CN102333861A - 用于分离非常小的胚胎样(vsel)干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

当前披露的主题提供了分离干细胞群的方法，所述干细胞群来自骨髓、外周血和/或其它来源。还提供了使用干细胞治疗受试者中的组织和/或器官损伤的方法。

Description

用于分离非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求下列申请的优先权：2008年9月30日提交的美国临时申请号61/194,719，2008年11月12日提交的美国临时申请号61/198,920，以及2009年9月24日提交的美国临时申请号61/245,650，各申请的公开内容通过引用整体纳入本文。

政府权益

本发明是在国立健康研究院授予的基金号R01 CA106281、R01DK074720、R01 HL072410、HL055757、HL068088和HL070897的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

技术领域

当前披露的主题总体上涉及从骨髓、脐带血、和/或其它来源分离的干细胞(在本文中被称为非常小的胚胎样(very small embryonic-like)(VSEL)干细胞)群的鉴定、分离及应用。更具体地，当前披露的主题涉及分离所述VSEL干细胞并且(任选地在体外处理后)将其用于治疗需要其的受试者中的组织和/或器官损伤。

背景技术

干细胞和干细胞衍生物的应用已经在医药研究中，尤其在提供用于治疗由于遗传缺陷、创伤、和/或疾病过程的任何一个造成的组织损伤的试剂领域中获得提高的兴趣。理想地，能够分化为受影响的细胞类型的细胞可以被移植入需要其的受试者中，其中它们将与器官微环境相互作用并供应必须的细胞类型以修复损伤。

已经付出了相当多的努力以从大量不同的组织中分离干细胞用在再生医药中。例如，授予Tsukamoto et al.的美国专利No.5,750,397披露了据报道能够分化为淋巴细胞、红细胞(erythroid)、和髓细胞单核细胞(myelomonocytic)谱系的人类造血干细胞的分离和生长。授予Bruder et al.的美国专利No.5,736,396披露了用于在合适的生长和/或分化因子的影响下分离的人类间充质干细胞的谱系定向分化的方法。随后可以将所述得到的细胞引入宿主用于间充质组织再生或修复。

强烈感兴趣的一个领域涉及胚胎干(ES)细胞的应用，其已经在小鼠中显示具有分化为动物的所有不同的细胞类型的潜能。小鼠ES细胞源自胚泡期的早期小鼠胚胎的内细胞群的细胞，并且其它多能和/或全能细胞已经从胚(germinal)组织(如原始生殖细胞；PGC)分离。这些多能和/或全能干细胞以未分化状态在体外增殖、保持10正常核型、以及保持分化为全部的三个胚层(内胚层、中胚层及外胚层)的衍生物的潜能的能力使得这些细胞作为细胞的潜在来源用在出生后受试者的再生治疗中是有吸引力的。

人类ES(hES)细胞的开发还不及对小鼠ES细胞进行的进展成功。Thomson et al.报道了来自低等灵长类(美国专利No.5,843,780；Thomson et al.(1995)92 Proc Natl Acad Sci USA 7844-7848)、以及来自人类(Thomson etal.(1998)282 Science 1145-1147)的多能干细胞。Gearhart et al.产生了来自胎儿性腺组织的人类胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott et al.(1998)95 ProcNatl Acad Sci USA 13726-13731；及美国专利No.6,090,622)。hES和hEG细胞均具有多能干细胞的理想特征，在于它们能够在体外增殖而不分化，它们通常维持正常的核型，并且它们仍然能够分化为多种不同的细胞类型。无性(clonally)来源的人类胚胎干细胞系在培养中长期维持多能性和增殖潜能(Amit et al.(2000)227 Dev Biol 271-278)。

ES细胞或其它多能细胞用于受试者中再生治疗的一个重大挑战是控制细胞生长和分化为受试者治疗所需的特定细胞类型。已有许多生长因子对ES细胞分化的影响的报道。例如，Schuldiner et al.报道了八种生长因子对细胞从hES细胞分化为不同细胞类型的影响(参见Schuldiner et al.(2000)97Proc Natl Acad Sci USA 11307-11312)。如其中所披露的，在开始通过胚状体样(embryoid body-like)形成的分化后，在bFGF、TGFPI、活化素-A、BMP-4、HGF、EGF、PNGF、或视黄酸的存在下培养细胞。每种生长因子对分化途径具有独特的影响，但是没有生长因子排他地指导分化为一种细胞类型。

理想地，能够从受试者分离和纯化干细胞和/或前体细胞是有益的，所述细胞能够在被再引入受试者用于治疗目的之前被纯化和/或体外处理。受试者的自身细胞的应用将消除采用辅助免疫抑制治疗的需要，由此维持受试者免疫系统的能力。然而，用于分离ES细胞系，尤其是hES细胞系的目前的策略排除了从受试者分离细胞并将它们再引入相同的受试者。

因此，对于来自成年动物的其它干细胞类型的研究在继续。例如，间充质干细胞(MSC)是一种这样的细胞类型。已经显示MSC具有分化为包括骨(Haynesworth et al.(1992)13 Bone 81-88)、软骨(Mackay et al.(1998)4Tissue Eng 415-28；Yoo et al.(1998)80 J Bone Joint Surg Am 1745-57)、脂肪组织(Pittenger et al.(2000)251 Curr Top Microbiol Immunol-11)、腱(Younget al.(1998)16 J Orthop Res 406-13)、肌肉及基质(Caplan et al.(2001)7Trends Mol Med 259-64)的多个谱系的潜能。

另一细胞群，多能成年祖细胞(MAPC)也已经从骨髓纯化(BM；Reyeset al.(2001)98 Blood 25 261 5-2625；Reyes & Vetfaillie(2001)938 Ann NYAcad Sci 231-235)。这些细胞已经显示能够在体外扩展为超过100次的群体倍增(100 population doubling)而没有端粒缩短或核型异常的发生。已经显示MAPC在限定的培养条件下能够分化为各种间充质细胞30类型(如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞及骨骼成肌细胞)、内皮、神经外胚层细胞、以及更最近的，分化为肝细胞(Schwartz et al.(2000)109 J Clin Invest1291-1302)。

此外，已报道造血干细胞(HSC)能够分化为多种细胞类型。已报道BM造血干细胞能够“转分化(transdifferentiate)”为表达早期心(Orlic etal.(2003)7 Pediatr Transplant 86-88；Makino et al.(1999)103 J Clin Invest697-705)、骨骼肌(Labarge & Blau(2002)111 Cell 589-601；Corti et al.(2002)277 Exp Cell Res 74-85)、神经(Sanchez-Ramos(2002)69 Neurosci Res880-893)、肝(Petersen et al.(1999)284 Science 1168-1170)、或胰腺细胞(lanus et al.(2003)111 J Clin Invest 843-850；Lee & Stoffel(2003)111 J ClinInvest 799-801)标记物的细胞。在人类体内实验中还表明CD34⁺外周血(PB)干细胞的移植导致供体-来源的肝细胞(Korbling et al.(2002)346 N Engl JMed 738-746)、上皮细胞(Korbling et al.(2002)346 N Engl J Med 738-746)、和神经元(Hao et al.(2003)12 J Hematother Stem Cell Res 23-32)的出现。此外，已显示人类BM-来源的细胞有助于梗塞的心肌的再生(Stamm et al.(2003)361 Lancet 45-46)。

这些报道已经被解释为成年干细胞的转分化或可塑性现象存在的证据。然而，成年组织特异性干细胞的转分化的概念目前在科学和医药界内是广泛争议的主题(参见，如，Lemischka(2002)30 Exp Hematol 848-852；Holden &Vogel(2002)296 Science 2126-2129)。试图再生的研究结果表明借助神经干细胞的转分化是不成功的(Castro et al.(2002)297 Science 1299)。还显示肌肉组织中发现的造血干/祖细胞(HSPC)起源于BM(Mckinney-Freeman etal.(2002)99 Proc Natl Acad Sci USA 1341-1346；Geiger et al.100 Blood721-723；Kawada & Ogawa(2001)98 Blood 2008-2013)。此外，借助涉及单独的HPC移植入致命照射的小鼠的嵌合动物的研究表明循环HPSC和/或它们的子代的转分化和/或可塑性(如果其确定存在)是极稀有的事件(Wagerset al.(2002)297 Science 2256-2259)。

因此，持续存在产生适于多种应用(包括但不限于治疗多个器官和/或组织的损伤和/或疾病)的可移植细胞群的新方法的需要。

发明概述

本概述部分列出了当前披露的主题的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变体和改变。本概述部分仅是许多和改变的实施方式的示例。提及的给定实施方式的一个或更多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以伴随或不伴随提及的特征而存在；同样地，那些特征可以应用到当前披露的主题的其它实施方式，不管在本概述部分中是否列出。为了避免过多重复，本概述部分没有列出或建议这样的特征的所有可能组合。

当前披露的主题提供了用于从非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物的群体形成胚状体样球体的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45^-细胞群；以及(b)在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中培养VSEL干细胞或其衍生物达足以使胚状体样球体形成的时间。在一些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物包含CD34⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-非常小的胚胎样(VSEL)干细胞。在一些实施方式中，VSEL干细胞的直径约为3-4μm，表达SSEA-1、Oct-4、Rev-1、和Nanog的至少一种，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核，并且具有开放型染色质(常染色质)。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45^-细胞群从人或从小鼠分离。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45^-细胞群从人或小鼠中选自骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的来源分离。在一些实施方式中，诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个生长因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2及其组合。在一些实施方式中，通过将VSEL干细胞或其衍生物与C2C12细胞共培养将所述一个或更多个因子提供给VSEL干细胞或其衍生物。

在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括通过下述方法分离包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45^-细胞群，所述方法包括下述步骤：(a)提供怀疑包含CD45^-干细胞的初始细胞群；(b)将所述初始细胞群与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在初始细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合；(c)选择为CD34⁺或Sca-1⁺、并且CD45^-的细胞的第一亚群；(d)将所述细胞的第一亚群与对于一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合，所述标记物选自CD45R/B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119；(e)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(f)收集为CD34⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-的细胞的第二亚群，由此分离CD45^-干细胞的亚群。在一些实施方式中，每个抗体包含可检测的标记。在一些实施方式中，所述可检测的标记包括荧光标记或者可以通过包含荧光标记的试剂被检测的部分。在一些实施方式中，所述分离包括FACS分类(sorting)。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离为c-met⁺、c-kit⁺、和/或LIF-R⁺的那些细胞。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离表达选自SSEA-1、Oct-4、Rex-1及Nanog的一个或更多个基因的那些细胞。在一些实施方式中，细胞群包括骨髓样品、脐带血样品、或外周血样品。

在当前披露的主题的一些实施方式中，在用足以将包含VSEL干细胞的CD45^-干细胞从骨髓迁移到受试者的外周血的量的迁移剂处理受试者后，将所述细胞群从受试者的外周血分离。在一些实施方式中，所述迁移剂包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗剂的至少一种。在一些实施方式中，CXCR4拮抗剂是T140肽。在一些实施方式中，所述受试者是小鼠。

在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括将干细胞的亚群与结合到CXCR4的抗体接触以及从干细胞的亚群分离为CXCR4⁺的那些细胞。

在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离为CXCR4⁺和/或AC133⁺的那些细胞。

在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括选择为HLA-DR^-、MHCI类^-、CD90^-、CD29^-、CD105^-、或其组合的那些细胞。

当前披露的主题还提供了包含多个非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的胚状体样球体。

当前披露的主题还提供了包含本文披露的胚状体样球体的细胞培养物。在一些实施方式中，本文披露的胚状体样球体在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中提供。

当前披露的主题还提供了将非常小的胚胎样(VSEL)干细胞分化为感兴趣的细胞类型的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体；以及(b)在包含分化诱导量的一个或更多个因子的培养基中培养胚状体样球体直到培养基中出现感兴趣的细胞类型，所述因子诱导VSEL干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型是神经元细胞或其衍生物。在一些实施方式中，神经元细胞或其衍生物选自少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞及神经元。在一些实施方式中，所述神经元细胞或其衍生物表达选自GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1及Olig2的标记物。在一些实施方式中，所述培养持续至少约10天。在一些实施方式中，所述培养基包含约10ng/ml rhEGF、约20ng/ml FGF-2及约20ng/ml NGF。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为内胚层细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述培养包括在包含活化素A的第一培养基中培养胚状体样球体；以及其后在包含N2补充物-A、B27补充物及约10mM烟酰胺的第二培养基中培养胚状体样球体。在一些实施方式中，在第一培养基中的培养持续约48小时。在一些实施方式中，在第二培养基中的培养持续至少约12天。在一些实施方式中，内胚层细胞或其衍生物表达选自Nkx6.1、Pdx1及C-肽的标记物。在一些实施方式中，感兴趣的细胞类型为心肌细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述培养持续至少约15天。在一些实施方式中，所述培养基包含碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及转化生长因子D1的组合，数量足以造成胚状体样球体细胞的亚组分化为心肌细胞。在一些实施方式中，所述心肌细胞或其衍生物表达选自Nsx2.5/Csx和GATA-4的标记物。

在当前披露的方法的一些实施方式中，所述胚状体样球体通过下述制备：(a)提供包含VSEL干细胞的CD45^-细胞群；以及(b)在包含一个或更多个诱导VSEL细胞的胚状体样球体形成的因子的培养基中培养VSEL干细胞足以使胚状体样球体出现的时间。

当前披露的主题还提供了包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的本文披露的分化的非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的制剂。在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂用于人类中是可接受的。

当前披露的主题还提供了用于治疗受试者中组织损伤的方法。在一些实施方式中，所述方法包括给予受试者一种组合物，该组合物包含在药学上可接受的载体中的多个分离的CD45^-干细胞，所述CD45^-干细胞包含VSEL干细胞，数量和经由的途径足以允许CD45^-干细胞群的至少一部分移植入(engraft)所述组织并且在其中分化，由此治疗损伤。在一些实施方式中，所述损伤选自缺血性损伤、心肌梗塞及中风。在一些实施方式中，受试者为哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物选自人类和小鼠。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞的分离的CD45^-干细胞从选自骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的来源分离。

在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分化分离的CD45^-干细胞以在给予受试者所述组合物之前产生预定的细胞类型。在一些实施方式中，所述预定的细胞类型选自神经细胞、内胚层细胞、心肌细胞及其衍生物。

当前披露的主题还提供了用于产生嵌合动物的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将一个或更多个包含VSEL干细胞的CD45^-干细胞群添加到胚胎，从而一个或更多个CD45^-干细胞发育为胚胎的一个或更多个细胞类型。在一些实施方式中，所述添加包括将一个或更多个CD45^-干细胞注射入胚泡期胚胎的囊胚腔。在一些实施方式中，所述添加包括聚集(aggregating)包含VSEL干细胞的一个或更多个CD45^-干细胞与桑葚胚期胚胎。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括在加入一个或更多个包含VSEL干细胞的CD45^-干细胞后孕育胚胎至少直到出生，以提供嵌合动物。

当前披露的主题还提供了从CD45^-干细胞群纯化非常小的胚胎样(VSEL)干细胞中感兴趣的细胞类型的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞的CD45^-干细胞群；(b)鉴定表达VSEL干细胞的标记物的CD45^-干细胞的亚群；以及(c)纯化所述亚群。在一些实施方式中，所述群和所述亚群除了为CD45^-外，均为CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-或Sca-1⁺/lin^-。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞的CD45^-干细胞群从选自骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的来源分离。在一些实施方式中，感兴趣的细胞类型选自骨骼肌细胞、肠上皮细胞、胰腺细胞、内皮细胞、表皮细胞、黑色素细胞、神经元细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰腺细胞、内皮细胞、上皮细胞、视网膜色素细胞及内胚层细胞。在一些实施方式中，所述标记物选自GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、Myf5、MyoD、成肌蛋白(Myogenin)、Nsx2.5/Csx、GATA-4、甲胎蛋白(α-Fetoprotein)、CK19、Nkx2-3、Tcf4、Nkx 6.1、Pdx1、VE-钙粘蛋白、Krt 2-5、Krt 2-6a、BNC、DCT、TYR及TRP。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为心肌细胞，所述标记物选自Nkx2.5/Csx、GATA-4、MEF2C。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为内皮细胞，所述标记物选自VEGFR2、VE-钙粘蛋白、血管性血友病因子(von Willebrand factor)及TIE2。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为骨骼肌细胞，所述标记物选自Myf5、MyoD及成肌蛋白。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为肝细胞，所述标记物选自甲胎蛋白和CK19。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为神经细胞，所述标记物选自βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、GFAP及巢蛋白。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为胰腺细胞，所述标记物选自Nkx6.1和Pdx1。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为黑色素细胞，所述标记物选自DCT、TYR及TRP。

当前披露的主题还提供了用于鉴定胚状体样球体形成的诱导剂的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)从已知包含诱导剂的细胞制备包含多个cDNA克隆的cDNA文库；(b)用所述cDNA文库转化不包含所述诱导剂的多个细胞；(c)在足以造成VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体的条件下，在转化的多个细胞存在下，培养多个VSEL干细胞或其衍生物；(d)分离包含所述诱导剂的转化的细胞；(e)从转化的细胞回收cDNA克隆；以及(f)鉴定由回收的cDNA克隆编码的多肽，由此鉴定胚状体样球体形成的诱导剂。在一些实施方式中，已知包括诱导剂的细胞为C2C12细胞。在一些实施方式中，多个cDNA克隆包含位于克隆载体(cDNA克隆被插入其中)中cDNA克隆位点的至少一侧的侧翼的至少一个引物结合位点。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括利用杂交到位于cDNA克隆位点的两侧的侧翼的引物位点的引物扩增转化的细胞中存在的cDNA克隆。在一些实施方式中，所述鉴定是通过对cDNA克隆的测序。

当前披露的主题还提供了从脐带血或其部分(fraction)分离包含VSEL干细胞的CD45^-干细胞的亚群的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)将脐带血或其部分与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合；(b)选择为CD34⁺或Sca-1⁺、并且为CD45^-的细胞的第一亚群；(c)将细胞的第一亚群与对于选自CD45R/B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119的一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合；(d)从细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(e)收集为CD34⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-的细胞的第二亚群，由此分离包含VSEL干细胞的CD45^-干细胞的亚群。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括在低渗溶液中孵育脐带血或其部分或所述任何亚群达到足以基本上裂解可能存在的所有红细胞(erythocyte)的时间。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离对于CXCR4、c-met、c-kit、或LIF-R的至少一种为阳性的那些细胞。

因此，当前披露的主题的一个目的是提供新的干细胞群，以及制备和应用其的方法。这个目的和其它目的全部或部分通过当前披露的主题实现。

当前披露的主题的一个目的已经在上面陈述，其他目的将随着描述的继续以及结合下述实施例和附图而变得显而易见。

根据一些实施方式，提供了源自人类的成人(adult)器官或组织细胞的非常小的胚胎样干细胞(VSEL)的富集群体，其中所述群体这样富集：通过就CD133⁺CXCR4⁺CD34⁺Lin^-CD45^-细胞来选择细胞以获得靶(target)VSEL的富集群体。在一些实施方式中，所述VSEL源自血液(例如，脐带血、外周血)。所述靶VSEL是Oct-4⁺、Nanog⁺和/或SSEA⁺。在一些实施方式中，所述靶VSEL在细胞核中表达Oct-4蛋白，并且在表面上表达SSEA抗原。在一些实施方式中，所述靶VSEL表达选自下列的原始生殖细胞(PGC)标志物：胎儿型碱性磷酸酶、OctA、SSEA-1、CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis、Nobox和Hdac6。在一些实施方式中，可以通过就大小为2至6μm或大小为2至4μm的细胞进行选择而富集VSEL的富集群体。可以通过就含有原始的非结构化的(primitive unorganized)常染色质的细胞进行选择而富集VSEL的群体。优选地，在VSEL的富集群体中，至少25％(例如30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)的细胞是靶VSEL。

根据一些实施方式，提供了产生细胞群体的方法，所述细胞群体就来自人类血液(例如，脐带血、外周血)的靶非常小的胚胎样干细胞(VSEL)进行了富集，包括裂解(lysing)血液以除掉红细胞和制备Lin^-CD45^-CD133⁺细胞的富集群体。

根据一些实施方式，提供了产生细胞群体的方法，所述细胞群体就来自人类血液(例如，脐带血、外周血)的靶非常小的胚胎样干细胞(VSEL)进行了富集，包括：i)裂解血液以除掉红细胞；ii)制备CD133⁺细胞的富集群体；和iii)制备Lin^-CD45^-CD133⁺的富集群体。可以通过使用免疫磁珠就CD133⁺细胞富集VSEL的群体。可以通过荧光激活的细胞分选就Lin^-CD45^-CD133⁺细胞富集VSEL的群体。在一些实施方式中，可以在低渗的氯化铵溶液中裂解血液以除掉红细胞。

附图说明

图1A和1B描绘了Sca-1⁺/lin^-/CD45^-和Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞的透射电子显微镜(TEM)图像。

图1A显示Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞较小并且测量的直径为3-4μm。它们具有由细胞质的窄缘围绕的较大细胞核。在超微水平上，细胞质的窄缘具有一些线粒体、分散的核糖体、内质网的小轮廓、以及一些囊泡。细胞核被包含在具有核孔的核膜内。染色质松散地压缩并由常染色质构成。图1B显示与之相反，Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞表现为异源形态并且较大。它们的平均测量直径为8-10μm，并具有分散的染色质和突出的核仁。

图2描绘了荧光显微图像，描绘了对Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的表达研究的结果并表明Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞是SSEA-1⁺并表达Oct-4和Nanog。如左侧所示，通过FACS分离的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞被评估SSEA-1、Oct-4及Nanog的表达。所有的图像在Plan Apo 60XA/1.40油性物镜(Nikon，Japan)下采集。右侧示出了在ADOBEPHOTOSHOP

CS软件(Adobe SystemIncorporated，San Jose，California，United States of America)中进行的代表性细胞(箭头)的10x放大的图像。阴性染色对照未示出。对从四个独立类别分离的细胞进行染色。示出了代表性数据。

图3A-3C描绘了对Sca-1⁺/lin^-/CD45^-的CXCR4、c-met和LIF-R的表达研究的结果。

图3A描绘了RT-PCR产物在其上分离并用溴化乙锭染色的凝胶的图像，并描绘了Sca-1⁺/lin^-/CD45^-中对于CXCR4(泳道(lane)1)、c-Met(泳道3)和LIF-R(泳道5)的mRNA的表达结果。RT-PCR进行30个循环。阴性RT-PCR反应(DNA代替cDNA：泳道2、4和6)。示出了来自三个独立的类别的代表性结果。图3B描绘了通过FACS分离并通过免疫组织化学染色评估CXCR4、c-Met和LIF-R的表达的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的荧光显微图像(在Plan Apo 60XA/1.40油性物镜(Nikon，Japan)下采集图像)。未示出阴性染色对照。示出了来自四个独立的实验的代表性结果。图3C是描绘了通过包含SDF-1或不包含SDF-1(阴性对照)的MATRIGEL

滴状物的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的化学引诱研究结果。示出了每100μm的MATRIGEL

滴状物周长的化学引诱的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的数量。从三个独立的实验收集数据。^*与对照MATRIGEL

相比p＜0.00001。

图4A和4B描绘了FACS分类从不同年龄的动物分离的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的结果。

图4A是从源自3周大(上侧)和1岁大的小鼠(下侧)的BMMNC分类的细胞的FACS点图。左侧描绘了鼠BMMNC的点图。作为Sca-1⁺/lin^-(中侧)的来自淋巴门(lymphoid gate)的细胞通过对于CD45表达的FACS进行分类(右侧)。进行三个独立的分类实验(对于每类8只小鼠的BM被收集)。示出了代表性类别。图4B是条形图，描绘了在通过FACS分离来自3周大和1岁大的小鼠的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞中PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达，并通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR进行比较。进行四个独立的分类实验(对于每类收集8只小鼠的BM)。数据是平均数±SD。^*p＜0.01 vs.来自年老动物的细胞。

图5是条形图，描绘了来自具有相对长的生命期的小鼠品系(C57BL/6)的细胞数量与具有相对短的生命期的小鼠品系(DBA/2J)的细胞数量的比较结果。所述图示出了与C57BL/6小鼠相比，DBA/2J小鼠中Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的数量减少。通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR比较通过FACS从三周大DBA/2J和C57BL/6小鼠分离的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞中PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达。进行三个独立的分类实验(对于每类6只小鼠的BM被收集)。数据是平均数±SD。^*p＜0.01vs.来自年老DBA/2J小鼠的细胞。

图6A和6B描绘了骨髓单核细胞(BMMNC)的侧群(SP)的分类。

图6A是描绘BMMNC的SP的FACS分类的点图。图6B是条形图，描绘了通过FACS从3周大的小鼠分离的BMMNC、SP、SP Sca-1⁺/lin^-/CD45^-、SP Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺、Sca-1⁺/lin^-/CD45^-和Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞中的PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达，并通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR进行比较。进行三个独立的分类实验(对于每类，8只小鼠的BM被收集)。数据以平均数±SD表示。^*p＜0.01 vs.来自年老动物的细胞。

图7是四个点图，描绘了细胞的多个亚群的移植结果和这些细胞对长期血细胞生成的贡献。Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞对长期血细胞生成没有贡献。Ly5.2小鼠被移植以来自Ly5.1小鼠的10⁴个Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺或2×10⁴个Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞，并且与10⁶个BMMNC Ly5.2细胞一起移植入Ly5.2受体小鼠，在移植后8个月通过FACS评估Ly5.1细胞的存在。上侧描绘了来自外周血的MNC的分析。下侧描绘了来自骨髓的MNC的分析。示出了代表性结果。

图8A和8B描绘了荧光显微图像，描绘了具有对于SSEA-1(图8A；4个图板)或Oct-4(图8B)特异的抗体的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-BM细胞的ES样球体的染色。

图9A和9B描绘了在C2C12细胞上的GFP⁺Sca-1⁺/lin^-/CD45^-BM细胞的胚状体样球体的形成。

图9A描绘了在实施例20所述的条件下，共培养Sca-1⁺/lin^-/CD45^-BM细胞与C2C12细胞后胚状体(EB)-样球体的显微图像。图9B是描绘Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达的荧光显微图像，表明这些胚状体源自从绿色免疫荧光阳性(GFP+)小鼠(购自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，United States of Americ的C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J小鼠)分离的纯化Sca-1⁺/lin^-/CD45^-BM细胞，并且不是C2C12细胞。

图10是从鼠淋巴结分离的碘化丙啶(propidium iodide)染色的细胞、HSC(造血干细胞；Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺)或VSEL干细胞(Sca-1⁺/lin^-/CD45^-)的一系列点图。

图11A-11G是鼠骨髓细胞的FACS分析的系列点图。

图11A是低渗裂解后鼠骨髓MNC的点图。图11B是示出了来自R1门(R1 gate)用于谱系标记物表达和CD45抗原的细胞的染色的点图。在这个图中，R2示出了谱系-和CD45阴性BM MNC。分析来自R1和R2的细胞的Sca-1的表达和HLA-DR(参见图11C)、MHC I类(参见图11D)、CD29(参见图11E)、CD90(参见图11F)及CD105(参见图11G)抗原的共表达。

图12是来自VSEL干细胞衍生的球体(VSEL-DS)的碘化丙啶染色的细胞的系列点图。示出了三个独立的代表性实施例。

图13描绘了对从D3胚胎干细胞(ED-D3；顶侧)形成的胚状体和从VSEL干细胞(底侧)形成的胚状体样球体进行碱性磷酸酶(AP)染色的图。

图14描绘了荧光显微图像，表明VSEL干细胞衍生的胚状体样球体表达早期胚胎发育标记物如SSEA-1、GATA-6、GATA-4、FOXD1及Nanog。

图15描绘了在VSEL干细胞衍生的胚状体样球体中存在的细胞的透射电子显微镜图，表明这些细胞在尺寸上大于它们来源的初始VSEL干细胞(图15，上侧)，但仍具有非常原始的包含常染色质的细胞核。图15的中侧描绘了在用SDF-1、HGF/SF及LIF刺激从VSEL干细胞-衍生的胚状体样球体分离的细胞后MAPKp42/44的磷酸化研究结果，表明相应的受体(分别为SDF-1、HGF/SF及LIF)在这些细胞的表面表达。并且最后，图15的下侧描绘了从来自VSEL干细胞衍生的胚状体样球体的细胞的连续传代分离的细胞的RT-PCR分析结果，其揭示了调节胚状体的原肠胚形成的基因(如GATA-6、Cdx2、Sox2、HNF3及AFP)的mRNA的表达增加。

图16A-16C和图17A-17D描绘了荧光显微镜图像，描绘了ES样球体分化为少突胶质细胞(图16A-16C)或神经元(图17A-17D)。细胞用针对巢蛋白的抗体染色，其利用Alexa Fluor 594-标记的山羊抗-小鼠IgG第二抗体检测，其给予红色荧光。用抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor 488结合物检测细胞中存在的GFP(绿色荧光)，并且细胞核用DAPI染色(蓝色荧光)。

图18A-18C描绘了荧光显微镜图像，描绘了ES样球体分化为表达胰腺细胞的标记物(C-肽)的内胚层细胞。

图19A-19C和20A-20D描绘了荧光显微图像，描绘了ES样球体分化为心肌细胞。这些细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)，表明心肌细胞源于由GFP⁺Sca-1⁺/lin^-/CD45^-BM细胞形成的胚状体。细胞用针对肌钙蛋白I或α横纹肌辅肌动蛋白的抗体染色(分别为图19和20)，其利用Alexa Fluor 594-结合的第二抗体检测，其给予红色荧光。用抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor 488结合物检测细胞中存在的GFP(绿色荧光)，细胞核用DAPI染色(蓝色荧光)。

图21A-21C描绘了对来自单VSEL干细胞衍生的球体的细胞进行RT-PCR的结果，其表明这些细胞可以分化为心肌细胞(中胚层；参见图21A)、神经细胞和少突胶质细胞(外胚层；参见图21B)及胰腺或肝细胞(内胚层；参见图21C)。

图22A-22I描绘了表明培养的细胞中心脏-特异性抗原的表达的免疫荧光和透射共聚焦显微镜照片。

图22A-22C和22D-22F描绘了其中Sca-1⁺/lin^-/CD45^-BMMNC被培养的培养板的图像。具有Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的板中的许多细胞对于心脏-特异的肌球蛋白重链是阳性的(图22B、22C、22E及22F；绿色荧光)。这些心脏-特异性肌球蛋白重链-阳性的细胞中的许多对于心脏肌钙蛋白I也是阳性的(图22D和22F[箭头]；红色荧光)。图22G-22I是其中Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞被培养的培养板的图像。这些细胞对于前述心脏-特异性抗原的表达基本上是阴性的(参见图22H)。通过DAPI染色鉴定图22A-22I中的每个的细胞核(蓝色荧光)。比例尺＝20μm。

图23描绘了Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的FACS分类结果，表明能够被分类的这些细胞的产量随着供体动物的年龄而降低。

图24是描绘作为年龄的函数的小鼠骨髓中存在的VSEL干细胞(左侧)和HSC(右侧)的百分数的两幅图。

图25是两幅图，描绘了从较老的小鼠分离的VSEL干细胞形成胚状体样球体的能力下降(左侧)以及根据小鼠(细胞从其分离)的年龄的VSEL干细胞的培养物中CD45⁺细胞的百分数增加(右侧)。

图26为从5周大的小鼠(左侧)与2.5岁大的小鼠(右侧)分离的VSEL干细胞的不同表达模式。在左侧中，示出了免疫荧光和透射共聚焦显微镜图像，表明来自5周大的小鼠的培养的细胞中不同造血抗原的表达。在右侧中，示出了在从2.5岁大的小鼠分离的VSEL干细胞中，CD45被表达并且所述细胞能够在甲基纤维素培养基中的第二培养基中生长造血集落。

图27A-27B描绘了人类脐带血的FACS分类结果。

图27A示出了人类CB包含表达CXCR4(0.037±0.02％，n＝9)、CD34(0.118±0.028％，n＝5)及CD133(0.018±0.008％，n＝5)的lin^-/CD45^-MNC群。图27B表明这些CXCR4⁺/CD133⁺/CD34⁺/lin^-/CD45^-细胞非常小(约3-5μm；图27B，上侧)，而CB-来源的lin^-/CD45⁺造血细胞较大(＞6μm；图27B，下侧)。

图28A-28C描绘了对来自人类脐带血的分类的细胞的基因表达研究结果。

图28A和286是条形图，显示通过FACS分类的CB-来源的CXCR4⁺/CD133⁺/CD34⁺/lin^-/CD45^-细胞、以及CXCR4⁺/lin^-/CD45^-、CD34⁺/lin^-/CD45^-、以及CD133⁺/lin^-/CD45^-/细胞高度富集由多能胚胎细胞表达的转录因子如Oct-4和Nanog的mRNA。图28C示出了确认FACS分析的RT-PCR结果。

图29描绘了CB-VSEL干细胞的免疫荧光染色结果，表明高度纯化的CB-来源的CXCR4⁺/lin^-/CD45^-细胞在它们的表面上表达SSEA-4并且在细胞核内表达Oct-4和Nanog转录因子。

图30描绘了三种不同的CB-VSEL干细胞的光学显微图片，表明这些细胞非常小～3-5μm，并包含相对大的细胞核和具有许多线粒体的细胞质的窄缘。这些细胞的细胞核中的DNA包含作为多能胚胎干细胞的特征的开放型常染色质。

图31A-31C描绘了光学显微图片，表明来源于GFP⁺小鼠的VSEL干细胞-DS如果被平铺在补充有IL-3+GM-CSF的甲基纤维素培养基中可以形成小的第二球体(图31A和31B)。通过从初始甲基纤维素培养基的甲基纤维素溶解回收的这些第二球体制备的单细胞悬浮液，如果再次平铺在甲基纤维素培养基(图31B)或血浆凝块(图31C)中并由IL-3和GM-CSF刺激，形成造血集落。这些为造血集落的证据通过FACS分析来自甲基纤维素中生长的溶解集落的细胞的CD45表达或通过免疫荧光染色来自血浆凝块培养基中生长的集落的细胞的CD45而获得。

图32是用于从人类脐带血分离VSEL干细胞的基于FACS的策略的略图。

图33.流式细胞术分离源自骨髓的Sca-1+/Lin-/CD45+造血干细胞和Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL。代表性的点图显示了来自淋巴门(A)(基于Sca-1(FITC)和谱系标记物(PE)(C)以及CD45(APC)的表达)的小细胞的分类。图板D显示了区域3(R3)含有Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL而区域4(R4)含有Sca-1+/lin-/CD45+细胞。通过将BMC的分类与具有已知直径的珠子的分类作比较，图板B中的FSC轴确认了图板A中的感兴趣区域中的细胞的非常小的尺寸(2-10μ)。如(R3)所示，总BMC中只有0.02％是VSEL。FSC，前向分散特征；SSC，侧向分散特征。

图34.心肌梗塞尺寸。从小组I-III中的Masson三色染色心脏检测的心机梗塞面积分数([梗塞面积/LV面积]x100)，三个小组分别经载体、CD45+造血干细胞和VSEL处理。○，个体小鼠；●，平均数±SEM。

图35.超声心动描记术检测LV的功能。冠状动脉闭塞/重灌注后35天以载体处理(A、B)、CD45+细胞处理(C、D)和VSEL处理(E、F)的小鼠的代表性的二维(A、C、E)和M-模式(B、D、F)图像。箭头代表梗塞壁(A、C、E)。与载体处理和CD45+细胞处理的心脏相比，VSEL处理的心脏显示出较小的LV腔，较厚的梗塞壁和改善的梗塞壁运动。图板G-J证明VSEL的移植改善了MI之后35天LV心脏收缩功能的超声心动描记术检测。数据为平均数±SEM。n＝11-14只小鼠/组。^*P＜0.05 vs.第35天时的小组II；^#P＜0.05 vs.第35天时的小组I；^§P＜0.05 vs.各个小组在96小时之时的数值。

图36.LV重塑的形态测量学检测。来自于载体处理(A)、CD45+造血干细胞处理(B)和VSEL处理(C)的心脏的代表性Masson三色染色心肌部分。分别以蓝色和红色鉴别出结痂组织和有活力的(viable)心肌层。注意：在VSEL处理的心脏中LV腔较小，梗塞壁较厚。图板D-H显示了LV结构参数的形态测量学检测。数据为平均数±SEM。n＝11-14只小鼠/组。^*P＜0.05 vs.小组II。

