な関連性があるという所見は、これらの細胞型間の相互作用が軸索の退縮に役割を果たしている可能性があることを示唆するものである。グリア瘢痕のin vitroモデルにおける成体感覚ニューロン軸索とマクロファージとの相互作用を試験した。30分間のベースライン観察期間の後、NR8383マクロファージを培養物に添加し、このマクロファージとジストロフィー軸索との相互作用をモニターした。ジストロフィー軸索とマクロファージとの間の直接的な細胞間接触を頻繁に観察した。これらの接触は、長時間にわたるものであり、マクロファージの移動と一緒になったとき、軸索の効果的な曲げおよび基質からの持ち上げをもたらした軸索の劇的な操作につながった。2つの細胞を結びつける長期にわたり這う過程が、マクロファージが軸索から離れた後に残ることが多かったので、2つの細胞型の間に強い長時間持続する接着が起こり得たことは明らかであった。しかし、退縮後にマクロファージ接触を失ったいくつかの軸索が、それらが再びジストロフィーになるまで伸長することができたので、マクロファージ誘発性退縮は、軸索の再成長を永久的に妨げなかった。これらの2つの細胞型の間の直接的な細胞間接触は、最終的には常に軸索の大幅な退縮をもたらした。したがって、マクロファージ接触は、グリア瘢痕のin vitroモデルにおいてジストロフィー軸索の退縮を誘発した。
マクロファージが、ジストロフィー軸索に非常に近くまで移動するが、接触しないことが認められた多くの例が存在し、これらの例では軸索退縮が認められなかった。軸索とマクロファージとの間の物理的相互作用が軸索の退縮を誘発するのに必要であるかどうか、またはマクロファージ由来因子が十分であるかを判断するために、マクロファージをDRG培養物に添加する前にマクロファージをトリプシンで処理して、細胞外タンパク質を除去した。トリプシンによるマクロファージの前処理により、広範なマクロファージの移動性と軸索との複数回の衝突が可能になった。しかし、処理は、マクロファージが軸索に物理的につなぎ留められることを完全に妨げ、長時間持続する直接的な細胞間接触がない場合には、その後の退縮は認められなかった。しかし、マクロファージが退縮を誘発する因子(複数可)を分泌していた可能性があった。この仮説を検定するために、マクロファージ馴化培地をin vitroでジストロフィー軸索に加えた。マクロファージ馴化培地は、退縮を誘発しなかった。したがって、軸索の近くにマクロファージまたは分泌因子が単に存在することでは、ジストロフィー軸索との物理的な相互作用がない場合には、軸索の退縮を誘発することができなかった。
基質が軸索の退縮に役割を果たすかどうかを判断するために、ジストロフィー成長円錐を生じさせない均一な成長促進ラミニン基質上で成体感覚ニューロンを培養した。ラミニン上の成長円錐は、多数の糸状仮足および層状仮足により扁平であり、全体的な軸索の退縮が一定の速度で起こった。マクロファージをこれらの培養物に添加した場合、軸索との直接的な細胞間接触が認められた。しかし、これらの接触は、一過性であり、広範でないので、速やかに絶たれ、軸索の退縮をもたらさなかった。膜接触点の遺残物がニューロンに速やかに再吸収され、成長円錐が妨げられずに基質にわたって伸長し続けた。したがって、マクロファージ誘発性軸索退縮は、基質依存性であり、許容状態の基質ラミニン上で活発な成長状態のニューロンは、CSPG勾配により誘発されたジストロフィーの状態にあるものと異なり、マクロファージ接触に対して感受性でなかった。
さらなる問題は、初代マクロファージがNR8383マクロファージ細胞系とin vitroで同じようにジストロフィー軸索と相互作用するかどうかであった。成体Sprague−Dawleyラットの骨髄から前駆細胞を採取し、in vitroでマクロファージに分化させ、80%を超えるED−1+細胞の培養物を得た。マクロファージのこの特定の集団は、他の身体の源から採取された集団と異なる脊髄病変に認められるマクロファージの表現型、形態および機能特性を保持することが示された(Longbrakeら、2007年)。次に軸索退縮を誘発する初代マクロファージの能力を評価した。非刺激初代マクロファージは、退縮を誘発することができなかった。スポット勾配ニューロン培養物に添加した場合、これらのマクロファージは、基質に接着したが、運動性でなく、休止状態のマクロファージの特性を示した。マクロファージがジストロフィー軸索上に落ち着いた場合にのみ、軸索との接触が起こった。マクロファージも、それらの細胞間相互作用も、細胞系マクロファージで以前に認められた物理的特性のいずれも、すなわち、引っ張りも、細胞過程による物理的付着の徴候なども示さなかった。
