CN102373176B - 一种极小类胚胎样干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种优化的骨髓干细胞分选方法，用于分选成体骨髓干细胞中一群数量极少的、具有多向分化潜能的亚群细胞，即极小类胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)。

Description

一种极小类胚胎样干细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及一种骨髓干细胞分选制备方法，具体的涉及极小类胚胎样干细胞的分选制备方法。

背景技术

心血管疾病每年夺走1200万人的生命，接近世界人口总死亡的1/4，成为人类健康的头号大敌。对于心肌梗死或心力衰竭，传统的治疗方法，包括药物、介入和外科手术均不能使缺失的心肌细胞再生，由于心肌缺失造成不可逆转的心肌重塑过程，终至心力衰竭和死亡。近年来，干细胞再生医学在心血管疾病治疗中取得了突破性进展，该技术又被称为细胞心肌成形术(cellular cardiomyoplasty)，即通过移植干细胞或心肌细胞，或者动员外周循环血干细胞或骨髓干细胞迁移到心肌受损部位来实现损伤心肌的修复。

目前应用于动物实验及临床实验的干细胞种类主要包括胚胎干细胞和各种成体干细胞。胚胎干细胞由于受到免疫排除和伦理道德等问题的干扰，因而在临床应用中受到限制。成体干细胞，主要包括造血干细胞、骨髓单核细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨骼肌成肌细胞、脐血干细胞及脂肪来源的干细胞等。成体骨髓干细胞不存在免疫排斥反应，采取方便，被认为是最有前景的细胞移植类型。

通常认为干细胞移植可以增加细胞因子如VEGF的释放，促进缺血区新生血管的形成，改善灌注、改善冬眠心肌和顿抑心肌的功能，减少心室扩张和心室重构。移植的干细胞在局部微环境的诱导下可以分化为心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等，即具有可塑性，但也有研究发现移植的骨髓干细胞并没有分化为心肌细胞，只是分化为不同的血液细胞。因此，目前争议的焦点主要是成体干细胞的横向分化潜能。

近年来，研究者在成体组织中发现类似于胚胎干细胞的、能真正横向分化的成体干细胞类型。

数项研究表明骨髓中存在表达多能干细胞标记(如Oct-4、Nanog、SSEA-1、Rex-1等)的成体干细胞，如MSC亚群[Colter DC，Sekiya I，ProckopDJ.Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotentialadult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.Proc Natl Acad Sci US A，2001.(98)：7841-7845.Pochampally RR，Smith JR，Ylostalo J，et al.，Serum deprivation of human marrow stromal cells(hMSCs)selects for asubpopulation of early progenitor cells with enhanced expression of OCT-4 andother embryonic genes.Blood，2004.103：1647-1652]、MAPC[Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.，Pluripotency of mesenchymal stem cellsderived from adult marrow.Nature，2002.418：41-49]、MIAMI[D’Ippolito G，Diabira S，Howard GA，et al.，Marrow-isolated adult multilineage inducible(MIAMI)cells，a unique population of postnatal young and old human cells withextensive expansion and differentiation potential.J Cell Sci，2004.117：2971-2981]、USSC[Kogler G，Sensken S，Airey JA，et al.，A new human somatic stemcell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential.J Exp Med，2004.200：123-135]等。2004年，Kucia等[Kucia，M.，et al.，Cellsexpressing early cardiac markers reside in the bone marrow and are mobilizedinto the peripheral blood after myocardial infarction.Circ Res，2004.95(12)：1191-9]首次报道小鼠骨髓MNCs中富集一类表达心肌细胞转录因子(Nkx2.5/Csx，GATA-4，MEF2C)的非造血干细胞，表面标记为CXCR4(+)、lin(-)、CD45(-)、Sca-1(-)。该研究小组连续进行数项研究，于2006年首次提出极小类胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)的概念[Kucia M.，et al.，A population of very small embryonic-like(VSEL)CXCR4(+)SSEA-1(+)Oct-4+stem cells identified in adult bone marrow.Leukemia，2006.20(5)：857-69]。