图37.心肌细胞和左心室肥大的检测。图板A-C显示了来自Masson三色染色的经载体处理(A)、CD45+造血干细胞处理(B)和VSEL处理(C)的心脏的有活力的心肌层中的心肌细胞的代表性图像。比例尺＝50pm。与CD45+造血干细胞处理的心脏不同，VSEL处理的心脏未显示出增加的肌细胞剖面面积(与非梗塞对照心脏(D)相比)。超声心动描记术估计的LV质量在VSEL处理的心脏(E)中显著较低。数据为平均数±SEM。n＝11-14只小鼠/组。D：^*P＜0.05 vs.小组II；^#P＜0.05 vs.对照；E：^*P＜0.05 vs.小组II和III(最终的)；^#P＜0.05 vs各个基线值。

图38.VSEL移植和心肌细胞再生。通过EGFP(B、D，绿色)和α-横纹肌(sarcomeric)辅肌动蛋白(C、D，红色)分别鉴别VSEL和肌细胞；图板D显示了合并区域。显示了对EGFP(箭头，B，绿色)和α-横纹肌辅肌动蛋白(箭头，C，红色)均为阳性的两个肌细胞。细胞核以DAPI染色(A、D，蓝色)。比例尺＝40μm。

图39.梗塞区域中的肌细胞面积分数的测定。图板A-C显示了Masson三色染色的经载体处理(A)、CD45+造血干细胞处理(B)和VSEL处理(C)的心脏的结痂的代表性例子。放大倍率x600。图板D中显示了定量数据。数据为平均数±SEM。n＝11-14只小鼠/组。D：^*P＜0.05 vs.小组II。

图40.外周血(PB)中循环的VSEL的流式细胞术分析。在急性MI之后24小时、48小时和7天；在假性手术(假性对照)之后24小时；以及从未经处理的小鼠(对照)，收集PB样品。使用Sca-1、谱系标记物和CD45将PB白细胞(PBL)的全部群体染色。在点图中显示PBL，代表它们的前向(FSC)vs.侧向分散特征(SSC)，分别与细胞内容物的大小和粒度/复杂度相关。区域R1(图板A)中包括了无粒的、小的(大小为2-10μm)事件，其包括VSEL群体。进一步分析来自区域R1的细胞的Sca-1和谱系标记物(Lin)的表达，在区域R2(图板B)中只包括Sca-1+/Lin事件。然后基于CD45的表达分析来自区域R2的细胞，将CD45-和CD45+亚群体显示于柱状图(图板C，分别为区域R3和R4)。百分率显示了每个亚群体在总PBL中所占的平均含量。根据FSC，图板D分别显示了区域R5和R6中Sca-1+/Lin-/CD45-细胞(VSEL)和Sca-1+/Lin-/CD45+细胞(HSC)的大小。红色圆圈代表每个亚群体中细胞的主要定位。

图41.急性MI之后VSEL运动的时间过程。显示了MI之后24小时、48小时和7天，未处理的(对照)、假性操作(假性对照)和梗塞小鼠的每微升血液中循环的Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL的绝对数目。图板A和B分别代表从6周龄和15周龄小鼠获得的数据。绝对数目是基于VSEL占外周血中PBL和总白细胞计数的百分含量计算的。数据为平均数±SEM。●，平均数；○，个体小鼠；^*P＜0.0025 vs.对照以及假性对照。

图42.急性MI之后HSC运动的时间过程。图形显示了MI之后24小时、48小时和7天，未处理的(对照)、假性操作(假性对照)和梗塞小鼠的每微升血液中循环的Sca-1+/Lin-/CD45+HSC的绝对数目。图板A和B分别代表从6周龄和15周龄小鼠获得的数据。绝对数目是基于HSC占PBL和总白细胞计数的百分含量计算的。数据为平均数±SEM。●，平均数；○，个体小鼠；^*P＜0.0025 vs.各个年龄小组中的对照以及假性对照。

图43.来自急性MI之后的6周龄和15周龄小鼠(分别为图板A和B)的源自外周血的细胞中多能标记物(Oct-4、Nanog、Rex1、Rif1、Dppa1)和造血干细胞标记物(Scl)的mRNA水平。将从每个实验小组的动物血液中收集的细胞汇集在一起以获得每个时间点的平均mRNA含量。对于所有的样品进行一式三份qRT-PCR。将mRNA含量的倍数增加与对照进行比较。基于三次反应计算平均值。数据显示为平均数±SEM。PSC，多能干细胞。

图44.源自外周血(PB)的VSEL中的Oct-4的表达。MI之后24小时从PB分离的运动的VSEL(下端图板)和HSC(上端图板)的代表性的共焦显微镜图像。通过FACS分离Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL和Sca-1+/Lin-/CD45+HSC然后进行免疫染色。上端图板显示了Sca-1+/Lin-/CD45+细胞(HSC)，其对于CD45(FITC，绿色荧光，造血细胞标记物)是阳性的，对于Oct-4(TRITC，红色荧光)是阴性的。下端图板显示了Sca-1+/Lin-/CD45-细胞(VSEL)，其对于CD45是阴性的，对于Oct-4(多能细胞标记物)是阳性的。细胞核以DAPI染色(蓝色荧光)。Tr，透射图像。

图45.实验方案。使用了三组WT小鼠(小组I-III，n＝11-14/组)。在基线超声波心动描记术四天之后，小鼠进行30分钟的冠状动脉闭塞，然后进行重灌注。MI之后48小时，小鼠接受心肌内注射载体(小组I)、Sca-1+/Lin-/CD45+造血干细胞(小组II)或Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL(小组III)。在细胞移植后48小时和MI之后35天重复超声波心动描记术。在MI之后35天，处死小鼠以进行形态测量学和组织学研究。

图46.LV重塑的超声心动描记术检测。图板A和B显示了LV尺寸的超声心动描记术测量。数据为平均数±SEM。n＝11-14只小鼠/组。

图47.心肌毛细血管密度的定量测定。梗塞边界区域(A)和非缺血区域(B)中的心肌毛细血管密度。在载体处理的、CD45+造血干细胞处理的和VSEL处理的心脏之间没有显著性差异。数据为平均数±SEM。n＝11-14只小鼠/组。

图48A-B.图板A-除掉RBC以获得TNC或MNC成分(fraction)的实验程序。通过FACS(荧光激活的细胞分选)对CB-VSEL进行计数。图板B-代表性的设门策略，以对CB-VSEL和造血干细胞(HSC)进行流式细胞术分析和FACS分选。百分率显示了两种细胞成分中的CB-VSEL和HSC的平均含量(平均值±SEM)。

图49.通过ImageStream系统获得的源自CB的VSEL和HSC的图像。每幅照片显示了细胞的亮视野图像，以7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色后的细胞核图像，以及与下列表面标志物的表达相关的图像：Lin(绿色)、CD45(橙色)和CD133(AC133；黄色)。比例尺表示10μm。

图50A-B.图板A-相对于新鲜的CB样品，以两种RBC消除程序进行分离之后，从1毫升CB获得的总细胞数目。图板B-可以从分离自1毫升CB的TNC(RBC裂解后)和MNC(以Ficoll-Paque分离后)获得的CB-VSEL和HSC的绝对数目。数值显示为平均值±SEM(P＜0.05；N＝5)。

图51.通过ImageStream系统获得的CB-VSEL和HCS的形态学特征，包括大小和N/C比率。细胞的大小计算为基于细胞的亮视野图像的较短细胞轴的长度，N/C比率显示为细胞质和细胞核面积之比，它们分别是基于亮视野和细胞核图像计算的。数字表示每个参数的平均值(平均值±SEM)。

图52A-B.图板A和B显示了从CB单元(通过用于储存的常规程序制备并在其解冻之后)回收的CB-VSEL和HSC。数值表示从处理1毫升CB获得的两个群体的平均绝对数目(x103)(平均值±SEM；N＝5；当与新鲜CB比较时，P＜0.05)。置于柱形图内的百分率是存在于最初的新鲜CB样品中的CB-VSEL和HSC的最初数目的回收百分率。

图53A-D.图板A-D显示了CD133+/Lin^-/CD45^-CB-VSEL的原始亚群的百分含量和形态学特征，所述亚群的特征在于共表达CD34、Oct-4和SSEA-4抗原。数值表示通过ImageStream系统从10次独立实验计算的平均数(平均值±SEM)。

图54.由ImageStream系统获得的CB-VSEL亚群的代表性图像。每幅照片显示了细胞的亮视野图像，以7-AAD染色后的细胞核图像，以及表面和核内标志物的表达。比例尺表示10μm。

图55A-C.Annexin V(AnV)在CB-VSEL和HSC上的结合，这是由于RBC裂解过程中释放的微囊泡转移磷脂酰丝氨酸。图板A-在RBC裂解之前和之后，CB-VSEL和HSC中的AnV+细胞的含量。图板B-在RBC裂解之前和之后，AnV+细胞成分中血型糖蛋白A+(GlyA+)细胞的含量。图板C-RBC裂解之后分选的CD34+/AnV+/GlyA+的纯化的成分的集落生成潜力与通过Ficoll-Paque分离的CD34+细胞的对比。数字代表平均值(平均值±SEM)。

图56A-G.通过FACS分选源自人类UCB衍生的VSEL的设门策略。通过FACS从人类UCB有核细胞(UCB-nucleated cells)的总成分(TNC)中分离UCB-VSEL。图板A：标准直径为1、2、4、6、10和15μm的预先确定大小的珠子颗粒。区域R2包括直径介于2μm的所有物体。图板B：通过显示FSC vs.SSC信号的点图显示源自UCB的TNC。图板C和D：来自区域R1的细胞，分别就造血Lin标志物表达以及它们的存活性(通过7-AAD)对其进行分析。图板E：基于CD34和CD45抗原表达显示源自包括区域R2和R3的门的Lin^-存活事件。包括并从区域R4分选CD133⁺/Lin^-/CD45^-CB-VSEL的群体。图板F：新鲜分选的UCB-VSEL的纯度和存活性分析。图板G：固定并以7-AAD重新染色细胞之后，分选的UCB-VSEL成分中的有核细胞的含量分析。在区域R6中显示了7-AAD+有核的UCB-VSEL。百分率显示了总UCB-有核细胞中指明的细胞亚群的平均含量。

图57A-D.通过ISS获得的UCB-VSEL和HSPC的代表性图像。图中显示了UCB-VSEL及其造血对应物的形态学特征的比较，包括它们的大小和标志物表达。图板A：用作大小标志物的预先确定大小的珠子的亮视野图像。图板B、C和D分别是表达CD34、CD133+和CXCR4抗原的UCB-VSEL和HSPC的多通道图像。每幅照片显示了细胞的亮视野图像，与指明的表面标志物的表达相关的荧光图像，以及以7-AAD染色后的细胞核图像。在每个图板中，造血Lin标志物和CD45的表达分别显示为绿色(Lin；FITC)和橙色(PE)，而CD34、CD133或CXCR4的表达显示为黄色(PE-Cy5)。所有的图像均以相同的放大倍数显示。比例尺表示10μm。数值反映了每个群体的平均大小(平均值±SEM)，其由IDEAS软件根据较短的细胞轴的长度计算。

图58A-F.UCB-VSEL的原始亚群的含量和形态学的ISS分析。图板A-D显示了ISS中UCB-VSEL的含量的分析。在分析之前将细胞固定并以7-AAD染色。图板A：根据形态学参数(包括细胞核的面积和亮视野的长宽比)显示所分析的物体。基于亮视野计算长宽比，其为较短的细胞轴(宽度)与较长的轴(高度)之比。圆的、非长形的细胞具有接近1.0的长宽比，而长形的细胞或细胞块(clumps)具有较低的长宽比。包括了圆的、含有DNA的单个细胞以进行进一步分析(区域R1)。图板B：基于CD45和造血Lin标志物的表达在直方图中显示来自区域R1的物体。在区域R2中包括Lin^-/CD45^-的物体。图板C：根据Oct-4的核内表达和CD133抗原的表面表达分析来自区域R2的非造血成分。在区域R3中包括了具有两种标志物的共表达的物体，其代表UCB-VSEL含量。图板D：根据由IDEAS软件计算的大小(计算为较短的细胞轴的长度)显示来自区域R3的UCB-VSEL。在点图中标出了UCB-VSEL中的小于6和8μm的细胞的平均含量。所有图板上的百分率表示每个区域中指明的成分占总UCB细胞的含量(平均值±SEM)。图板E-F：表格和图形显示了UCB-VSEL亚群(根据表面存在CD34和SSEA-4抗原以及Oct-4的细胞核表达来区分)的含量和形态学特征，例如大小、N/C比率和小于6μm的细胞的含量。平均值表示为平均值±SEM。代表性图像显示了共表达CD133和Oct-4抗原的细胞。

图59A-E.RBC裂解和在Ficoll-Paque上离心后获得的细胞成分中的UCB-VSEL和HSPC回收和基因表达的分析。图板A-B分别是以1xBDPharmLyse缓冲液裂解RBC后获得的TNC成分和Ficoll-Paque分离后获得的MNC的成分中UCB-VSEL的含量分析。两个细胞成分均就Lin标志物(FITC)、CD45(PE)以及原始SC的标志物之一，例如CD34、CD133或CXCR4(APC)进行染色。图板A和B显示了根据CD45和指明的原始细胞标志物的表达而源自两种细胞成分的Lin-细胞。区域R5中显示了UCB-VSEL，区域R4中显示了其造血对应物。百分率表示每个成分的细胞中的亚群的平均含量(平均值±SEM)。图板C-D：通过在低渗溶液中裂解RBC或通过在Ficoll-Paque梯度上离心而从1毫升UCB中分离的UCB-VSEL和HSPC的绝对数目。数值表示来自5次独立实验的平均数(平均值±SEM)。相对于在裂解RBC后获得的TNC，P＜0.05被认为是统计学上显著的(#)。图板E：裂解RBC和在Ficoll-Paque上离心后分别获得的TNC和MNC成分中与多能性相关的基因(Oct-4和Nanog)和与组织定向相关的基因(Nkx2.5/Csx、GATA-4和VE-钙粘蛋白)的表达。数据显示为所分析的成分与总CB细胞之间的平均(平均值±SEM)倍数差异。与总的未纯化的UCB细胞相比，P＜0.05被认为是统计学上显著的(^*)。

图60A-B.以用于临床应用的AXP^TM AutoXpress平台处理UCB单元之后的UCB-VSEL和HSPC的回收。图板A：可以从1毫升UCB中回收的总的CD34+细胞以及具有CD34表达的UCB-VSEL和HSPC的绝对数目。在下列新鲜的和经处理的UCB样品中分析回收情况：i)完全未经处理的UCB(灰色条柱)；ii)体积耗竭(volume depletion)之后获得的UCB的新鲜浓缩物(黑色条柱)；和iii)经历冷冻/解冻程序之后的UCB的浓缩物(阴影条柱)。平均值表示为平均值±SEM。与完全未经处理的UCB相比，P＜0.05被认为是统计学上显著的(^*)。图板B：在每个UCB处理步骤中从1毫升UCB中回收的表达CD133抗原的HSPC的绝对数目的类似分析。平均值表示为平均值±SEM。与完全未经处理的UCB相比，P＜0.05被认为是统计学上显著的(^*)。

图61A-B.以多种策略处理UCB之后的UCB-VSEL和HSPC的回收。图板A：从1毫升完全/未经处理的UCB(白色条柱)以及从1毫升经过以下处理的UCB回收的UCB-VSEL的绝对数目：i)裂解RBC(灰色条柱)；ii)在Ficoll-Paque梯度上离心(阴影条柱)；和iii)双步骤处理，包括CD133+的免疫磁性分离，然后进行FACS。图板B：从1毫升UCB(按照对于UCB-VSEL回收的描述进行处理)回收的HSC的绝对数目。平均值表示为平均值±SEM。与完全未经处理的UCB相比，P＜0.05被认为是统计学上显著的(^*)。

图62.通过ISS获得的代表多能性UCB-VSEL亚群的细胞的图像。图中显示了表达CD34抗原和多能性标志物Oct-4和SSEA-4的UCB-VSEL的代表性图像。每幅照片由亮视野图像和与细胞核图像(7-AAD；红色)和Lin标志物和CD45(FITC；绿色)、Oct-4或SSEA-4(PE；黄色)和CD34或CD133(PE，黄色或PE-Cy5，红紫色)的表达(如每幅照片上所示)相关的单独的荧光图像组成。组合照片显示了细胞核(7-AAD)和指明的标志物的复合。数值显示了所示细胞的直径。比例尺表示10μm。

图63A-B.含有UCB-VSEL的UCB亚群的绝对数目。图板A：表达CD34、CD133和CXCR4抗原的UCB的非造血成分的含量，其富含UCB-VSEL。图板B：表达CD34抗原以及PSC的标志物(0ct-4和SSEA-4)的UCB-VSEL的亚群的含量。数值表示可以从1毫升UCB中分离的细胞的平均绝对数目(平均值±SEM)。

图64A-D.通过FACS分选VSEL的设门策略。通过FACS从免疫荧光染色的鼠BM有核细胞分离源自BM的VSEL。图板A：与具有1、2、4、6、10和15μm的标准直径的6种大小不同的珠子颗粒(Flow Cytometry Sizebeads，Invitrogen；Molecular Probes，Carlsbad，Calif.，USA)比较之后，在门R1中包括了介于2-10μm的无颗粒的(agranular)小的事件。图板B：通过显示正向分散(FSC)相对于侧向分散(SSC)信号(它们分别与细胞的大小和粒度/复杂性相关)的点图显示BM有核细胞。图板D：就Sca-1和Lin的表达进一步分析来自区域R1的细胞，仅将Sca-1⁺/Lin^-的事件包括在区域R2中。基于CD45标志物的表达，进一步将来自区域R2的群体分选进入CD45^-和CD45⁺亚群，显示于直方图中(图板C，分别为区域R3和R4)。Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞(VSEL)分选为包括在包含区域R1、R2和R3的逻辑门中的事件，而Sca-1⁺/Lin/CD45⁺细胞(HSC)来自包括区域R1、R2和R4的门。百分率显示了总的BM有核细胞中每个细胞亚群的平均含量(±SEM)。

图65A-D.源自胸腺的VSEL的ImageStream系统分析。图中显示了就Sea-1、CD45和造血谱系标志物(Lin)染色之后，从胸腺分离的细胞的完整群体的分析。图板A显示了根据形态学参数(包括细胞核的面积和亮视野的长宽比)所获取的所有物体。基于每个细胞的亮视野图像计算长宽比，其为较短的细胞轴(宽度)与较长的轴(高度)的比。圆的、非长形的(non-elongated)细胞具有接近1.0的长宽比，而长形的细胞或细胞块具有小于1.0的长宽比。在区域R1中包括了圆的、含有DNA的单个细胞以进行进一步分析。随后，基于Lin(图板B)和CD45(图板D)的表达在直方图中显示来自区域R1的物体。来自包括区域R2和R3的逻辑门的Lin^-/CD45^-物体显示于点图中，其中显示了它们的侧向分散特征和Sca-1表达(图板C)。区域R4中包括了Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞。Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞在源自胸腺的总细胞中的百分含量显示为平均值±SEM。

图66A-B.通过ISS获得的鼠VSEL、HSC、红细胞和血小板之间的形态学比较。图板A显示了就Sca-1(FITC，绿色)、Lin(PE，橙色)和CD45(PE-Cy5，红紫色)染色的鼠VSEL以及就Ter119(PE，橙色)和CD41(FITC，绿色)染色的源自血液的红细胞和血小板。在固定之后，所有的样品以7-AAD(红色)进行染色以显示细胞核。红细胞和血小板没有细胞核，而VSEL显示出含有细胞核的细胞结构。显示了每个群体的平均大小(平均值±SEM)。比例尺表示10μm。图板B显示了当与相同级别的大小预先确定的珠子相比较时，来自所有3个群体的细胞(VSEL、RBC和血小板)。

图67A-D.以ImageStream系统检测到的人工假象。图板A显示了就Sea-1染色为阳性的正常的有核的Lin^-/CD45^-细胞。在下面的图板上显示了假“阳性”的人工假象的选择的图像(图板B)，被破坏的、降解的细胞(图板C)和细胞碎片(图板D)。每幅照片显示了亮视野图像以及与细胞核图像(7-AAD；红色)和Sca-1(FITC；绿色)、Lin(PE；橙色)和CD45(PE-Cy5；黄色)的表达相关的单独的荧光图像。比例尺表示10μm。

图68.通过ISS在鼠组织中分析的Oct-4⁺/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞的图像。图中显示了在骨髓、肺、脑、肾、胰腺和骨骼肌检测的此类细胞的代表性图像。就多能性标志物Oct-4(FITC；绿色)、CD45和Lin(PE；橙色)以及Sca-1(PECy5；红紫色)染色分离自器官的细胞。以7-AAD(红色)染色细胞以显示细胞核，并通过ISS分析以检测Oct-4的核内表达，如在放大的组合的图像中所示。比例尺表示10μm。

图69A-B.存在于鼠器官中的Oct-4⁺/Sca-1^-/Lin^-/CD45^-细胞的绝对数目。图板A显示了通过使用由ISS获得的百分含量和分离自每种器官的总细胞数而计算的每个器官中Oct-4⁺VSEL的含量[x103]。数值表示为平均值±SEM。图板B显示了所分析的所有器官中Oct-4⁺VSEL的总数目的百分率分布的估计。数值显示为平均值±SEM。

图70.在成体器官中检测到的Oct-4⁺VSEL的共聚焦显微镜图像。图中显示了在骨髓、脑和肾中检测到的Oct-4⁺VSEL的代表性图像。就Oct-4(TRITC；红色)、CD45(Cy5；红紫色)和Sca-1(FITC；绿色)染色分选的Sca-1⁺Lin^-/CD45^-细胞。细胞核以DAPI(蓝色)进行染色。图像显示了对CD45为阴性而对Oct-4(其为多能性细胞的标志物)和Sea-1为阳性的Oct-4⁺/Sca-1⁺Lin^-/CD45^-细胞(VSEL)。合并的图像显示了Oct-4的核内染色以及Sca-1抗原的表面存在。比例尺表示5μm。

序列表的简单描述

SEQ ID Nos：1-64是可以用于扩增多个鼠核酸序列的32个引物对的核苷酸序列，总结于表1中。

表1

用于实时RT-PCR的鼠引物的序列

SEQ ID Nos：65-80是可以用于扩增多种人类核酸序列的8个引物对的核苷酸序列，总结于表2中。

表2

用于实时RT-PCR的人类引物的序列

发明详述

本主题现在将参照所附的实施例在下文中更充分地描述，其中示出了当前披露的主题的代表性实施方式。然而，当前披露的主题可以体现在不同的形式中并且不应当被视为限制本文阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式以便这个披露将是彻底和完全的，并且将向本领域技术人员充分传达当前披露的主题的范围。

I.总则

从相对容易地可获得的来源如骨髓(BM)、流动的外周血(mPB)、或脐带血(CB)分离的造血干细胞(HSC)可以随后用作各种固体器官(如心、脑、肝或胰腺)的再生必须的其它干细胞的前体，这个概念造成了科学界的兴奋。已经假定HSC具有胚层-非限制性的可塑性并且可以转分化为来自所有非-造血谱系的干细胞。遗憾的是，第一个有希望的报道表明“HSC”对不同组织再生的巨大贡献没有被其它研究人员再现。

响应于此，科学界在对于干细胞可塑性的观点方面变得极化。已经提议了先前报道的数据的许多可选解释。迅速被接受的第一概念是通过细胞融合现象解释干细胞的可塑性。提出了数据，即，供体-来源的HSC和/或单核细胞可以与受者组织中存在的分化细胞融合，导致在它们的细胞核中具有双倍数量的染色体并表达源自两个“亲代”细胞的细胞表面和细胞质标记物的融合细胞的形成。

干细胞可塑性的另一解释是基于暴露于外部刺激(如，器官损伤、非生理的培养条件、和/或其它应激)的细胞中的外遗传改变的出现。然而，细胞融合和外遗传改变均极罕见，随机存在事件似乎不能充分解释先前公布的阳性“转-去分化”数据。此外，在许多最近公布的研究中，融合被排除作为对观察到的供体来源的嵌合性的主要贡献者。

BM可能包含异质干细胞群的概念令人吃惊地不被认为是涉及干细胞可塑性的讨论的一部分。本文披露的是BM干细胞是异质的并被预期为多能性的直接证据。已经显示BM包含内皮-、骨-、骨骼肌-、心-、肝-、和神经-组织定向干细胞。

然而，这些潜在候选细胞还没有在单细胞水平被很好的表征。如本文披露的，鼠骨髓(BM)包含表达非造血干细胞的标记物的稀有(BMMNC的～0.02％)Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞群。更重要地，这些稀有细胞在体外培养中能够分化为心肌细胞、胰腺细胞并生长神经球(neurospheres)。这些Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞具有未分化的胚胎样干细胞的形态并表达未分化的胚胎样干细胞的多个标记物。

本文披露的是从鼠骨髓(BM)鉴定和纯化稀有CD34⁺/lin^-/CD45^-(人类)或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-(小鼠)细胞的亚群，在本文中称为“非常小的胚胎样(VSEL)干细胞”。除了为Sca-1⁺/lin^-/CD45^-或CD34⁺/lin^-/CD45^-，VSEL干细胞还表达多能干细胞(PSC)的标记物，如SSEA-1、Oct-4、Nanog及Rex-1。直接电子显微镜分析表明VSEL干细胞较小(约3-4μm)，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核，并包含开放型染色质(常染色质)，其为典型的胚胎干细胞。VSEL干细胞的数量在来自年轻(～1月大)小鼠的BM中最多，并随着年龄减少。与长寿命的C57BL/6动物相比，它在短寿命的DBA/2J小鼠中也显著减少。VSEL干细胞在体外强烈地响应于SDF-1、HGF/SF及LIF，并表达CXCR4、c-met及LIF-R。这个表达多能-和组织定向干细胞标记物的VSEL干细胞群可以为用于组织和/或器官再生的多能干细胞的来源。

II.定义

本文所用的所有技术和科学术语，除非下面另外定义，意图具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。本文所用的技术参考文献意图涉及本领域通常理解的技术，包括对于本领域技术人员显而易见的那些技术的变体或等效技术的替换。虽然相信下面的术语可以被本领域普通技术人员很好的理解，但是陈述下面的定义以促进当前披露的主题的解释。

根据长期存在的专利法惯例，术语“一”、“一个”及“该(这)”用在这个申请(包括权利要求书)中时意味着“一个或更多个”。因此，短语“一个干细胞”指的是一个或更多个干细胞，除非上下文清楚地表明其它含义。

本文所用的术语“靶组织”和“靶器官”指的是VSEL干细胞和/或体外分化的VSEL干细胞衍生物在给予受试者后聚集的预定位点。例如，在一些实施方式中，当前披露的主题的方法涉及已经被例如缺血或其它损害损伤的靶组织或靶器官。

本文所用的术语“对照组织”指的是怀疑基本上缺乏给予的细胞的聚集的位点。例如，根据当前披露的主题的方法，未被损害或损伤的组织或器官是代表性的对照组织，其是不同于预定靶组织的组织或器官。例如，如果要被治疗的损伤是心肌梗塞，那么预定的靶组织将是心脏，受试者中基本上所有其它组织和器官可以被认为是对照组织。

本文所用的术语“靶向”(targeting)和“自动导向”(homing)用于描述细胞(例如，VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物)在给予受试者后的体内活性，指的是与对照组织相比细胞在靶组织中的优先迁移和/或聚集。

本文所用的术语“选择性靶向”和“选择性自动导向”指的是细胞(例如，VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物)的优先定位，其导致给予的VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在靶组织中的聚集，在一些实施方式中，其是给予的VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在对照组织中的聚集的约2倍，在一些实施方式中，其是给予的VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在对照组织中的聚集的约2倍，在一些实施方式中，给予的VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物的聚集是对照组织中的约5倍或更多，在一些实施方式中，给予的VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物的聚集是对照组织中的约10倍或更多。术语“选择性靶向”或“选择性自动导向”还指的是VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在靶组织中的聚集，伴随在对照组织中的聚集的缺乏，在一些实施方式中，伴随在所有对照组织中的聚集的缺乏。

术语“靶向的缺乏”在本文中用于描述在其中聚集如果存在将是可检测的条件下，基本上没有VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在一个或更多个对照组织中的结合或聚集。所述短语还意图包括在这样的条件下，VSEL干细胞和/或其体外分化的VSEL干细胞衍生物在一个或更多个对照组织中最小的、背景聚集。

本文所用的术语“受试者”(subject)指的是任何无脊椎动物或脊椎动物物种的成员。因此，术语“受试者”意图包括动物界的任何成员，包括而不限于脊索动物门(即Osteichythyes(多骨鱼)、Amphibia(两栖类)、Reptilia(爬行类)、Aves(鸟类)及Mammalia(哺乳类)纲的成员)，以及其中包括的所有目和科。

类似地，本文披露的所有基因、基因名称、和基因产物意图相应于来自任何物种(对于其本文披露的组合物和方法是可用的)的同源物。因此，所述术语包括而不限于来自人类和小鼠的基因和基因产物。可以理解当来自特定物种的基因或基因产物被披露时，这个披露仅是示意性的，而不被解释为限制，除非其中它出现的上下文清楚地表示。因此，例如，对于表1和2(其分别披露了对于鼠和人类核酸序列的GENBANK

登记号)中列出的基因，意图包括来自其它动物的同源基因和基因产物，所述其它动物包括而不限于其它哺乳动物、鱼、两栖动物、爬行动物及鸟类。

当前披露的主题的方法尤其用于温血脊椎动物。因此，当前披露的主题涉及哺乳动物和鸟类。更具体地预期是分离、处理及利用来自下述哺乳动物的VSEL干细胞，所述哺乳动物如人类和其它灵长类动物，以及由于濒临绝种而重要的那些哺乳动物(如西伯利亚虎)、对于人类经济上重要的那些哺乳动物(农场饲养用于人类消费的动物)和/或社会上重要的那些哺乳动物(作为宠物或在动物园中保留的动物)，例如除了人类外的食肉类(如猫和狗)、猪(swine)(猪(pig)、肉猪(hog)及野猪)、反刍类(如畜牛(cattle)、牛、羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛及骆驼)、啮齿类(如小鼠、大鼠、和兔)、有袋类、以及马。还提供了所披露的方法和组合物对于鸟类的应用，包括处于危险中、置于动物园中、以及禽类的那些种类的鸟类，更具体地为驯养的禽类，如家禽，如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，因为它们对于人类也是经济上重要的。因此，还预期的是来自牲畜的VSEL干细胞的分离、处理及应用，所述牲畜包括而不限于驯养的猪(swine)(猪(pig)和肉猪(hog))、反刍动物、马、家禽等。

本文所用的术语“约”在涉及可测量值如重量、时间、剂量等的量时，意味着包括在一些实施方式中偏离特定量±20％的变化、在一些实施方式中偏离特定量±10％的变化、在一些实施方式中偏离特定量±5％的变化、在一些实施方式中偏离特定量±1％的变化、在一些实施方式中偏离特定量±0.1％的变化，因为这样的变化适于进行所披露的方法。

术语“分离的”在核酸或多肽(包括，例如，肽)的上下文中使用时，表明所述核酸或多肽远离它的天然环境而存在。分离的核酸或多肽可以以纯化形式存在或者可以存在于非天然环境中。

术语“核酸分子”和“核酸”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其聚合物。除非明确地限制，所述术语包括包含具有与参考天然核酸类似的性质的天然核酸的已知类似物的核酸。术语“核酸分子”和“核酸”也可以用于替换“基因”、“cDNA”及“mRNA”。核酸可以被合成，或者可以源于任何生物来源，包括任何有机体。

术语“分离的”在细胞(包括，例如VSEL干细胞)的上下文中使用时，表明所述细胞远离其天然环境而存在。分离的细胞也可以以纯化形式存在或者存在于非天然环境中。

如本文所用的，细胞在已经从存在于其天然环境中的所有其它细胞分离时，而且当那种细胞在细胞混合物中的比例大于在其天然环境中发现的比例时，以“纯化形式”存在。换句话说，当被讨论的细胞群代表富集的感兴趣的细胞群时，细胞被认为处于“纯化形式”，即使其它细胞或细胞类型也存在于所述富集群中。当细胞包括在一些实施方式中至少约10％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约20％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约25％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约30％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约40％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约50％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约60％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约70％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约75％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约80％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约90％的混合细胞群、在一些实施方式中至少约95％的混合细胞群，在一些实施方式中至少约100％的混合细胞群时，它被认为是处于“纯化形式”，条件是所述细胞包括“纯化”群中更大百分比的总细胞群，大于纯化前在所述群中的百分比。在这方面，术语“纯化的”和“富集的”可以被认为是同义的。

III.非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的分离

III.A.概述

当前披露的主题提供了从细胞群分离CD45^-干细胞的亚群的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供怀疑包含CD45^-干细胞的细胞群；(b)将所述细胞群与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或Sca-1特异的第二抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合；(c)选择为CD34⁺或Sca-1⁺、并且CD45^-的细胞的第一亚群；(d)将所述细胞的第一亚群与对于一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合，所述标记物选自包括而不限于CD45R/B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119的组；(e)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(f)收集为CD34⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-的细胞的第二亚群，由此分离CD45^-干细胞的亚群。

如本文所用的，术语“CD45”指的是酪氨酸磷酸酶，也称为白细胞共同抗原(LCA)，并具有基因记号PTPRC。这个基因相应于GENBANK

登记号NP_002829(人类)、NP_035340(小鼠)、NP_612516(大鼠)、XP_002829(狗)、XP_599431(牛)及AAR16420(猪)。另外的CD45同源物的氨基酸序列也存在于GENBANK

数据库中，包括那些来自多种鱼类和多种非人类灵长类的同系物。

如本文所用的，术语“CD34”指的是存在于一些造血和非造血干细胞上的细胞表面标记物，并具有基因记号CD34。GENBANK

数据库披露了来自人类(如，AAB25223)、小鼠(NP_598415)、大鼠(XP_223083)、猫(NP_001009318)、猪(MP_999251)、牛(NP_776434)及其它的CD34的氨基酸和核酸序列。

在小鼠中，一些干细胞还表达干细胞抗原Sca-1(GENBANK

登记号NP_034868)，也称为淋巴细胞抗原Ly-6A.2。

因此，CD45^-干细胞的亚群表示存在于分离步骤前的细胞群中的所有CD45^-细胞的亚群。在一些实施方式中，CD45^-干细胞的亚群来自人类，并且是CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-。在一些实施方式中，CD45^-干细胞的亚群来自小鼠，并且是Sca-1⁺/lin^-/CD45^-。

所披露的亚群的分离可以利用可以基于CD45、CXCR4、CD34、AC133、Sca-1、CD45R/B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119标记物的一种或多种的表达或表达缺乏来分离细胞的任何方法进行，包括而不限于荧光活化的细胞分类(FACS)。

如本文所用的，lin^-指的是不表达下列标记物的任何一种的细胞：CD45R/B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119。这些标记物存在于下述细胞上：从早期Pro-B到成熟B细胞的B细胞谱系的细胞(CD45R/B220)；骨髓谱系的细胞，如在骨髓发育期间的单核细胞、骨髓粒细胞及外周中性白细胞(Gr-1)；胸腺细胞、外周T细胞及肠上皮内皮淋巴细胞(TCRαβ和TCRγδ)；骨髓细胞、NK细胞、一些活化的淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞、B1细胞及树突细胞的亚类(CD11b)；以及成熟的红细胞和红细胞系前体细胞(Ter-119)。

所述分离步骤可以作为一系列步骤以逐步方式或同时进行。例如，每个标记物的存在或缺乏可以单独地评估，在每个步骤基于是否存在单独的标记物产生两个亚群。因此，感兴趣的亚群可以被选择并基于下一标记物的存在或缺乏而被进一步分开。