マクロファージは、一般的に病変後3日目まで損傷脊髄に浸潤しないので、CNS内の常在性グリア細胞は損傷に即時に反応する(Watanabeら、1999年)。病変内のグリア細胞は、活性化マクロファージと酷似して、活性化され、食作用を有するようになる。常在性グリア細胞であった可能性が最も高かった一般的なマクロファージの浸潤の前の病変後2日目に限られた数のED−1+細胞が損傷部内に認められた。軸索退縮に対するミクログリア細胞寄与の可能性をin vitroモデルを用いて評価した。皮質ミクログリア細胞をP1 Sprague−Dawleyラットから採取し、低速度撮影した培養物に添加する前にin vitroで成熟させた。初代マクロファージと同様に、初代ミクログリア細胞は、培養物中で活性化された状態になるためにはインターフェロンガンマおよびLPSで刺激しなければならなかった。非刺激ミクログリア細胞は、ラミニン/アグリカンスポット勾配基質に接着せず、これが我々のモデルにおけるジストロフィー軸索と相互作用することを妨げた。しかし、刺激されたミクログリア細胞は、軸索と接着し、物理的に相互作用し、50%の時間退縮を誘発したが、活性化ミクログリア細胞とジストロフィー軸索との接触は、マクロファージの接触ほど強くなかった。したがって、実験的に活性化されたミクログリア細胞も軸索退縮の誘発に役割を果たすことができる。
他の問題は、in vitroでのジストロフィー軸索の退縮の誘発は、病変脊髄内で通常認められる食作用を有する細胞型に特異的であり、ジストロフィー軸索と他の細胞型との相互作用の単なる結果ではないかどうかであった。星状細胞は、CNSの損傷後のグリア瘢痕の不可欠な構成要素である。それらは、高い数で存在し、再生性軸索に広範に接触する。DRG培養物に添加する前に、皮質星状細胞をin vitroで成熟させた。星状細胞は、基質に接着し、ジストロフィー軸索に広範に接触した。基質に結合した後、星状細胞は速やかに縁から離れてアグリカン勾配を下って移動した。星状細胞突起は、軸索上に広がり、時として軸索の側方変位をもたらした。しかし、これらの接触は、接触した軸索の退縮をもたらさなかった。したがって、退縮の誘発は、ED−1+食細胞との相互作用に特異的であって、他の細胞型との単なる物理的相互作用ではない。
1.後柱圧壊病変モデル
33匹の成体雌Sprague−Dawleyラット(250〜300g)をin vivo試験に用いた。すべての外科的処置のためにラットを吸入イソフルオランガス(2%)で麻酔した。T1椎弓切除術を実施して、C8脊髄セグメントの背側面を露出させた。30ゲージ針を用いて中線から両側0.75mmにデュロトミーを行った。次いで、Dumont#3鉗子をC8の後脊髄に1.0mmの深さに挿入し、鉗子を押し込み、圧力を10秒間保持し、さらに2回繰り返すことによって、後柱圧壊病変を加えた。病変の完了は、白色物質の除去の観察によって確認した。次いで、膜の穴をゲルフィルムで覆った。筋層を4−0ナイロン縫合糸で縫合し、皮膚を外科用ステープルで閉じた。切開部の閉鎖時に、動物にマルカイン(1.0mg/kg)を切開部に沿って皮下に、ならびにブプレノルフィン(0.1mg/kg)を筋肉内に投与した。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。病変後2、4、7、14または28日目に動物を屠殺した(1群当たりN=3)。すべての動物への処置は、Case Western Reserve Universityの動物資源センターのガイドラインおよびプロトコールに従って実施した。
動物に後柱圧壊損傷の前日、ならびに2日目の時点の病変後1日目、病変後1および3日目(4日目の時点)、ならびに病変後1、3および5日目(7日目の時点)にもリポソーム封入クロドロネートまたは空リポソーム対照を腹腔内注射した(1群当たりN=3)。クロドロネートは、Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germanyからの寄贈であった。クロドロネートは、前述のようにリポソームの封入されていた(Van RooijenおよびSanders、1994年)。
屠殺の2日前に、後柱をテキサスレッド結合3000MWデキストランで一側に標識した。手短に述べると、右後肢の坐骨神経を露出させ、Dumont#3鉗子で10秒間圧壊し、さらに2回繰り返した。1.0μLの滅菌水中3000MWデキストラン−テキサスレッド10%をHamilton注射器で圧壊部位の坐骨神経内に注射した。筋層を4−0ナイロン縫合糸で、皮膚を外科用ステープルで閉じた。切開部の閉鎖時に、動物にマルカイン(1.0mg/kg)を切開部に沿って皮下に、ならびにブプレノルフィン(0.1mg/kg)を筋肉内に投与した。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。動物を標識の2日後にイソフルランの過剰投与により屠殺し、PBSと続いて4%PFAで潅流した。組織を採取し、4%PFAで後固定し、免疫組織化学検査用に処理した。