归纳起来，VSELs主要有以下特点：1)体内数量少，约占骨髓MNCs的0.01-0.02％，且随年龄增加而减少；2)VSELs表达ESCs的多能性原始标记蛋白类：小鼠为Sca-1(+)/lin(-)/CD45(-)，人为CD133(+)/CXCR4(+)/CD34(+)/Lin(-)/CD45(-)；3)形态学：VSELs体积小，直径约2-4μm(小鼠)、6-8μm(人)，电镜下可见其具有典型的ESCs形态特征，如细胞核大，细胞壁薄，高核/浆比值，染色体排列无序，含有双倍DNA结构和大量线粒体；4)在mRNA和蛋白质水平表达SSEA-1、Oct-4、Nanog，以及GATA-4、Nkx2.5/Csx、MEF2C和内皮标记VE-cadherin；5)分布：广泛存在小鼠多个组织器官(其中骨髓、脑、肾、肌肉、胰腺数量较多)及人脐血、骨髓和外周血；6)可被动员：正常情况下，外周血中VSELs数量极少，AMI后大量VSELs动员至外周血，其动员与梗死区多种趋化因子，如SDF-1等表达上调有关；7)横向分化潜能：在适当促分化条件下能分化为三个胚层来源的细胞，包括心肌细胞。

有关VSELs移植的动物实验显示，AMI后48h经心肌输注1×10⁴个eGFP标记的VSELs，观察至AMI后35天，移植组心功能明显改善，心肌细胞代偿性肥大减轻，而移植1×10⁵个造血干细胞(HSCs)未见任何心功能和组织结构改善。VSELs移植组梗死区可见数量极少的eGFP+心肌细胞和毛细血管。该研究表明经心肌内输注小剂量VSELs即可改善心功能、减轻左室重构，为VSELs移植治疗AMI提供了实验基础[Dawn，B.，et al.，Transplantation of bonemarrow-derived very small embryonic-like stem cells attenuates left ventriculardysfunction and remodeling after myocardial infarction.Stem Cells，2008.26(6)：1646-55]。

VSELs的发现意义不仅在于为心肌再生找到一种新的“种子”，更重要的是其类似ESCs的形态学特征及多向分化潜能，从而可能为前述争议画上句号，将干细胞再生心肌研究引入一个全新方向。VSELs具有与ESCs相似的无可比拟的横向分化潜能，有固定的表面抗原标记，且无ESCs的免疫排斥及伦理争议等问题，故可临床应用。在体内，骨髓基质成纤维细胞分泌SDF-1等趋化因子，使表达SDF-1受体CXCR4的VSELs粘附或包绕在骨髓细胞周围，因此，常规方法获取的MSCs极有可能混杂VSELs，这可能解释关于干细胞横向分化能力的诸多研究结果的差异。由于表面标记的相似性，VSELs同上述诸多表达ESCs标记的多能干细胞很可能存在部分甚至完全重叠。因此，VSELs很可能就是骨髓干细胞横向分化的核心。

发明内容

本发明提供一种极小类胚胎样干细胞的制备方法，该方法采用全骨髓培养法，以多次更换培养液的方式逐步去除未贴壁的细胞，细胞呈明显克隆样生长后，酶解使其重新悬浮，流式细胞仪富集sca-1(+)、lineage(-)及CD45(-)的亚群细胞，即得极小类胚胎样干细胞。

本方法包括如下三步：(一)首先采用全骨髓贴壁培养法，去除全骨髓细胞中的悬浮细胞；(二)待细胞克隆化生长至一定程度后，在已贴壁或半贴壁的剩余细胞中分选VSELs；(三)行透射电镜扫描，观察两种分选方法所获得的VSELs是否存在细胞形态学差异。

本发明提供的极小类胚胎样干细胞的制备方法，全骨髓培养法的培养时间优选为5-6天，更优选为5天，更换培养液的次数优选为3次，优选的更换时间为第1次为24小时，以后每隔两天清洗一次。