可选地，所述亚群可以通过仅分离出具有特定标记物特征的那些细胞而产生，其中短语“标记物特征(marker profile)”指的是两种或更多种标记物的存在或缺乏的总结。例如，混合的细胞群可以包含CD34⁺和CD34^-细胞。类似地，相同的混合细胞群可以包含CD45⁺和CD45^-细胞。因此，这些细胞中的一些将是CD34⁺/CD45⁺，另一些将是CD34⁺/CD45^-，另一些将是CD34^-/CD45⁺，其它将是CD34^-/CD45^-。这些标记物的单独的组合的每种代表不同的标记物性质。随着另外的标记物被加入，所述性质可以变得更复杂并对应最初的混合细胞群的越来越小的百分比。在一些实施方式中，当前披露的主题的细胞具有CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-的标记物性质，在一些实施方式中，当前披露的主题的细胞具有Sca-1⁺/lin^-/CD45^-的标记物性质。

在当前披露的主题的一些实施方式中，对于由感兴趣的细胞类型表达的标记物(如，在CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的表面上表达的多肽)特异的抗体用于分离和/或纯化具有感兴趣的标记物特征的BM细胞的亚群。可以理解基于感兴趣的标记物特征，所述抗体可以用于阳性或阴性地选择群体的部分，其在一些实施方式中随后被进一步分开。

在一些实施方式中，采用具有不同特异性的多个抗体、抗体衍生物、和/或抗体片段。在一些实施方式中，每个抗体、或其片段或衍生物，对于选自包括而不限于Ly-6A/E(Sca-1)、CD34、CXCR4、AC133、CD45、CD45R、B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b、Ter-119、c-met、LIF-R、SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog的组的标记物是特异性的。在一些实施方式中，表达一个或更多个选自包括而不限于SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog的组的基因的细胞被分离和/或纯化。

当前披露的主题涉及细胞群，其在一些实施方式中表达下面的抗原：CXCR4、AC133、CD34、SSEA-1(小鼠)或SSEA-4(人类)、胎儿碱性磷酸酶(AP)、c-met及LIF-受体(LIF-R)。在一些实施方式中，当前披露的主题的细胞不表达下面的抗原：CD45、谱系标记物(即，细胞为lin^-)HLA-DR、MHC I类、CD90、CD29及CD105。因此，在一些实施方式中，当前披露的主题的细胞可以被表征如下：CXCR4⁺/AC133⁺/CD34⁺/SSEA-1⁺(小鼠)或SSEA-4⁺(人类)/AP⁺/c-met⁺/LIF-R⁺/CD45^-/lin^-/HLA-DR^-/MHC I类^-/CD90^-/CD29^-/CD105^-。

在一些实施方式中，每个抗体、其片段或衍生物包括可检测的标签。结合于不同标记物的不同的抗体、其片段或衍生物可以包括不同的可检测标签或可以采用同样的可检测标签。

各种可检测标签对于本领域技术人员是已知的，用于将可检测标签结合到生物分子如抗体和其片段和/或衍生物的方法也是已知的。如本文所用的，短语“可检测标签”指的是可以加入到抗体、或其片段或衍生物的任何部分，其允许抗体的检测。代表性的可检测部分包括而不限于：共价附着的生色团、荧光部分、酶、抗原、具有特异反应性的基团、化学发光部分及电化学可检测的部分等。在一些实施方式中，抗体被生物素化。在一些实施方式中，利用第二抗体检测生物素化的抗体，所述第二抗体包括抗生物素蛋白或链霉亲和素基团并且还结合于包括而不限于Cy3、Cy5及Cy7的荧光标签。在一些实施方式中，抗体、其片段或衍生物用荧光标签如Cy3、Cy5、或Cy7直接标记。在一些实施方式中，所述抗体包括生物素-结合的大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(Sca-1；克隆E13-161.7)、链霉亲和素-PE-Cy5结合物、抗-CD45-APCCy7(克隆30-F11)、抗-CD45R/B220-PE(克隆RA3-6B2)、抗-Gr-1-PE(克隆RB6-8C5)、抗-TCRαβPE(克隆H57-597)、抗-TCRγδPE(克隆GL3)、抗-CD11b PE(克隆M1/70)及抗-Ter-119PE(克隆TER-119)。在一些实施方式中，所述抗体、片段、或其衍生物用荧光标签直接标记并且结合于抗体的细胞通过荧光-活化的细胞分类被分离。另外的检测策略对于本领域技术人员是已知的。

虽然FACS扫描是用于纯化细胞亚群的便利方法，但是可以理解也可以采用其它方法。可以采用的示例性方法是采用特异性结合于CD45、CXCR4、CD34、AC133、Sca-1、CD45R/B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119的一种或多种的抗体，所述抗体包含这样的部分(如生物素)，对于所述部分高亲和力结合试剂是可获得的(如抗生物素蛋白或链霉亲和素)。例如生物素部分可以附着于对于每种标记物的抗体，对于所述标记物，在细胞表面上的存在是理想的(如，CD34、Sca-1、CXCR4)，具有结合的抗体的细胞群可以与包含抗生物素蛋白或链霉亲和素部分的亲和试剂接触(如包含抗生物素蛋白或链霉亲和素的柱)。结合于柱的那些细胞将被回收并按希望的进一步分开。任选地，结合于所述群中要去除的那些细胞上存在的标记物(如，CD45R/B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119)的抗体可以用生物素标记，不与亲和试剂结合的细胞可以被回收并进一步纯化。

还应理解在纯化过程的一个或更多个步骤中不同的分离技术(如亲和性纯化和FACS)可以一起采用。

包含当前披露的主题的CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的细胞群可以从任何受试者或从包含它们的受试者内的任何来源分离。在一些实施方式中，所述细胞群包括骨髓样品、脐带血样品、或外周血样品。在一些实施方式中，在用足以将CD45^-干细胞从骨髓迁移到受试者的外周血的量的迁移剂处理受试者后，所述细胞群从受试者的外周血分离。如本文所用的，短语“迁移剂”指的是这样的化合物(如肽、多肽、小分子、或其它试剂)，其在给予受试者时导致VSEL干细胞或其衍生物从受试者的骨髓迁移到外周血。换句话说，将迁移剂给予受试者导致受试者外周血中存在比在给予迁移剂之前直接存在于其中的VSEL干细胞和/或VSEL干细胞衍生物的数量增加的VSEL干细胞和/或VSEL干细胞衍生物。然而，可以理解迁移剂的效果不需要是即时的，通常包括延迟时间，在此期间迁移剂对受试者中的组织或细胞类型起作用以便产生其效果。在一些实施方式中，所述迁移剂包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗剂(如，T140肽；Tamamura et al.(1998)253 Biochem Biophys Res Comm 877-882)的至少一种。

在一些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物还表达选自包括而不限于c-met、c-kit、LIF-R及其组合的组的标记物。在一些实施方式中，所披露的分离方法进一步包括分离为c-met⁺、c-kit⁺、和/或LIF-R⁺的那些细胞。

在一些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物还表达SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog，并且在一些实施方式中，所披露的分离方法进一步包括分离表达这些基因的那些细胞。

当前披露的主题还提供了通过当前披露的方法分离的CD45^-干细胞群。

III.B. CD45 ^- 干细胞群的进一步分开

本文披露的是CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的亚群的分离和/或纯化。这些细胞包括包含多能和组织-定向干细胞的异质细胞群。本文还披露了用于纯化披露的亚群的策略。

在一些实施方式中，异质亚群被进一步分开以富集某些谱系的VSEL干细胞。如本文披露的，CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-亚群包括对于各种组织的VSEL干细胞，所述组织包括而不限于神经细胞、骨骼肌细胞、心脏细胞、肝细胞、肠上皮细胞、胰腺细胞、内皮细胞、表皮细胞及黑色素细胞。这些细胞可以通过从CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-亚群纯化表达与这些谱系相关的一个或更多个标记物的那些细胞而被分开。例如，对于神经组织的VSEL干细胞可以利用检测胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白、βIII微管蛋白、少突胶质细胞转录因子1(Olig1)、和/或少突胶质细胞转录因子2(Olig2)的表达的试剂而被分开。类似地，对于骨骼肌的VSEL干细胞可以利用检测Myf5、MyoD、和/或成肌蛋白的表达的试剂被分开。可以采用的另外的VSEL干细胞类型和标记物包括而不限于：心肌细胞VSEL干细胞(Nsx2.5/Csx，GATA-4)、肝细胞VSEL干细胞(甲胎蛋白，CK19)、肠上皮VSEL干细胞(Nkx 2-3，Tcf4)、胰腺细胞TCSC(Nkx 6.1，Pdx 1，C-肽)、内皮细胞VSEL干细胞(VE-钙粘蛋白)、上皮细胞VSEL干细胞(Krt 2-5，Krt 2-6a，BNC)及黑色素细胞VSEL干细胞(DCT、TYR、TRP)。

IV. 分化VSEL干细胞的方法

IV.A. 胚状体(EB)样球体的产生

当前披露的主题还提供了分化VSEL干细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法包括首先产生胚状体样球体。如本文所用的，短语“胚状体样球体”和“胚状体样”指的是在合适的体外培养条件下形态上表现的与由ES细胞形成的胚状体类似的细胞的聚集。如本文所用的，所述短语与“胚状体”可互换地使用，指的是当形成胚状体的细胞为利用当前披露的技术分离和/或纯化的CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞时这样的聚集。产生来自ES细胞的EB的方法在本领域是已知的(参见，例如，Martin & Evans(1975)in Teratomas and Differentiation(M.I.Sherman & D.Solter，Eds.)，pp.169-187，Academic Press，New York，New York，United Statesof America；Doetschman et al.(1985)87 J Embryol Exp Morphol 27-45)。本文披露的是从其它多能和多潜能细胞制备EB样球体的方法，包括CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞。

在一些实施方式中，从非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物的群体形成胚状体样体的方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45^-细胞群；(b)在体外在培养基中培养VSEL干细胞或其衍生物足以使胚状体样体出现的时间，所述培养基包含一个或更多个诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样体形成的因子。

如本文所用的，术语“一个或更多个诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样体形成的因子”指的是一个生物分子或多个生物分子，其在与多个VSEL干细胞或其衍生物接触时诱导VSEL干细胞或其衍生物形成一个或更多个胚状体(EB-样)样球体。在一些实施方式中，诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样形成的一个或更多个因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2及其组合。在一些实施方式中，所述一个或更多个因子通过VSEL干细胞或其衍生物与C2C12细胞的共培养提供给VSEL干细胞或其衍生物。

IV.B. 分化VSEL干细胞或其衍生物的方法

一旦产生EB-样球体，其中的细胞可以通过在合适的条件下培养细胞而体外分化。在一些实施方式中，在体外将非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型的方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样；以及(b)在培养基中培养所述胚状体样直到感兴趣的细胞类型在体外培养物中出现，所述培养基包含分化诱导量的诱导VSEL干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型的一个或更多个因子。

如本文所用的，短语“分化-诱导量”指的是生长因子或其它活化剂的量，其在体外分化培养基中存在时，导致VSEL干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型。在一些实施方式中，生长因子或其它活化剂包括而不限于表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGFβ1)及其组合，和/或其它补充剂，包括而不限于N2-补充剂-A、B27补充剂及烟酰胺(可以从Stem Cell Technologies Inc.，Vancouver，British Columbia，Canada获得)。还参见Fraichard et al.(1995)108J Cell Sci 3181-3188。

生长因子和/或其它补充剂的选择依赖于希望EB-样球体分化成为的细胞类型。在一些实施方式中，EB样球体可以分化为神经元衍生物，包括而不限于神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经胶质细胞。如实施例22中披露的，EB样球体可以通过在包含补充有rhEGF、FGF-2及NGF的NEUROCULT

Basal Medium(Stem Cell Technologies Inc.，Vancouver，British Columbia，Canada)的培养基中培养它们而分化为神经元衍生物。EB样球体可以通过在包含活化素A的培养基中培养它们而分化为内胚层衍生物(参见实施例23)。并且，EB样球体可以通过在包含bFGF、VEGF及TGFPI的培养基中培养它们而分化为心肌细胞(参见实施例24)。

可以从干细胞如ES细胞在体外产生的其它细胞类型包括而不限于肝细胞(Yamada et al.(2002)20 Stem Cells 146-154)、造血细胞及胰腺细胞。

V. 利用VSEL干细胞用于治疗的方法和组合物

V.A. 受试者

当前披露的主题还提供了用于治疗受试者的组织或器官损伤的方法，所述方法包括给予受试者药物组合物，其中所述药物组合物包括药学上可接受的载体中包含VSEL干细胞的多个分离的CD45^-干细胞，量和经由的途径足以允许包含VSEL干细胞的CD45^-干细胞群的至少一部分结合到组织并在其中分化，由此治疗损伤。

如本文所用的，短语“治疗受试者中的组织或器官的损伤”指的是设计为改善受试者中损伤的原因的症状的干涉(如在疾病过程起始后)以及设计为防止疾病在受试者中发生的干涉。换句话说，术语“治疗”和其语法变体意图宽泛地解释为包括涉及降低疾病的严重性和/或治疗疾病的含义，以及涉及预防的含义。在这个后面的方面，“治疗”指的是“防止”或以另外的方式提高受试者抵抗疾病过程的能力。

V.B. 制剂

当前披露的主题的组合物在一些实施方式中包括包含载体的组合物，尤其是药学上可接受的载体，如，但不限于人类中药学上可接受的载体。任何合适的药物制剂可以用于制备用于给予受试者的组合物。

例如，合适的制剂可以包括含水和无水无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素、以及为制剂提供与预定的受者的体液等张的溶质。

应当理解除了上面特别提及的成分，当前披露的主题的制剂可以包括本领域中关于讨论的制剂类型的常见的其它试剂。例如，可以使用无菌不含致热原的含水和无水溶液。

当前披露的主题的治疗方案和组合物可以与另外的佐剂或生物反应修饰剂一起使用，所述修饰剂包括而不限于细胞因子和其它免疫调节化合物。

V.C. 给药

用于给予当前披露的主题的细胞的合适的方法包括而不限于静脉内注射和直接递送到靶组织或器官。在一些实施方式中，给药方法包括用于细胞在需要治疗的部位区域化递送或聚集的特征。在一些实施方式中，所述细胞被直接递送入要被治疗的组织或器官。在一些实施方式中，通过细胞的静脉内注射完成当前披露的细胞的选择性递送，其中它们靶向(home to)靶组织或器官并结合于其中。在一些实施方式中，当前披露的细胞由于靶组织或器官产生SDF-1梯度而靶向靶组织或器官，其作为对于本文披露的CXCR4⁺细胞的趋化引诱剂。

V.D. 剂量

有效剂量的当前披露的主题的组合物被给予需要其的受试者。“治疗有效量”或“治疗量”是足以产生可测量的反应(如被治疗的受试者中的生物或临床相关反应)的治疗组合物的量。可以改变当前披露的主题的组合物中的活性成分的实际剂量水平以便给予可以有效实现对于特定受试者的理想治疗反应的活性化合物的量。所选的剂量水平将依赖于治疗组合物的活性、给药途径、与其他药物或治疗的组合、要治疗的状况的严重性、以及要治疗的受试者的状况和先前药物史。然而，化合物的开始剂量在低于实现理想的治疗效果所需的水平并逐渐提高剂量直到实现理想的效果，这在本领域的技术范围内。组合物的效能可以变化，因此“治疗有效量”可以变化。然而，利用本文所述的实验方法，本领域的技术人员可以容易地评估当前披露的主题的候选化合物的效能和功效并因而调整治疗方案。

在阅览本文呈现的当前披露的主题的披露内容后，考虑特定剂型、所述组合物所用的给药方法及要治疗的特定疾病，本领域的普通技术人员可以调整给予个体受试者的剂量。剂量的进一步计算可以考虑受试者的身高和体重、症状的严重性和阶段及另外的有害身体状况的存在。这样的调整或改变，以及何时和怎样进行这样的调整或改变的评估对于医药领域中的普通技术人员是熟知的。

VI. 产生具有VSEL干细胞的嵌合动物的方法

VSEL干细胞(如，当前披露的主题的CD34⁺/CXCR4⁺/lin^-/CD45^-或Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞)和/或其衍生物还可以利用适用于ES细胞领域中已知的技术用于产生嵌合动物(参见，例如，Nagy et al.(2003)Manipulating the  Mouse Embryo.A Laboratory Manual，Third Edition.Cord Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，United States of Amrica；Robertson(1991)44 Biol Reprod 238-45；Jaenisch(1988)240 Science1468-1474；Robertson et al.(1986)323 Nature 445-447；Bradley et al.(1984)309 Nature 255-258。还参见美国专利Nos.5,650,550；5,777,195)。例如，所述细胞可以被注射入胚泡或与桑葚胚期胚泡聚集。在一些实施方式中，通过将VSEL干细胞或其衍生物引入受者产生的嵌合体为可以将VSEL干细胞的基因组传递到随后的世代的种系(germline)嵌合体。

VII. 其它应用

VII.A. 基因表达研究

本文披露的VSEL干细胞及其衍生物还可以用于监测细胞在靶组织中(如嵌合动物中)的分化。例如，嵌合动物可以利用纯化的VSEL干细胞的亚群(如，纯化的心肌细胞VSEL干细胞的亚群)产生，并且可以观察嵌合体中VSEL干细胞的衍生物的分化和/或发展。在一些实施方式中，VSEL干细胞包括可检测的标记物(如编码可操作地连接到在被监测的细胞类型中可操作的启动子的GFP的编码序列)，以促进区别VSEL干细胞衍生物与源自VSEL干细胞被引入的宿主动物的细胞。

此外，本文披露的VSEL干细胞及其衍生物还可以用于基因表达研究。例如，可以确定VSEL干细胞及其衍生物(包括而不限于纯化的VSEL干细胞的亚群)的基因表达性质，其可以随后与其它细胞类型比较，其它细胞类型包括而不限于比VSEL干细胞更多或更少分化的细胞类型。换句话说，由于VSEL干细胞比全能细胞分化得多，而比终端分化的细胞分化得少，因此VSEL干细胞及其衍生物可以用于产生并比较沿着从全能细胞到终端分化的细胞的分化途径的各种细胞类型中的基因表达性质，由此鉴定在细胞从全能细胞分化到VSEL干细胞再到终端分化的细胞时什么基因被下调和上调。任选地或此外，可以比较VSEL干细胞与ES细胞之间的基因表达性质以鉴定这些干细胞类型之间表达不同的基因。

VII.B. 鉴定胚状体样球体形成的诱导剂的方法

当前披露的细胞和方法还可以用于鉴定胚状体样球体形成的诱导剂。如本文所用的，短语“胚状体样球体形成的诱导剂”指的是这样的分子(例如，生物分子，包括而不限于多肽、肽、或脂质)，其在其中VSEL干细胞及其衍生物不另外的形成一个或更多个胚状体样球体的条件下引起多个VSEL干细胞及其衍生物形成一个或更多个胚状体样球体。在一些具体实施方式中，这样的条件包括而不限于：在其中缺乏诱导剂的培养基中培养VSEL干细胞或衍生物不形成一个或更多个胚状体样球体，但是当将诱导剂加入到同样的培养基时，导致VSEL干细胞或其衍生物形成一个或更多个胚状体样球体。

在一些实施方式中，本方法包括(a)制备包括来自已知包含诱导剂的细胞的多个cDNA克隆的cDNA文库；(b)用cDNA文库转化不包含诱导剂的多个细胞；(c)在足以引起VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体的条件下，在转化的多个细胞的存在下，培养多个VSEL干细胞或其衍生物；(d)分离包含诱导剂的转化的细胞；(e)从转化的细胞回收cDNA克隆；以及(f)鉴定由回收的cDNA克隆编码的多肽，由此鉴定胚状体样形成的诱导剂。在一些实施方式中，多个cDNA克隆存在于cDNA克隆载体内，所述载体包括在载体中克隆位点(cDNA克隆被插入其中)的至少一侧的侧翼的至少一个核苷酸序列，其可以结合引物如测序引物。在一些实施方式中，两条引物-结合核苷酸序列存在于克隆位点的每一侧的侧翼，允许cDNA插入以利用聚合酶链反应(PCR)进行扩增。因此，在一些实施方式中，本方法进一步包括利用杂交到引物位点(在cDNA克隆位点的两侧的侧翼)的引物扩增转化的细胞中存在的cDNA克隆，在一些实施方式中，通过直接对cDNA克隆测序或通过对扩增的PCR产物测序进行所述鉴定步骤。

然而，可以理解还可以采用普通技术人员的技术范围内的其他方法来鉴定诱导剂。例如，在一些实施方式中，已知包含诱导剂的细胞是C2C12细胞。可以检测C2C12-调节的培养基以测定C2C12培养基中存在的诱导剂是否是可扩散分子(例如，肽、多肽、或生物活性脂质)。如果所述诱导剂为可扩散的分子，C2C12-调节的培养基可以被热处理以确定诱导剂是热不稳定的(如肽或多肽)或不是热不稳定的(如生物活性脂质)。包括而不限于蛋白质组学分析和/或脂质色谱分析的分级(fractionation)研究可以随后用于鉴定推断的诱导剂。

如果C2C12-调节的培养基不包含诱导剂，意味着所述诱导剂存在于C2C12细胞上。可以用于鉴定存在于C2C12细胞上的膜-结合的诱导剂的技术包括而不限于利用单克隆抗体和/或siRNA。任选地或此外，可以采用基因表达分析，包括，例如，利用基因阵列、差别显示等。

当鉴定推断的诱导剂时，其作为诱导剂的状态可以通过用编码诱导剂的核苷酸序列转化不包含诱导剂的细胞系并确认转化的细胞系支持由VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体来确认。

此外，VSEL干细胞及其衍生物可以用于鉴定能够诱导胚状体样球体形成的其它细胞和细胞系。可以被检测的示例性的细胞系包括而不限于胎鼠成纤维细胞(murine fetal fibroblast)及其它鼠和人类恶性肿瘤细胞系(如畸胎瘤和肉瘤)。

自体同源的外周VSEL的选择(elective)收集和存贮(banking)

本发明还提供了选择性的健康保健保险模型，其使用个体自身的VSEL以用于该个体将来的健康保健用途，例如修复心肌梗塞。个体可以选择收集、处理并保存他或她自身的VSEL以用于他或她的将来的健康保健需要的分配。优选地，在供体处于健康或“疾病前”的状态时收集VSEL。过程包括在非疾病状态时收集、处理和保存VSEL的方法。美国专利公开号2006/0233768和美国专利公开号2008/0038231公开了这样的方法，每篇皆通过引用全文并入本文。

根据一个实施方式，提供了使受试者可以获得VSEL的方法，包括以下步骤：从受试者主动(proactively)收集VSEL，所述受试者没有直觉上感觉到需要以其自身收集的VSEL进行治疗的健康状况；从受试者收集VSEL；在收集时，将收集的VSEL打上标记以用于该受试者；将收集的VSEL保存于贮藏库；以及，当受试者需要的时候取回储存的VSEL。在优选的实施方式中，受试者是人类。

根据优选的实施方式，可以通过分离性输血(apheresis)方法收集VSEL。因此，提供了从疾病前人类受试者收集自体同源VSEL的方法；通过分离性输血方法从疾病前人类受试者的外周血收集VESL；在收集时，将收集的细胞打上标记以用于该人类受试者；以及保存收集的细胞以保持细胞的细胞完整性。

根据另一个优选的实施方式，提供了从疾病前受试者收集自体同源VSEL的方法，包括以下步骤：给予疾病前受试者干细胞增强剂(potentiatingagent)；通过分离性输血方法从疾病前受试者的外周血收集VESL；在收集时，将收集的细胞打上标记以用于该受试者；以及保存收集的细胞以保持细胞的细胞完整性。

根据另一个优选的实施方式，提供了从疾病前受试者收集自体同源VSEL的方法，包括以下步骤：给予疾病前受试者干细胞增强剂或迁移剂；通过分离性输血方法从疾病前受试者的外周血收集VESL；在收集时，将收集的细胞打上标记以用于该受试者；以及保存收集的细胞以保持细胞的细胞完整性；其中连续两天给予疾病前受试者干细胞增强剂，受试者每天接受一剂，并且其中在连续的第三天进行分离性输血过程。优选地，一种或多种干细胞增强剂选自G-CSF、GM-CSF、地塞米松、CXCR4受体抑制剂及其组合。CXCR4受体抑制剂可以选自AMD3100、ALX40-4C、T22、T134、T140和TAK-779。

根据另一个优选的实施方式，提供了从疾病前受试者收集自体同源VSEL的方法，包括以下步骤：给予疾病前受试者至少两剂大约1μg/kg/天至8μg/kg/天的G-CSF；通过分离性输血方法从疾病前受试者的外周血收集VESL；在收集时，将收集的细胞打上标记以用于该受试者；以及保存收集的细胞以保持细胞的细胞完整性。可以在2至6天的时间内给予疾病前受试者至少两剂G-CSF。优选地，连续两天给予疾病前受试者至少两剂G-CSF，受试者每天仅接受一剂。更优选地，受试者在连续天数内接受所给予的两剂G-CSF。在另一个优选的实施方式中，大约每12小时至大约每36小时给予疾病前受试者至少两剂G-CSF。

根据另一个优选的实施方式，以大约4至大约6μg/kg/天或与此等同的剂量给予受试者G-CSF。

根据另一个优选的实施方式，通过皮下给予受试者每剂大约50μg至大约800μg的G-CSF。

根据另一个优选的实施方式，通过皮下给予受试者每剂大约300μg至大约500μg的G-CSF。

根据另一个优选的实施方式，受试者是人类受试者，其满足以下至少一个条件：体重为10至200kg，年龄为2至80岁。

可以通过皮下给予G-CSF。优选地，通过皮下给予疾病前受试者每剂大约480μg的G-CSF。

可以在给予第二剂G-CSF后的那一天使用分离性输血方法从外周血收集VESL。在优选的实施方式中，在给予第二剂G-CSF后大约12至大约36小时使用分离性输血方法从外周血收集VESL。根据一个实施方式，当受试者是成人或者非新生儿童时进行收集步骤。根据另一个实施方式，收集步骤包括在单一收集过程中对于每个受试者收集至少1x10²⁰数量级以上的总有核细胞，或至少10¹⁹、或10¹⁸、或10¹⁷、或10¹⁶、或10¹⁵、或10¹⁴、或10¹³、或10¹²、或10¹¹、或10¹⁰、或10⁹、或10⁸、或10⁷、或10⁶、或10⁵数量级以上的总有核细胞的步骤。优选地，收集步骤包括在单一收集过程中对于每个受试者收集至少1x10¹²数量级以上的总有核细胞的步骤。优选地，收集步骤包括在单一收集过程中对于每个受试者收集至少1x10⁸数量级以上的CD34+干细胞的步骤。更优选地，收集步骤包括在单一收集过程中对于每个受试者收集至少1x10⁹数量级以上的CD34+干细胞的步骤。更优选地，收集步骤包括在单一收集过程中对于每个受试者收集至少1x10¹⁰数量级以上的CD34+干细胞的步骤。

根据另一个实施方式，收集步骤分多次进行。

根据另一个实施方式，保存步骤包括将收集的细胞储存于干细胞库。

根据另一个实施方式，在收集步骤之前的至少一个星期给予干细胞增强剂。

根据另一个实施方式，健康状况选自肿瘤疾病、免疫疾病和白细胞减少症。

根据优选的实施方式，分离性输血方法在收集步骤中进行至少一个小时；在收集步骤中进行至少二个小时；在收集步骤中进行至少三个小时；在收集步骤中进行至少四个小时。

根据另一个实施方式，在实质性细胞分裂之前通过保存步骤将收集步骤中收集的细胞保存起来。

根据另一个实施方式，保存步骤还可以包括将VSEL进一步处理装入多个单独的容器以进行储存的步骤。处理步骤还可以包括分离富集了或除去了干细胞表面抗原的一个细胞群的步骤。干细胞表面抗原可以选自CD34、lin、SSEA-1、Oct-4、Nanog和Rex-1、KDR、CD45和CD133。

根据另一个实施方式，保存步骤还可以包括以下步骤：在储存到干细胞库之前，从收集的细胞群中确定至少一个与个体相关的区别特征，从而在使用时提供可靠的证明以使收集的VSEL与该个体匹配。区别特征可以是DNA或RNA序列，或者可以是VSEL的一个群体或非VSEL的至少一个群体的细胞的蛋白质组。确定步骤还可以包括为每个细胞群体提供代表区别特征的信息的标志记号。标志记号可以体现在标签、条形码、磁条和微芯片中的至少一个之中，或嵌于保存的收集的细胞群之内。

根据另一个实施方式，保存步骤还可以包括将至少一个VSEL群和至少一个非VSEL群冷冻保存。至少一个VSEL群和至少一个非VSEL群可以在单独的容器中冷冻保存或者可以在同一个容器中冷冻保存。

根据另一个优选的实施方式，提供了用于治疗有需要的受试者的组合物和方法，包括给予受试者自体同源的富含VSEL的细胞群。

优选的，受试者或个体处于非疾病或疾病前的状态。应该注意，本文中使用的术语“疾病前”状态(相对于“疾病后”状态)涵盖了“健康”、“无疾病”的绝对项(相对于“不健康的/患病的”)以及疾病过程的渐进的相对项(比疾病后状态“更健康”或“患病更轻”)。由于可以在受试者被诊断患有疾病之前的时间定义“疾病前”，所以受试者可以是绝对项意义上的健康或者可能已经患有疾病，其中所述疾病还没有表现出来，或者没有被诊断出来或检测出来。即使是在后一种情况下，对于这样的“疾病前”状态，疾病也可能还没有蔓延到达收集的细胞；或者即使收集的细胞已得病，它们的侵略性也不高或者由于其处于发育的早期阶段所以健康程度较高，或者细胞仍然保持着一些对抗同一疾病和/或其它疾病的必要的功能。因此，术语“健康的”细胞既涵盖了绝对意义上的细胞是健康的，还涵盖了相对意义上来讲的这些收集的细胞(在受试者成为患者之前收集的)比患者体内目前具有的细胞(在其“疾病后”状态)更加健康。

具体地，“疾病前”状态可以指受试者被诊断患有或知道受试者患有特定靶向的疾病，或疾病的类别(统称为“特定疾病”)，从而可以在预计到受试者将来表现出该特定疾病的合适时间从该受试者收集干细胞。例如，考虑到家族健康史、遗传史和/或图谱，受试者可能被认为具有在成年时期患上某些特定疾病(例如某些癌症)的一定的可能性。

可以不脱离本发明的范围和精神适用“疾病前”状态的其它定义。例如，可以建立某些标准以将干细胞受试者预诊断为“疾病前”状态。这种预诊断可以建立作为在“疾病前”状态从受试者收集VSEL之前的任选的筛选过程。这样的“疾病前”状态的标准可以包括以下一种或多种收集前的考虑或参照，例如(a)特定疾病之前(pre-specific disease)；(b)受试者和/或健康专业人员确切知道特定或一般疾病之前；(c)患上和/或诊断为一种或多种类别的疾病之前；(d)相对于某些身体状况和/或征兆，相对于某些特定疾病，相对于某些先前治疗史和/或预防性治疗等等，受试者的与某些疾病(例如在某年龄时)相关的一个或多个临界参数之前；(e)受试者是否适合一种或多种已经建立的统计学和/或人口统计学模型或模式(例如统计学上不可能患上某些疾病)；和(f)基于主流医疗实践，受试者是否处于某些可接受的健康状况。

本发明提供了选择性的健康保健保险模型，其使用个体自身的外周血VSEL以用于个体将来的健康保健用途。更具体地，本发明提供了一种方法，其中个体可以选择在他或她处于健康状态时收集、处理并保存他或她自身的VSEL以用于他或她将来的健康保健需要的分配。本发明还包括在非疾病状态时收集、处理、保存并分配成人(包括小孩(pediatric))外周血VSEL的方法。收集的VSEL将包括足够的剂量，当个体将来的健康保健处理需要的时候，可以立即进行一个或多个移植。

干细胞收集方法

本发明的VSEL可以从骨髓、外周血(优选经迁移的外周血)、脾、脐带血及其组合收集。可以使用本领域已知的任何方法从各个来源收集VSEL。一般地，从受试者收集VSEL的方法包括收集总有核细胞的群体，然后进一步富集VESL的群体。

根据另一个优选的实施方式，提供了在非疾病状态时从个体供体收集足量VSEL剂量、处理收集的VSEL、将其冷冻保存以用于供体将来的健康保健需要的分配的方法。在本发明的一个实施方式中，通过分离性输血方法在非疾病或疾病前阶段从成人或小孩的外周血收集VSEL和祖细胞，进行处理以使收集的VSEL的数量和质量最优化，冷冻保存，并在有需要时将细胞解冻后用于自体同源的治疗性目的。自体同源的治疗性目的是指：从供体收集的细胞后来被输回供体内。

根据优选的实施方式，可以通过分离性输血方法收集VSEL，其通常使用分离性输血设备。

根据优选的实施方式，提供了从疾病前人类受试者收集自体同源VSEL的方法；通过分离性输血方法从疾病前人类受试者的外周血收集VESL；在收集时，将收集的细胞打上标记以用于该人类受试者；以及保存收集的细胞以保持细胞的细胞完整性。人类受试者可以是成人或非新生儿童(non-neonate child)。因此，以上方法可以进一步包括收集成人或非新生儿童的外周血VSEL，其中，在冷冻保存之前将细胞分为等份的确定的剂量部分，从而可以从贮藏库中取出细胞而不需要将所有收集的细胞解冻。

可以在任何个体中进行收集，包括成人或非新生儿童。此外，收集可以包括一个或多个收集步骤或收集阶段。例如，可以从个体收集(例如，通过分离性输血方法)至少两次，至少三次或至少五次。在每个收集步骤中，对于该个体的每千克体重所收集的总有核细胞的数目可以是一百万(1x10⁶)或更多(例如，1x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³、1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶、1x10¹⁷、1x10¹⁸、1x10¹⁹、1x10²⁰)。在优选的实施方式中，单个收集阶段所收集的细胞数目可以等于或大于1x10¹⁵个总有核细胞，或至少在10¹⁴、或10¹³、或10¹²、或10¹¹、或10¹⁰、或10⁹、或10⁸、或10⁷、或10⁶，或10⁵个总有核细胞的数量级，这取决于供体的重量和年龄。

取决于情况和要从供体收集的VSEL的数量和质量，优选的是在供体处于“成人(或成年)(adult)”或“成熟的”年龄(除非在特定上下文中另取它义，否则本文所用的术语“成人(或成年)”是指并且包括成人(或成年)和非新生儿童)和/或处于某最低体重时从该供体收集VSEL。例如，根据本发明的一个实施方式，当受试者处于10至200kg的范围或该范围内的任何范围(例如20至40kg)时收集VSEL。另外或者可替代的，根据本发明的一个实施方式，可能需要受试者处于2-80岁(例如2-10、10-15、12-18、16-20、20-26、26-30、30-35、30-40、40-45、40-50、55-60、60-65、60-70和70-80岁)范围的某个年龄。

干细胞增强(potentiating)剂

可以通过在收集之前注入细胞生长因子(例如，如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF))增加外周血中循环的VSEL的数量。向骨髓和外周血供体注入生长因子是常规的，未发现其与任何长期持续的不良效应相关。不利的副作用是不常见的，但包括以下可能：长骨、胸骨和骨盆疼痛、轻微头痛、轻微恶心以及瞬间的体温升高。在收集外周血VSEL之前1-6天给予生长因子。注入G-CSF之后1-6天，通过分离性输血设备无菌地收集外周血VSEL。

在优选的实施方式中，提供了迁移(mobilizing)大量外周血VSEL的方法，包括给予干细胞增强剂。干细胞增强剂的作用是提高可以从个体收集的VSEL的数目或质量。这些试剂包括但不限于，G-CSF、GM-CSF、地塞米松、CXCR4受体抑制剂、白介素-1(IL-1)、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、PIXY-321(GM-CSF/IL-3融合蛋白)、巨噬细胞炎性蛋白、干细胞因子、血小板生成素和生长相关的癌基因，作为单独试剂或联合给予。在优选的实施方式中，提供了迁移大量外周血VSEL的方法，包括给予疾病前受试者G-CSF。

根据优选的实施方式，在1至6天的时间内给予疾病前受试者G-CSF，在受试者外周血的分离性输血之后结束。优选地，在2至6天的时间内给予疾病前受试者至少两次G-CSF。例如，可以在第1天和第3天，或者在第1天、第3天和第5天，或者，可替代地，在第1天、第2天和第5天给予G-CSF。最优选地，在3天的时间内连续每天给予疾病前受试者两次G-CSF。因此，根据优选的实施方式，在第1天和第2天给予疾病前受试者G-CSF，然后在第3天进行分离性输血。