組織を4%PFAで一夜後固定し、30%スクロースに一夜浸漬し、OCTマウンティング媒体中に凍結し、クリオスタット上で20μm縦方向切片に切断した。次いで、組織を抗GFAP(Accurate Chemical and Scientific Corporation、Westbury、NY)、抗ED−1(Millipore、Billerica、MA)で染色し、それぞれAlexafluor−405またはAlexafluor−488(Invitrogen、Carlsbad、CA)とともにインキュベートし、次いで、Zeiss Axiovert 510レーザー走査共焦点顕微鏡で撮像した。
1匹の動物当たり脊髄の背面の200μm下の深さで始まる3連続切片を動物ごとに分析して、軸索退縮を定量した。Zeiss LSM5 Image Browserソフトウエアを用いて特性GFAPおよびED−1染色パターンおよび標識軸索の末端と中心の間の距離により病変の中心を同定した。群のすべての動物のすべての切片の測定値を平均して、時点ごとの退縮の平均距離を求めた。
DRGは、以前に記載されたように採取した(Tomら、2004年;Daviesら、1999年)。手短に述べると、DRGを成体雌Sprague−Dawleyラットから切り離した(Zivic Miller、Harlan)。中枢および末梢根を除去し、神経節をHBSS中コラゲナーゼII(200U/mL、Worthington)およびディスパーゼII(2.5U/mL、Roche)の溶液中でインキュベートした。消化DRGを洗浄し、新鮮なHBSS−CMF中で3回緩やかに摩砕した後、低速度で遠心分離した。次いで、解離DRGをB−27、Glutamaxおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したNeurobasal−A培地(すべてInvitrogen製)に再懸濁し、計数した。DRGを3000細胞/mLの密度、合計6000細胞/皿でDelta−T皿(Fisher)上に置いた。
Delta−T培養皿(Fisher、Pittsburgh、PA)をTomら、2004年と同様に調製した。手短に述べると、2番ビットを用いて各皿の上半分に1つの穴をあけて、経時顕微鏡検査時の細胞、酵素、阻害剤などの添加用のポートを造成した。次いで、皿を滅菌水で洗浄し、ポリ−1−リシン(0.1mg/mL、Sigma)を用いて室温で終夜被覆し、滅菌水で洗浄し、乾燥した。培養物表面上に2.0μLのアグリカン溶液(2.0mg/mL、Sigma in HBSS−CMF、Invitrogen)をピペッティングすることにより、アグリカン勾配スポットを形成させ、乾燥した。1つの皿当たり6つのスポットをのせた。アグリカンスポットが完全に乾燥した後、皿の全表面をHBSS−CMF中ラミニン溶液(10μg/mL、BTI、Stoughton、MA)中に37℃で3時間浸した。細胞の平板培養の直前にラミニン浴を除去した。ラミニン浴のみを用い、アグリカンを用いないで、ラミニンのみの基質を含む皿を上と同様に調製した。ここで用いた基質の濃度は、Tomら、2004年により用いられたものと異なる。皿調製プロトコールからニトロセルロースを除くことによって、顕微鏡検査の明瞭さを改善することができる。しかし、皿表面への基質の結合の差を補償するために、用いる基質の濃度を上記のものに再較正した。
成体Sprague−Dawley肺胞マクロファージ細胞系である、NR8383細胞(ATCC#CRL−2192)をYinら(2003年)に記載の通り培養した。手短に述べると、細胞を非被覆組織培養フラスコ(Corning)中、15%FBS、Glutamax、Penn/Strep(Invitrogen)および重炭酸ナトリウム(Sigma)を添加したF−12K培地(Invitrogen)中で培養し、週2〜3回フィードした。この細胞系は、接着性および懸濁細胞の混合培養物を形成しており、フィーディング時に浮遊細胞を収集し、再び平板培養することによって継代培養した。経時顕微鏡実験用の細胞系マクロファージを準備するために、細胞を0.5%トリプシン/EDTA(Sigma)を用いて収集し、血清不含有F−12Kで3回洗浄し、非被覆組織培養フラスコ中、血清不含有F−12K中で1.0×106/mLの密度で平板培養した。翌日経時実験に用いる前に、培養細胞系マクロファージをEDTAおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、HEPES(50μM、Sigma)の添加を含め上のように補足したNeurobasal−A中に2.5×105/70μLの密度で再懸濁した。