本发明提供的极小类胚胎样干细胞的制备方法，优选的具体步骤如下：

a.取出全骨髓细胞接种到塑料培养瓶中，置于37℃、含5％CO2的潮湿培养箱中培养；

b.接种后24小时初次更换培养液，去除非贴壁细胞，之后每两天更换一次培养液，共计更换3次；

c.全骨髓细胞培养5天，细胞呈明显克隆样生长后，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA液使所有细胞重新悬浮；

d.将细胞悬液加至荧光素标记抗体稀释液混匀，避光，置冰上孵育30min；

e.清洗未结合的抗体，离心，重复两次，然后重新悬浮；

f.以流式细胞仪分选sca-1(+)/lin(-)/CD45(-)，即得极小类胚胎样干细胞。

由于VSELs体积小、数量少，通过常规密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞(MNCs)并进一步分选的方法容易损失大多数VSELs。同时，由于VSELs仅占骨髓MNCs的0.01-0.02％，通过全骨髓细胞裂解法去除红细胞获得MNCs并进一步从中分选的方法，同样容易损失大部分VSELs细胞。因此，本发明的目的是提供一种能够最大程度地保存骨髓中VSELs、减少其损耗的分选方法，从而优化骨髓干细胞移植治疗的“种子”来源，优化心肌治疗心肌梗死的操作流程。

本发明提供的研究数据表明，采用联合培养的间接分选方法，能够明显提高VSELs在分选细胞中所占的比例，减少损耗。并且培养过程并未影响VSELs的生物学特性，从而为下一步干细胞移植治疗提供可靠的细胞来源。

具体实施方式

以下举例说明本发明的具体实施的方法，并不对本专利构成任何限制，实施例1中的实施方式不限于动物，在本领域普通技术人员的可预测的情况下，可以扩展为其他动物和人类，只是在人类中需要采用活体对骨髓进行采样，本实施例在说明本发明实施方式的同时，也和传统的红细胞裂解的直接分选法做了对比说明本发明的技术效果。

实施例1：小鼠骨髓极小胚胎样干细胞分选

材料与方法

实验动物

本实验所使用的动物为SPF级C57/BL6种系小鼠，雄性，4-6周龄，体重约14g±2g，由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供。所有实验动物均受到人道对待，符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》。所有实验方案均得到中国医学科学院实验动物管理委员会和北京协和医学院阜外心血管病医院实验动物伦理委员会的批准。

主要实验试剂及配制方法

试剂名称                                厂商

IMEM(Iscove′s Modified Dulbecco′s     Gibco

Medium)

胎牛血清(FBS，特优级)                   Gibco

0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA               Sigma

青-链霉素储存液(10,000U/ml)             Invitrogen

细胞裂解液(10×)                        BD Pharmingen

PE-anti-Ly-6A/E(Sca-1)单克隆抗体        BD Pharmingen

FITC-anti-CD45单克隆抗体                BD Pharmingen

APC-anti-TCR βchain单克隆抗体          BD Pharmingen

APC-anti-CD11b单克隆抗体                BD Pharmingen

APC-anti-Gr-1单克隆抗体                 BD Pharmingen

APC-anti-Ly-76单克隆抗体                BD Pharmingen

APC-anti-CD45R/B220单克隆抗体           BD Pharmingen

主要试剂配制方法：

(1)IMDM完全培养液

IMDM培养液        88％

胎牛血清          12％

青霉素            100U/ml

链霉素            100U/ml

用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

(2)PBS缓冲液：

KCl               0.2g

KH₂PO₄            0.2g

NaCl              8.0g

Na₂HPO₄·12H₂O    2.08g

调pH至7.4，定容至1L，高压灭菌。

(3)洗涤缓冲液：

PBS               98％

FBS               2％

用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

(4)细胞裂解工作液(1×)：

细胞裂解液(10×)  10％

蒸馏水            90％

将pH调至7.1-7.4，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，用时加热至室温。

A组(本发明方法)：C57/BL6小鼠骨髓干细胞的分离和培养

(1)动物腹腔麻醉(氯胺酮30mg/kg体重)；

(2)75％乙醇浸泡3-5min(头部在液面上，以防动物呛水)；

(3)于细胞培养用超净台内，剪开动物腿部皮肤，分离腿部肌肉，取出动物腿部股骨和胫骨(粘有骨骼肌)；

(4)用PBS或不含血清的细胞培养液洗去所取骨骼上的残留血液，置于PBS中备用；

(5)剔除骨骼上残留的骨骼肌，除去长骨两端的软骨帽；

(6)轻轻刮去一层骨端的骨垢(不要直接剪去长骨两端，以防损失两端骨垢中的大量细胞)，用完全培养液缓慢冲出骨髓腔中的细胞，特别要尽量冲出骨垢中的细胞(动作要轻，尽量不要产生气泡)；