另外，根据优选的实施方式，给予受试者低剂量的G-CSF。因此，受试者可能接受一剂大约1μg/kg/天至8μg/kg/天的G-CSF。优选地，以大约2至大约7μg/kg/天的剂量或其等同剂量给予受试者G-CSF。更优选地，以大约4至大约6μg/kg/天的剂量或其等同剂量给予受试者G-CSF。对于皮下注射，G-CSF的剂量可以是大约50μg至大约800μg，优选大约100μg至大约600μg，更优选大约250μg至大约500μg，最优选大约300μg至大约500μg。

根据另一个优选的实施方式，CXCR4受体的拮抗剂或抑制剂可以用作干细胞增强剂。已经发现的增加外周血中VSEL数量的CXCR4抑制剂的例子包括但不限于，AMD3100、ALX40-4C、T22、T134、T140和TAK-779。另外参见美国专利号7,169,750，通过引用全文并入本文。可以在收集步骤之前给予个体干细胞增强剂。例如，可以在收集步骤之前至少一天，至少三天，或至少一周给予增强剂。优选地，在2至6天的时间内给予疾病前受试者至少两次CXCR4抑制剂。例如，可以在第1天和第3天，或者在第1天、第3天和第5天，或者，可替代地，在第1天、第2天和第5天给予CXCR4抑制剂。最优选地，在3天的时间内连续每天给予疾病前受试者两次CXCR4抑制剂。因此，根据优选的实施方式，在第1天和第2天给予疾病前受试者CXCR4抑制剂，然后在第3天进行分离性输血。

制剂和给药途径的选择将取决于个体受试者、受试者中待治疗的状况的本性以及一般地取决于主治医生的判断。CXCR4抑制剂的合适剂量范围将根据这些考虑变化，但一般地，以大约0.1μg/kg至5mg/kg体重的范围给予化合物；优选地，该范围是大约1μg/kg至300μg/kg体重；更优选为大约10μg/kg至100μg/kg体重。因此，对于通常为70-kg的人类受试者，剂量范围是大约0.7μg至350mg，优选为大约700μg至21mg；最优选大约700μg至7mg。与例如静脉内给药相比，口服或经皮肤给药的化合物的剂量可以更高一些。

干细胞处理

在本发明的一些实施方式中，收集之后，根据本领域已知的方法处理VSEL(参见，例如Lasky，L.C.and Warkentin，P.I.；Marrow and Stem CellProcessing for Transplantation；American Association of Blood Banks(2002))。在本发明的实施方式中，处理可以包括以下步骤：准备容器(例如管)和标签，取样和/或测试所收集的材料，离心，将材料从收集容器转移至贮藏容器，添加冷冻保存剂，等等。在一些实施方式中，处理之后，可以获得一些经处理的VSEL以进行进一步测试。

还可以优选在保存步骤之前进行细胞的处理。处理可以包括例如以某些细胞表面标记物富集或除去细胞。任何细胞表面标记物(包括本说明书中任何地方所列出的细胞表面标记物)均可以用作富集或除去的标准。此外，处理可以包括分析VSEL的一个群体或非VSEL的至少一个群体中一个细胞的至少一个特征。特征可以是DNA或RNA序列。例如，可以对基因组DNA或RNA进行部分测序或完全测序(确定的)。或者，可以将细胞的DNA或RNA的特定区域进行测序。例如，可以从细胞或细胞群提取核酸。可以使用扩增探针通过扩增方法将这些核酸特定区域进行扩增。扩增方法可以是例如PCR或LCR。扩增之后，可以将扩增子(扩增的产物)进行测序。此外，可以使用基因芯片通过杂交或其它技术分析DNA和RNA。

本发明的特别独特之处在于，不需要进行任何种类的组织分型，因为所收集的VSEL将用于自体同源移植。但是，特定种类的组织分型可用于样品鉴别或使用这些VSEL用于可能的同种异基因(allogeneic)的用途。这种信息可以包括基因型或表型信息。表型信息可以包括任何可以观察到的或测量出来的特征，可以是肉眼可见的或系统水平的或显微水平的、细胞或分子水平的。基因型信息可以指特定的个体生物的具体遗传组成，包括个体基因组的遗传组成中的一个或多个变异或突变，以及该遗传组成与疾病的可能的关系。这种基因型信息的例子为遗传“指纹”和供体的人类白细胞抗原(HLA)类型。在本发明的一些实施方式中，按照如下方式处理VSEL：鉴别出用于移植的确定的剂量并等份分装入合适的容器。

在优选的实施方式中，富含VSEL的群体中的细胞数目可以等于或大于2x10⁸个总有核细胞，或者至少在10⁷、或10⁶、或10⁵、或10⁴的数量级，这取决于供体的体重和年龄。优选将这些细胞分成等份，从而可以在一个冷冻贮存袋或管中储存足够用于一次移植的细胞数量，而适合于微移植(补充性干细胞注入)的细胞数量将储存于合适的容器中(冷冻贮存袋或管)。一般地，根据本发明的一个实施方式，每个收集过程收集至少一个单位，收集的每个单位的目标是超过10³的数量级，更优选为10⁴，更优选为10⁵，最优选为10⁶。这个过程构成了“单元化储存”的独特过程，这可以使个体取出用于自体同源用途的细胞数量，而不需要将储存的全部体积的细胞解冻(以下详细讨论)。这可以包括将收集的VSEL进行处理从而使总有核细胞的数量优化，以确保用于靶标疾病的足够的细胞数目而不浪费细胞或者仅有少量浪费(即，疾病指导的剂量)。容错和冗余计算机系统将用于数据处理，以保持记录与受试者信息相关并确保从储存库中迅速并有效地取回VSEL。

干细胞富集或分类

优选地，富集程序包括通过大小和/或细胞标记物分类细胞。例如，按照替代的(surrogate)CD34+细胞的测定，干细胞包含大约0.1-1.0％的总有核细胞。因此，可以根据CD34+的表达分类干细胞。VSEL不表达CD45，因此，可以将表达CD45的细胞从想要的富含VSEL的群体中分类出来。VSEL干细胞表达多能干细胞的标记物，例如SSEA-1、Oct-4、Nanog和Rex-1，因此，可以使用这些标记物应用类似的策略。类似地，可以根据大小通过分类TNC群体制备富含VSEL的干细胞群，可以单独进行或者与其它分类策略联合进行，从而制备富含VSEL的细胞群体。

在本发明一个方面，通过本发明的方法收集的细胞可以被分类为至少两个亚群体，可以将其单独或者一起(例如在相同的瓶中)冷冻保存。所述至少两个细胞亚群体可以是VSEL的两个亚群体。但是，所述至少两个细胞亚群体可以是(1)干细胞群体或富含VSEL的群体，和(2)非干细胞群体或除去了VESL的群体。此外，还考虑到两个亚群体(即上述的(1)和(2))可以一起冷冻保存。

可以根据与VSEL相关的细胞表面标记物分类VSEL。由于本发明的一个实施方式是富集VSEL，所以有用的用于细胞分类的标记物不需要是只在VSEL上表达的标记物。那些不是只在干细胞上表达的细胞标记物对于富集VSEL仍然是有用的。还应该注意：分化的细胞的标记物也可用于本发明的方法，因为这些标记物可用于例如选择性除去分化的细胞，因此在剩余的细胞群中富集VSEL。可以用于本发明的任意方法的标记物(不论是细胞表面的还是其它的)至少包括以下所列：胎儿肝脏激酶-1(Flk1)；骨特异性碱性磷酸酶(BAP)；骨形成蛋白受体(BMPR)；CD34；CD34⁺、Sca1⁺、Lin^-特征；CD38；c-Kit；集落形成单位(CFU)；成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)；Hoechst染料；KDR；白细胞共同抗原(CD45)；谱系表面抗原(Lin)；Muc-18(CD146)；干细胞抗原(Sca-1)；Stro-1抗原；Thy-1；CD14；血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1或CD31)；CD73；脂肪细胞脂结合蛋白(ALBP)；脂肪酸转运子(FAT)；脂肪细胞脂结合蛋白(ALBP)；B-1整合蛋白；CD133；胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)；O4；CD166；细胞角蛋白19(CK19)；巢蛋白(Nestin)；碱性磷酸酶；甲胎蛋白(AFP)；骨形成蛋白-4；Brachyury；分化簇30(CD30)；Cripto(TDGF-1)；GATA-4基因；GCTM-2；Genesis；生殖细胞核因子；肝细胞核因子-4(HNF-4)；巢蛋白；神经细胞粘附分子(N-CAM)；Oct-4；Pax6；阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；干细胞因子(SCF或c-Kit配体)；端粒酶；TRA-1-60；TRA-1-81；波形蛋白；MyoD和Pax7；成肌蛋白(myogenin)和MR4；CD36(FAT)；和CD29。

VSEL表达的标记物的模式也可用于以更高的精确度对VSEL进行分类并归类。任何鉴定方法(包括检测标记物或一系列(array)标记物)均可用于鉴定和/或鉴别根据本文公开的实施方式获得的细胞。例如，已知一些细胞类型表达标记物的某种模式，可以根据这些已知的模式分类根据本文描述的方法收集的细胞。还可以应用多参数分类。下面的表提供了某些细胞类型可能表达的鉴别模式或一系列标记物的例子。

VSEL的大小也可以成为设计分类策略的基础，从而制备VSEL的富集群体。可以使用细胞标记物和大小模式的组合以更高的精确度对VSEL进行分类和归类。一般地，通过介于2-10μm的大小进行分类从而制备VSEL的富集群体。在一些实施方式中，通过介于2-8μm的大小进行分类从而制备VSEL的富集群体。在一些实施方式中，通过介于2-6μm的大小进行分类从而制备VSEL的富集群体。在一些实施方式中，通过介于2-5μm的大小进行分类从而制备VSEL的富集群体。在一些实施方式中，通过介于2-4μm的大小进行分类从而制备VSEL的富集群体。在一些实施方式中，通过介于3-5μm的大小进行分类从而制备VSEL的富集群体。在一些实施方式中，通过介于3-6μm的大小进行分类从而制备VSEL的富集群体。在一些实施方式中，通过介于3-8μm的大小进行分类从而制备VSEL的富集群体。

细胞治疗

在本发明的一个实施方式中，从受试者的外周血收集VSEL并在受试者需要这样的细胞治疗时将其导入或移植回个体中。

VSEL和包含本发明的VSEL的组合物可以通过增强(augmentation)受伤组织而用于修复、治疗或改善各种美观性或功能性状况(例如缺陷)。本实施方式的VSEL可以提供重建或增强受伤组织的重要资源，因此代表了医学上有用的VSEL的新来源。在优选的实施方式中，VSEL可用于组织工程和再生药物以替换那些由于发育缺陷、损伤、疾病或因年龄造成的磨损或破裂而造成损害的身体部件。VSEL提供了独特的系统，其中细胞可以分化产生同一受试者或基因型的特定谱系。因此，VSEL提供了用于个体化干细胞治疗的显著优点。

另外，这样的VSEL及其组合物可用于在没有疾病或外伤的情况下通过向软组织区域、开口、凹窝或空隙增加体积而增强与损伤无关的软组织，例如用于“平滑”。本发明还包括多次和连续给予VSEL。

对于基于干细胞的治疗，优选地从自体同源或异源的人类或动物来源收集VSEL。自体同源的动物或人类来源是更优选的。然后按照本文的描述制备并分离干细胞组合物。为了将VSEL和/或包含本发明所述的VSEL的组合物导入或移植进入人类或动物受体，制备了单核细胞的悬浮液。这样的悬浮液包含处于生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的一定浓度的本发明的VSEL。或者，干细胞悬浮液可以是不含血清的无菌的溶液，例如冷冻保存的溶液。还可以使用富集的干细胞制品。然后通过例如注射将干细胞悬浮液导入供体组织的一个或多个位点。

浓缩的或富集的细胞可作为药学上或生理上可接受的制品或者含有生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物给药，其被给药至感兴趣的受体生物(包括人类和非人动物)的组织。可以通过将细胞重悬于合适的液体或溶液(例如无菌生理盐水或其它生理上可接受的可注射的水性液体)中制备含有干细胞的组合物。本领域技术人员可以通过常规方式确定用于这样的组合物中的成分的数量。

VSEL或其组合物可以这样给药：将干细胞悬浮液置于吸收性或粘附性材料(即，胶原海绵基质)上并将含有干细胞的材料插入到目标位点之内或之上。或者，可以通过非肠道注射途径给予VSEL，包括皮下、静脉内、肌肉内和胸骨内。其它的给药模式包括但不限于，鼻内、胸内、皮内、经皮肤、肠道和舌下。在本发明的一个实施方式中，通过内窥镜外科手术介导VSEL的给药。

对于可注射的给药，组合物处于无菌溶液或悬浮液中，或者可以重悬于药学上和生理上可接受的水性或油性介质中，介质中可以含有防腐剂、稳定剂和使得溶液或悬浮液与受体体液(即血液)等渗的材料。适合使用的赋形剂的非限制性的例子包括水、磷酸盐缓冲的盐水、pH为7.4的0.15M氯化钠水溶液、右旋糖、甘油、稀释的乙醇等等，及其组合。示例性的稳定剂为聚乙二醇、蛋白质、糖、氨基酸、无机酸和有机酸，这些可以单独使用或混合使用。所用的量或数量以及给药途径是根据个体基础确定的，并且对应于本领域技术人员已知的在相似类型的应用或适应症中所用的数量。

根据本发明，VSEL可以给予到身体的组织，包括上皮组织(即皮肤、内腔等)，肌肉组织(即平滑肌)，血液，脑和各种器官组织，例如那些与泌尿系统相关的器官(即膀胱、尿道、输尿管、肾等)。

根据另一个优选的实施方式，提供了用于增强外周血VSEL移植的组合物和方法。从受试者的外周血收集的细胞一般包含细胞的完全混合物。即，存在VSEL、部分分化的细胞(例如祖细胞或成纤维细胞)和功能细胞(即终端分化细胞)的混合物。就较短时间的重构和注入后阶段的其它生理益处来讲，祖细胞、部分及可能的终端分化细胞的存在可能具有显著优点。

根据本文描述的一般治疗方法，通过分离性输血方法获得的细胞混合物可以这样给予受试者：通过静脉内(i.v.)导管注入受试者的血流中，就像其它任何静脉内流体一样。或者，然而，可以产生细胞的个别化(individualized)混合物从而提供特异性针对受试者治疗需要的细胞治疗混合物。可以将通过例如分离性输血方法获得的细胞的完全混合物进行鉴定、分类并分成不同的细胞群体。可以使用细胞标记物(例如VSEL标记物或组织特异性标记物)将从外周血收集而来的细胞群体进行表型鉴定。通过使用这些标记物可以基于细胞类型进行分离和分类。因此，细胞的混合物被转化为细胞群体，细胞群体可以更广泛地分成两个部分：干细胞部分和非干细胞部分。非干细胞部分可进一步分为祖细胞或成纤维细胞部分，以及功能细胞或完全分化的细胞部分。一旦将外周血细胞混合物分类之后，可以将干细胞和非干细胞部分分开冷冻保存并储存。按照这种方式可以创建来自受试者的不同细胞群体的库或贮藏库。或者，可以将干细胞和非干细胞部分冷冻保存在一起，然后在使用前进行分类和分离。

按照这种方式产生的细胞群体的类型包括从胚层(即，内胚层、中胚层和外胚层)发育而来的细胞类型的任意群体。这些包括但不限于，外周血VSEL、外周血CD34+细胞、造血祖细胞或分化的细胞、神经祖细胞或分化的细胞、神经胶质祖细胞或分化的细胞、少突胶质细胞祖细胞或分化的细胞、皮肤祖细胞或分化的细胞、肝祖细胞或分化的细胞、肌肉祖细胞或分化的细胞、骨祖细胞或分化的细胞、间充质干细胞或祖细胞、胰腺祖细胞或分化的细胞、前体软骨细胞(progenitor chondrocyte)或分化的软骨细胞、基质祖细胞或分化的细胞、培养的扩展的干细胞或祖细胞、培养的分化的干细胞或祖细胞、或其组合。特别感兴趣的是造血细胞，其可以包括任何可能与红细胞谱系、淋巴细胞谱系或髓细胞单核细胞谱系以及成肌细胞和成纤维细胞相关的有核细胞。感兴趣的还有祖细胞，例如造血、神经、基质、肌肉(包括平滑肌)、肝、肺、胃肠道和间充质祖细胞。感兴趣的还有分化的细胞，例如成骨细胞、肝细胞、粒细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经元细胞、胰腺(细胞)或其组合和混合物。

然后可以将各种细胞类型的细胞群体组合、重新组合或混合成为适合用于治疗受试者的疾病和/或再生特定组织的细胞的细胞治疗混合物。VSEL、组织特异性祖细胞以及任选的功能细胞的组合被认为可以增强VSEL的移植。因此，在一个实施方式中，本发明提供了使用VSEL、祖细胞以及任选的功能细胞的自体同源混合物以增强干细胞或祖细胞移植的方法和产品。这种细胞治疗产品可以包括：大约10％至大约90％的外周血VSEL、大约10％至大约80％的外周血VSEL、大约10％至大约60％的外周血VSEL或大约10％至大约40％的外周血VSEL；和大约10％至大约90％的非VSEL、大约20％至大约90％的非VSEL、大约40％至大约90％的非VSEL、大约60％至大约90％的非VSEL。非干细胞部分可以任选地包括大约5％至大约50％的功能细胞、大约5％至大约40％的功能细胞、大约5％至大约30％的功能细胞、大约5％至大约20％的功能细胞或大约5％至大约10％的功能细胞。

上述的细胞治疗产品的合适的例子为PBSC、造血祖细胞和任选的粒细胞或造血系统的其它功能细胞的自体同源混合物。另一个例子是包含PBSC、心肌祖细胞和任选的心肌细胞的自体同源混合物的细胞治疗产品。

根据另一个优选的实施方式，提供了治疗有需要的患者的方法，包括给予受试者VSEL的自体同源混合物。

干细胞存贮

在本发明的另一个方面，本发明提供了细胞库以支持选择性健康保健保险模型以有效保护群体成员抵抗将来的疾病。个体可以选择在他或她处于健康状态时收集、处理并保存他或她自身的VSEL以用于他或她将来的健康保健需要的分配。

收集并经处理的VSEL被“存贮”在干细胞库或贮藏库或储存设施，或任何安全保管VSEL的地点以用于将来的用途。储存设施可以按照如下方式设计：当发生灾难性事件(例如核攻击)的时候仍可以安全地保管VSEL。在一些实施方式中，储存设施可以在地下，处于洞穴或地窖中。在其它实施方式中，其可以在山的一侧或外层空间。储存设施可以封闭在屏蔽材料(例如铅)之中。

根据优选的实施方式，提供了以四个步骤进行干细胞存贮的方法。步骤A包括给予个体一种或多种干细胞增强剂以增加该个体的外周血中VSEL的数量。步骤B包括使用分离性输血方法从所述个体的外周血收集至少一个VSEL群和至少一个非VSEL群，其中所述个体没有直觉上感觉到需要以其自身收集的VSEL进行治疗的健康状况。步骤C包括将所述至少一个VSEL群和至少一个非VSEL群保存，作为保存的细胞群。步骤D包括取回保存的细胞群以用于将VSEL自体同源移植到该个体中。以下更详细地描述这个方法的每个方面。

实施例

下面的实施例提供了示意性的实施方式。根据本发明披露的内容和本领域的一般技术水平，本领域的技术人员将认识到下面的实施例仅是示例性的并且可以采用各种变化、修改及改变而不偏离当前披露的主题的范围。

实施例1

骨髓细胞

从来自无病原体、3周、1月及1岁大的雌性C57BL/6或DBA/2J小鼠(从The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，United States of America获得)的股骨获得的BM分离鼠单核细胞(MNC)。用低渗溶液(Lysing Buffer，BD Biosciences，San Jose，California，United States of America)去除红细胞。

任选地，从来自无病原体、4-6周大的雌性Balb/C小鼠(JacksonLaboratory)的股骨获得的鼠BM分离MNC并进行Ficoll-Paque离心以获得轻密度MNC。通过采用顺磁小型珠(Miltenyi Biotec，Auburn，California，United States of America)根据制造商的方案分离Sca-1⁺细胞。

从四个尸体BM供体(年龄为52-65岁)获得轻密度人类BMMNC，如果必要，去除粘附细胞和T淋巴细胞(A-T-MNC)，如Ratajczak et al.(2004a)103 Blood 2071-2078和Majka et al.(2001)97 Blood 3075-3085中所述。通过免疫亲和性选择，借助MINIMACS^TM顺磁珠(Miltenyi Biotec)，根据制造商的说明，分离CD34⁺细胞，如Ratajczak et al.(2004a)103 Blood 2071-2078和Majka et al.(2001)97 Blood 3075-3085中所述。通过FACS分析测定分离的CD34⁺细胞的纯度为＞98％。

实施例2

骨髓-来源的细胞的分类

对于鼠BM细胞，利用FACSVANTAGE^TM SE(Becton Dickinson，Mountain View，California，United States of America)，通过多参数、活性无菌细胞分类，从鼠BMMNC的悬浮液分离Sca-1⁺/lin^-/CD45^-和Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞。简短地，BMMNC(100×10⁶个细胞/ml)被重新悬浮在细胞分类培养基(CSM)中，包含不含酚红的1×Hank’s Balanced Salt Solution(GIBCO，Grand Island，New York，United States of America)、2％热失活的胎牛血清(FCS；GIBCO)、10mM HEPES缓冲剂(GIBCO)及30U/ml的庆大霉素(GIBCO)。下面的单克隆抗体(mAb)用于对这些细胞染色：生物素-结合的大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(Sca-1；克隆E13-161.7)、链霉亲和素-PE-Cy5结合物、抗-CD45-APCCy7(克隆30-F11)、抗-CD45R/B220-PE(克隆RA3-6B2)、抗-Gr-1-PE(克隆RB6-8C5)、抗-TCRαβPE(克隆H57-597)、抗TCRγδPE(克隆GL3)、抗-CD11b PE(克隆M1/70)及抗-Ter-119PE(克隆TER-119)。所有的mAB以饱和浓度加入并且在冰上孵育细胞30分钟，冲洗两次，随后以5×10⁶个细胞/ml的浓度重新悬浮在CSM中用于分类。

任选地，将全部鼠BM在室温下在BD裂解液(BD Biosciences，San Jose，California，United States of Amirica)中裂解15分钟，并在PBS中冲洗两次。单细胞悬浮液被染色用于与PE结合的谱系标记物(CD45R/B220(克隆RA3-6B2)、Gr-1(克隆RB6-8C5)、TCRαβ(克隆H57-597)、TCRγδ(克隆GL3)、CD11b(克隆M1/70)、Ter-119(克隆TER-119))、与PE-Cy5结合的CD45(克隆30-F11)、生物素结合的大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(Sca-1)(克隆E13-161.7)、链霉亲和素-APC和MHC I类(克隆CTDb)、HLA-DR(克隆YE2/36HLK)、CD105/Endoglin、与FITC结合的CD29和CD90(Thy1)，在冰上进行30分钟。冲洗后，通过FACS(BD Biosciences，San Jose，California)分析它们。获得至少10⁶个事件并通过利用Cell Quest软件进行分析。代表示例性的系列分类的系列点图在图11中示出。

对于人类BM细胞，通过采用FITC-标记的抗-CD45和PE-标记的抗-CXCR4单克隆抗体(来自BD Biosciences Pharmingen(Palo Alto，California，United States of America))和MOFLO^TM细胞分类器(DakoCytomationCalifornia Inc.，Carpinteria，California，United States of America)分离CXCR4⁺/CD45⁺、CXCR4⁺/CD45^-、CXCR4^-/CD45⁺、CXCR4^-/CD45^-BMMNC，如Ratajczak et al.(2004b)18 Leukemia 29-40中所述。简短地，细胞在4℃被染色30分钟，冲洗两次、分类及在分类后立即离心以利用Qiagen RNA分离试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，California，United States of America)，根据制造商的方案分离RNA。

实施例3

侧群(SP)细胞分离

根据Goodell et al.(2005)Methods Mol Biol 343-352的方法从骨髓分离SP细胞。简短地，将BMMNC以10⁶个细胞/ml重新悬浮在预热的DMEM/2％FBS中并在37℃预先孵育30分钟。随后在DMEM/2％FBS中用5μg/mlHoechst 33342(Sigma Aldrich，St.Louis，Missouri，United States of America)标记细胞并在37℃孵育90分钟。染色后，细胞被沉淀，重新悬浮在冰冷的细胞分类培养基中，随后在冰上维持直到它们的分类。利用FACSVANTAGE^TM(Becton Dickinson，Mountain View，California，UnitedStates of America)进行分析和分类。在350nm处激发Hoechst染料并且用424/44带通(BP)滤光器(Hoechst蓝)和675/20BP滤光器(Hoechst红)收集其荧光发射。利用列表模式的线性放大收集所有参数并以Hoechst蓝对Hoechst红点图显示以可视化SP。随后，利用生物素-结合的大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(Sca-1；克隆E13-161.7)、链霉亲和素-PE-Cy5结合物、抗-CD45-APC-Cy7(克隆30-F11)、抗-CD45R/B220-PE(克隆RA3-6B2)、抗-Gr-1-PE(克隆RB6-8C5)、抗-TCRαβPE(克隆H57-597)、抗-TCRγδPE(克隆GL3)、抗-CD11b PE(克隆M1/70)及抗-Ter-119PE(克隆TER-119)抗体从SP悬浮液分离Sca-1⁺/lin^-/CD45^-和Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞。

实施例4

趋化分离

在鼠BM-、PB-及脾-来源的MNC的分离后，细胞被重新悬浮在无血清培养基中并在37℃平衡10分钟。Costar Transwell 24孔板的下室(6.5-mm直径，5μM孔滤器)(Costar Corning，Cambridge，Massachusetts，United Statesof America)填充有650μl的无血清培养基和包含SDF-1(200ng/ml)、HGF(10ng/ml)、或LIF(50ng/ml)的0.5％BSA，或仅填充有培养基(对照)，如Ratajczak et al.(2004b)18 Leukemia 29-40和Kucia et al.(2004a)32 BloodCells Mol Dis 52-57中所述。

在一些涉及心肌梗塞模型的实验中(参见实施例25)，采用来自梗塞的组织匀浆的上清液(LV前壁)或对照(LV后壁)心肌。将细胞悬浮液(100μl)加入上室。所述板在37℃、95％湿度、5％CO₂下孵育5小时，并在倒置显微镜下评估。收集来自下室的细胞并通过FACS分析(FACSCAN^TM，Becton Dickinson)计数它们的数量，如Ratajczak et al.(2004a)103 Blood 2071-2078和Majka et al.(2001)97 Blood 3075-3085中所述。

实施例5

透射电子显微镜(TEM)分析

对于透射电子显微镜，将Sca-1⁺/lin^-/CD45^-和Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞在0.1M卡可酸盐缓冲液(pH7.4)中的3％戊二醛中4℃固定10小时、在四氧化锇(osmium tetride)中后固定、并脱水。固定的细胞随后被包埋在LX112中并以800A切片、用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色并在Philips CM10电子显微镜(在60kV运行)上观察。

实施例6

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

利用RNEASY

Mini Kit(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States ofAmerica)分离总RNA。利用一步RT-PCR(Qiagen Inc.)，根据制造商的说明书逆转录mRNA(10ng)。利用HOTSTARTAQ

DNA聚合酶(QiagenInc.，Valencia，California，United States of America)扩增获得的cDNA片段。所用的引物对于CXCR4(GENBANK

登记号BC031665)，正向引物5’-GACGGACAAGTACCGGCTGC-3’(SEQ ID NO：59)和反向引物5’-GACAGCTTAGAGATGATGAT-3’(SEQ ID NO：60)；对于Met受体(GENBANK

登记号NM_008591)，正向引物5’-CGCGTCGACTTATTCATGG-3’(SEQ ID NO：61)和反向引物(5’-CACACATTGATTGTGGCACC-3’(SEQ ID NO：62)；以及对于LIF-R(GENBANK登记号NM_013584)，正向引物5’-GAGCATCCTTTGCTATCGGAAGC-3’(SEQ ID NO：63)和反向引物5’-CGTTATTTCCTCCTCGATGATGG-3’(SEQ ID NO：64)。获得的PCR产物的正确尺寸通过琼脂糖凝胶上的分离确定。

实施例7

实时定量RT-PCR(RQ-PCR)

为了Oct4、Nanog、Rex1、Dppa3、Rif1、Myf5、MyoD、成肌蛋白、GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、甲胎蛋白、CK19、Nsx2.5/Csx、GATA-4、VE-钙粘蛋白、DCT、TYR、TRP、Nkx 2-3、Tcf4、Krt 2-5、Krt 2-6a、BNC、Nkx6.1及Pdx1 mRNA水平的分析，用RNEASY

Mini Kit(QiagenInc.，Valencia，California，United States of America)从细胞分离总mRNA。利用TAQMAN

Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems，FosterCity，California，United States of America)逆转录mRNA。通过实时RT-PCR，利用ABI PRISM

7000 Sequence Detection System(ABI，Foster City，California，United States of America)，采用表1中披露的引物，进行Oct4、Nanog、Rex1、Dppa3、Rif1、Myf5、MyoD、成肌蛋白、GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、甲胎蛋白、CK19、Nsx2.5/Csx、GATA-4、VE-钙粘蛋白、DCT、TYR、TRP、Nkx 2-3、Tcf4、Krt 2-5、Krt 2-6a、BNC、Nkx 6.1及Pdx1和R2-微球蛋白mRNA水平的检测。25μl反应混合物包含12.5μl SYBR

Green PCR Master Mix、10ng的cDNA模板及正向和反向引物。用PRIMER EXPRESS

软件(Applied Biosystems，Foster City，California，United States of America)设计引物并列于表1中。

随后测定阈值周期(Ct)，即，扩增的感兴趣的基因到达固定阈值的量的周期数。用比较Ct方法计算Oct4、Nanog、Rex1、Dppa3、Rif1、Myf5、MyoD、成肌蛋白、GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、甲胎蛋白、CK19、Nsx2.5/Csx、GATA-4、VE-钙粘蛋白、DCT、TYR、TRP、Nkx2-3、Tcf4、Krt 2-5、Krt 2-6a、BNC、Nkx6.1及Pdx1 mRNA表达的相对量。靶标的相对量值，标准化为内源性对照β2-微球蛋白基因并相对于校准器，表达为2^-ΔΔCt(倍数差别)，其中ΔCt＝靶基因的Ct(Oct4的Myf5、Nanog、Rex1、Dppa3、Rif1、Myf5、MyoD、成肌蛋白、GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、Olig1、Olig2、甲胎蛋白、CK19、Nsx2.5/Csx、GATA-4、VE-钙粘蛋白、DCT、TYR、TRP、Nkx 2-3、Tcf4、Krt 2-5、Krt 2-6a、BNC、Nkx6.1、Pdx1)-内源性对照基因(β2-微球蛋白)的Ct，ΔΔCt＝靶基因的样品的ΔCt-靶基因的校准器的ΔCt。

为了避免扩增污染DNA的可能性，i)用于实时RTR-PCR的所有引物用要扩增的cDNA内的内含子序列设计，ii)利用合适的阴性对照(无模板的对照)进行反应，iii)通过分析扩增产物的熔解曲线(解离图)重新检查产物的均匀扩增，iv)熔解温度(Tm)为57-60℃，探针Tm比引物Tm至少高10℃，最后，v)进行凝胶电泳以确认扩增的正确尺寸和非特异性带的缺乏。

代表性分析的结果在表3和4中示出。

表3

VSEL干细胞标记物的RQ-PCR分析 ^*

·数据表达为相较于输入BMMNC中表达的表达的倍数增加(平均数+/-SD)。(n＝3独立的类别，对于每一类从12个供体收集BM)。^*p＜0.00001。

表4

PSC标记物的RQ-PCR分析 ^*

PSC标记物	Sca-1+/lin-/CD45+	Sca-1+/lin-/CD45-
			Oct4	0.85±0.01	174.49±12.43*
Nanog	0.51±0.02	145.14±29.36*
			Rex1	0.96±0.07	140.91±16.68*
Dppa3	0.24±0.03	39.25±4.49*
			Rif1	15.17±0.45	66.04±7.83*

·数据表达为相较于输入BMMNC中表达的表达的倍数增加(平均数+/-SD)。(n＝3个独立的类别，对于每一类从12个供体收集BM)。^*p＜0.00001

实施例8

分类的细胞的荧光染色

检测来自四个独立的类别的细胞中每个抗原的表达。Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对CXCR4(1∶100，兔多克隆IgG；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California，United States of America)、Met(1∶100，兔多克隆IgG；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California，United States of America)、LIF受体gp190(1∶200，小鼠单克隆IgG；BDBiosciences)、Oct4(1∶200，小鼠单克隆IgG；ChemiconInt.，Temecula，California，United States of America)、SSEA-1(1∶200，小鼠单克隆IgM；Chemicon Intl.，Temecula，California，United States of America)及Nanog(1∶200，山羊多克隆IgG；Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，California，United States of America)的抗体染色。利用合适的第二AlexaFluor 488山羊抗-兔IgG、Alexa Fluor 594山羊抗-小鼠IgG、Alexa Fluor 594山羊抗-小鼠IgG、Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgM和Alexa Fluor 594兔抗-山羊IgG(1∶400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States ofAmerica)。

在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。用DAPI染色细胞核(MolecularProbes，Eugene，Oregon，United States of America)。荧光图像用附着于NikonInverted Microscope Eclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统收集并由COOLSNAP^TM HQ数字B/W CCD(Roper Scientific，Tucson，Arizona，UnitedStates of America)照相机捕获。

实施例9

造血实验

对于细胞增殖实验，在用于集落形成单位-粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)集落的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)+白介素(IL)-3、用于爆裂式形成单位(burst forming unit)-红细胞系(BFU-E)集落的促红细胞生成素(EPO)+干细胞因子(SCF)、以及用于CFU-巨核细胞集落的血小板生成素(TPO)的存在下，将鼠或人分类的BMMNC平铺在无血清甲基纤维素培养基中，如Ratajczak et al.(2004a)103 Blood 2071-2078和Majka et al.(2001)97 Blood 3075-3085中所述。利用倒置显微镜，在7天时计数鼠造血集落，在12天时计数人造血集落。

对于CFU-S实验，用致命剂量的γ-射线(900cGy)照射雌性Balb/C小鼠(4-6周大)。24小时后，小鼠经由尾静脉注射被移植以从同系小鼠获得的1×10⁴个分类的BMMNC。在12天时，去除脾并固定在Tellysyniczky’s固定剂中，利用放大镜计数脾表面上CFU-脾集落，如Ratajczak et al.(2004a)103 Blood 2071-2078中所述。

对于长期再群体化(repopulation)实验，用致命剂量的γ-射线(900cGy)照射C57BL/6(Ly 5.2)小鼠。24小时后，小鼠被移植(通过尾静脉注射)以10⁶个从C57BL/6(Ly 5.2)分离的BMMNC以及来自C57BL/6(Ly 5.1)小鼠的2×10⁴个Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞或2×10⁴个Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺。移植的小鼠从后-眼血管丛(retro-orbital plexus)以各种间隔喂养以获得Ly5表型的样品。在移植后8个月评估供体-来源的嵌合体的最后分析。

实施例10

嵌合性实验

在FACSVANTAGE^TM(Becton Dickinson，Mountain View，California，United States of America)上分析PBMNC和BMMNC的样品。用FITC-结合的抗-CD45.2(克隆104)和PE-结合的抗-CD45.1(克隆A20)对细胞染色。在扣除背景后从两个分离的测量(Ly5.1-阳性和Ly5.2-阴性)计算供体结合的百分比。

实施例11

为了研究细胞迁移，简单地，将浓度为200ng/ml的SDF-1或HGF/SF(10ng/ml)或LIF(100ng/ml)溶解在4℃的Growth Factor ReducedMATRIGEL

Matrix(BD Bioscience，Bedford，Massachusetts，United States ofAmerica)中。没有化学引诱物的Growth Factor Reduced MATRIGEL