以前に確立されたプロトコール(Tobianら、2004年)に基づいて骨髄前駆細胞を収集した。手短に述べると、成体雌Sprague−Dawleyラット(225〜275g、Harlan)から大腿骨を除去した。大腿骨の末端を除去し、10%FBS、Glutamax、Penn/Strep、ベータ−メルカプトエタノールおよびHEPES(Invitrogen)(D10F)を添加した冷DMEMを含む注射器を大腿骨に挿入し、骨髄を流し出し、収集した。得られた細胞混合物を70ミクロンフィルターに通し、遠心分離した。上清を除去し、得られた細胞ペレットをAKT溶解緩衝液(BioWhitacre)に再懸濁して、赤血球を溶解し、遠心分離した。上清を除去し、骨髄前駆細胞を含むペレットを再懸濁し、さらに20%LADMAC細胞系馴化培地(Dr.Clifford Hardingの寛大な寄贈物)をさらに添加した上のDMEM中で平板培養して、マクロファージへの分化を誘導した。細胞を5、7、9日目にフィードし、10日目に培養実験用に収集した。経時実験の1日前に、トリプシン/EDTAを用いて初代マクロファージを収集し、D10Fで3回洗浄し、非被覆ペトリ皿(Falcon)中、D10F中で1.0×106/mLの密度で平板培養した。翌日、初代マクロファージをEDTAおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、経時顕微鏡実験用にNeurobasal−A+HEPES中に5.0×105/70μLの密度で再懸濁した。
P0−P1ラットの皮質を除去し、細切し、EDTA中0.5%トリプシンで処理することにより、皮質星状細胞を収集した。細胞を、ポリ−L−リシンを被覆したT75フラスコ上10%FBS(Sigma)および2mM Glutamaxを含むDMEM/F12(Invitrogen)に播種し、4時間後に振とうして、非接着細胞を除去した。星状細胞を培養物中で少なくとも28日間成熟させた。星状細胞をEDTAおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、経時顕微鏡実験用にNeurobasal−A+HEPES中に5.0×105/70μLの密度で再懸濁した。
P0−P1ラットの皮質を除去し、細切し、EDTA中0.5%トリプシンで処理することにより、皮質ミクログリア細胞を収集した。細胞を、ポリ−L−リシンを被覆したT75フラスコ上20%FBS(Sigma)および2mM Glutamaxを含むDMEM/F12(Invitrogen)中で5〜7日間平板培養した。経時実験の1日前に、フラスコを攪拌して、接着性の低い細胞を除去し、これらの細胞を非被覆ペトリ皿(Falcon)中、D10F中で1.0×106/mLの密度で平板培養した。翌日、初代ミクログリア細胞をEDTAおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、経時顕微鏡実験用にNeurobasal−A+HEPES中に5.0×105/70μLの密度で再懸濁した。
低速度撮像の前にDRGニューロンを37℃で48時間インキュベートした。加熱ステージ装置に移す前にHEPES(50μM、Sigma)を含むNeurobasal−A培地を培養物に添加した。100倍油浸対物レンズを用いたZeiss Axiovert405M顕微鏡により3時間にわたり30秒ごとに経時画像を得た。スポットリム中にまっすぐ延び、特徴的なジストロフィー形態を有していた成長円錐を選択した。ニューロンを30分間観察し、さらなる細胞型の添加の前にベースライン挙動を測定した(初代マクロファージN=3を除くすべての群についてN=6)。細胞の添加後150分間成長円錐を観察した。我々はMetamorphソフトウエアにより伸長/退縮および成長の速度を追跡した。
データは、Minitab 15ソフトウエアを用いて一元もしくは二元配置ANOVAまたは適切な場合、一般的線型モデル、およびテュキー事後検定により解析した。
結果は、マクロファージが直接的な物理的接触によりジストロフィー成体軸索の退縮を誘発するという最初の決定的な証拠を示している。退縮の誘発は、ニューロンの成長状態およびマクロファージの活性化状態に依存していた。初代骨髄由来マクロファージは、in vitroで軸索退縮を誘発するために細胞系マクロファージおよび脊髄病変内のマクロファージと同様な活性化の状態に達するのにインターフェロンガンマおよびLPSによる刺激を必要とした。これは、in vivoでのマクロファージの挙動は状態に依存し、マクロファージの浸潤のみがミエリン変性が存在する場合の軸索退縮と相関することを示す以前の研究と一致している(McPhailら、2004年)。本試験は、成体感覚ニューロンが、阻害性CSPGの勾配によって誘発された停滞した成長のジストロフィー状態にあった場合にマクロファージ誘発性退縮を受けやすかったことを示している。均一なラミニン基質上で成長の活発な状態にある成体ニューロンは、マクロファージとの接触を速やかに断ち、退縮しなかった。