(7)将冲出的细胞直接种到塑料培养瓶中(一只小鼠细胞接种一瓶25cm²培养瓶)，置于37℃、含5％CO₂的潮湿培养箱中培养；

(8)接种后24小时初次换液，去除造血细胞、成纤维细胞和其它非贴壁细胞，可用PBS轻缓洗一次，动作尽量轻柔，以免将附着于瓶底的半贴壁细胞洗掉；之后每两天更换一次培养基；

(9)全骨髓细胞培养5-6天后，可见细胞形成多个形态不均一的细胞克隆，约达到70-80％融合，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA液使所有细胞重新悬浮，以血细胞计数板计算细胞数量；

B组(直接分选法)：C57/BL6小鼠骨髓单个核细胞的分离——红细胞裂解法

(1)动物腹腔麻醉(氯胺酮30mg/kg体重)；

(2)75％乙醇浸泡3-5min(头部在液面上，以防动物呛水)；

(3)于细胞培养用超净台内，剪开动物腿部皮肤，分离腿部肌肉，取出动物腿部股骨和胫骨(粘有骨骼肌)；

(4)用PBS或不含血清的细胞培养液洗去所取骨骼上的残留血液，置于PBS中备用；

(5)剔除骨骼上残留的骨骼肌，除去长骨两端的软骨帽；

(6)轻轻刮去一层骨端的骨垢(不要直接剪去长骨两端，以防损失两端骨垢中的大量细胞)，用完全培养液缓慢冲出骨髓腔中的细胞，特别要尽量冲出骨垢中的细胞(动作要轻，尽量不要产生气泡)；

(7)离心，350g×10min，弃上清，加入1ml洗涤缓冲液重悬细胞；

(8)按10∶1比例加入细胞裂解液，立即漩涡混匀，室温孵育15min；

(9)离心，200g×5min，轻轻吸弃上清，加入5ml洗涤缓冲液混匀清洗，相同条件离心一次，吸弃上清。若裂解不全，肉眼可见较多红细胞，可重复一次裂解步骤；

(10)将裂解得到的小鼠骨髓单个核细胞重悬于洗涤缓冲液，并以血细胞计数板计数。

流式细胞仪纯化sca-1(+)/lin(-)/CD45(-)骨髓极小胚胎样干细胞(VSELs)：

(1)将上述两种分选方法得到的细胞悬液离心，收集细胞，并以PBS清洗1次，按10⁶/50μl浓度重悬细胞；

(2)取适量荧光素标记的抗体原液：PE-anti-Ly-6A/E(Sca-1)、FITC-anti-CD45、APC-anti-TCR βchain、APC-anti-CD11b、APC-anti-Gr-1、APC-anti-Ly-76、APC-anti-CD45R/B220，以洗涤缓冲液(PBS+2％FBS)稀释至0.1μg/50μl，与细胞悬液等体积；

(3)将细胞悬液加至抗体稀释液，轻轻吹打混匀，避光，置冰上孵育30min；

(4)以洗涤缓冲液(200μl/10⁶cells)清洗未结合的抗体，离心350g×5min，重复两次；

(5)将抗体孵育后的细胞重悬于洗涤缓冲液，浓度调至5×10⁵cells/100μl；

(6)行流式细胞仪(MoFlo)检测，观察sca-1(+)、lin(-)及CD45(-)的细胞亚群在总细胞中所占比例，并分选sca-1(+)/lin(-)/CD45(-)的VSELs。

透射电镜(TEM)观察骨髓极小胚胎样干细胞的形态及超微结构：

(1)固定：

①收集经流式细胞仪分选出的骨髓极小胚胎样干细胞，转移至EP管，以PBS清洗2次，离心，吸弃上清；

②沿EP管壁缓缓加入4℃预冷的2％戊二醛1ml，4℃固定30min-2h；

③以探针拨离细胞团块，移入青霉素小瓶中，在4℃用PBS洗3次×10min；

④以1％四氧化锇在4℃固定15-30min；

⑤PBS漂洗3次×10min。

(2)脱水：用系列丙酮在室温下脱水，依次为50％丙酮，1次×10min；70％丙酮，1次×10min；90％丙酮，2次×10min；100％丙酮，3次×10min。