Matrix用作对照。MATRIGLE

的滴状物被转移到玻璃底孔(Willco WellsBV，Amsterdam，The Netherlands)上并在37℃孵育30分钟以聚合。随后将Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞重新悬浮在DMEM中，加入0.5％BSA，密度为2×10³/孔。

所述板在37℃、95％湿度、5％CO₂下孵育12小时。随后用Hoechst 33342(Sigma Aldrich，St.Louis，Misouri，United States of America)将Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞染色，利用附着于Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统，通过计数可见细胞的数量/100μm的MATRIGEL

滴状物周长，定量迁移到SDF-1剃度的细胞数量，并通过coolsnap HQ数字B/W CCD(Roper Scientific，Tucson，Arizona，United States ofAmerica)照相机捕获。

实施例12

统计分析

在Macintosh computer PowerBase 180上，利用Instat 1.14(GraphPad，SanDiego，California，United States of America)软件计算我们的FACS数据的算术平均数和标准差。利用用于未配对样品的Student t检验或用于多个比较的ANOVA分析数据。统计显著性限定为p＜0.05。

实施例13

骨髓来源的Sca-1 ⁺ /lin ^- /CD45 ^- 细胞类似未分化的胚胎干细胞

本申请的共同发明人先前表明BM包含造血Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺群和非造血Sca-1⁺/lin^-/CD45^-干细胞群(Kucia et al.(2005b)19 Leukemia1118-1127)，并且后面的细胞高度富集用于早期VSEL干细胞的标记物的mRNA。参见Kucia et al.(2005b)33 Exp Hematol 613-623和Kucia et al.(2004b)Circ Res 1191-1199。这里披露的是通过采用透射电子显微镜(TEM)评估这些细胞的形态学。

如图1A和1B所示，Sca-1⁺/lin^-/CD45^-(图1A)细胞与Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺(图1B)细胞相比尺寸上更小(3-4μm vs.8-10μm)，包含相对大的细胞核，并且具有细胞质的窄缘。此外，这些小Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的细胞核中的DNA包含作为多能胚胎干细胞的特征的开放型常染色质(参见图1A)。因此，本文首次披露了成年BM中存在胚胎样细胞的形态学证据。

实施例14

骨髓来源的Sca-1 ⁺ /lin ^- /CD45 ^- 细胞表达多个多能干细胞(PSC)标记物

Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞表达对于VSEL干细胞典型的mRNA。如本文所披露的，评估用于神经组织、骨骼和心肌、肝、胰腺、表皮、黑色素细胞及肠上皮的VSEL干细胞的多个标记物的基因的扩展的组(参见表3)。

有趣地是，确定这些细胞还表达通常与PSC相关的mRNA，包括Oct-4、Nanog、Rex1及Dppa3，并富集用于端粒酶蛋白Rif1的mRNA(参见表4)。此外，本申请披露的内容提供了纯化的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞在蛋白水平表达多个胚胎干细胞标记物(包括SSEA-1、Oct-4及Nanog)的证明(参见图2)。如其中所示出的，SSEA-1、Oct-4及Nanog分别在Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的57±7％、43±6％及28±4％上是可检测的，表明PSC蛋白在从BM新鲜分离的限定的细胞群中表达。

实施例15

骨髓-来源的Sca-1 ⁺ /lin ^- /CD45 ^- 表达CXCR4、c-met、和LIF-R

先前的研究表明表达VSEL干细胞标记物的BM-来源的细胞可以通过利用对于基质来源的因子-1(SDF-1)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)或白血病抑制因子(LIF)梯度的趋化性从BMMNC的悬浮液分离(Ratajczaket al.(2004b)18 Leukemia 29-40)。如本文所披露的，检测通过FACS纯化的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的相应群的相应受体(CXCR4、c-met及LIF-R)的表达。图3A示出：通过FACS分类的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞表达用于所有这些受体的mRNA。此外，如图3B所示，这些受体的表达还通过免疫染色确认。这些受体以纯化的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的82±6％(CXCR4)、61±8％(c-met)、和43±5％(LIF-R)上存在。此外，在直接趋化性研究中，确定这些高度纯化的细胞强烈地相应于SDF-1(参见图3C)、HGF/SF及LIF梯度。

实施例16

Sca-1 ⁺ /lin ^- /CD45 ^- 细胞在来自年轻小鼠的BM中富集

由共同发明人产生的先前的RQ-PCR数据表明来自年轻小鼠的BM包含多于来自年老小鼠的BM的PSC和/或VSEL干细胞(Kucia et al.(2005b)Leukemia 1118-1127)。如图4所示，通过采用源自1月大和1岁大的小鼠的BMMNC的FACS分析，已经确定Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的数量减少约6-10倍(图4A，下侧)。此外，本文披露的FACS分析符合从年老动物分离的BMMNC中的PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA表达的显著降低，如通过RQ-PCR评估的(图4B)。

实施例17

Sca-1 ⁺ /lin ^- /CD45 ^- 细胞在短寿命DBA/2J小鼠中减少

本文还披露了这样的发现，即Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的数量随着鼠品系而变化。尤其是，显示与长寿命C57BL/6小鼠相比，这些细胞的数量在短寿命DBA/2J小鼠中减少。图5中显示的数据表明实际上，在从来自3周大的DBA/2J小鼠的BMMNC分离的mRNA中，多个PSC/VSEL干细胞的mRNA显著减少。

实施例18

Sca-1 ⁺ /lin ^- /CD45 ^- 细胞存在于BM细胞的侧群中

已知BMMNC的侧群(SP)高度富集干细胞(参见，例如，Goodell etal.(1996)183 J Exp Med 1797-1806；Jackson et al.(2001)107 J Clin Invest1395-1402；Macpherson et al.118 J Cell Sci 2441-2450)。为了明确通过本文披露的技术鉴定的胚胎样干细胞是否存在于BMMNC的SP中，BMMNC的侧群从BM分离(参见图6A)。为了比较，Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞从相同的骨髓样品分离(参见图4A)。

随后，Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺(SP Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺)和Sca-1⁺/lin^-/CD45^-(SP Sca-1⁺/lin^-/CD45^-)细胞均从SP BMMNC分离。所有的这些细胞群与未纯化的BMMNC一起比较来自早期PSC/VSEL干细胞的mRNA的表达。如图6B所示，SP高度富集PSC/VSEL干细胞的标记物的mRNA。然而，从相同数量的BMMNC分离的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的总产量的计算表明：与从BMMNC的淋巴门直接分类的这些细胞相比，从SP再分类的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的数量约低两个数量级。此外，消除Sca-1⁺/lin^-/CD45^-群的SP细胞不表达PSC/VSEL干细胞的mRNA，其表明SP Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞可能负责SP细胞的多能性。

实施例19

Sca-1 ⁺ /lin ^- /CD45 ^- 细胞与Sca-1 ⁺ /lin ^- /CD45 ⁺ 细胞对比是非造血的

采用多个实验来评估从BM分离的胚胎样细胞是否具有造血潜能。首先，确定这些细胞是否能在体外造血集落中生长，但是没有检测到这些细胞的克隆形成活性。其次，与Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞相比，Sca-1⁺/lin^-/CD45^-不辐射防护致命照射的小鼠或在致命照射的同系受者中形成CFU-S集落。

为了明确这些细胞是否富集一些长期造血再群体化干细胞，通过采用供体/受者动物(在Ly.5基因座同基因异系(congenic))研究这些细胞在移植给致命照射的小鼠后对造血系统的长期再群体化的贡献。10⁴个来自Ly5.1小鼠的Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞与10⁶个Ly5.2的BMMNC细胞一起移植入Ly5.2受者小鼠导致在移植后8个月评估时约17±3％的小鼠嵌合性(n＝6)。在类似的实验中，在与10⁶个BMMNC共移植的2×10⁴个Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的移植后观察到供体细胞对造血没有贡献(参见图7)。在类似的实验中将绿色免疫荧光阳性(GFP+)Sca-1⁺/lin^-/CD45^-和Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞移植到致命照射的同系受体中后获得类似的结果。

实施例1-19的讨论

BM-来源的细胞对组织再生的贡献已经由一些研究者解释，涉及HSC的转-去分化现象。然而，共同发明人已经确定BM包含稀有Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞群，其表达非造血干细胞的多个标记物并且能够在体外培养中分化为中胚层-来源的心肌细胞和外胚层-来源的神经细胞。这些细胞已经被称为非常小的胚胎样(VSEL)干细胞。VSEL干细胞在器官发生和快速身体生长/扩展期间循环是可能的。由于VSEL干细胞对应SDF-1梯度，因此单独或与其它化学引诱剂结合的SDF-1-CXCR4轴可以在年轻BM中这些细胞的积聚中扮演关键角色。

本文披露的是这些高度纯化的BM-来源的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞(～0.02％的BMMNC)在mRNA和蛋白水平表达多个胚胎干细胞标记物，如表面标记物SSEA-1和转录因子Oct-4、Nanog及Rex-1。在直接TEM研究中，观察到这些细胞非常小(3-4μm)并且表现出非常不成熟的形态(例如，它们具有相对大的细胞核并包含不成熟的开放型常染色质)。这些细胞中的开放型染色质不仅与胚胎干细胞的mRNA的存在相关，还与多个VSEL干细胞的mRNA的存在相关，如那些能够分化为骨骼肌、心肌、神经、肝、肠上皮、皮肤表皮、黑色素细胞及内分泌胰腺的那些VSEL干细胞。因此，本文首次披露了成年BM中胚胎样细胞群在形态学水平的鉴定。

此外，这些细胞的一些在蛋白水平表达神经、心脏、或骨骼肌的早期发育标记物，表明尽管它们的类似的同源形态，这些细胞表现出一定程度的组织定向并且是异源的。有趣的是，注意到干细胞的多个潜在化学引诱剂(例如，SDF-1、HGF/SF及LIF)的表达在损伤的器官中上调，并且缺氧调节的/诱导的转录因子(HIF-1)在它们的表达中扮演重要角色(Ceradini et al.(2004)10 Nat Med 858-864；Pennacchietti et al.(2003)3 Cancer Cell 347-361)。为了支持这个观点，SDF-1、HGF/SF及LIF的启动子包含多个功能性HIF-1结合位点。因此，SDF-1-CXCR4、HGF/SF-c-met及LIF-LIF-R轴可以引导干细胞的转运(trafficking)。

为了支持这个观点，本文披露了证明：高度纯化的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞在蛋白水平表达CXCR4、c-met及LIF-R，并且通过趋化性分别强烈地响应于SDF-1、LIF及HGF/SF梯度。这个观察与下述事实一致，即，鼠胚胎干细胞还在它们的表面上表达功能性CXCR4、c-met及LIF-R，并且SDF-1、HGF/SF及LIF影响这些细胞的活动性(Kucia et al.(2005c)23 Stem Cells879-894；Guo et al.(2005)23 Stem Cells 1324-1332)。

还可以期待如果Sca-1⁺/lin^-/CD45^-BMMNC群富集胚胎样PSC，那么这些细胞还应该能够沿着造血谱系分化。然而，在移植入致命照射的受者后，既不保护致命照射的小鼠，也不有助于长期的造血。因此，CD45^-细胞群似乎仅限于异源非造血VSEL干细胞。然而，还可能在本文披露的标准实验中，没有检测到Sca-1⁺/lin^-/CD45^-BMMNC的潜在多能性并且在注射入发育中的胚泡后获得对它们的造血潜能的最终答案。

鉴定的胚胎样干细胞的数量在年轻动物的BM中更高，并且它们的数量随着年龄减少。此外，Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞在相当于50岁老人的1岁大的小鼠中几乎不能检测到。BM中VSEL干细胞的这个年龄依赖含量可以解释为什么再生过程在较年轻的个体中更有效。还注意到长寿命和短寿命小鼠品系之间的BMMNC中Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的含量差别。与较短寿命(DBA/2J)小鼠相比，长寿命(例如，C57BL/6)的BM中这些细胞的浓度高得多。

最后，VSEL干细胞是高度活动的并响应于SDF-1梯度及附着于BM-来源的成纤维细胞。时间-推移研究表明这些细胞快速附着于、迁移于之下、和/或经历这些细胞中的伸入运动(emperipolesis)。在与CXCR4拮抗剂T140预孵育后，VSEL干细胞与BM-来源的成纤维细胞的相互作用被有效抑制。由于成纤维细胞分泌SDF-1和其它化学引诱剂，它们可以为这些细胞创造靶向环境。它们与BM-来源的成纤维细胞的强烈的相互作用具有重要的含义-表明分离的BM基质细胞可能被这些小胚胎样PSC/VSEL干细胞“污染”。

似乎本文披露的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞代表BM-来源的干细胞的新的亚群。例如，间充质干细胞(MSC)具有与成纤维细胞类似的形态。造血细胞为CD45⁺。MSC也是CXCR4^-和CD34^-，并且从没有在单细胞水平被鉴定。类似地，推定的多能成年祖细胞(MAPC)还没有在单细胞水平被明确地鉴定，USSC细胞或MIAMI细胞也没有。这些细胞的存在仅基于观察到的脐带血或骨髓细胞体外分化为不同的组织而被推定。

此外，应该考虑Sca-1⁺/lin^-/CD45^-PSC/VSEL干细胞非常小这个事实，尤其是在基于用于从BM、mPB及CB分离干细胞的梯度或速度离心的方案中。非常可能PSC/VSEL干细胞由于它们非常小的尺寸而在这些分离过程中被丢失。

实施例20

胚状体样球体的形成

在具有4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、5％热失活的FBS、10ng/mlrhEGF、10ng/ml FGF-2的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium中，将从C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J小鼠(可以从The Jackson Laboratory，BarHarbor，Maine，United States of America获得)的BMMNC分离的GFP⁺Sca-1⁺/lin^-/CD45^-(5×10⁴/35mm玻璃底板)与C2C12细胞(1.5×10⁶/35mm玻璃底板)一起培养，其是可以从American Type Culture Collection(ATCC；Manassas，Virginia，United States of America)商购获得的小鼠成肌细胞细胞系的亚克隆。每日将生长因子加入培养基中。每72小时更换培养基。在开始共培养后约5-7天开始出现胚状体样球体。

用碘化丙啶对来自VSEL干细胞-来源的球体(VSEL-DS)的细胞进行染色并进行FACS分析以评估细胞的多倍性。三个独立的实施例示于图12中。

将胚状体在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对SSEA-1(1∶200，小鼠单克隆IgM；Chemicon Intl.，Temecula，California，United States of America；参见图8A)或Oct4(1∶200，小鼠单克隆IgG；Chemicon Int.；参见图8B)的抗体染色。利用合适的第二Alexa Fluor 594抗-小鼠IgM和Alexa Fluor 594山羊抗-小鼠IgG(1∶400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States ofAmerica)。在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。用DAPI(Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)标记细胞核。通过抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor 488结合物(1∶400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，UnitedStates of America；参见图9A和9B)，绿色荧光蛋白被可视化。荧光图像用附着于Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统收集并由cool snap HQ数字B/W CCD(Roper Scientific，Tucson，Arizona，United States of America)照相机捕获。

实施例21

VSEL干细胞平铺在C2C12细胞上

鼠C2C12细胞是原始成肌细胞细胞系，用作用于肌生成(myogeneic)分化的模型。为了将VSEL干细胞分化/扩展为肌原(myogenic)谱系，通过FACS纯化的BM-来源的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-VSEL干细胞被平铺在C2C12细胞上。5-10％的平铺的VSEL干细胞开始增殖并形成轻微地附着/漂流的包含圆形细胞的胚状体样球体。

为了排除这些胚状体样球体由C2C12细胞形成的可能性，从GFP⁺小鼠分离VSEL干细胞，如实施例20那样形成胚状体样球体。确定胚状体样球体由GFP⁺VSEL干细胞形成。

通过DNA倍数性分析，排除C2C12细胞和VSEL干细胞之间融合的可能性。简短地，用碘化丙啶对从鼠淋巴结分离的细胞、HSC(造血干细胞；Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺)或VSEL干细胞(Sca-1⁺/lin^-/CD45^-)染色并进行FACS分析。通过用碘化丙啶对细胞染色并随后进行FACS分析测定每个细胞的DNA含量(参见图10)。

有趣地是，胚状体样球体表达胚胎干细胞特异性碱性磷酸酶(参见图13)。

胚状体样球体的进一步表征表明它们表达早期胚胎发育标记物，如SSEA-1、GATA-6、GATA-4、FOXD1及Nanog(参见图14)。透射电子显微镜表明存在于VSEL干细胞-来源的胚状体样球体中的细胞在尺寸上大于它们来源的原始VSEL干细胞(图15，上侧)，但仍具有包含常染色质的非常原始的细胞核。

VSEL干细胞的发育迁移可以通过SDF-1、HGF/SF及LIF协调(orchestrated)。进一步确定从VSEL干细胞-来源的胚状体样球体分离的细胞通过MAPKp42/44的强烈磷酸化响应于这些因子的刺激，其表明这些因子可在它们的发育和迁移中起作用。进一步确定相应的受体(分别为CXCR4、c-met及LIF-R)在VSEL干细胞-来源的胚状体样球体的表面上表达(图15，中侧)。

此外，来自VSEL干细胞-来源的胚状体样球体(VSEL-DS)的细胞，在C2C12细胞上再平铺后，可以再生长新的胚状体样球体(一直到至少5-7个另外的传代)。然而，这些胚状体样球体的数量和大小随着每次传代而变得更小。从来自连续传代的胚状体样球体分离的细胞的RT-PCR分析表明调节胚状体的原肠胚形成的基因的mRNA的表达增加，如GATA-6、Cdx2、Sox2、HNF3、AFP(图15，下侧)。

实施例22

胚状体样球体的神经元分化

为了产生神经元衍生物(神经元、少突胶质细胞、神经胶质细胞)，将10-50个胚状体样球体/35mm玻璃底板平铺在补充有10ng/ml的rhEGF、20ng/ml FGF-2及20ng/ml NGF的NeuroCult Basal Medium(Stem CellTechnologies，Vancouver，British Columbia，Canada)中。将细胞培养10-15天。每24小时加入生长因子，每2-3天更换培养基。

分化15天时，将细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断、并随后用针对βIII微管蛋白(1∶100，兔多克隆IgG；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California，United States of America)、巢蛋白(1∶200，小鼠单克隆IgG1；ChemiconInt.，Temecula，California，United States of America)、或O4(1∶200，少突胶质细胞标记物4，小鼠单克隆IgM；Chemicon Intl.)的抗体染色。利用合适的第二Alexa Fluor 594山羊抗-兔IgG、Alexa Fluor 594山羊抗-小鼠IgG、和Alexa Fluor 594山羊抗-小鼠IgM(1∶400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)。在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。

图16A-16C和17A-17D总结了源于VSEL干细胞的少突胶质细胞(图16A-16C)和神经元(17A-17D)的染色。在图16和17中，蓝色表示细胞核的DAPI染色(分子探针；蓝色)，巢蛋白染色表现为红色，绿色荧光蛋白(GFP)由抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor 488结合物(1∶400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)可视化。GFP存在于分离的细胞中，其是从GFP⁺小鼠(购自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，UnitedStates of America的C57BL/6-Tg(ACTbEGFP)1Osb/J小鼠)分离的。荧光图像用附着于Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300的TE-FMEpi-Fluorescence系统收集并由cool snap HQ数字B/W CCD(RoperScientific，Tucson，Arizona，United States of America)照相机捕获。

实施例23

胚状体样球体的内胚层分化

开始分化前，在PBS中简单冲洗胚状体样球体。将10-50个胚状体样球体/35mm玻璃底板平铺在补充有4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、1％热失活的FBS及50ng/ml的重组人活化素A的DMEM/F12 Medium中。48小时后，更换培养基并在N2补充物-A、B27补充物及10mM烟酰胺(购自StemCell Technologies Inc.，Vancouver，British Columbia，United States of America)的存在下，在具有4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、5％热失活的FBS的DMEM/F 12 Medium中进行分化。每隔一天更换培养基。在培养12-17天后出现岛样集簇。

分化17天时，将细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对胰腺C-肽(1∶100，豚鼠IgG，Linco Research，Inc.，St.Charles，Missouri，United States ofAmerica)的抗体染色。利用合适的第二Alexa Fluor 594抗-豚鼠IgG(1∶400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)。在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。

图18A-18C总结了源于VSEL干细胞的内胚层细胞的染色。在图18A-18C中，蓝色表示细胞核的DAPI染色(Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America；蓝色)，C-肽染色表现为红色，绿色荧光蛋白(GFP)由抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor 488结合物(1∶400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)可视化。GFP存在于分离的细胞中，其是从GFP⁺小鼠(购自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，United Statesof America的C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J小鼠)分离的。荧光图像用附着于Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统收集并由cool snap HQ数字B/W CCD(Roper Scientific，Tucson，Arizona，United States of America)照相机捕获。

实施例24

胚状体样球体的心肌细胞分化

将10-50个胚状体样球体/35mm玻璃底板平铺在具有4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、10％热失活的FBS及10ng/ml bFGF、10ng/mlVEGF及10ng/mlTGFβ1的DMEM中。每24小时加入生长因子，每2-3天更换培养基。在分化约15-17天后心肌细胞分化。

分化17天时，将细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对肌钙蛋白I(1∶200，小鼠单克隆IgG2b；Chemicon Intl.，Temecula，California，United States ofAmerica)及α-横纹肌(sarcomeric)辅肌动蛋白(1∶100，小鼠单克隆IgM，Abcam，Inc.，Cambridge，Massachusetts，United States of America)的抗体染色。利用合适的第二Alexa Fluor 594山羊抗-小鼠IgG和Alexa Fluor 594抗-小鼠IgM(1∶400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)。在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。

图19A-19C和20A-20D总结了源于VSEL干细胞的心肌细胞的染色。在图19A-19C中，蓝色表示细胞核的DAPI染色(Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America；蓝色)，肌钙蛋白I染色表现为红色，绿色荧光蛋白(GFP)由抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor 488结合物(1∶400；MolecularProbes，Eugene，Oregon，United States of America)可视化。在图20A-20D中，红色对应α横纹肌辅肌动蛋白的染色。GFP存在于分离的细胞中，其是从GFP⁺小鼠(购自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，United States ofAmerica的C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J小鼠)分离的。荧光图像用附着于Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统收集并由cool snap HQ数字B/W CCD(Roper Scientific，Tucson，Arizona，United States of America)照相机捕获。

实施例21-24的讨论

为了支持下述假定：从单独的VSEL干细胞生长的胚状体样球体中存在的细胞能够分化为全部三个胚层，来自单独的VSEL-DS的细胞被平铺在支持心肌细胞、神经元细胞及胰腺细胞的分化培养基上。组织化学染色及RT-PCR分析(图21A-21C)表明：来自单独的VSEL干细胞-来源的球体的细胞分化为心肌细胞(中胚层)、神经细胞和少突胶质细胞(外胚层)及胰腺β-岛(内胚层)产胰岛素细胞。细胞形态和谱系特异性蛋白的表达的这些变化与组织特异性基因的上调平行(参见图21)。

实施例25

心肌梗塞的研究

利用购自Jackson Laboratory的两组(n＝24/组)野生型小鼠(C57BL/6、129品系，体重25-35g，年龄12-16周)。实验准备已经描述在Guo et al.(1998)275 Am J Physiol H1375-1387和Guo et al.(1999)96 Proc Natl Acad Sci.USA11507-11512中。小鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg i.p.)麻醉、插管、利用小啮齿动物通气机通气。实验中体温、心率及动脉pH被小心地维持在生理范围内。利用无菌技术，通过中线胸骨切开术打开胸腔。在从左心耳的心尖左前向下冠状动脉2-3mm下用锥形针穿过8-0尼龙缝合线，将非-外伤性气囊阻塞物用在动脉上。通过膨胀气囊阻塞物诱导冠状动脉梗塞。组I的小鼠经历30分钟冠状动脉梗塞，随后再灌注，而组II中的小鼠经历假手术(1小时开胸状态)。参见Guo et al.(1998)275 Am J Physiol H1375-1387和Guo et al.(1999)96 Proc Natl Acad Sci.USA 11507-11512。在再灌注开始后6小时、24小时、48小时、或96小时处死小鼠(在每个时间点每个组中n＝6只小鼠)。

安乐死后，将血液样品(对于每只小鼠1.0-1.5ml)收集在肝素-冲洗的注射器中用于外周血单核细胞(PBMNC)的分离。从缺血和非-缺血区收集心肌组织样品并立即冷冻在液氮中用于mRNA提取。

实施例26

心脏标记物的体外表达

测试培养基中骨髓-来源的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-MNC分化为心肌细胞表型的能力。由于在单独培养时Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞不能存活，Sca-1⁺/lin^-/CD45^-和Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺BMMNC在分离的板中与为细胞存活提供有益环境的未纯化的骨髓细胞一起培养。21天后，免疫染色这些细胞以检测心脏-特异性肌球蛋白重链和心脏肌钙蛋白I的表达。Sca-1⁺/lin^-/CD45^-BMMNC被加入的板中培养的细胞(图22A-22C和22D-22F)与Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞被加入的板相比，表现出不同的表型。在具有Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的板中的多个细胞对于心脏-特异性肌球蛋白重链是阳性的(图22B、22C、22E及22F；绿色荧光)。这些心脏-特异性肌球蛋白重链-阳性细胞中的许多对于心脏肌钙蛋白I也是阳性的(图22D和22F[箭头]；红色荧光)。

相反，Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞被加入其中的板中培养的细胞(图22G-22I)对于这些心脏-特异性抗原的表达主要是阴性的(图22H)。在图22A-22I，通过DAPI鉴定细胞核(蓝色荧光)。这些结果表明Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞能够在培养基中分化为心肌细胞表型。

实施例27

免疫组织化学

通过免疫组织化学检验PSC/VSEL干细胞中心脏-特异性标记物(GATA-4和Nkx2.5/Csx)的表达。鼠对照(未纯化的)BMMNC和化学吸引于SDF-1、HGF及LIF的BMMNC、或通过FACS分类的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-和Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺BM来源的细胞在1％多聚甲醛中固定30分钟、被0.5％Triton×100渗透、在4℃与兔多克隆抗-GATA-4(Santa Cruz)和兔多克隆抗-Nkx2.5/Csx(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California，UnitedStates of America)初始抗体整夜孵育。FITC-和TRITC-标记的第二抗体分别用于检测GATA-4和Nkx2.5/Csx。利用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 510，CarlZeiss，Thornwood，New York，United States of America)计数对于心脏标记物阳性的细胞并表达为总MNC的百分数。

实施例28

功能性多能VSEL干细胞数量随着年龄减少

还研究了年轻与年老小鼠中VSEL干细胞的数量。观察到可以通过FACS分类的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞的产量随着年龄减少(图23和24)。进一步确定VSEL-DS可以在与C2C12细胞的共培养中仅由从年轻小鼠分离的VSEL干细胞形成(图25)。有趣的是，来自2.5-岁大的动物的VSEL干细胞在与C2C12共培养时形成圆形细胞的细胞集簇。这些圆形细胞表达CD45抗原并且能够在甲基纤维素的第二培养基中中生长造血集落(图26)。

实施例29

VSEL干细胞从脐带血的分离

脐带血(CB)来源的VSEL干细胞的染色和分离

在室温下将全人脐带CB在BD裂解缓冲液(BD Biosciences，San Jose，California，United States of America)中裂解并在PBS中冲洗两次。单细胞悬浮液被染色用于与FITC结合的多个谱系标记物(CD2克隆RPA-2.10；CD3克隆UCHT1；CD14克隆M5E2；CD66b克隆G10F5；CD24克隆ML5；CD56克隆NCAM16.2；CD16克隆3G8；CD19克隆HIB19；以及CD235a克隆GA-R2)、与PE结合的CD45(克隆HI30)、与APC结合的CXCR4(克隆12G5)、CD34(克隆581)或CD133(CD133/1)的组合，在冰上进行30分钟。冲洗后，通过FACS(BD Biosciences，San Jose，California，UnitedStates of America)分析细胞。获得至少10⁶个事件并通过利用Cell Quest软件分析。

通过多参数、活性无菌细胞分类从CB MNC的悬浮液分类CXCR4⁺/lin^-/CD45^-、CD34⁺lin^-/CD45^-、或CD133⁺/lin^-/CD45^-细胞(MOLFO^TM，DakoA/S，Fort Collins，Colorado，United States of America，或BD FACSARIA^TMCell-Sorting System，BD Biosciences，San Jose，California，United States ofAmerica)。

透射电子显微镜(TEM)分析。对于透射电子显微镜，CXCR4⁺/lin^-/CD45^-细胞在0.1M卡可酸盐缓冲液(pH7.4)中3％戊二醛中4℃固定10小时，在四氧化锇(osmium tetride)中后-固定及脱水。随后将固定的细胞包埋在LX112树脂(Ladd Research Industries，Inc.，Burlington，Vermont，United Statesof America)中并以800A切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色、并在PhilipsCM10电子显微镜(Philips，Eindhoven，the Netherlands)(在60kV运行)上观察。

RT-PCR。利用RNEASYMini Kit(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States of America)分离总RNA。根据制造商的说明，采用一步RT-PCR(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States of America)逆转录mRNA(10ng)。利用HOTSTARTAQ

DNA聚合酶(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States of America)扩增获得的cDNA片段。用于Oct4的引物序列为正向引物：5’-TTG CCA AGC TCC TGA AGC A-3’(SEQ ID NO：65)和反向引物：5’-CGT TTG GCT GAA TAC CTT CCC-3’(SEQ ID NO：66)，用于Nanog的引物序列为正向引物：5’-CCC AAA GCT TGC CTT GCT TT-3’(SEQ IDNO：67)和反向引物：5’-AGA CAG TCT CCG TGT GAG GCA T-3’(SEQ IDNO：68)。PCR产物的正确尺寸通过琼脂糖凝胶上的分离确认。

实时RT-PCR(RQ-PCR)。为了分析Oct4、Nanog、Nkx2.5/Csx、VE-钙粘蛋白及GFAP mRNA水平，借助RNEASYMini Kit(Qiagen Inc.，Valencia，California，United States of America)从细胞分离总mRNA。借助TAQMAN

Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems，Foster City，California，United States of America)逆转录mRNA。利用ABI PRISM

7000Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，California，UnitedStates of America)，通过实时RT-PCR进行Oct4、Nanog、Nkx2.5/Csx、VE-钙粘蛋白、GFAP及β2-微球蛋白mRNA水平的检测。25μl反应混合物包含12.5μl SYBR Green PCR Master Mix、10ng的cDNA模板、用于Oct4的5’-GAT GTG GTC CGA GTG TGG TTC T-3’(SEQ ID NO：69)正向和5’-TGT GCA TAG TCG GTG GTT GAT-3’(SEQ ID NO：70)的反向引物；用于Nanog的5’-GCA GAA GGC CTC AGC ACC TA-3’(SEQ ID NO：71)正向和5’-AGG TTC CCA GTC GGG TTC A-3’(SEQ ID NO：72)反向引物；用于Nkx2.5/Csx的5’-CCC CTG GAT TTT GCA TTC AC-3’(SEQ ID NO：73)正向和5’-CGT GCG CAA GAA CAA ACG-3’(SEQ ID NO：74)反向引物；用于VE-钙粘蛋白的5’-CCG ACA GTT GTA GGC CCT GTT-3’(SEQ ID NO：75)正向和5’-GGC ATC TTC GGG TTG ATC CT-3’(SEQ ID NO：76)反向引物；用于GFAP的5’-GTG GGC AGG TGG GAG CTT GAT TCT-3′(SEQ ID NO：77)正向和5’-CTG GGG CGG CCT GGT ATG ACA-3′(SEA ID NO：78)反向引物；用于2微球蛋白的5’-AAT GCG GCA TCT TCA AAC CT-3’(SEQ ID NO：79)正向和5’-TGA CTT TGT GAG AGC CCA AGA TA-3’(SEQ ID NO：80)反向引物。借助PRIMEREXPRESS

软件(Applied Biosystems，Foster City，California，United States ofAmerica)设计引物。

随后测定阈值周期(Ct；即，扩增的感兴趣的基因到达固定阈值的量的周期数)。用比较Ct方法计算Oct4和Nanog mRNA表达的相对定量。靶标的相对定量值，标准化为内源性对照β2-微球蛋白基因并相对于校准器，表达为2^-ΔΔCt(倍数差别)，其中ΔCt＝靶基因(Oct4、Nanog、Nkx2.5/Csx、VE-钙粘蛋白、GFAP)的Ct-内源性对照基因(β2-微球蛋白)的Ct，ΔΔCt＝靶基因的样品的ΔCt-靶基因的校准器的ΔCt。

为了避免扩增污染DNA的可能性，用于实时RTR-PCR的所有引物用要扩增的cDNA内的内含子序列设计，利用合适的阴性对照(无模板的对照)进行反应，通过分析扩增产物的熔解曲线(解离图)复查产物的均匀扩增，熔解温度(Tm)为57-60℃，产物Tm比引物Tm至少高10℃，并且，进行凝胶电泳以确认扩增产物的正确尺寸和非特异性带的缺乏。

CB-来源的VSEL干细胞的荧光染色。检测来自四个独立的实验的细胞中每个抗原的表达。CXCR4⁺/lin^-/CD45^-细胞在3.5％多聚甲醛中固定20分钟、被0.1％Triton×100渗透、在PBS中冲洗、用2％BSA预阻断并随后用针对SSEA-4(克隆MC-813-70；1∶100；小鼠单克隆IgG，Chemicon Intl.，Temecula，California，United States of America)、Oct-4(克隆9E3；1∶100；小鼠单克隆IgG；Chemicon Intl.，Temecula，California，United States ofAmerica)、以及Nanog(1∶200，山羊多克隆IgG；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，California，United States of America)的抗体染色到。利用合适的第二Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG、Alexa Fluor 594山羊抗-小鼠IgG及Alexa Fluor 594兔抗-山羊(1∶400；Molecular Probes，Eugene，Oregon，United States of America)。

在对照实验中，细胞仅用第二抗体染色。用DAPI标记细胞核(MolecularProbes，Eugene，Oregon，United States of America)。荧光图像用附着于NikonInverted Microscope Eclipse TE300的TE-FM Epi-Fluorescence系统收集并由cool snap HQ数字B/W CCD(Roper Scientific，Tucson，Arizona，United Statesof America)照相机捕获。

统计分析。在Macintosh computer PowerBase 180上，利用Instat 1.14(GraphPad，San Diego，Califormia，United States of America)软件计算FACS数据的算术平均数和标准差。利用用于未配对样品的Student t检验或用于多个比较的ANOVA分析数据。统计显著性限定为p＜0.05。

还利用实施例2中描述的通常的FACS方法从人类脐带血分离VSEL干细胞。对于人类细胞，采用直接针对CXCR4(用别藻蓝蛋白(APC)标记)、CD45(用藻红蛋白(PE)标记)、CD19、CD16、CD2、CD14、CD3、CD24、CD56、CD66b及CD235a的抗体。用荧光素异硫氰酸盐(FITC)标记针对谱系标记物的抗体。分离的VSEL干细胞是CXCR4⁺/lin^-/CD45^-，在TEM下看起来类似鼠VSEL干细胞(即，直径约3-4μm，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核、并包含开放型染色质(常染色质))，通过实时RT-PCR富集多能干细胞的标记物(参见实施例7)。

实施例29的讨论

CD34 ⁺ CD133 ⁺ CXCR4 ⁺ lin ^- /CD45 ^- 细胞群存在于CB中

进行多参数分析(在图32中绘出)以确定人类CB单核细胞(CB MNC)是否包含类似于VSEL干细胞的细胞群。为了从CB分离MNC，不采用Ficoll-Paque离心，通过低渗裂解去除红细胞。此外，假定CB-VSEL干细胞，类似它们在成年鼠BM中的相对物，将是小的并且是lin^-/CD45^-。

因此，研究小(＜5μm)lin^-/CD45^-CB MNC群。还研究这些细胞如同它们的鼠BM-来源的相对物那样表达CXCR4。此外，检测所述细胞的其它人类干细胞抗原如CD133和CD34的表达。

图27A示出了人类CB包含表达CXCR4(0.037±0.02％，n＝9)、CD34(0.018±0.028％，n＝5)及CD133(0.018±0.008％，n＝5)的lin^-/CD45^-MNC群。这些CXCR4⁺/CD133⁺/CD34⁺/lin^-/CD45^-细胞通过FACS以类似于VSEL干细胞的方式分类、不在体外生长造血集落、并且还类似于鼠VSEL干细胞，非常小(约3-5μm；图27B，上侧)。相反，CB-来源的lin^-/CD45⁺造血细胞较大(＞6μm；图27B，下侧)。此外，在CB-来源的小lin^-/CD45^-细胞中观察到CXCR4、CD34及CD133抗原的共表达的显著重叠，确定lin^-/CD45^-细胞的0.015±0.005％为CXCR4⁺/CD133⁺/CD34⁺。