幹細胞は活性化マクロファージのDRGへの接着を妨げることができる
結果
1.モデル
後柱圧壊損傷後に、再生軸索は、マクロファージおよびミクログリア細胞に遭遇し、ジストロフィー終末を形成する。これについての概略を図1に示す。本発明者らの実験室による以前の試験で、マクロファージ浸潤が後柱圧壊損傷後の軸索ダイバックと相関することが示された(図2および3)。損傷後の上行後柱感覚軸索の軸索ダイバックの程度を特徴付けた後、本発明者らは、様々な治療戦略を評価するために用いることができる、ダイバックのin vitroモデルを確立した。in vitroアッセイは、成長促進タンパク質ラミニンおよび強力に阻害性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンアグリカンの対立勾配の基質上の培養成体DRGニューロンからなっている(Tomら、2004年)。このスポット勾配は、軸索成長を停滞させ、損傷脊髄で認められるものと同様なジストロフィー成長円錐の形成を誘発する。
図7にMAPCがマクロファージの阻害作用を調節することができるかどうかを判断するための実験設計の概略図を示す。MAPCを1DIV DRGスポット培養物に添加し、さらに1日インキュベートした。これらの共培養したニューロンの成長円錐の形態は、スポット上に一般的に認められるジストロフィー成長円錐とかなり異なっていた。これらの成長円錐は、ますます運動性となり、扁平化し、広範なラメラポディアを有していた。マクロファージは、成長円錐および軸索に接触したが、これらの接触はしばしば一過性のものであり、撮像した6つの軸索のうちの5つは、特徴的なマクロファージ媒介性退縮を受けなかった(図8)。
in vivoでの軸索ダイバックに対するMAPCの免疫調節作用を脊髄損傷の後柱圧壊モデルを用いて検討した。軸索ダイバックの最も劇的な段階は、活性化マクロファージの病変への浸潤と時空的に関連していた、病変後2〜4日目に起こる。MAPCが、軸索ダイバックの量を減少させるように病変内の活性化マクロファージを調節する可能性があった。したがって、MAPCを損傷直後に脊髄に移植し、病変後2〜4日目に軸索ダイバックの程度を測定した。MAPCは、病変の約500ミクロン尾側、中線の500ミクロン外側に移植した。この位置は、上行路のさらなる破壊を最小限にし、細胞が病変部位で血液およびCSFの流れにより脊髄から変位することを防ぐように損傷軸索の末端の近くにMAPCを置くために選択した。
病変コアにおけるビメンチン/NG2+稀突起グリア前駆細胞は、マクロファージ浸潤の時点近くに拡大し始め、軸索切断線維の末端は、この細胞集団と結合している。これは、CNS病変内のNG2+細胞が軸索を安定化する役割を果たすことにより、NG2+細胞がマクロファージ媒介性退縮を予防する理想的候補となることを示唆する。成体マウス脊髄からのNG2+グリア細胞をin vitroで1日後にDRG培養物に添加した。2日目に、30分間のベースライン観察期間の後、NR8383マクロファージを経時皿に添加し、さらに2.5時間観察した。DRGを含む培養物中のNG2+グリア細胞の存在は、マクロファージ誘発性退縮を予防するのに十分ではない(N=5)。図14において、軸索は、マクロファージ接触後に退縮し、NG2+グリア細胞上で安定化する。
1.DRG解離
DRGは、以前に記載されたように採取した(Tomら、2004年;Daviesら、1999年)。手短に述べると、DRGを成体雌Sprague−Dawleyラットから切り離した(Harlan)。中枢および末梢根を除去し、神経節をHBSS中コラゲナーゼII(200U/mL、Worthington)およびディスパーゼII(2.5U/mL、Roche)の溶液中でインキュベートした。消化DRGを洗浄し、新鮮なHBSS−CMF中で3回緩やかに摩砕した後、低速度で遠心分離した。次いで、解離DRGをB−27、Glutamaxおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したNeurobasal−A培地(すべてInvitrogen製)に再懸濁し、計数した。DRGを3000細胞/mLの密度、合計6000細胞/皿でDelta−T皿(Fisher)上に置いた。
Delta−T培養皿(Fisher)をTomら、2004年と同様に調製した。手短に述べると、2番ビットを用いて各皿の上半分に1つの穴をあけて、経時顕微鏡検査時の細胞、酵素、阻害剤などの添加用のポートを造成した。次いで、皿を滅菌水で洗浄し、ポリ−1−リシン(0.1mg/mL、Invitrogen)を用いて室温で終夜被覆し、滅菌水で洗浄し、乾燥した。培養添加し表面上に2.0μLのアグリカン溶液(2.0mg/mL、Sigma in HBSS−CMF、Invitrogen)をピペッティングすることにより、アグリカン勾配スポットを形成させ、乾燥した。1つの皿当たり6つのスポットをのせた。アグリカンスポットが完全に乾燥した後、皿の全表面をラミニン溶液(10μg/mL、HBSS−CMF中のBTI)中に37℃で3時間浸した。細胞の平板培養の直前にラミニン浴を除去した。
成体Sprague−Dawley肺胞マクロファージ細胞系である、NR8383細胞(ATCC#CRL−2192)をYinら(2003年)に記載の通り培養した。手短に述べると、細胞を非被覆組織培養フラスコ(Corning)中、15%FBS(Sigma)、Glutamax、Penn/Strep(Invitrogen)および重炭酸ナトリウム(Sigma)を添加したF−12K培地(Invitrogen)中で培養し、週2〜3回フィードした。経時顕微鏡実験用の細胞系マクロファージを準備するために、細胞をトリプシン/EDTA(Invitrogen)を用いて収集し、3回洗浄し、非被覆組織培養フラスコ中、血清不含有F−12K中で1.0×106/mLの密度で平板培養した。経時実験に用いる前に、培養細胞系マクロファージをEDTAおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、HEPES(50μM、Sigma)を添加したNeurobasal−A中に2.5×105/70μlの密度で再懸濁した。
GFPで標識したSprague−DawleyラットMAPCを、低グルコースDMEM(Invitrogen)、0.4×MCDB−201培地(Sigma)、1×ITS液体培地補足物質(Sigma)、1mg/mlリノール酸−アルブミン(Sigma)、100U/mlペニシリンGナトリウム/100μg/ml硫酸ストレプトマイシン(Invitrogen)、100μM 2−P−L−アスコルビン酸(Sigma)、100ng/ml EGF(Sigma)、100ng/ml PDGF(R&D Systems)、50nMデキサメタゾン(Sigma)、1000U/ml ESGRO(Chemicon)および2%ウシ胎児血清(Hyclone)からなるラットMAPC培地中で生育した。培養物を10ng/mlフィブロネクチン(Invitrogen)被覆150cm2組織培養フラスコ(Corning)上で1000細胞/cm2の初期密度で平板培養し、その後、200細胞/cm2で再び平板培養した。細胞は、15mlの培地/フラスコ中で37℃および5.0%CO2で維持し、トリプシン/EDTA(Invitrogen)を用いて3〜4日ごとに継代を行った。
細胞を上述のように培養し、48時間後に50mlコニカルチューブ(BD Bioscience)に馴化培地を収集した。馴化培地を4℃で400×gで5分間遠心分離し、上清を新たな50mlコニカルチューブに移した。次いで、馴化培地を4℃で保存した。
NR8383ラットマクロファージを上述のように培養し、経時顕微鏡実験の1日前に、マクロファージをトリプシン/EDTA(Invitrogen)を用いて収集し、3回洗浄し、非被覆組織培養フラスコ中、血清不含有F−12K中で1.0×106/mLの密度で平板培養した。1mLの血清不含有F12K培地当たり20μLの50倍濃縮MAPC馴化培地を1×の最終濃度を得るために加えた。経時実験に用いる前に、培養細胞系マクロファージをEDTAおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、HEPES(50μM、Sigma)を添加したNeurobasal−A中に2.5×105/70μlの密度で再懸濁した。
経時撮像の前にDRGニューロンを37℃で48時間インキュベートした。加熱ステージ装置に移す前に、HEPES(50μM、Sigma)を含むNeurobasal−A培地を培養物に添加した。100倍油浸対物レンズを用いたZeiss Axiovert405M顕微鏡により3時間にわたり30秒ごとに経時画像を得た。スポットリム中にまっすぐ延び、特徴的なジストロフィー形態を有していた成長円錐を30分間選択して、細胞または馴化培地の添加前にベースライン挙動を観察し、次いで3時間観察した。
経時撮像後に、DRGを4%PFAで固定し、抗B−チューブリンIII型(1:500;Sigma)、抗コンドロイチン硫酸(CS−56、1:500、Sigma)および抗GFP(1:500、Invitrogen)で免疫染色した。