通过FACS分类的CB-来源的CXCR4⁺/CD133⁺/CD34⁺/lin^-/CD45^-细胞，以及CXCR4⁺/lin^-/CD45^-、CD34⁺/lin^-/CD45^-及CD133⁺/lin^-/CD45^-/细胞高度富集由多能胚胎细胞表达的转录因子如Oct-4和Nanog的mRNA(图28A和28B)。随后通过常规RT-PCR确认这些标记物的表达(图28C)。此外，这些细胞，如本文对于BM-来源的VSEL干细胞披露的，还富集对于不同器官/组织的多个发育基因如Nkx2.5/Csx、VE-钙粘蛋白及GFAP的mRNA，其分别是心脏-、内皮-及神经组织定向干细胞(TCSC)的标记物。

CB-来源的CXCR4 ⁺ lin ^- /CD45 ^- 细胞在蛋白水平表达SSEA-4、Oct-4及 Nanog。鼠BM-来源的VSEL干细胞在蛋白水平表达SSEA-1、Oct-4及Nanog。因此，进行免疫荧光染色以评估CB-VSEL干细胞是否也表达类似的胚胎干细胞标记物。图29示出了染色的实例，表明高度纯化的CB-来源的CXCR⁺/lin^-/CD45^-细胞在它们的表面上表达SSEA-4并在细胞核中表达Oct-4和Nanog转录因子。

CB-来源的CXCR4 ⁺ /lin ^- /CD45 ^- /细胞的透射电子显微镜分析。通过透射电子显微镜(TEM)分析CXCR4⁺/CD34⁺/CD133⁺/lin^-/CD45^-细胞。图30表明CB-VSEL干细胞非常小～3-5μm并包含相对大的细胞核和具有许多线粒体的细胞质的窄缘。这些细胞的细胞核中的DNA包含作为多能胚胎干细胞的特征的开放型常染色质。因此，当前披露的主题首次提供了成年CB中存在非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的独特群的形态学证据。

实施例30

VSEL-DS可以分化为造血细胞

观察到从源自GFP⁺小鼠的VSEL-DS分离的细胞如果平铺在补充有IL-3+GM-CSF的甲基纤维素培养基中时，形成小的第二球体(图31A和31B)。通过从初始甲基纤维素培养基的甲基纤维素溶解回收的这些第二球体制备的单细胞悬浮液，如果再次平铺在甲基纤维素培养基(中侧)或血浆凝块(plasma clot)(右侧)中并由IL-3和GM-CSF刺激，形成造血集落。这些为造血集落的证据通过FACS分析来自甲基纤维素中生长的溶解集落的细胞的CD45表达或通过免疫荧光染色来自血浆凝块培养基中生长的集落的细胞的CD45而获得(图31C)。

平行地，通过采用实时RT-PCR分析从甲基纤维素中生长的集落分离的细胞的造血基因的表达。在IL-3+GM-CSF的存在下，在扩展期间，通过常规RT-PCR并通过RQ-PCR观察到造血转录因子如c-myb、PU-1及SCL的mRNA的上调。因此，VSEL干细胞可能是BM中最原始的HSC的来源。

实施例31

VSEL-DS体外分化为造血细胞

VSEL-DS被胰蛋白酶化(trypsynized)并平铺在基于甲基纤维素的培养基(StemCell Technologies Inc.，Vancouver，British Columbia，Canada)中。在甲基纤维素培养基中培养5天时，细胞增殖并形成小球体。这些球体通过抽吸从甲基纤维素培养基回收、被冲洗并胰蛋白酶化以获得单细胞悬浮液，并重新平铺在基于甲基纤维素的培养基中，所述基于甲基纤维素的培养基包含用于造血集落形成的细胞因子和生长因子的所选组合。

为了CFU-GM集落生长，加入鼠白介素-3(mlL-3)+鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子m(GM-CSF)。同时，将这些细胞的等分试样平铺在血浆凝块培养基中。为此的原因是这些培养基适于通过免疫荧光和免疫组织化学染色分析。在第4-6天在甲基纤维素和血浆凝块条件中均形成造血集落。回收来自甲基纤维素中生长的集落的细胞用于mRNA分离或FACS分析。

实施例32源自骨髓的非常小的胚胎样干细胞(VESL)的移植削弱心肌梗塞之后的左心室功能紊乱和重塑

成人骨髓(BM)含有Sca-1+/Lin-/CD45-非常小的胚胎样干细胞(VSEL)，其表达几种谱系的标记物(包括心脏标记物)并在体外分化成心肌细胞。我们检测了源自骨髓的VSEL是否促进重灌注的心肌梗塞(MI)之后的心肌修复。小鼠进行30分钟的冠状动脉闭塞，然后进行重灌注并且在MI之后48小时接受心肌内注射载体(n＝11)、1X10⁴个Sca-1+/Lin-/CD45+EGFP-标记的造血干细胞(n＝13[细胞对照组])，或1X10⁵个Sca-1+/Lin-/CD45-EGFP-标记的细胞(n＝14[VSEL处理组])。在MI之后第35天，与载体处理的对照相比，VSEL处理的小鼠在存活组织(组织学和超声心动描记术)中表现出改善的整体和局部左心室(LV)心脏收缩功能(超声心动描记术)和削弱的肌细胞肥大。相反，移植Sca-1+/Lin-/CD45+细胞未能赋予任何功能上或结构上的益处。分散的EGFP+肌细胞和毛细血管存在于VSEL处理的小鼠的梗塞区域，但是它们的数目很少。移植相对较少数目的CD45-VSEL足以在MI之后改善LV功能并减少肌细胞肥大，而数目多十倍的CD45+造血干细胞是无效的。这些结果支持VSEL移植用于心脏修复的潜在治疗性应用。

动物中的很多研究已经证实心肌梗塞(MI)之后以骨髓(BM)细胞(BMC)治疗后左心室(LV)功能和解剖的改善[1]。临床试验的最初结果也提示在患有急性MI和缺血性心肌病的患者中以BMC治疗之后LV功能的改善和结痂尺寸的减小[2]。但是，在动物和人类研究中使用了几种不同的BMC类型、数目和给药途径。

成人BM含有小CXCR4+细胞群，其为非造血细胞并同时表达几种不同组织的谱系标记物，从而显示出分化为各种不相关谱系的潜力[3-5]。这些非常小的胚胎样干细胞(VSEL)是Sca-1+/Lin-/CD45-；它们表达(除了其它的谱系标记物之外)心脏标记物，包括Nkx2.5/Csx、GATA-4和MEF2C，并在体外特定培养条件下获得心肌细胞表型[5]。在MI中以BMC治疗观察到的有益效应可能至少部分归功于VSEL。因此，选择性给予VSEL本身应该足以在实验性MI中产生功能和结构上的改善，虽然缺少BM中存在的所有其它的细胞类型。

因此，本研究的目的在于：(i)确定直接心肌内移植VSEL是否产生LV功能和梗塞后重塑的改善，和(ii)研究VSEL治疗效应的潜在机理。为了将细胞特异性作用与非特异性作用区分开，将Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL与Sca-1+/Lin-/CD45+细胞(高度富含造血干细胞，与VSEL的差别仅在于CD45的表达)直接进行比较。结果显示在重灌注MI之后给予少量的VSEL足以改善LV功能和尺寸并削弱心肌肥大。相反，移植数目多得多的Sca-1+/Lin-/CD45+细胞没有有益效应。VSEL减少梗塞后LV重塑的能力使得有理由进一步研究这些细胞的治疗性应用，并且可能对于将来动物和人类中的BMC介导的心脏修复的研究设计具有显著意义。

本研究按照路易斯维尔大学医学院动物管理和使用委员会(Animal Careand Use Committee of the University of Louisville School of Medicine)和实验室动物管理和使用规程(Department of Health and Human Services，Publication No.[NIH]86-23)的规定进行。

实验方案。本研究在广为接受的小鼠MI模型[6，7]中进行。实验方案总结于图45。所有的小鼠(小组I-III)进行30分钟的冠状动脉闭塞，然后重灌注35天。重灌注之后48小时，小鼠接受心肌内注射载体(小组I)、CD45+造血干细胞(小组II)或VSEL(小组III)。在冠状动脉闭塞/重灌注之前4天、细胞注射后48小时(即MI之后96小时)以及MI之后35天(处死之前)进行超声波心动描记研究。

VSEL和Sca-1+/Lin-/CD45+造血干细胞的分离。按照以前的描述分离VSEL和CD45+细胞[5]。简而言之，从4-6周龄的雄性EGFP转基因小鼠的股骨和胫骨获取BMC，使用0.9％的NH4Cl溶液将红血细胞裂解。将新鲜分离的BMC重悬于含有1％胎牛血清(FBS，HyClone，Logan，UT)的PBS。同时加入以下的一抗：生物素偶联的单克隆大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(Sca-1)(克隆E13-161.7)、APC-Cy7-偶联的单克隆大鼠抗-小鼠CD45(克隆30-F11)和PE-偶联的单克隆大鼠抗-小鼠谱系标记物(抗-CD45R/B220[PE；克隆RA3-6B2]、抗-Gr-1[PE；克隆RB6-8C5]、抗-TCRαβ[PE；克隆H57-597]、抗-TCRγδ[PE；克隆GL3]、抗-CD11b[PE；克隆M1/70]、抗-Ter119[PE；克隆TER-119])。使用PE-Cy5-偶联的链霉亲和素进行二抗染色。所有的试剂购自BDPharmingen(San Jose，CA)。在4℃染色20分钟，染色之后以补充了1％FBS的PBS洗涤细胞。使用MoFlo机器(Dako，Carpinteria，CA)根据图33中显示的方案进行流式细胞术细胞分类。将大宗分类的细胞收集入2ml含有10％FBS的DMEM中。通过分类之后立即重新分析分离的细胞检验纯度。分类的细胞的存活性总是超过90％。通过在1000g离心10分钟使分类的细胞沉淀，并重悬于较小体积(与细胞数目成比例)的含有10％FBS的DMEM中。将细胞等份分装于50-μl体积以用于心肌内注射(总剂量，100,000个细胞用于小组II；10,000个细胞用于小组III)。

心肌梗塞和细胞移植。使用三组野生型(WT)小鼠(C57/BL6株，体重20-25g，10-12周龄，Jackson Laboratories)。已经详细描述过实验准备[6，7]。使用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)将小鼠麻醉，插管，使用小动物呼吸机通气。在实验全过程中小心地将体温、心率和动脉pH维持在生理范围内。使用无菌技术通过中线胸骨切开术开胸。使用锥形针将8-0尼龙线穿过距离左侧外耳尖2mm的左前下行冠状动脉下面，将非创伤球囊封闭器置于动脉上。通过给球囊封闭器充气诱导冠状动脉闭塞。通过目视检验(即注意给气囊充气之后末梢心肌层出现苍白颜色；由于放气后的充血又恢复亮红色)并通过观察缺血过程中ECG上的S-T部分的升高和QRS的加宽以及重灌注之后它们的消退而确认成功进行了冠状动脉闭塞和重灌注[6，7]。然后在层中关闭胸腔，在胸腔中遗留小管10-20分钟以排出空气和液体。将呼吸器从小鼠中移除，以热灯使小鼠保持温暖，给予液体(腹膜内给予1.0-1.5ml处于水中的5％的右旋糖)，并通过鼻锥获得100％氧气。48小时之后，重新麻醉小鼠并通气，重新通过无菌技术开胸。使用30G的针通过心肌内注射载体(50μl，小组I)、Sca-1+/Lin-/CD45+造血干细胞(50μl中有100,000个细胞，小组II)或Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL(50μl中有10,000个细胞，小组III)。在外周梗塞区域圆形模式中，在梗塞和非梗塞的心肌层的交界处总共进行五次注射。在层中关闭胸腔，使小鼠进行如上所述的恢复。

超声心动描记术研究。使用带有15-7MHz线性宽带和12-5MHz定相阵列传导器的HDI 5000 SonoCT超声心动描记仪(Philips Medical Systems)[8]获取超声波心动描记图。使用戊巴比妥钠(25mg/kg，i.p.)将小鼠麻醉。将前胸部位剃毛并将小鼠置于左侧卧位置。使用直肠温度探针，在研究全程过程中使用加热垫小心地将体温控制在接近37.0℃。使用修饰的旁胸骨长轴和旁胸骨短轴切面获得二维(2D)、M-模式和光谱Doppler图像[8]。在中乳头水平(mid-papillary level)从M-模式追踪获得心脏收缩和心脏舒张的解剖学参数。通过Teichholz公式估计LV体积。通过面积-长度方法估计LV质量。由对处理分配不知情的研究人员使用Prosolv数据分析软件(version 2.5，Problem Solving Concepts，Inc.，Indianapolis，IN)离线分析图像。

形态测量学分析。在研究的末尾，打开胸膛，将导管插入腹部大动脉，使用KCl和CdCl₂使心脏停在舒张状态，切除，使用10％中性缓冲的福尔马林通过大动脉逆行灌注。切下右心房以允许引流。调节灌注压力以匹配平均动脉压力。以来自蓄压器(其高度设定为等于体内测定的LV心脏舒张末期压力)的固定液填充LV腔[8-10]。将LV连续切割为与其纵轴垂直的四个环，处理并包埋于石蜡。沿纵轴每0.5-1.0mm的间隔获取三个Masson三色染色的连续LV切片，通过这些切片的数码图像的计算机化测面法(Image-Pro Plus，Media-Cybernetics，Carlsbad，CA)计算梗塞面积分数[8-10]。使用中间切片测定LV的直径。在连续切片中计算梗塞壁、隔膜壁和后壁的厚度并平均18，91。在所有的情形中使用2.1pm的平均肌节长度以纠正LV解剖学参数的原始测定值[10]。

为了测定心肌细胞剖面面积，从三色染色的心肌切片获取数码图像。使用环形模式和中心核在横切的心肌切片中测定肌细胞的剖面面积[11，12]。平均来讲，每个心脏测定总共100个肌细胞。所有的形态测量学分析皆由对处理分配不知情的研究人员进行。

免疫组化。在福尔马林固定的4-μm厚的组织学切片中进行免疫组化。通过α-横纹肌辅肌动蛋白(Sigma)和肌钙蛋白T(Santa Cruz)的存在识别心肌细胞；通过PECAM-1(Santa Cruz)和血管性血友病因子(Sigma)识别内皮细胞；通过α-平滑肌肌动蛋白(Sigma)识别平滑肌细胞[8，13]。使用细胞特异性标记物与EGFP的共存(colocalization)鉴定起源于BMC的细胞[8，14]。以DAPI鉴别细胞核。

为了测定毛细血管密度[11，12]，以抗-CD31(Santa Cruz)一抗将切片染色，然后加入TRITC偶联的二抗[13]。在梗塞区域、边界区域和非缺血区域的连续视野内以100倍放大倍数数出CD31-阳性的毛细血管轮廓。平均来讲，每个心脏中数出总共40-50个视野。

统计学分析。以平均数±SEM报告数据。以单因素ANOVA分析形态测量学和组织学数据，而以双因素(时间和小组)ANOVA分析连续超声心动描记术参数，然后进行Student t-检验(视情况进行Bonferroni修正)[15]。所有的统计学分析皆通过使用SPSS软件(第8版，SPSS，Inc.，Chicago，IL)进行。

结果

排除。总共使用233只小鼠(73只VVT和160只EGFP转基因的)。将66只WT小鼠分配进行心肌梗塞研究(小组I-III)，160只EGFP转基因小鼠用作细胞分离的BM供体，7只小鼠用于确定肌细胞面积。在早期梗塞后阶段有16只小鼠死亡，在心肌内注射之后72小时内有9只小鼠死亡。由于冠状动脉闭塞的失败，将3只小鼠排除在本研究之外，总共在小组I、II和III中分别剩余11、13和14只小鼠。

心肌梗塞尺寸。在三个小组中平均梗塞面积分数没有显著差异(图34)。梗塞面积分数测定结疤组织的平均面积，其表示为LV面积在相距0.5-1.0mm的三个LV切片中的百分率[8，9，12]。

VSEL的移植削弱LV心脏收缩的功能紊乱。在冠状动脉闭塞之前(基线)，小组I、II和III中所有的LV功能(按照超声心动描记术测定)参数都是相似的(图35)。细胞移植后48小时(重灌注后96小时)，各小组间LV心脏收缩功能的损坏程度也是相似的(图35)，这表明缺血/重灌注中持续的损伤和与心肌内注射相关的损伤是相当的。在载体处理(小组I)和CD45+细胞处理(小组II)的小鼠中，在重灌注之后96小时和35天之间还存在进一步的功能恶化(图35G-J)。相反，在VSEL处理的小鼠中(小组III)，与96小时相比，在第35天时既没有整体(图35G)又没有局部(图35I，J)LV心脏收缩功能的损伤。结果是，与载体处理(小组I)和CD45+细胞处理(小组II)小鼠相比，在第35天时小组III中的小鼠表现出显著较高的LV喷射分数(图35A-F、G)和较小的LV心脏收缩末期直径(图35A-F、H)。在小组III中，在梗塞区域中还有增强的局部心肌功能，这由以下证明：与小组I和II相比，心脏收缩梗塞壁厚度分别高出48％(P＜0.05)和29％(P＜0.05)(图3I)，心脏收缩壁厚度分数分别高出44％(P＜0.05)和21％(图3A-F、J)。

VSEL的移植中断LV重塑。同时以形态测量学方法(图36)和超声心动描记术(图46)测定梗塞之后35天的LV重塑程度。在中乳头水平获得的三色染色LV切片上进行形态测量(图4A-C)。通过形态测量得知，小组III中的平均LV腔室直径分别比小组I和II小12％和20％(P＝NS vs.小组I；P＜0.05 vs.小组II)(图36D)。在三个小组中梗塞壁厚度和后LV壁厚度没有显著差异(图36E、G)。与小组II相比，小组III中的梗塞壁厚度/腔室半径比例显著升高(P＜0.05)(图36F)。平均来讲，小组III中通过形态测量估计的LV体积分别比小组I和II小24％和30％(P＝NS vs.小组I；P＜0.05 vs.小组II)(图36H)。在第36天通过超声心动描记术测定的LV直径和体积反映出通过形态测量学观测到的趋势(图46)。总之，通过形态测量学和超声心动描记术得知，与载体处理的小鼠相比，VSEL处理的小鼠具有趋向于LV重塑改善的趋势，但是差异不是统计学上显著的。在CD45+细胞处理的小鼠(小组II)中没有观察到这种趋势。

VSEL的移植削弱LV肥大。由于梗塞后LV重塑与肌细胞肥大和LV质量增加相关联，所以我们研究了细胞治疗对这些参数的影响。为此，我们将三个梗塞组(小组I-III)与单独的非梗塞小鼠(相似年龄，均为10-12周；未进行外科手术)对照组比较。与非梗塞对照小鼠相比，在载体处理和CD45+细胞处理的小鼠中肌细胞的剖面面积均显著升高(小组I和II中分别为228±16μm²[+41％]和258±17μm²[+59％]，相对于非梗塞对照中的162±20μm²；二者的P＜0.05)(图37)。相反，在VSEL处理的小鼠(小组III)中，肌细胞面积与非梗塞小鼠没有差异(图37)。小组III中肌细胞面积比小组I和II分别小15％(P＝NS)和30％(P＜0.05)(图37)。这些结果由LV质量的超声心动描记术估计得到确证。虽然在MI之后35天时，所有小组中超声心动描记术估计的LV质量均比基线值显著升高，但是，VSEL处理的小鼠的LV质量比小组I和II分别小28％(分别为123±7mg vs.172±14和170±6mg；二者的P＜0.05)(图37)。总之，这些数据表明VSEL的移植与存活组织中肌细胞肥大的减小有关。

VSEL治疗对结痂中的有活力的心肌层的影响。通过对α-横纹肌辅肌动蛋白和EGFP同时呈阳性鉴别源自移植细胞的心肌细胞[8，14]。在小组III的梗塞区域中鉴别出分散的EGFP+心肌细胞(图38)，而在小组II中未观察到任何EGFP+心肌细胞；但是，EGFP+心肌细胞的数目非常少。为了评价细胞治疗对梗塞修复的效应，测定梗塞区域中肌细胞占据的面积，将其表达为总梗塞面积的百分率。(梗塞区域定义为以Masson三色染色的心肌切片中含有结痂的全部LV片段)。肌细胞分别构成小组I、II和III中梗塞区域的52.9±3.3％、46.5±2.9％和603±2.3％(图39)；因此，平均来讲，在VSEL处理的小鼠中，梗塞区域中有活力的心肌层数量分别比载体处理和CD45+细胞处理的小鼠高15％和30％(P＝NS vs.载体；P＜0.05 vs.CD45+细胞)。

细胞治疗对毛细血管密度、肌细胞凋亡和肌细胞周期的影响。在梗塞边界区域和非缺血区域中定量测定了心肌毛细血管密度。在每个区域中，三个小组之间均没有显著差异(图47)。类似地，在每个区域中，三个小组之间均没有针对发夹-1探针(为了检测细胞凋亡)和Ki67(细胞周期的标记物)的免疫反应性的差异(数据未显示)。

讨论

BMC代表异质群体，其包括具有不同分化潜能的各种干/祖细胞。预定分化为各种谱系的成人BM细胞(VSEL)可能对于BMC移植之后组织特异性细胞的形成发挥作用[3-5]。在本研究中，我们检测了VSEL在重灌注MI之后改善LV功能和解剖的能力。

本研究的主要发现总结如下：(i)在重灌注MI之后心肌移植仅仅10,000个VSEL即足以诱导可见的LV功能和尺寸的改善；(ii)这种有益效应与非梗塞区域中LV肥大的削弱和源自VSEL的再生肌细胞的存在有关，虽然这些肌细胞的数目是非常少的；(iii)相反，移植数目高十倍的Sca-1+/Lin-/CD45+造血干细胞未改善LV功能和尺寸。这些结果证明：相对很少数目的具有强烈分化潜能的BM细胞能够赋予心脏修复益处，而数目多得多的CD45+造血干细胞不能产生这样的益处。本文报告的观察结果强调了正确选择BM细胞的重要性并支持以下观点：以前观察到的BMC治疗之后的有益效应[2，18，19]可能归结于移植的BM制品中少量的VSEL。

小CXCR4+细胞存在于成人BM中，成人BM表达指征形成几种不同谱系(包括内皮细胞、骨骼肌、神经元和心脏谱系)的标记物[3-5]。鉴于VSEL在体外分化为具有心肌细胞和内皮细胞表型的细胞的能力，MI之后移植VSEL可能改善心脏功能和LV重塑。本研究的数据支持我们的作业假说，因为其证明给予仅10,000个VSEL细胞即引起LV功能的改善和LV膨胀的削弱。这些有益效应的程度是中等的，可能是由于注射了少量的VSEL。使用大量的VSEL应该延伸这些有益效应。每10,000个BM单核细胞有大约1个VSEL[5]。因此，为了向一枚心脏中注射10,000个VSEL，我们使用了从3-4只EGFP转基因小鼠收集的全部BM(本研究中总共使用了160只EGFP转基因小鼠)。以前的使用BMC的研究者[20-23]将高10-100倍的细胞数目(1X10⁵至1x10⁶个细胞)注射进入梗塞小鼠心脏。可以预见的是，如果移植相似数目的VSEL将产生比本研究中以10,000个VSEL观测到的效应更大的效应。

因为已经报道了几种不同的细胞类型是有益的，所以存在一种观念：任何细胞治疗均可以减轻梗塞后LV重塑。因此，我们感觉重要的是不仅要比较VSEL(其为Sca-1+，Lin-，CD45-且非造血的)相对于载体的效应，还要比较其与另一种细胞类型的效应。我们选择了Sca-1+/Lin-/CD45+造血干细胞，因为这两种细胞群体之间的差异仅在于CD45的表达；因此，Sca-1+/Lin-/CD45+细胞可能是研究VSEL作用的最佳对照细胞。为了确保CD45+细胞的有益效应不被遗漏并且为了增强支持VSEL的有益作用的证据，我们决定移植比VSEL高十倍数量的CD45+细胞(CD45+细胞的来源不受到以上针对VSEL描述的限制)。我们推论：如果CD45+细胞具有促进心脏修复的潜能，仅移植10,000个这样的细胞可能不足以检测到该性质。此外，通过比较100,000个CD45+细胞和10,000个VSEL，我们“偏向”于喜爱以CD45+细胞进行的实验，所以任何支持VSEL优越性的证据将是更有力的。我们的发现——移植CD45+细胞不能有利地影响LV功能和重塑的任何测定值——提供了这样的确证：以数目低10倍的VSEL观测到的有益效应是真实的修复特性的结果，而非细胞治疗的非特异性效应。

移植VSEL后改善梗塞后重塑的机理仍然不明确。在梗塞区域观察到了分离的新的心肌细胞和源自EGFP标记的VSEL的毛细血管，但是其数目太少以致于不能构成所观测到的有益效应。VSEL可能抑制肌细胞凋亡和/或激活内源性心脏干细胞[24，25]，从而引起心脏质量的保持和/或新肌细胞的形成。虽然我们所测的发夹-1和Ki67阳性在MI之后35天的三个小组中没有差异，但是仍然具有这样的可能：VSEL治疗与较早时间点的细胞凋亡的减少和/或细胞周期的增加相关。还有这样的可能：VSEL分泌的生长因子可能抑制肥大，预期这将对LV功能产生有利结果。在VSEL处理的心脏中发现的心肌肥大减少(图37)支持了这一点。另一方面，情况也可能相反，即，VSEL处理的小鼠中肥大的抑制可能是VSEL通过其它机制引起的LV功能改善的结果(而非起因)。需要进一步研究以验证这些假设。不论VSEL的效应的机理是什么，似乎可以合理推论移植更大数量的这些细胞效果将增强。

本研究结果对于BMC介导的心脏修复有重要意义。我们的数据表明CD45-非造血VSEL比CD45+造血干细胞更加有效，似乎可能的是，更大数量的VSEL将达到MI后更显著的LV功能和结构的改善。此外，本发现暗示：VSEL是几个BMC移植的实验和临床研究中所观测到的有益效应[2，18，19，26]中起作用的BMC的至少一种特异性亚型。这提示选择性给予分离的或扩增的VSEL可能比移植未分开的BM更加有效。由于VSEL正常存在于成人BM中[5]，所以可以在人类中完成这些细胞的收获和移植。

总之，我们提供了以下观点的证据：源自BM的VSEL可用于缓解MI之后的LV重塑。移植相对较少数量的VSEL足以改善LV功能并减少肌细胞肥大。相反，移植数量高十倍的CD45+造血干细胞是无效的，这强调了VSEL作用的特异性。总之，本研究结果支持以下观点：VSEL移植可在治疗上用于MI之后的心脏修复。

实施例33：源自骨髓的多能的非常小的胚胎样干细胞(VESL)在急性心肌梗塞之后迁移

成人骨髓(BM)含有Sca-1+/Lin-/CD45-多能非常小的胚胎样干细胞(VESL)，其能够在体外分化为几个谱系，包括心脏和血管谱系。由于干/祖细胞从BM中迁移是其参与器官修复的先决条件，所以我们研究了VSEL在急性心肌梗塞(MI)之后是否迁移至外周血(PB)。野生型小鼠(C57/BL6株，6或15周龄)进行30分钟的冠状动脉闭塞，然后进行重灌注(小组III-V，VIII-X，n＝6-12/组)或a1-h开胸状态(假性对照，小组II和VII，n＝8-12/组)；24小时、48小时或7天之后处死小鼠，收集PB样品。不经任何处理处死对照(小组I和VI，n＝6/组)。通过流式细胞术，在基线条件下在PB中几乎检测不到VSEL，但是在MI之后48小时其水平在较年幼(6周龄)和较年长(15周龄)小鼠中均显著升高(分别为3.33±0.37和7.10±0.89个细胞/μl血液)。在MI之后48小时，qRT-PCR分析显示：与对照或假性对照相比，6周龄梗塞小鼠的PB细胞中多能性的标记物(Oct-4、Nanog、Rex-1、Rif1和Dppa1)的mRNA水平显著升高(但是15周龄中没有)。共焦显微镜分析确认：迁移的VSEL表达Oct-4蛋白，而Sca-1+/Lin-/CD45+造血干细胞不表达。这是第一次证明Oct-4+多能干细胞(VSEL)在急性MI之后是迁移的——从BM迁移至PB。这个现象可能对于梗塞心肌层的修复具有病理生理和治疗上的意义。

多个研究证明：成人骨髓(BM)具有干/祖细胞，其不仅补充造血系统，而且补充其它器官中的细胞。已经表明源自骨髓的细胞(BMC)参与几个器官(包括大脑、干燥、肺、肾[27-31]以及心脏[32-37])损伤之后的组织修复。已经在心肌梗塞(MI)之后的心脏中注意到有源自BMC的心肌细胞[32，33，36]。原始细胞从BM中出来进入血液中是BMC有效修复组织的必不可少的第一个步骤[38，39]。虽然已经表明BMC促进组织修复，但是其机理仍然不明。已经有人提出从BMC产生多谱系细胞是BMC介导的组织修复的机理，有可能多能BMC(能够多谱系分化)在组织损伤后从BM中迁移出来，然后自动导向(homing)并进行组织重构。成人BM具有几种类型的原始细胞，包括造血干细胞(HSC)[40]和多种非造血原始细胞，例如间充质干细胞(MSC)[41]、多能成人祖细胞(MAPC)[42]、分离自骨髓的成人多谱系可诱导(MIAMI)细胞[43]、组织定向干细胞(TCSC)[44]和源自BM的多能干细胞[45]。我们鉴别出BM中的非造血原始细胞的罕见群体，其对于Sca-1为阳性，对于谱系标记物(Lin)和泛白细胞标记物CD45均为阴性(Sca-1+/Lin-/CD45-)[46]。

由于这些细胞表达一些与多能状态相关的标记物(SSEA-1、Oct-4、Nanog和Rex-1)并在体外分化成所有三个胚层的成分，我们将这些细胞命名为“非常小的胚胎样干细胞”(VESL)[46-48]。除了神经、内皮、肌肉和胰腺组织的标记物之外，VSEL富含心脏特异性抗原(Nkx2.5/Csx、GATA-4、MEF-2C)的mRNA并且能够在体外获得心肌细胞表型[46，49]。我们还报道过鼠的源自BM的VSEL在各种形式的组织损伤之后迁移[38，50]。基于以上观察，我们推论：多能VSEL可能在急性MI之后迁移进入外周血(PB)。以前没有证明过多能BMC迁移进入PB。

因此，使用广为接受的小鼠MI模型[51]，我们研究了(i)在急性MI之后，VSEL是否从BM迁移至PB；和(ii)VSEL的迁移是否受年龄影响。我们使用全套方法(流式细胞术、通过qRT-PCR分析mRNA和免疫细胞化学)确定绝对细胞数目以及迁移动力学。将VSEL(Sca-1+/Lin-/CD45-)的迁移直接与Sca-1+/Lin-/CD45+造血干细胞(HSC)比较。我们的结果显示：在急性MI之后，年幼和较年长小鼠的PB中的Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL水平均上升，与PB中多能标记物的升高是一致的，虽然这些基因的表达随年龄降低。

材料和方法

所有的实验按照实验室机构动物管理和使用委员会(LaboratoryInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC))的规定进行。研究符合美国国立卫生研究院发布的实验室动物管理和使用规程(NIHPublication No.85-23，revised 1996)。

实验方案。使用10组(n＝6-12/组)野生型小鼠(C57BL/6株，JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)。小组I-V为6周龄，而小组VI-X为15周龄。小组III-V和VIII-X中的小鼠进行冠状动脉闭塞/重灌注，而小组II和VII(假性对照)进行假性程序(1小时开胸状态)而无冠状动脉闭塞。在MI之后24小时(小组III和VIII)、48小时(小组IV和IX)或7天(小组V和X)将梗塞小鼠处死；假性对照(小组II和VI)在假性程序之后24小时处死，以分析细胞迁移。小组I和VI中的小鼠不经任何处理即处死，用作对照。

心肌梗塞。已经详细描述过实验准备。简而言之，使用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)将小鼠麻醉，插管，使用小动物呼吸机通气。在实验全过程中小心地将体温、心率和动脉pH维持在生理范围内。

使用无菌技术通过中线胸骨切开术开胸。使用锥形针将8-0尼龙线穿过距离左侧外耳尖2mm的左前下行冠状动脉下面，将非创伤球囊封闭器置于动脉上。通过给球囊封闭器充气30分钟诱导心肌梗塞。通过目视检验(即注意给气囊充气之后末梢心肌层出现苍白颜色；由于放气后的充血又恢复亮红色)并通过观察缺血过程中ECG上的S-T部分的升高和QRS复合物的加宽以及重灌注之后它们的消退而确认成功进行了冠状动脉闭塞和重灌注[51]。

重灌注之后在层中关闭胸腔，使小鼠恢复。为了补充手术前后的液体损失，在手术后注入Dextran 40(10％v/v，处于0.9％氯化钠中)。在连续时间点使小鼠安乐死，收集血液样品进行流式细胞术、mRNA分析和免疫细胞化学。

流式细胞术分析并从外周血分类VSEL和HSC。

在图40中给出了流式细胞术分析和分类的方案。使用I x BD Pharm LyseBuffer(BD Pharmingen，San Jose，CA)裂解RBC，从而获得PB白细胞(PBL)的完整群体。在含有2％胎牛血清(FBS)的培养液中使用CD45、谱系标记物和Sca-1将细胞染色30分钟。使用下列荧光色素偶联的抗小鼠抗体：大鼠抗-CD45(APC-Cy7；克隆30-F11)、抗-CD45R/B220(PE；克隆RA3-6B2)、抗-Gr-1(PE；克隆RB6-8C5)、抗-TCRαβ(PE；克隆H57-597)、抗-TCRγδ(PE；克隆GL3)、抗-CD11b(PE；克隆M1/70)、抗-Ter119(PE；克隆TER-119)和抗-Ly-6A/E(Sca-1，生物素；克隆E13-161.7，然后以PE-Cy5-偶联的链霉亲和素染色)(均来自BD Pharmingen)。以含有10％FBS的RPMI 1640培养液洗涤并重悬细胞。使用MoFlo(Dako，Carpinteria，CA)通过流式细胞术分析PBL中VSEL和HSC的百分率。使用Hemavet 950，WBC血液学系统(DrewScientific，Oxford，CT)进行总白细胞计数(每单位体积的PB)。从各自的百分含量和总白细胞数目计算出1μl血液中VSEL和HSC的绝对数目。对于免疫细胞化学和共焦显微镜方法，根据以前描述的分类策略分离Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL和Sca-1+/Lin-/CD45+HSC(图40)[47]。

免疫细胞化学和共焦显微镜方法。将新鲜分离的源自PB的Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL和Sca-1+/Lin-/CD45+HSC在直径为22-mm的以聚-L-赖氨酸(Sigma)包被的培养板上植板24小时。以4％多聚甲醛溶液固定细胞20分钟并以0.1％Triton X-100在室温(RT)渗透5分钟。在室温以10％驴血清(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)封闭30分钟以避免非特异性抗体结合。在37℃以针对Oct-4(小鼠单克隆IgG，Chemicon，1∶200)和CD45的一抗(FITC-偶联的大鼠IgGI，克隆30-F11，BD Pharmingen，1∶100)孵育细胞两个小时。洗涤之后，在37℃以TRITC-偶联的驴抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoresearch，1∶200)孵育细胞两个小时。在37℃以DAPI(Invitrogen)将细胞核染色10分钟。使用LSM 510共焦显微镜(CarlZeiss，Thornwood，NY)获取免疫荧光显微镜图像。