骨髄前駆細胞をTobianら、2004年に記載されているように採取した。手短に述べると、成体雌Sprague−Dawleyラット(Harlan)から大腿骨を除去した。大腿骨の末端を除去し、10%FBS、Glutamax、Penn/Strep、ベータ−メルカプトエタノールおよびHEPES(Invitrogen)(D10F)を添加した冷DMEMを含む注射器を大腿骨に挿入し、骨髄を流し出し、収集した。得られた細胞混合物を70μmフィルターに通し、遠心分離した。上清を除去し、得られた細胞ペレットをAKT溶解緩衝液(BioWhitacre)に再懸濁して、赤血球を溶解し、遠心分離した。上清を除去し、骨髄前駆細胞を含むペレットを再懸濁し、さらに20%LADMAC細胞系馴化培地(Dr.Clifford Hardingの寛大な寄贈物)をさらに添加した上のDMEM中で平板培養して、マクロファージへの分化を誘導した。細胞を10日目に培養実験用に収集した。経時実験の1日前に、トリプシン/EDTAを用いて初代マクロファージを収集し、D10Fで3回洗浄し、非被覆ペトリ皿(Falcon)中、D10F中で1.0×106/mlの密度で平板培養した。翌日、初代マクロファージをEDTAおよび細胞スクレーパーを用いて収集し、経時顕微鏡実験用にNeurobasal−A+HEPES中に5.0×105/70μlの密度で再懸濁した。
成体雌Sprague−Dawleyラット250〜300gをすべての外科的処置のために吸入イソフルオランガス(2%)で麻酔した。T1椎弓切除術を実施して、C8脊髄セグメントの背側面を露出させた。30ゲージ針を用いて中線から両側0.75mmにデュロトミーを行った。次いで、Dumont#3宝石商摂子をC8の後脊髄に1.0mmの深さに挿入し、摂子を押し込み、圧力を10秒間保持し、さらに2回繰り返すことによって、後柱圧壊病変を加えた。病変の完了は、白色物質の除去の観察によって確認した。次いで、膜の穴をゲルフィルムで覆った。筋層を4−0ナイロン縫合糸で縫合し、皮膚を外科用ステープルで閉じた。切開部の閉鎖時に、動物にマルカイン(1.0mg/kg)を切開部に沿って皮下に、ならびにブプレノルフィン(0.1mg/kg)を筋肉内に投与した。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。病変後2、4、7、14または28日目に動物を屠殺した。
培養ラット由来MAPCまたは初代骨髄由来マクロファージ(インターフェロンガンマおよびLPSで24時間刺激した)を組織培養フラスコから採取し、HBSS−CMFで3回洗浄し、200,000細胞/μLの密度でHBSS−CMFに懸濁した。後柱圧壊損傷の直後に、1.0μLの細胞懸濁液を右側後柱に0.5mmの深さで一側に注射した。注射部位は、中線の0.5mm外側で、病変の縁の0.5mm尾側であった。細胞は、Nanoject II(Drummond)に取り付けた引きガラスピペットにより15秒間隔で44回の23.0nLパルスで注射した。最終の注射の2分後にガラスピペットを脊髄から引き抜いた。移植後、注射部位をゲルフィルムで覆い、筋層を4−0エチコン縫合糸で閉じ、皮膚を外科用ステープルで閉じた。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。病変後2または4日目に動物を屠殺した
12.軸索の標識
屠殺の2日前に、後柱をテキサスレッド結合3000MWデキストランで一側に標識した。手短に述べると、右後肢の坐骨神経を露出させ、Dumont#3鉗子で10秒間圧壊した。1.0μLの滅菌水中3000MWデキストラン−テキサスレッド10%をHamilton注射器で圧壊部位の坐骨神経内に注射した。筋層を4−0ナイロン縫合糸で、皮膚を外科用ステープルで閉じた。切開部の閉鎖時に、動物にマルカイン(1.0mg/kg)を切開部に沿って皮下に、ならびにブプレノルフィン(0.1mg/kg)を筋肉内に投与した。術後、麻酔からの回復時に動物を加熱ランプで温め、飼料および水を自由に摂取させた。動物を標識の2日後にイソフルランの過剰投与により屠殺し、PBSと続いて4%PFAで潅流した。組織を採取し、4%PFAで後固定し、免疫組織化学検査用に処理した。
組織を4%PFAで終夜後固定し、30%スクロースに終夜浸漬し、OCTマウンティング媒体中に凍結し、クリオスタット上で20μm縦方向切片に切断した。次いで、組織を抗GFAP/Alexafluor−405、抗ED−1/Alexafluor−594または−633、抗GFP/Alexafluor−488および抗ビメンチン/Alexafluor−633で染色した。次にZeiss Axiovert 510レーザー走査共焦点顕微鏡で10倍の倍率で撮像した。