通过定量实时RT-PCR(qRT-CRR)测定多能基因的表达。使用RNeasyMini Kit(Qiagen Inc.，Valencia，CA)从PBL组分中分离总mRNA并使用TaqMan Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行逆转录。使用ABI PRISM7000 Sequence Detection System(AppliedBiosystems，Foster City，CA)通过qRT-PCR定量测定表征多能干细胞(Oct-4、Nanog、Rex-1、Rif1和Dppa1)、造血细胞(Scl)和β2-微球蛋白的标记物的mRNA表达。以前已经描述过引物序列(使用Primer Express软件设计)[46]。使用含有12.5μl的SYBR Green PCR Master Mix和10ng的正向和反向引物的25-μl反应混合物。然后确定阈值循环(CT)，即扩增的感兴趣基因的量达到固定阈值时的循环数目。使用比较型Ct方法进行mRNA表达的相对定量。靶标的相对定量值(按照内源对照(β2-微球蛋白基因)标准化并相对于校正者)表达为2-ΔΔCt(-倍数变化)，其中ΔCt＝(靶标基因[Oct-4、Nanog、Rex-1、Rif1、Dppa1、Scl]的Ct)-(内源对照基因[β2-微球蛋白]的Ct)，ΔΔCt＝(靶标基因样品的ΔCt)-(靶标基因校正者的ΔCt)。为了避免扩增污染性DNA的可能性，(i)所用用于实时RT-PCR的引物均设计为含有内含子序列以进行特异cDNA扩增；(ii)以合适的阴性对照(不含模板的对照)进行反应；(iii)通过分析扩增产物的熔解曲线(解离图)重新检测产物的一致性扩增；和(iv)熔解温度(Tm)是57-60℃，探针Tm至少比引物Tm高10℃。对于每组基因进行三次独立实验。

统计学分析。数据为平均值±SEM。使用单因素ANOVA分析细胞浓度和心脏特异性转录因子和与多能状态相关的定量mRNA数据(mRNA水平的倍数降低)。如果ANOVA显示出总体差异，则使用针对非配对数据的Student t-检验进行post hoc对比，根据Bonferroni修正调整得到的概率值。P＜0.0025被认为是统计学显著的。所有的统计学分析皆通过使用SPSS(version 8)统计学软件(SPSS，Inc.，Chicago，IL)进行。

VSEL在MI之后迁移进入外周血。在MI之后24小时、48小时和7天检测循环的VSEL(Sca-1+/Lin-/CD45-)和HSC(Sca-1+/Lin-/CD45+)的数目。在每个时间点估计PB中VSEL和HSC的百分含量(图8)，从各自的总白细胞计数计算出每微升血液中两种细胞群体的绝对数目。将循环的原始细胞的百分率与PB细胞的数目组合避免了可能的稀释混淆效应。

在对照小鼠中，循环的VSEL数目非常低(在6周龄和15周龄小鼠中分别是0.98±0.20和1.44±0.37VSEL/μl血液)(图41)。假性操作的动物在开胸程序24小时之后循环的VSEL的数目与各自的未处理对照相似(在6周龄和15周龄小鼠中分别是1.20±0.15和1.65±0.20VSEL/μl血液)(图41)，这表明开胸本身不足以使VSEL迁移。在6周龄小鼠中在MI之后24小时循环的VSEL显著升高(2.28±0.30VSEL/μl血液[小组III]；P＜0.0025 vs.未处理对照和假性对照)(图41)。在两个年龄的小组中，MI之后48小时迁移的VSEL数目均达到峰值(在6周龄和15周龄小鼠中分别是3.33±0.37[小组IV]和7.10±0.89[小组IX]VSEL/μl血液；P＜0.0025 vs.各自的未处理和假性对照)(图41)。在MI之后7天，循环的VSEL与各自的未处理对照中所观察到的相似(在6周龄和15周龄小组中分别是1.62±0.37[小组V]和1.63±0.27[小组XI]VSEL/μl血液)(图41)。

与VSEL的数目相比，对照小鼠的PB中循环的Sca-1+/Lin-/CD45+HSC的数目更高(在6周龄和15周龄小鼠中分别是5.47±0.81[小组I]和6.48±0.77[小组VI]HSC/μl血液)(图42)。在每个年龄组中假性手术之后24小时，HSC的数目均没有显著变化(在6周龄和15周龄小鼠中分别是7.69±0.66[小组I]和5.46±0.74[小组VI]HSC/μl血液)。但是，在MI之后24小时循环的HSC升高(在6周龄和15周龄小鼠中分别是9.20±0.82[小组III]和8.82±0.53[小组VIII])。在MI之后48小时HSC迁移更多(在6周龄和15周龄小鼠中分别是15.19±1.31[小组IV]和12.96±1.12[小组IX]HSC/μl血液；P＜0.0025 vs.各自的未处理和假性对照)，然后在MI之后的7天下降(在6周龄和15周龄小鼠中分别是1 1.69±0.92[小组V]和8.99±0.82[小组XI]HSC/μl血液；P＜0.0025 vs.假性对照)(图42)。

在急性MI之后外周血富含多能原始(primitive)细胞。为了确认PB在MI之后富含VSEL，我们评价了在冠状动脉闭塞/重灌注之后不同时间点收集的源自PB的细胞中多能标记物的表达。为此目的，我们使用qRT-PCR检测多能标记物(包括Oct-4、Nanog、Rex-1、Rif1和Dppa1)的mRNA。在急性MI之后48小时处死的6周龄小鼠中，我们发现PB确实富含具有这些标记物mRNA的细胞(与未处理的对照相比，Oct-4、Nanog、Rex-1、Rif1和Dppa1的mRNA水平分别增加10.01±1.98、6.02±1.66、5.28±1.68、2.07±0.99和3.18±0.49倍；对于所有的比较P都小于0.05；图43，图板A)。相反，在15周龄小鼠的PB细胞中，这些标记物的各自的mRNA水平相对于未处理的对照仅高出2.24±0.95、1.41±0.36、2.61±0.84、3.43±0.98和2.03±1.01倍，这表明在较年长的小鼠中，迁移的细胞表达显著较低水平的与多能状态相关的基因。在MI之后48小时，我们还观察到在6周龄小鼠中造血细胞标记物(Scl)mRNA水平的升高(与各自的未处理对照相比高出4.32k1.54倍)，但是在15周龄小鼠中没有(0.82k0.32倍的差异)(图43，图板A和B)。

从外周血中分离的迁移的VSEL表达OCT-4。通过免疫细胞化学方法在蛋白水平检测了迁移的VSEL中Oct-4(一种多能标记物)的表达。为此目的，通过FACS从PB细胞的完整群体中分离VSEL和对照HSC。分别以CD45(造血细胞标记物)和Oct-4(多能标记物)将分类的细胞染色。免疫染色之后的共焦显微镜分析确认：迁移和分类的Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL是非常小的(直径小于5μm)，其对CD45为阴性，并且表达Oct-4(图44，下端图板)。相反，分类的Sca-1+/Lin-/CD45+HSC比VSEL大得多，其对于CD45为阳性，并且不表达Oct-4(图44，上端图板)。

讨论

成人BM可能含有各种具有修复非造血器官能力的原始细胞。在这个意义上，已经表明外源的细胞因子诱导的BMC的迁移在中风以及MI之后是有益的[32，52]。此外，在各种损伤组织(包括大脑、肝脏、肾、肺和心脏)中鉴别到源自BMC的细胞，这表明组织损伤能够诱导BMC从骨髓迁移至PB[27-32，33，34]，但是从未报道过急性MI之后多能干细胞的迁移。

使用互补性方法(流式细胞术、qRT-PCR和共焦显微镜方法)，我们报道了表达Oct-4的多能VSEL在急性MI之后早期发生迁移。我们未观察到未经处理的健康动物相对于经过开胸假性程序的动物的PB中的VSEL水平的任何显著性差异，这表明手术本身不会使多能细胞从BM干细胞库发生迁移。在经过MI的小鼠中，循环的VSEL的水平在24和48小时的时候上升，然后在第7天回复至在未处理对照中观测到的水平。通过qRT-PCR分析确认了这些通过流式细胞术得到的观察结果。以前的研究表明在MI之后各种类型的BMC发生迁移。这些包括造血干细胞[53，54]、间充质干细胞[55]、内皮祖细胞[53，56]和其它不同的由表面标记物表征的亚群。已经在急性MI之后的患者中观察到循环的CD34+祖细胞[54，57]和CD34+/CXCR4+、CD34+/c-kit+、cmet+亚群[58，59]。动物中的研究表明MI之后在梗塞心肌层中存在源自BM的c-kit+、CD31+细胞[60]。在患有急性MI的患者的PB中检测到的祖细胞表达水平升高的早期心脏(GATA-4、Nkx2.51Csx和MEF2C)和内皮细胞(VE-钙粘蛋白和血管性血友病因子)标记物的mRNA[58]。在小鼠中获得了相似的结果[44]。但是，以上研究中没有研究这些迁移的亚群中多能细胞的含量(如多能标记物的表达所反映)[44，58]。在本研究中，我们通过全套方法证明了MI之后血液中存在多能VSEL。首先，使用流式细胞术，通过其典型表型(Sca-1+/Lin-/CD45-)在PB中鉴别出VSEL。其次，通过qRT-PCR检测出更高的多能标记物(Oct-4、Nanog、Rex-1、Rif-I和Dppa1)的mRNA水平。最后，我们通过共焦显微镜在蛋白水平确认了VSEL中Oct-4(一种多能标记物)的表达，但是在对照群体(Sca-1+/Lin-/CD45+HSC)中没有表达。

除了检测MI之后VSEL迁移的时间过程之外，我们还试图确定在年幼(6周龄)和年长(15周龄)小鼠中这些细胞的释放是否是否有差别。使用表面标记物的流式细胞术分析，我们发现在6周龄和15周龄小鼠中VSEL的迁移动力学是相似的。但是，在MI之后48小时(当迁移达到顶峰时)，与6周龄小鼠相比，15周龄小鼠中多能标记物(例如Oct-4、Nanog、Rex-1、Rif1和Dppa1)的mRNA水平较低。这些数据表明虽然具有VSEL表型特性(Sca-1+/Lin-/CD45-)的细胞被释放到较年长的动物的PB中，但是这些细胞随着年龄的增长丧失多能标记物，这个观察结果与以前关于多能消耗和干细胞功能与年龄的报道[61-63]是一致的。在MI之后VSEL发生迁移这一观察结果对于心脏和其它组织的修复具有重要意义。我们以前已经表明VSEL在mRNA和蛋白水平表达多能标记物，例如Oct-4、Nanog和Rex-1[46-48]。我们还证明在合适的培养条件下，VSEL产生与胚状体类似的细胞球状物，有效扩展类似培养的胚胎干细胞，并在体外分化成所有三个胚层的成分[46-48]。这些原始细胞在MI之后从BM迁移至PB将是其参与心脏修复的第一个步骤。因此，在MI之后的早期，PB中的VSEL的自动导向迁移(trafficking)显著增加这一发现给出了以下可能性：这些多能细胞可能在这种情况下对于心肌修复发挥作用。通过给予细胞因子或生长因子增加内源VSEL的迁移可能在治疗上用于促进MI之后的修复。

总之，我们的结果证明：在急性MI之后多能Sca-1+/lin-/CD45-VSEL从BM发生迁移。多能VSEL的循环水平在MI之后的早期(48小时)达到顶峰，然后在第7天下降。与这些观察结果一致，梗塞动物的PB富含表达多能标记物(Oct-4、Nanog、Rex1、Rif-I和Dppa1)的细胞，虽然这些基因在VSEL中的表达随年龄而降低。

实施例34：非常小的胚胎样(VSEL)干细胞和心脏干细胞在修复心肌梗塞中的用途

已经表明源自骨髓(BM)的细胞在心肌梗塞(MI)之后改善左心室(LV)功能并削弱有害的LV重塑。在成人BM中鉴别出负责这些有益效应的细胞类型为多能SSEA-1+/Oct-4+/Sca-1+/Lin-/CD45-非常小的胚胎样干细胞(VSEL)的罕见群体，其在体外分化为心脏谱系。使用MI的小鼠模型，我们发现：在基线条件下在外周血(PB)中几乎检测不到VSEL，但是在MI之后显著升高，在48小时达到顶峰(流式细胞术)，与PB细胞中多能标记物(Oct-4、Nanog、Rex1、Rif-I和Dppa1)的mRNA水平的升高(RQ-PCR分析)一致，这表明在MI之后短时间内VSEL迁移进入血液。重要的是，在小鼠中直接的心肌内注射VSEL改善了LV功能并削弱了LV重塑，这提示这些多能细胞可在治疗上用于MI的修复。另一个有前景的细胞治疗方法是使用成人心肌层中存在的c-kit+心脏干细胞(CSC)。我们发现冠状动脉内给予CSC在大鼠急性MI模型和两个旧的治愈的MI模型(大鼠和猪)中均显示出有益效应；在所有情况下，给予CSC均产生改善的心脏收缩功能、减少的LV扩张和肌细胞和冠状动脉血管的再生。这些数据支持CSC在修复急性和旧的MI中的治疗性应用并为未来的CSC临床试验提供了基础。

实施例35：分离自脐带血的SSEA-4⁺/Oct-4⁺/CD133⁺/CXCR4⁺/Lin^-/CD45^-非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的分离和分子及功能表征

在脐带血(CB)中鉴定了非常小的胚胎样(VSEL)SC的群体。这些VSEL是：i)尺寸非常小(＜6mm)；ii)SSEA-4⁺/Oct-4⁺/CD133⁺/CD34⁺/CXCR4⁺/Lin^-/CD45^-；iii)响应于基质衍生的因子(SDF)-1梯度；和iv)具有包含原始常染色质的大的细胞核。本实施例提供了分离/纯化策略，使用数个成像和分子技术以更好地分析这些原始细胞。

注意到，由于尺寸较小，所以在储存/冷冻前通过体积耗竭进行的常规CB单元处理过程中损失了CD133⁺/Lin^-/CD45^-VSEL(42.5±12.6％)。有趣的是，相对于正常的造血(H)SC，这些细胞在冷冻和解冻后对于变化的抗性更大。在冷冻的CB单元中保存了82.7±17.3％的最初冷冻的CD133⁺/Lin^-/CD45^-VSEL，而仅有65.0±6.1％的CD133⁺/Lin^-/CD45^-HSC被回收。

此外，当使用Ficoll离心来纯化CB单核细胞(CB MNC)时，发现虽然损失了59.8±7.2％的CD133⁺/Lin^-/CD45^-VSEL，但是它们的造血对应物(CD133⁺/Lin^-/CD45⁺)几乎全部被回收(图48A)。这些数据说明，需要开发其它的“更加节省VSEL”的除掉红细胞的策略，因为这些细胞具有异常的尺寸和密度。

本实施例提供了“节省VSEL”的策略，其是通过低渗裂解从CB中除掉红细胞。注意到在这个程序中，裂解的红细胞释放磷脂酰丝氨酸阳性的(PS⁺)膜衍生的微囊泡(MV)，并且这些PS⁺MV优先结合至VSEL。由于该现象，VSEL变成PS⁺并且可能在Annexin-V结合试验中被误认为是凋亡细胞。通过数个互补性的成像方法确认了VSEL的独特形态学特征。IMAGESTREAM^TM分析揭示：VSEL比红细胞小，比血小板大，并且具有高核质比(图48B)。具有最小尺寸(＜6mm)的CD133⁺/Lin^-/CD45^-VSEL成分显示出高核质比并且在细胞核中高度表达Oct-4；在表面表达SSEA-4和CD133抗原。

最后，与剖腹产相比，在来自阴道分娩的CB样品中发现的VSEL的数目高2-3倍。这支持以下观点：VSEL是由于分娩相关的应激/低氧而被释放进入CB的。

总之，CB包含VSEL的群体，但是，由于其独特的形态，通过目前使用的体积耗竭策略仅能回收这些细胞中的～50％。考虑到VSEL可用于再生医学，在CB库中需要开发新的体积耗竭/红细胞消除策略，以避免损失这些稀少的、原始的和重要的细胞。

本实施例公开的实验的目标是：1)测定i)从CB中消除红细胞(RBC)的不同方法和ii)储存/冷冻前用于CB体积耗竭的常规程序对于回收CB-VSEL的影响；2)建立允许增强CB-VSEL存活/回收的新的CB处理程序；和3)更好地测定CB-VSEL的不同亚群的形态学特征。

为了进行CB-VSEL的分离程序，从健康供体收集脐带血。通过使用两种不同程序除掉RBC：1)使用氯化铵的低渗溶液进行裂解；2)在Ficoll-Paque的梯度中离心(图48A)。这些RBC消除程序产生2种不同的细胞成分，分别是：1)总的CB有核细胞(TNC)和2)CB单核细胞(MNC)。

为了鉴定这两种成分中的CB-VSEL群体，就造血谱系标志物(Lin)、CD45和CD133的存在对细胞进行染色，随后通过MoFlo细胞分选仪(Beckman Coulter)进行分析，以获得CB-VSEL的百分含量(图48B)。基于这些细胞的百分含量和通过使用不同的分离程序获得的每种成分中的总细胞数计算CB-VSEL的绝对数目。

通过ImageStream系统(Amnis Corp)分析这两种分离的成分中CD133+/Lin^-/CD45^-CB-VSEL的存在，以及CB-VSEL的形态学特征，包括原始/多能性标志物(CD34、SSEA-1、Oct-4)的表达，细胞大小和核质比(N/C比率)。

为了研究TNC和MNC的分离后的存活性以及RBC衍生的微囊泡(MV)转移相关的Annexin-V(AnV)结合现象，就CB-VSEL相关的抗原(Lin、CD45、CD133)和血型糖蛋白A(GlyA)对两种成分进行染色，然后与AnV和7-氨基放线菌素D(7-AAD)一起温育。在一些实验中，基于AnV结合分选源自CB的总CD34+细胞的两种成分，以通过进行造血集落生成试验在体外评估其功能。

为了在冷冻的CB单元中分析CB-VSEL的存在，我们评估了获自脐带血库的以下样品：1)新鲜收集的CB；2)冷冻程序前的CB细胞的浓缩物；3)CB细胞的冷冻浓缩物。通过流式细胞术计算CB-VSEL的含量。

A.通过裂解RBC制备的源自CB的细胞优于通过Ficoll-Paque分离制 备的细胞，并且产生较高的CB-VSEL的产率

通过流式细胞术，我们证明CD133+/Lin^-/CD45^-CB-VSEL在通过Ficoll-Paque离心和通过RBC裂解而分离的两种细胞成分中是相似的(分别是0.010±0.002％和0.012±0.003％；P＝NS)。然而，当基于百分含量和通过每种程序分离的细胞绝对数目计算从1毫升CB中分离的CB-VSEL的绝对数目时(图50A)，我们发现：当通过在Ficoll-Paque上离心进行分离时，损失了59.2±7.2％的CB-VSEL。我们观察到，通过在Ficoll-Paque上离心进行分离而从1毫升CB中获得的CB-VSEL的绝对数目少于通过低渗的氯化铵裂解RBC而获得的数目(分别是505.6±91.4和1259.7±355.1；P＜0.05)(图50B)。

同时，我们观察到，通过Ficoll-Paque分离的MNC中的CD133+/Lin^-/CD45⁺HSC的数目稍高于通过裂解RBC获得的TNC中的数目(分别是0.302±0.075％和0.149±0.023％；P＝NS)。基于这一点，可以通过两种RBC消除方法来有效分离HSC，如通过Ficoll-Paque梯度或通过低渗氯化铵溶液裂解处理而从1毫升CB中获得的相似的总细胞数目所证实(分别是16079.1±3997.6和15492.6±2399.1；P＝NS)(图50B)。

通过ImageStream直接分析CB-VSEL和HSC(包括这两种群体的大小和N/C比率)确认：CB-VSEL比HSC小得多(分别是6.75±1.04和8.12±1.58μm)并且具有较高的N/C比率(分别是0.55±0.14和0.40±0.18)(图51)。

B.通过目前应用的程序进行的常规CB单元处理/体积耗竭可能导致 CB-VSEL的不想要的损失

流式细胞术分析揭示：通过使用常规的体积耗竭策略，在用于储存/冷冻而处理/制备的的CB细胞浓缩物中显著损失了42.5±12.6％的CD133+/Lin^-/CD45^-CB-VSEL。同时，在该制备物中仅损失了26.67±12.5％的CD133+/Lin^-/CD45⁺HSC(图52)。

另一方面，相对于CD133+/Lin^-/CD45⁺HSC，CD133+/Lin^-/CD45^-CB-VSEL对于冷冻和解冻程序的抗性更高。因此，我们观察到，虽然在解冻程序后回收了大约82.66±17.31％的CB-VSEL，但同时仅回收了65.00±6.12％的HSC(图52)。

C.在表达多能干细胞标志物的原始亚群中富含CD133+/Lin ^- /CD45 ^- CB-VSEL

在接下来的步骤中，通过使用ImageStream分析，我们研究了表达干细胞标志物(包括CD34、Oct-4和Nanog)的多种CB-VSEL亚群。我们应用细胞核染色，仅在有核物体上进行分析(排除无核细胞碎片)。我们研究了CB-VSEL的3个亚群的百分含量(图53A)、它们的大小(图53B)和N/C比例(图53C)，以及每个群体中的非常小的细胞(＜6μm)的含量(图53D)。我们发现：表达胚胎抗原SSEA-4的CD133+/Lin^-/CD45^-CB-VSEL的亚群是最稀少的，显示出最小的细胞大小和最高的N/C比率，并且含有最大数目的非常小的细胞，这可以表明它们的最原始的多能性质(图53)。图54中显示了代表性细胞的图像。

D.在RBC裂解过程中产生的微囊泡将磷脂酰丝氨酸转移至CB-VSEL

在分析通过不同程序分离的CB-VSEL的存活性时，我们惊奇地发现：存在于TNC(在RBC裂解后获得的)中的大量的CB-VSEL以及一些HSC表达磷脂酰丝氨酸并且与Annexin V结合(分别是47.3±9.8和12.9±5.9％)(图55A)。这可以是这些细进行细胞凋亡的标志。然而，当在染色前裂解RBC时，对于CB-VSEL和HSC而言，Annexin V+细胞的数目分别降低至14.1±7.6和3.1±1.0％(图55A)。我们想知道这个未预料到的效应是否可以通过从裂解的RBC转移至CB细胞的磷脂酰丝氨酸得到解释。为了更好地解决这个问题，我们就GlyA的表达对CB细胞进行染色，并且发现，当在RBC裂解前进行染色时，Annexin V+/GlyA+CB-VSEL和HSC显著减少(图8B)。最后，为了排除细胞凋亡的参与，我们从CB TNC中分选出CD34+/AnV+/GlyA+TNC的群体，并且发现这些细胞产生与从MNC的非裂解成分中分选的CD34+细胞数目相当的集落(图55C)。

总结

基于通过Ficoll-Paque梯度离心或在储存/冷冻前减小体积来消除红细胞(RBC)的CB处理程序导致CB-VSEL的显著损失。RBC裂解是增强的RBC消除方法，其允许最大的CB-VSEL回收。RBC裂解后分离的CB-VSEL成分富含最原始的多能的CB细胞，其表达CD34、Oct-4和SSEA-4抗原。

在RBC裂解过程中，存在于RBC膜上的一些分子(包括磷脂酰丝氨酸和GlyA)可以通过微囊泡被转移至CB-VSEL，这造成了假阳性染色。

CB处理程序可用于保持存在于经处理的CB单元中的一些非常小的和密的(dense)原始干细胞，例如CB-VSEL。

在RBC裂解过程中产生的微囊泡可以将磷脂酰丝氨酸和GlyA转移至CB-VSEL。在例如Annexin V存活性染色时需要考虑这些抗原的转移。

实施例36：源自脐带血的非常小的胚胎/外胚层样干细胞的分离和表征

人类脐带血(UCB)已经被描述为多种干细胞的来源。鉴定了来自UCB的非常小的细胞的稀少群体，所述细胞在表型上类似于在成年鼠组织(包括骨髓)中描述的非常小的胚胎/外胚层样干细胞(VSEL)。这些分离自人类UCB的细胞的尺寸非常小(小于红细胞)，并且富集于CD133⁺、CD34⁺和CXCR4⁺谱系阴性(Lin^-)CD45^-细胞中。它们具有大的含有非结构化的常染色质的细胞核，并且表达细胞核胚胎转录因子Oct-4和Nanog，并且在细胞表面具有阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)。基于这些特征，这些细胞被命名为″源自UCB的非常小的胚胎/外胚层样干细胞(UCB-VSEL)″。

由于它们的尺寸和密度小，所以在UCB制备的多个步骤中经常会损失源自脐带血(UCB)的非常小的胚胎/外胚层样干细胞(VSEL)。在Ficoll-Paque上进行梯度离心以及在冷冻前对UCB单元进行的常规体积耗竭过程中，损失显著数目的这些细胞(这些细胞小于红细胞)。为了在最后的UCB制备物中保留这些细胞，使用了相对较短的和经济的三步分离程序，其允许回收存在于新鲜收集的UCB单元中的～60％的最初数目的Lin^-/CD45⁺/CD133⁺UCB-VSEL。在该新方法中：i)在低渗氯化铵溶液中裂解UCB以除掉红细胞；ii)通过免疫磁珠富集包括VSEL细胞的CD133⁺细胞，和随后，iii)通过荧光激活的细胞分选法分选Lin^-/CD45⁺/CD133⁺细胞。整个分离程序需要～2至3小时/UCB单元，分离的细胞高度富含小的Lin^-/CD45^-/CD133⁺细胞的Oct-4⁺和SSEA-4⁺群体。

本实施例的改进的分离程序允许回收～60％的最初数目的Lin^-/CD45^-/CD133⁺UCB-VSEL并在最终的UCB制备物中保留这些细胞。

制备细胞以进行流式细胞术(FC)分析

分离

根据两种程序制备完整的人类UCB样品，从而除掉红细胞(RBC)。样品的一部分在室温(RT)经过1xBD Pharm裂解缓冲液(BD Pharmingen，SanJose，Calif.)处理15分钟，以除掉RBC，并在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤两次。

其余的UCB样品用于通过在Ficoll-Paque Plus(Pharmacia FineChemicals，Uppsala，Sweden)梯度上离心来获得单核细胞(MNC)成分。简而言之，以PBS按1∶1稀释血液并置于Ficoll-Paque溶液的上面。将样品在500xg在25℃离心30分钟，从界面处收集UCB MNC。

从Cleveland脐带血中心获得临床级别的UCB样品，包括：i)未经处理的UCB；ii)以自动化UCB体积耗竭平台(AXP^TM AutoExpress Platform)处理的UCB浓缩物；iii)解冻后的UCB。

免疫染色

使用以下荧光素异硫氰酸盐(FITC)-缀合的鼠抗-人抗体，就Lin标志物对总的有核细胞(TNC)和MNC以及获自临床UCB样品的有核细胞成分的单细胞悬浮液进行染色：抗-CD2(克隆RPA-2.10)；抗-CD3(克隆UCHT1)；抗-CD 14(克隆M5E2)；抗-CD66b(克隆G10F5)；抗-CD24(克隆ML5)；抗-CD56(克隆NCAM16.2)；抗-CD16(克隆3G8)；抗-CD19(克隆HIB19)；和抗-CD235a(克隆GA-R2)。还就CD45[藻红蛋白(PE)；克隆HI30]并就CXCR4[别藻蓝蛋白(APC)；克隆12G5]、CD34(APC或PE-Cy5；克隆581；均来自BD Bioscience，San Jose，Calif.)或CD133(APC或PE；CD133/1；Miltenyi Biotec，Auburn，Calif.)的组合对细胞进行染色。染色在含有2％胎牛血清(FBS；Invitrogen，Carlsbad，Calif)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培养基中在冰上进行30分钟。洗涤细胞，以4％多聚甲醛固定20分钟，并以0.1％Triton X-100溶液进行通透化处理10分钟。通过MoFlo细胞分选仪(Dako，Carpintera，CA)，使用7-氨基放线菌素D(7-AAD；BDPharmingen；40μm)分析细胞，从而估计多个源自UCB的群体的含量。在分析前10分钟加入7-AAD以染色有核物体。UCB-VSEL被分析为Lin^-/CD45^-/CD133⁺、Lin^-/CD45^-/CD34⁺和Lin^-/CD45^-/CXCR4⁺细胞，而造血干细胞/祖细胞(HSPC)被分析为Lin^-/CD45⁺/CD133⁺、Lin/CD45⁺/CD34⁺和Lin^-/CD45⁺/CXCR4⁺细胞。

制备细胞以进行ImageStream系统(ISS)分析

使用如上所述的两种分离方法制备源自UCB的TNC和MNC。然后，就如下所述的CD45、Lin标志物、CXCR4、CD34、CD133、SSEA-4和Oct-4的不同组合对细胞进行染色。基于ISS中可获得的检测通道，我们使用下列抗体的混合物：与FITC(如上所述的克隆)缀合的针对造血Lin的人类抗体以及抗-CD45(FITC或PE；克隆HI30)、抗-CXCR4(生物素；克隆12G5)、CD34(PE-Cy5；克隆581；均来自BD Pharmingen)和CD133(生物素或PE；CD133/1；Miltenyi Biotec)。以生物素化的抗体染色后，以PE或PE-Cy5(BDPharmingen)缀合的链霉亲和素进行染色，这取决于所选的用于染色的标志物的组合。在冰上在含有2％FBS(Invitrogen)的RPMI培养基中进行染色30分钟。然后洗涤细胞，以4％的多聚甲醛固定20分钟，并以0.1％TritonX-100溶液通透化处理10分钟。在分析之前加入7-AAD(BD Pharmingen；40μm)以将有核物体染色10分钟。

对于核内Oct-4检测和Oct-4⁺UCB-VSEL的鉴定，首先以4％的多聚甲醛将新鲜分离的细胞固定20分钟，然后以0.1％Triton X-100溶液通透化处理10分钟。洗涤细胞并以抗-小鼠/人Oct-4一抗[小鼠单克隆免疫球蛋白(Ig)G；Chemicon Int.，Temecula，Calif.；1∶200]在37℃染色2个小时。洗涤之后，加入PE缀合的抗-小鼠IgG二抗(BioLegend；San Diego，Calif.；1∶200)，并且将细胞在37℃温育2个小时。就Oct-4染色之后，以针对CD133(PE-Cy5)、CD45(FITC)和Lin(FITC)的直接缀合的抗体温育细胞。将经过染色的细胞重悬于PBS以进行进一步分析。分析前加入7-AAD，5分钟后，直接在ISS上运行样品。

以ISS 100(Amnis Corporation，Seattle，Wash.)分析样品。分别通过通道3、4、5和6检测来自FITC、PE、7-AAD和PE-Cy5的信号；分别通过通道1和2收集侧向分散特征(SSC)和亮视野图像。

以ISS分析UCB-VSEL的形态学特征

基于细胞的亮视野图像，通过IDEAS软件计算细胞大小(直径)：其为较短的细胞轴的长度(以微米(μm)表示)；而核质比(N/C比率)的计算方式为：基于亮视野细胞图像和细胞核图像，其为细胞核面积(μm²)与细胞质面积(μm²)之比。细胞质面积计算为：细胞的总面积(μm²)与细胞核面积(μm²)之差。在收集自不同的UCB样品的最少100个细胞图像上进行分析。

通过实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析基因表达

通过实时RT-PCR进行所制备的源自UCB的细胞中的多种多能和组织定向基因的信使(m)RNA含量的分析。简而言之，通过RNeasy Mini Kit(Qiagen Inc.，Valencia，Calif.)从细胞分离总mRNA，通过TaqMan ReverseTranscription Reagents(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)进行逆转录。使用ABI PRISM 7500 Sequence Detection System(Applied Biosystems)，通过实时RT-PCR进行Oct-4、Nanog、Nkx2.5/Csx、GATA-4和VE-钙粘蛋白基因的mRNA水平的检测。β2-微球蛋白用作内源对照。25μl反应混合物中包含12.5μl SYBR Green PCR Master Mix，10ng互补(c)DNA模板和7.5ng针对Oct-4、Nanog、Nkx2.5/Csx、GATA-4、钙粘蛋白和β2-微球蛋白的正向和反向引物。

通过Primer Express软件设计引物。按照之前在Kucia等人，Leukemia2007；21：297-303(通过引用方式全文并入本文)中的描述使用引物的序列。通过比较型Ct方法计算Oct-4、Nanog、Nkx2.5/Csx、GATA-4和钙粘蛋白的mRNA表达的相对定量。靶标的相对定量数值(根据内源对照(β2-微球蛋白基因)并相对于校准器进行校正)表示为2^-ΔΔCt(-倍数差异)，其中ΔCt＝(靶基因[Oct-4、Nanog、Nkx2.5/Csx、GATA-4、钙粘蛋白]的Ct)-(内源对照基因[β2-微球蛋白]的Ct)，并且ΔΔCt＝(针对靶基因的样品的ΔCt)-(针对靶基因的校准器的ΔCt)。为了避免扩增污染性DNA的可能性：(i)用于实时RT-PCR的所有引物都是用待扩增的cDNA内的内含子序列设计的；(ii)以合适的阴性对照(无模板的对照)进行反应；和(iii)通过分析所扩增的产物的熔解曲线(解离图)重新检查产物的一致性扩增。

统计学分析：数据表示为平均值±测量值的标准误差(SEM)。P值＜0.05被认为是统计学上的显著性。所有的统计学分析均使用Origin(5.0版)统计软件(Microcal Software，Inc.，Northampton，Mass.)进行。

结果

UCB-VSEL是表达CD34、CD133和CXCR4抗原的小细胞

已经鉴定出VSEL是UCB中的CD34⁺/CD133^-/CXCR4⁺/Lin^-/CD45^-细胞的稀少群体，其表达PSC标志物，包括Oct-4、Nanog和SSEA-4。通过使用荧光激活的细胞分选(FACS)，然后通过定量遗传分析，我们发现VSEL中富含UCB细胞的CD45^-/Lin^-/CD133⁺、CD45^-/Lin^-/CD34⁺和CD45^-/Lin^-/CXCR4⁺成分。然而，CD45^-/Lin^-/CD133⁺细胞的最稀少的亚群具有最高的多能性标志物的表达。

由于通常的分选程序排除小于红细胞的事件(直径＜6-8μm)(通过将其考虑为碎片或血小板)，我们加入了珠子颗粒作为大小标志物以分选这些小的细胞(图56)。因此，通过使用此类珠子颗粒作为大小标志物，我们能够更好地定义含有小物体(2-15μm)的分选区域，如点图中所示，其显示了所分析的物体的正向-(F)SC和SSC(区域R1；图56图板A和B)。该区域主要含有细胞碎片，但是也包括一些稀少的细胞核细胞物体。

图56图板A和B显示了通过具有预先确定的大小的珠子(直径为1、2、4、6、10和15μm)的混合物控制的分选的细胞的大小。就造血Lin标志物的表达及其存活性(通过以7-AAD染色)进一步分析包含于区域R1中的物体(平均为源自UCB的总物体的80.9±7.3％)(图56，分别为图板C和D)。进一步基于CD34、CD133或CXCR4和CD45抗原的表达显示源自包含区域R2和R3的逻辑门的活的Lin^-事件。图56图板E显示了UCB-VSEL(R4)中富含的CD45^-/Lin^-/CD34⁺成分的实例，其占总的所分析的源自UCB的细胞的平均0.062±0.015％。在通过表面标志物的表达进行的分选程序之后检查的分选的UCB-VSEL的纯度是平均97.5±1.3％，如图56图板F所示。然而，这种分选小细胞的策略导致随着UCB-VSEL一起被分离的收集的细胞碎片的数目增多。因此，我们观察到：当在分离后，固定CD45^-/Lin^-/CD34⁺物体的分选的成分并以7-AAD重新染色时，实际上～80.8±2.1％的选择的事件是有核细胞(图56图板G)。这意味着～20％的事件是细胞碎片。

还使用了相似的分选策略来分离富含UCB-VSEL的其它UCB细胞成分，例如CD45^-/Lin^-/CD133⁺和CD45^-/Lin^-/CXCR4⁺细胞(未显示)。图57显示了此类细胞以及它们的显示出造血潜力的CD45⁺对应物(CD45⁺/Lin^-/CD34⁺、CD45⁺/Lin^-/CD133⁺和CD45⁺/Lin^-/CXCR4⁺)的ISS图像的实例。我们发现：VSEL中富含的属于所有3种UCB细胞成分的细胞平均小于它们的CD45⁺造血对应物(图57图板B-D)。此外，UCB细胞的CD45^-/Lin^-/CD34⁺和CD45^-/Lin^-/CD133⁺群体小于人类红细胞(分别是6.58±1.09□m和6.75±1.04□m)，人类红细胞的直径为～7.87±0.85μm。因此，在较大数目的UCB-VSEL上进行的并且通过ISS评估的这个首次的定量形态学方法进一步支持在人类组织中存在小于红细胞的有核细胞。