軸索ダイバックを定量するために、1匹の動物当たり脊髄の背面の200μm下の深さで始まる3連続切片を分析した。特性GFAPおよび/またはビメンチン染色パターンによって病変の中心を識別し、Zeiss LSM 5 Image Browserソフトウエアを用いて中心を定めた。病変内で最も遠く突き出している5つの標識軸索の末端と病変の中心との距離を測定した。群内のすべての動物からのすべての切片の測定値を平均して、各時点についてのダイバックの平均距離を求めた。
間葉幹細胞は、市販のものを入手することができる。例えば、Rat Mesenchymal Stem Cell Kit(Milliporeカタログ番号SCR026)は、成体Fisher 344ラットの骨髄から分離されたすぐ使用できる初代間葉幹細胞ならびに間葉幹細胞集団の特徴付けのための陽性および陰性マーカーのパネルを備えている。陽性細胞マーカーは、間葉幹細胞上に存在する2つの細胞表面分子(インテグリンb1およびCD54)に対する抗体を含む。陰性細胞マーカーは、間葉幹細胞によって発現されない2つの特異的造血細胞表現マーカー(白血球上に存在するCD14ならびに単球およびマクロファージ上に存在するCD45)に対する抗体を含む。これらの間葉幹細胞を、退縮を減少させる能力について評価したところ、in vitro(グリア瘢痕)で退縮を減少させた(接着を減少させた)ことが認められた。
5μg/mlラミニン上で生育した成体DRGのMAPC馴化培地処理は、神経突起の伸長を促進する。図16を参照のこと。各解離DRGからの最長の軸索を、培地がNeurobasal−Aを含み、MAPC馴化培地、対照培地を加えた、または追加の培地を加えなかった、群について測定した。すべての条件は、互いから有意であった。一元配置ANOVA、*p<0.0001。B、無処理DRGの伸長の平均量を表す16倍画像。C、MAPC馴化培地で前処理したDRGの伸長の平均量を表す16倍画像。
Claims (12)
- 軸索退縮に関連するニューロン損傷を治療するための組成物であって、前記組成物が、複数の胚性胚葉の細胞型に分化し、かつ/またはoct4、テロメラーゼ、rex−1、rox−1、sox−2およびSSEA4の1つまたは複数を発現する能力を有する非胚性幹細胞であることを特徴とする、複能性成体前駆細胞(MAPC)または前記MAPCから分泌される因子を含み、前記MAPCは、ヒト骨髄に由来し、前記組成物は、軸索退縮を低減し、前記軸索退縮に関連するニューロン損傷を低減するために、前記損傷に十分に近接して十分な時間、十分な量で投与されることを特徴とし、前記ニューロン損傷が脊髄損傷の結果である、組成物。
- 脊髄損傷を有する被験体における軸索退縮を低減するための組成物であって、前記組成物が、複数の胚性胚葉の細胞型に分化し、かつ/またはoct4、テロメラーゼ、rex−1、rox−1、sox−2およびSSEA4の1つまたは複数を発現する能力を有する非胚性幹細胞であることを特徴とする、複能性成体前駆細胞(MAPC)または前記MAPCから分泌される因子を含み、前記MAPCは、ヒト骨髄に由来し、前記組成物は、軸索退縮を低減するために、有効な量で十分な時間にわたって投与されることを特徴とする、組成物。
- 前記分泌因子が、MAPC馴化細胞培養培地中に存在する、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記幹細胞がテロメラーゼを発現する、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記幹細胞がOct4を発現する、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、複数の胚性胚葉の細胞型に分化する能力を有する、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、3種全ての胚性胚葉の細胞型に分化する能力を有する、請求項6に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、テロメラーゼおよびoct4を発現する、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、テロメラーゼおよびoct4を発現し、複数の胚性胚葉の細胞型に分化する能力を有する、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記幹細胞が、3種全ての胚性胚葉の細胞型に分化する能力を有する、請求項9に記載の組成物。
- 前記組成物が分泌因子を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記分泌因子が、MAPC馴化細胞培養培地中に存在する、請求項11に記載の組成物。
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