接下来，我们通过ISS分析比较了UCB-VSEL的基本形态学特征，例如大小和N/C比率，以比较表达CD34，CD133或CXCR4抗原的UCB细胞的非造血成分(Lin^-/CD45^-)和造血成分(Lin^-/CD45⁺)(表36-1)。我们观察到：非造血Lin^-/CD45^-细胞的所有3种群体的N/C比率高于Lin^-/CD45⁺造血群体(表36-1)。

表36-1.VSEL和HSC的大小和核质比(N/C比率)

UCB-VSEL的多能性标志物的表达与它们的小的尺寸和高的N/C比率相关。

我们以前描述了在VSEL中高度富含UCB细胞的Lin^-/CD45^-/CD133⁺非造血成分(19，21)。因此，通过使用ISS分析，我们通过聚焦于CD34抗原和PSC标志物(Oct-4和SSEA-4；图58，图板A-E)的表达进一步表征了这些细胞。

我们证明：Lin^-/CD45^-/CD133⁺/SSEA-4⁺细胞是Lin^-/CD45^-/CD133⁺细胞的最稀少的群体，分别相对于Lin^-/CD45^-/CD133⁺/CD34⁺和Lin^-/CD45^-/CD133⁺/Oct-4⁺细胞，其显示出最原始的形态学参数(图62)。我们发现：Lin^-/CD45^-/CD133⁺/SSEA-4⁺细胞(所有UCB细胞的0.016±0.004％)是最小的(5.97±1.39μm)，包含最高百分率的小于6μm的细胞(84.2±19.4％)，并且显示出最高的N/C比率(图58，图板F)。经我们计算：1毫升的UCB平均分别包含166.2±41.6、1246.7±51.9和1901.2±561.0的Lin^-/CD45^-/CD133⁺/SSEA-4⁺、Lin^-/CD45^-/CD133⁺/Oct-4⁺和Lin^-/CD45^-/CD133⁺/CD34⁺细胞(图63)。

通过低渗裂解在分选前除掉红细胞优于Ficoll-Paque离心

除掉RBC是制备有核细胞以进行染色和随后的分选的关键步骤。因此，我们比较了两种不同的策略，即，在低渗氯化铵中裂解和Ficoll-Paque离心，以就有核细胞富集UCB，并分析了通过这两种方法分离的UCB细胞的Lin^-/CD45^-和Lin^-/CD45⁺成分中CD34⁺、CXCR4⁺和CD133⁺细胞的百分率(图59)。

我们的流式细胞术数据揭示：Lin^-/CD45^-细胞的所有3种亚群(CD34⁺、AC133⁺和CXCR4⁺)在通过低渗裂解和Ficoll-Paque离心分离的有核细胞中的百分率是相似的(对于Lin^-/CD45^-/CD34⁺细胞，分别是0.062±0.015％和0.045±0.009％；对于Lin^-/CD45^-/CXCR4⁺细胞，分别是for 0.013±0.001和0.022±0.004％；对于Lin^-/CD45^-/AC133⁺细胞，分别是0.012±0.003％和0.010±0.002％；图59，图板A和B)。另一方面和同时，我们观察到：通过Ficoll-Paque分离的有核的Lin^-/CD45⁺成分中的CD34⁺、CXCR4⁺和AC 133⁺细胞的百分含量高于通过低渗裂解获得的细胞(对于Lin^-/CD45⁺/CD34⁺细胞，分别是0.489±0.122％和0.230±0.052％；对于Lin^-/CD45⁺/CXCR4⁺细胞，分别是0.083±0.030％和0.021±0.006％；对于Lin^-/CD45⁺/AC133⁺细胞，分别是0.302±0.075％和0.149±0.023％；图59，图板A和B)。所有的流式细胞术分析都在固定和以7-AAD染色细胞之后进行，以排除无核碎片。

接下来，我们进行了定量分析并计算了通过两种方法可以从1毫升UCB中分离的特定细胞群体的总数目(图59，图板C和D)。首先，我们发现：虽然通过裂解RBC之后回收了存在于UCB中的总的白细胞的85.9±4.5％，但是通过Ficoll-Paque分离后仅获得了44.0±4.3％的细胞(表36-2)，预计这是由于除掉了粒细胞。接下来，重新计算了被分析的所有群体的百分含量(图59，图板A和B)，以将这些数值调整为通过所使用的每种制备方法所获得的细胞的总数目(图62)，以显示1毫升UCB中每个群体的绝对数目(图59，图板C和D)。

表36-2.通过两种不同的程序i)在低渗溶液中裂解RBC；和ii)在Ficoll-Paque梯度上离心处理的UCB样品中回收的细胞

如所预期的那样，我们观察到：通过两种方法有效地分离了HSC，如通过获自1毫升UCB的这些细胞的相似的总数目所指示(图59图板D)。与此相反，我们注意到：在Ficoll-Paque制备物中损失的富含UCB-VSEL的UCB亚群(Lin^-/CD45^-/CD34⁺和Lin^-/CD45^-/CD133⁺)显著高于低渗裂解制备物(对于Lin^-/CD45^-/CD34⁺细胞/1ml UCB，分别是2381.6±469.6和6454.2±1564.2；对于Lin^-/CD45^-/CD133⁺细胞/1ml UCB，分别是505.6±91.4和1259.7±355.1；图59图板C)。随后，通过在通过Ficoll-Paque离心除掉红细胞后获得的MNC中的与多能性和组织定向相关的基因(Oct-4，Nanog，Nkx2.5/Csx，GATA-4和钙粘蛋白)的mRNA的表达的降低，进一步确认了这一点(图59图板E)。

在常规体积耗竭中损失UCB-VSEL

在UCB冷冻前进行的体积耗竭可能是另一个潜在的可能潜在损失UCB-VSEL的步骤，这是由于它们的小的尺寸和不同的细胞密度。为了解决这个问题，我们在以下细胞中检查了Lin^-/CD45⁺/CD34⁺和Lin^-/CD45⁺/CD133⁺UCB-VSEL以及它们的CD45⁺造血对应物的含量：i)处理前的新鲜UCB样品；ii)使用AXP^TM AutoXpress Platform通过体积耗竭制备的用于冷冻的这些细胞的浓缩物；和iii)解冻后的UCB样品(图60)。

流式细胞术分析揭示出在通过体积耗竭策略处理并制备的用于冷冻储存的UCB细胞的浓缩物中，总的有核的CD34⁺和CD133⁺细胞以及Lin^-/CD45^-/CD34⁺和Lin^-/CD45⁺/CD34⁺细胞(图60图板A)和Lin^-/CD45^-/CD133⁺和Lin^-/CD45⁺/CD133⁺细胞(图60图板B)的显著损失。我们发现：在此类程序中，平均损失41.5±15.9％的Lin^-/CD45^-/CD34⁺和42.5±12.6％的Lin^-/CD45^-/CD133⁺细胞。同时，我们观察到：仅损失了26.9±14.8％的Lin^-/CD45⁺/CD34⁺和26.7±12.5％的Lin^-/CD45⁺/CD133⁺细胞(表36-3)。有趣的是，我们还注意到：在一定程度上，源自UCB的VSEL和Lin^-/CD45^-/CD133⁺细胞对于冷冻-解冻程序的抗性尤其更高(图60图板B和表36-3)。

表36-3.从在冷冻和解冻前通过体积耗竭处理的UCB单元回收的CD-VSEL和HSPC

三步分离CD133⁺VSEL

基于所呈现的数据，我们提出了新的三步分离程序以分离UCB-VSEL。由于在SSEA-4⁺Oct-4⁺VSEL中高度富含Lin^-/CD45UCB细胞的CD133⁺成分(19，21)，所以，我们着力于分离CD133⁺/Lin^-/CD45^-细胞。这种三步程序是基于：i)低渗裂解UCB细胞以除掉红细胞；ii)通过使用免疫磁珠选择CD133细胞；和iii)随后在尺寸珠子标志物的控制下通过使用FACS纯化Lin^-/CD45^-/CD133⁺细胞。

图61图板A显示了未经处理的UCB以及通过低渗裂解或Ficoll-Paque离心除掉红细胞的UCB中的Lin^-/CD45⁺/CD133⁺细胞的数目。再次证明，在防止损失UCB-VSEL方面，低渗裂解是比Ficoll-Paque梯度离心更优的方法。更重要的是，图61图板A还显示：如果我们使用提出的三步分离程序，我们还能够回收这些小细胞的最初数目的～60％。整个分离程序耗时仅2-4小时/100ml UCB。如果我们分选UCB-VSEL而不进行CD133选择，则理论上该程序将耗时2-3天！并且，将会使用大量的抗体。因此，虽然在最后的制备物中损失一些Lin^-/CD45⁺/CD133⁺细胞，但是提出的三步分选策略是高度有效的并且省时的程序。同时，如图61图板B所示，我们没有观察到具有造血潜力的源自UCB的Lin^-/CD45⁺/CD133⁺细胞(尺寸大于UCB-VSEL)的任何损失。

通过HSC的反式-去分化或通过细胞融合现象解释了源自BM或UCB的细胞对器官再生的贡献。鼠BM和UCB包含表达数种PSC标志物的小的原始细胞的群体。该群体能够在体外培养物中分化成为中胚层衍生的心肌细胞和外胚层衍生的神经细胞。我们将这些细胞称作“非常小的胚胎/外胚层样干细胞(VSEL)”，并且推论它们是在发育早期作为外胚层衍生的PSC的群体沉积的，其可以促成器官和组织再生。此外，我们观察到：如果在OP-9细胞支持性细胞系上扩增这些细胞，它们会分化并产生HSPC，这提出了以下问题：它们是否能够在移植后的长期造血重建中发挥作用。因此，在收集UCB时应该保留这些细胞以用于移植目的。然而，这些细胞是在储存的UCB产品中检出的；由于它们的尺寸小(小于红细胞)，它们中很多可能在细胞分离程序中损失掉了。此外，这些细胞在目前细胞计数学中使用的设门策略中被忽略了。

考虑到更好地在临床血液学中使用这些细胞以及其在再生医学中的更广泛的应用，本实施例提供了这些细胞的形态学表征，以及用于分离它们的策略的开发。由于时间限制，不可能通过使用常规的高速分选仪从UCB单元中纯化这些细胞。制备用于分选的UCB细胞的第一个步骤是除掉红细胞，为此，我们使用了两种方法：在低渗氯化铵溶液中裂解，以及在Ficoll-Paque梯度上离心。我们还评估了体积耗竭的影响及其对于维持UCB-VSEL的最初数目的影响。

我们发现：与HSPC不同(HSPC尺寸较大)，Ficoll-Paque梯度离心除掉了UCB-VSEL的最初数目的～50％。在体积耗竭过程中也损失了大量的这些细胞。这说明：就分离尺寸小的细胞而言，目前所使用的用于UCB储存的策略需要进行重新评价。我们使用在低渗氯化铵溶液中进行的UCB单元的裂解作为第一个步骤，以富集源自UCB的有核细胞。

我们聚焦于表达CD133抗原的UCB-有核细胞。据描述，该抗原不仅存在于HSC的表面上，而且存在于其它类型的恶性和正常的SC上。源自UCB的CD133⁺细胞富含VSEL。我们在此第一次证明：Lin^-/CD45⁺/CD133⁺细胞的最小的群体表达PSC标志物，例如在它们的细胞核中表达Oct-4转录因子，在它们的细胞表面表达SSEA-4抗原。多数Lin^-/CD45^-/CD133⁺/SSEA-4⁺细胞的直径小于6μm，并且显示出最高的N/C比率。这些显示出数种PSC标志物的小的细胞在制备UCB过程中特别易于经历潜在的损失。

我们发现：VSEL在低渗裂解中很好地存活，如在本实施例中所证明，有效地排斥存活性染料7-AAD。然而，红细胞的这种大规模裂解导致释放红细胞衍生的微囊泡，其可以向存在于裂解的UCB(包括VSEL)中的有核细胞的表面转移磷脂酰丝氨酸。其结果是，细胞在低渗裂解之后可能对于Annexin-V的染色呈阳性，这是由于通过微囊泡进行的磷脂酰丝氨酸的转移，其产生它们是凋亡细胞的假象。在低渗裂解后评判有核细胞的存活性时，需要考虑到这一因素。

基于我们关于“VSEL表达CD133抗原”的观察，我们使用免疫磁性选择作为我们的下一个步骤，以通过FACS就VSEL分离UCB有核细胞。我们注意到：在UCB低渗裂解后，通过免疫磁性进行的CD133选择允许分离存在于新鲜收集的单元中的UCB-VSEL(Lin^-/CD45^-/CD133⁺)的最初数目的～60％。

虽然回收了～60％的VSEL，但是该三步分离程序(低渗裂解+CD133⁺免疫磁性细胞选择+FACS)是在2-3小时内完成的。如果是通过直接从单核UCB细胞中分选VSEL，为了获得相似的细胞数目，由于显而易见的原因，分选程序将花费2-3天。

这种三步分离方法似乎是有效的。可以进行修改以进一步优化分离策略，以在相对短的时间内回收超过60％的VSEL。这包括使用淘析作为除掉红细胞的步骤，以及就小细胞进行富集。另外，特异于VSEL的抗体将允许直接从UCB MNC群体中分离这些细胞。这些抗体可能将靶向一些胚胎干细胞样抗原，例如针对SSEA表位的新的克隆。

总之，我们证明：由于它们的异常小的尺寸，所以在常规的体积耗竭程序或在密度梯度离心之后会损失大量的UCB-VSEL。为了更有效地分离这些细胞，我们提出了相对短的和经济的三步分离程序，其允许回收Lin^-/CD45^-/CD133⁺UCB-VSEL的最初数目的～60％。这种新的策略是基于：i)在低渗氯化铵溶液中裂解红细胞；ii)通过免疫磁珠选择CD133⁺细胞；和iii)在尺寸标志物珠子的控制下，通过FACS分选Lin^-/CD45^-/CD133⁺细胞。整个分离程序花费～2至3小时/UCB单元，并且分离的细胞高度富含小的、高度原始的Lin^-/CD45^-/CD133⁺细胞的Oct-4⁺和SSEA-4⁺群体。

实施例37：从成年组织中鉴定并分离干细胞的多仪器方法

在本实施例中，使用了多个互补性的细胞成像分析方法，包括ImageStream系统(ISS分析)和分子方法，以从成年鼠器官中鉴定并纯化非常小的胚胎样干细胞(VSEL)的群体。这些细胞：i)尺寸小；ii)具有高核质比；iii)含有原始的非结构化的常染色质；iv)在小鼠中发现它们存在于Sca-1⁺lin^-CD45^-细胞中，在人类中存在于CD 133⁺CXCR4⁺CD34⁺Lin^-CD45^-细胞中；和v)在细胞核中表达胚胎标志物例如Oct-4蛋白，并且在表面上表达SSEA抗原。在小鼠中，这些细胞中的大多数存在于脑、肾、胰腺和骨髓中。来自我们的实验室的数据证明：VSEL很可能是种系/外胚层衍生的多能干细胞的群体，其在器官发生过程中沉积于发育中的组织中，作为组织定向干细胞的来源，这些细胞的数目随着年龄而减少。我们相信，VSEL能够被用作多能干细胞的来源以用于再生医学。

分离自骨髓(BM)或脐带血(CB)的造血干细胞(HSC)被认为转分化为定向为心肌、肾或肝的干细胞。然而，当在组织/器官动物再生模型中使用高度纯化的干细胞的群体时，“干细胞可塑性”这个概念变得具有高度争议性。例如，以高度纯化的HSC进行的实验未确认以前作出的“HSC可以转分化为心肌”的观察结果，因此提供了针对干细胞可塑性的争论。各个报道之间的不一致性可以由下列事实解释：在以前进行的旧的证明干细胞可塑性的实验中，除了HSC之外，还可能在器官/组织再生模型中应用了其它的污染性干细胞的群体。

即使成年哺乳动物细胞中的干细胞可塑性现象可能是偶发的非常罕见的事件，但是这不能解释之前所有的阳性的干细胞可塑性实验。因此，本发明人假设了一种替代性解释：成年组织中含有一些稀少的多能干细胞，它们具有广阔的分化潜力，并且，如果这些细胞与TCSC(例如与HSC)一起纯化，则它们在一些报道的动物模型中引起组织再生。在这个方面，本发明人在BM中鉴定了潜在的多能干细胞(PSC)，其能够分化成来自所有三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞。此类PSC i)在小鼠中表达Sca-1抗原和CXCR4受体；ii)在人类中是CD133⁺CXCR4⁺CD34⁺；iii)不表达谱系特异性标志物(Lin^-)；iv)是非造血的(CD45)；和v)最重要的是，它们的尺寸非常小。关于“此类细胞可能非常小”的概念来自我们的实验，其中我们通过使用向α-趋化因子基质衍生的因子-1(SDF-1)的趋向性从BM分离了CXCR4⁺干细胞。SDF-1是针对CXCR4受体的配体，并且从BM(其中包括干细胞/祖细胞的稀少群体)中吸引CXCR4⁺细胞。我们注意到：在化学趋化分离过程中，某些响应于SDF-1梯度的细胞令人惊奇地非常地小(＜6μm)。更重要的是，它们中有一些在蛋白水平上表达早期发育标志物(例如GATA-4)。在移植前的胚囊中，在所谓的外胚层(胚胎的一部分，其在原肠胚形成过程中产生所有的TCSC，以用于组织和器官发育)中描述过类似的非常小的细胞。这种类似第一次间接指示了我们正在寻找的细胞可能是原始的外胚层衍生的干细胞。

非常小的胚胎样干细胞(VSEL)在成年鼠BM中的鉴定

众所周知，多数基于荧光激活的细胞分选仪(FACS)的分选程序排除直径小于5-6μm的事件，其中包含细胞碎片、红细胞和血小板。因此，我们假设：我们所寻找的非常小的细胞之前有可能在标准的分选程序中被排除在FACS分选的细胞群体之外。因此，为了开发用于非常小的表达胚胎干细胞标志物的细胞的有效分选策略，通过具有预先确定的尺寸的珠子(直径为1、2、4、6、10和15μm)来控制所分选的细胞的大小。这种新的通过尺寸珠子标志物控制的FACS分选方法显示于图64。该策略的第一个步骤是对包含所有小事件(2-10μm)的区域设门—在点图中显示为区域RI(图64图板A和B)。该区域中包含的多数是细胞碎片，但是也如我们所预期的那样包含一些稀少的有核的小细胞。

区域RI(图64图板A和B)中包括的事件包括由细胞仪分析的总事件的平均～50％，然后就Seal和谱系标志物(Lin)的表达进一步对其进行分析。Sca-1⁺/Lin^-事件显示于区域R2(图64图板D)，平均而言，其由0.30±0.05％的所分析的总的BM有核细胞组成。然后，根据CD45抗原的表达，将来自区域R2的细胞分选为Sca1⁺/Lin^-/CD45^-(区域R3)和Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺(区域R4)亚群(图64图板C)。我们发现：显示于R3中的第一群体(Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-)事实上包含非常小的表达早期胚胎标志物的细胞，显示于R4中的第二群体(Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-)高度富含HSC。直接的透射电子显微镜(TEM)分析确认：Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞显示胚胎干细胞的数个典型特征：例如尺寸小，细胞核大，细胞核被细胞质的狭窄边缘围绕，并且具有开放型的染色质(常染色质)。相反，Sca-1⁺lin^-CD45⁺细胞显示出异质形态，并且较大。它们的直径经测定为平均8-10μm；具有分散的染色质和突出的核仁。

基于TEM特征和早期胚胎标志物例如Oct-4、Nanog和SSEA-1的表达，我们将Sca-1+/Lin^-/CD45^-细胞命名为非常小的胚胎样干细胞(VSEL)。我们发现：VSEL占总BM有核细胞的～0.03％而HSC是～0.35％(图64图板C)。我们还注意到，95％的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-(VSEL)的直径在2-6μm尺寸范围内，而86％的Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺(HSC)在6-10μm的尺寸范围内。因此，通过应用流式细胞术和尺寸标志物珠子，我们确认了分离自成年BM的大多数Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞是异常小的细胞(＜6μm)，类似于在趋化分离实验中观察到的那些。

在下一个步骤中，使用了被称作ImageStream系统(ISS)分析的新的成像策略来更好地列举和评估VSEL的形态学特征。这种基于ISS的分析包括流式细胞术并结合显微镜，其允许对多个细胞参数进行统计学分析，并通过高分辨率的亮视野、暗视野和荧光图像显示流式分析中悬浮液中的细胞。ISS成像的高分辨率能够鉴定直径小至1μm的物体。因此，该成像策略对于分析小的细胞事件是理想的。因此，我们使用ISS来验证获自经典流式FACS分析的结果，以更好地显示感兴趣的事件。对于ISS分析，固定BM单核细胞(BMMNC)并以结合DNA的荧光染料7-氨基放线菌素(7AAD)将细胞染色，以更好地显示有核细胞(图65图板A)。通过应用该染色技术，通过在7-AAD细胞核图像中产生的自动化掩盖(形态掩盖)来计算细胞核的面积。通过从细胞的总面积中减掉细胞核的面积来计算细胞质的面积。N/C比率计算为细胞核和细胞质面积之比。

基于通过ISS所获得的物体的形态学特征和它们的直接的显微镜显示，我们能够排除碎片和人工假象，仅选择有核的完整的细胞进行进一步分析(图65)。通过应用ISS分析(其允许分析所获得的细胞的照片库)，我们更加精确地确认：VSEL的直径为～3.6μm，而Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺HSC较大，其直径为～6.S！lm。我们还注意到，VSEL的核质比显著高于HSC(分别是1.5±0.2和0.8±0.03)。此外，VSEL的细胞质面积显著低于HSC(分别是5.4±0.6和33.8±1.7)。虽然其尺寸小，但是当通过FACS就DNA含量对VSEL进行分析时，发现它们具有二倍体DNA。它们在表面不表达MHC-I和人类白细胞抗原-D相关的抗原(HLA-DR)并且是CD90^-CD105^-CD29^-。此外，如ISS分析所确认，源自BM的VSEL比外周血的血小板大并且比红细胞小(图66)。

我们的实验数据说明：在组织和器官损伤(例如，心脏梗塞、中风、毒性肝脏损伤)过程中，VSEL可以从BM中被释放并且在血液中循环。有趣的是，如果铺板于C2C12鼠肉瘤细胞饲养层，～5-10％的纯化的VSEL能够形成类似于胚体的球体。来自这些VSEL衍生的球体(VSEL-DS)的细胞由具有包含常染色质的大的细胞核的未成熟的细胞组成，并且是CXCR4⁺SSEA-1⁺Oct-4⁺，正如纯化的VSEL一样。然而，这些球体中的细胞已经变大并且显示出一些分化的迹象。

有趣的是，VSEL-DS的形成与年幼小鼠相关联，在分离自年老小鼠(＞2岁)的细胞中未观察到VSEL-DS。VSEL在BM中的这种年龄依赖性含量可以解释再生过程为何在较年幼个体中效率更高。BM单核细胞(BMMNC)中的这些细胞的含量在存活较长的和存活较短的小鼠株中也存在差异。存活较长的小鼠(例如C57B16)的BM中的这些细胞的浓度比存活较短的小鼠(DBA/2J)高得多。这说明一些基因可能负责发育组织的分布和这些细胞的扩增，并且这些基因可能参与控制再生能力，并由此控制哺乳动物的寿命。

由于VSEL表达原始生殖细胞(PGC)的数种标志物例如胎儿型碱性磷酸酶、OctA、SSEA-1、CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis、Nobox和Hdac6，所以我们预想它们可能与外胚层衍生的PGC的群体密切相关，所述外胚层衍生的PGC是早期胚胎发生过程中在发育中的胚胎中定向的干细胞的最初第一个群体。VSEL的活动性也非常高，并且高度响应于SDF-1梯度，粘附于纤连蛋白和纤维蛋白原，并且可能与BM衍生的基质纤维母细胞相互作用。共聚焦显微镜和时滞研究揭示：这些细胞迅速吸附至髓衍生的纤维母细胞，迁移至其下，并且在其中进行伸入运动(emperipolesis)。由于纤维母细胞分泌SDF-1，如上所述SDF-1与CXCR4受体结合，它们可以为小的CXCR4⁺VSEL产生归巢环境。VSEL与BM衍生的纤维母细胞之间这种有力的相互作用具有重要意义，即，分离的BM基质细胞可能从最开始即被这些细小的细胞污染。这种观察结果一定程度上可以解释髓衍生的纤维母细胞(例如间充质干细胞(MSC)或多潜能成年祖细胞(MAPC))的未预料的“可塑性”。最近，也有证据证明：在人类BM中尤其是年轻人中也存在类似的对应细胞。

成年鼠器官中VSEL的鉴定

为了分析成年器官中Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞的存在，灌注小鼠以除掉如我们所述的也可能以极低的水平在外周血中循环的VSEL。然后，将切除的器官进行酶促匀浆，洗涤分离的有核细胞，并以特异性抗体进行染色，以进行FACS和ISS分析。在新鲜分离的或固定的细胞上进行流式细胞术分析，所述细胞按照如源自BM的细胞的情况中所述，以结合细胞核DNA的染料7-AAD进行染色。在如上所述的固定的细胞的染色程序中加入7-ADD允许我们显示真实的有核事件。通过使用经典的FACS和ISS，我们发现所有的分析的器官都包含Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞的群体。此外，在染色程序中加入细胞核染料(7-ADD)显著改善了我们的分析的精确度：其将有核物体与无核的7-ADD-阴性的碎片区分开。ISS允许通过它们的真实图像显示所获得的物体，这为我们提供了以下机会：不仅将有核物体与无核碎片区分开，而且将阳性细胞与假阳性人工假象区分开。图67中显示了通过FACS错误地分选为“细胞”的细胞碎片的实例。该实例显示了ISS分析相对于FACS的明显优势。

如上一段所述，分离自鼠骨髓的VSEL是Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞的Oct-4阳性亚群。因此，在下一个步骤中，我们评估了鼠器官中的一些Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞(VSEL)。再次选择ISS分析作为最精确的方法，在固定并以细胞核染料7-AAD染色之后，就Oct-4、Sea-1、CD45和造血谱系标志物(Lin)对分离自经酶处理的组织的细胞进行染色。我们检测到小的有核的Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞在所分析的所有器官和组织中的存在(图68，表37-1)。我们发现：胰腺、脑、骨骼肌和肾是具有最高百分含量的这些细胞的器官(分别是0.330±0.099、0.110±0.027、0.082±0.018和0.056±0.004％)，而骨髓、胸腺和脾含有最低百分含量的Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞(分别是0.0018±0.0003、0.0018±0.0003和0.005±0.001％)(表37-1)。

表37-1.通过ImageStream系统测定的成年鼠器官/组织中Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞的含量和形态学特征。细胞通过酶消化而分离自成年的4-8周龄的小鼠(C57BL/6)的组织。在从3只6周龄的动物收集的器官上进行分析。

接下来，我们计算了每种器官中的这些细胞的绝对数目(图69图板A)。我们发现：小的有核的Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞的最高数目是在脑、肾、骨骼肌、胰腺和骨髓中(分别是43.97±12.38、19.87±2.03、15.18±6.79、9.41±4.71和8.39±2.00x10³)。另一方面，心脏、胸腺、睾丸和脾中包含最低数目的这些细胞(分别是1.35±0.56、2.03±0.37、2.38±1.25和3.86±0.43x10³)(图69)。

因此，通过使用ISS，我们在多个成年器官中鉴定出了在表型上对应于VSEL的Oct-4⁺细胞。此外，ISS允许我们将Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-VSEL与通常存在于经过酶消化的样品中的细胞碎片和人工假象区分开。在下一个步骤中，我们使用这些细胞的收集的图像来计算其形态学特征，例如平均大小和核质比(N/C比率)，其是基于细胞的亮视野和细胞核图像计算的。我们注意到：最小的Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞处于骨髓和心脏中(分别是3.78±0.64和4.74±0.93μm)。同时，在其它器官中检测到的Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞的尺寸也较小，＜6μm)(表37-1)。此外，相对高的核质比确认了所分析的群体的原始特性。骨髓和睾丸被鉴定为包含最高的N/C(分别是2.12±0.33和2.11±0.40)的Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞的器官。在所有其它器官中观察到了具有较低的N/C比率的细胞。

随后，通过对分选自多种器官的Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞进行共聚焦显微镜分析确认了通过ISS检测的小的Oct-4⁺Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞的存在(图7中显示的实例)。我们在所测定的所有器官中鉴定出了具有VSEL表型的小的(＜5μm)Oct-4⁺细胞的存在。此外，还通过在分选的细胞上进行常规的RT-PCR和RQ-PCR在mRNA水平上确认了Oct-4的表达。RQPCR分析揭示出在分离自骨髓的Sca-1⁺Lin^-CD45^-细胞中存在最高数目的Oct-4mRNA转录物(未显示)。

VSEL存在于人类脐带血(CB)中

新生的CB是非造血干细胞的重要来源。众所周知，源自CB的细胞促成骨骼肌、肝脏、神经组织和心肌的再生，更重要的是，最近，在山羊中移植了人类CB CD34⁺Lin^-细胞后，实现了多器官的移植和分化。一般而言，我们能够预想到CB作为被分娩相关的应激动员的新生的PB。分娩过程中数种细胞因子和生长因子的释放以及低氧条件可以动员新生髓细胞进入循环。因此，极有可能的是，CB中鉴定的原始SC的群体起源于新生BM。它们还可以从造血系统之外的其它干细胞小生境中被动员进入新生血液。

通过使用新的两步分离程序-通过低渗裂解除掉红细胞并结合多参数分选，我们能够从CB中分离类似于我们之前描述的源自鼠BM的VSEL的人类细胞的群体。这些分离自CB的VSEL(CB-VSEL)是非常小的(4-6μm)，并且在CXCR4⁺AC133⁺CD34⁺lin^-CD45^-CB单核细胞的群体中高度富集，具有包含非结构化的常染色质的大的细胞核，表达细胞核胚胎转录因子Oct-4和Nanog以及表面胚胎抗原SSEA-4。

在人类脐带血中发现了具有胚胎干细胞标志物的非常小的细胞。还发现这些细胞表达Oct-4和SSEA-4，并且具有生长神经球(neurosphere)并分化成神经组织的高潜力。这些发现表明：除了人类BM和CB之外，VSEL还可能类似地存在于其它器官和组织中，如同在小鼠中一样。因此，VSEL群体可能在维持哺乳动物干细胞库的动态平衡中发挥重要作用。

VSEL与分离自成年组织的其它潜在的多能干细胞(PSC)之间的关系

如在简介部分所提及，累积的证据证明：除了TCSC之外，成年器官还含有更原始的PSC的群体。这些细胞可能是TCSC的潜在的后备群体。如上所述，几个研究组报道了在发育上而言原始的干细胞群体的存在，其分布于成年器官/组织中。这些细胞还在以下文献中被不同地描述为：多潜能成年祖细胞(MAPC)、分离自髓的成年多谱系可诱导(MIAMI)、多潜能成年干细胞(MASC)和OmniCytes。极有可能的是，使用不同的分离策略，多个研究者描述了相同的干细胞群体，但是根据情况进行了不同的命名。然而，VSEL是目前为止在单细胞水平上被纯化并且通过使用多个互补性的细胞成像分析方法进行分析的这些细胞的唯一群体。

我们还预想到，原始细胞的所有这些群体处于成年组织中，并且可以在应激或组织损伤过程中被吸引，以使受损的器官再生。受损的器官分泌数种可以趋化VSEL的因子。也就是说，在低氧过程中，损伤的组织(例如梗塞的心肌、中风区域)分泌数种化学吸引剂。最重要的一些是在转录水平上被称作低氧诱导因子-1a(HIF-1a)的转录因子调节的基因的产物。因此，HIF-1a调节数个基因，包括：i)基质衍生的因子-1(SDF-1a)；ii)肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)和血管内皮生长因子(VEGF)。所有这些因子(SDF-1、HGF/SF和VEGF)配合干细胞在受损组织中的累积和它们向外周血中的动员。

为了支持这一观点，已经报道了VSEL或OmniCytes在″para-medics″中发挥重要作用，并且在器官/组织损伤中被动员进入外周血，并且在其中循环，以尝试使受损的器官富足并再生。这种生理机制可能在一些小的组织/器官损伤的再生中具有更加重要的作用。大的组织器官损伤的再生将需要局部输送更大数目的纯化的分离的和扩增自成年组织的PSC。然而，这些细胞在成年组织中的存在为这些细胞群体在再生医学中的应用提供了广阔的可能性。

应理解，可改变本文描述的主题的各个细节而不偏离所描述的主题的范围。而且，以上描述仅出于阐释的目的，而并非出于限制的目的。

参考文献

下面列出的参考文献及说明书中列出的所有参考文献，包括专利、专利申请、杂志文章及所有数据库条目(如GENBANK(R)登记号，包括GENBANK(R)数据库中存在的与披露的序列相关的任何注解)，以引用方式并入本文中到这样的程度，即它们补充、解释、教导本文所用的方法、技术、和/或组成，或为本文所用的方法、技术、和/或组成提供背景。

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Claims (31)

1.源自人类的成人器官或组织细胞的非常小的胚胎样干细胞(VSEL)的富集群体，其中所述群体这样富集：通过就CD133⁺CXCR4⁺CD34⁺Lin^-CD45^-细胞来选择细胞以获得靶VSEL的富集群体。

2.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是Oct-4⁺。

3.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是SSEA⁺。

4.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL在细胞核中表达Oct-4蛋白，并且在表面上表达SSEA抗原。

5.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是Nanog⁺。

6.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL表达选自下列的原始生殖细胞(PGC)标志物：胎儿型碱性磷酸酶、OctA、SSEA-1、CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis、Nobox和Hdac6。

7.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就大小为2至6μm的细胞进行选择而富集的。

8.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就大小为2至4μm的细胞进行选择而富集的。

9.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就含有原始的非结构化的常染色质的细胞进行选择而富集的。

10.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述群体中至少30％的细胞是靶VSEL。

11.源自人类血液的非常小的胚胎样干细胞(VSEL)的富集群体，其中所述群体这样富集：通过就CD133⁺CXCR4⁺CD34⁺Lin^-CD45^-细胞来选择细胞以获得靶VSEL的富集群体。

12.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述血液是脐带血。

13.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述血液是外周血。

14.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是Oct-4⁺。

15.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是SSEA⁺。

16.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL在细胞核中表达Oct-4蛋白，并且在表面上表达SSEA抗原。

17.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是Nanog⁺。

18.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL表达选自下列的原始生殖细胞(PGC)标志物：胎儿型碱性磷酸酶、OctA、SSEA-1、CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis、Nobox和Hdac6。

19.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就大小为2至6μm的细胞进行选择而富集的。

20.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就大小为2至4μm的细胞进行选择而富集的。

21.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就含有原始的非结构化的常染色质的细胞进行选择而富集的。

22.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述群体中至少30％的细胞是靶VSEL。

23.产生细胞群体的方法，所述细胞群体就来自人类血液的靶非常小的胚胎样干细胞(VSEL)进行了富集，所述方法包括裂解血液以除掉红细胞和制备Lin^-/CD45^-/CD133⁺细胞的富集群体。

24.权利要求23的方法，其中所述血液是脐带血。

25.权利要求23的方法，其中所述血液是外周血。

26.产生细胞群体的方法，所述细胞群体就来自人类血液的靶非常小的胚胎样干细胞(VSEL)进行了富集，所述方法包括：i)裂解血液以除掉红细胞；ii)制备CD133⁺细胞的富集群体；和iii)制备Lin^-/CD45^-/CD133⁺的富集群体。

27.权利要求26的方法，其中所述血液是脐带血。

28.权利要求26的方法，其中所述血液是外周血。

29.权利要求26的方法，其中所述Lin^-/CD45^-/CD133⁺的富集群体是通过荧光激活的细胞分选来富集的。

30.权利要求26的方法，其中在低渗的氯化铵溶液中裂解血液以除掉红细胞。

31.权利要求26的方法，其中通过使用免疫磁珠来富集CD133⁺细胞。

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