(3)浸透：吸弃瓶中脱水剂，加3ml纯丙酮-EPON 812(1∶1体积比)，室温下放置30min后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1ml，室温放置过夜。

(4)包埋：吸取混合包埋剂，滴2滴于2号胶囊模块孔的底部，把细胞团块移入胶囊底部中心，注满混合包埋剂，放60℃烤箱烘烤24h，使之固化成硬块。

(5)修块：将包埋块安装在特制的夹具上，在体视显微镜下用单刃刀片修正包埋块，即修去细胞团块表面的包埋剂，然后在细胞团块四周以45°角切去多余包埋剂，并做记号，以便定位。

(6)制备半薄切片：

①切片：将修好的包埋块固定在超薄切片机上，切取厚度1μm的半薄切片；

②染色：取洁净载玻片，浸入1％明胶和1％铬明矾混合液中，取出放在烤片机上加热至60℃使之干燥。在玻片上滴加一滴蒸馏水，用镊子将半薄切片移入水滴中，再放在烤片机上加热使之展平干燥。然后滴加美蓝染液(1％美蓝、1％硼酸钠和1％天青蓝)，在60℃染30s，用水冲洗，再滴加1∶1的0.25％硼酸钠和0.5％碱性复红，在60℃染10s，水洗，烤干。

③镜检及定位：在显微镜下观察半薄切片的细胞图像，确定欲做超薄切片的部位并作标记。

(7)制备超薄切片：清洗150-200目铜网，制备支持膜和三角形玻璃刀，在超薄切片机上安装玻璃刀，切取50-70nm厚度的超薄切片，贴在铜网有支持膜的一侧，保持在干燥器皿中，待染色。

(8)电子染色：

①将载有切片的铜网垂直夹于橡胶板上并平放入平皿内，在切片一侧滴加一滴醋酸双氧铀染色液，加盖，室温下染5-10min。

②取出橡胶板，以双蒸水冲洗切片，并用滤纸吸干，放入平皿内，加一滴铅染液(含醋酸铅、硝酸铅和枸橼酸铅)，室温下染5-10min。

③水洗、吸干、晾干备用。

(9)电镜观察：按说明书要求安装超薄切片，调试电镜，观察细胞形态、直径、核浆比值及细胞内部超微图像。

统计分析

两种分选方法均重复三次以上，得到各亚组细胞在总细胞中的比例(％)，所有连续变量均采用均数±标准误表示，用t检验(ttest)对两种分选方法的差异进行分析。所有数据均使用SPSS15.0进行统计分析。

结果：

A组中，经全骨髓贴壁培养后，每只C57/BL6小鼠平均获得4×10⁵个骨髓干细胞；B组中，每只C57/BL6小鼠平均获得2×10⁷个单个核细胞。A组重复6次，B组重复3次，分别测算Sca-1(+)、Lingeage(-)、CD45(-)亚群细胞在总细胞中所占比例，及VSELs在参与分选的总细胞中所占比例，如表1所示。

表1：两种方法分选比较

(▲p＜0.001vs group B，★p＝0.23vs group A)

两种分选方法相比，A组经全骨髓贴壁培养后，骨髓干细胞中sca-1(+)、CD45(-)亚群细胞比例(89.6±1.99％，22.9±1.84％)明显高于B组(16.53±0.54％，0.91±0.11％；p＜0.001respectively)；A组lin(-)亚群细胞比例(51.1±3.6％)也高于B组(34.7±3.0％，p＝0.023)；A组分选得到的sca-1(+)/lin(-)/CD45(-)VSELs比例(9.4±0.62％)明显多于B组(0.04±0.01％，p＜0.001)。

透射电镜扫描结果显示，直接分选和培养后间接分选得到的VSELs细胞形态、大小及内部结构均无差别，提示培养后间接分选方法并未影响细胞的生物学特性。

本实施例表明：(1)经红细胞裂解法获取骨髓单个核细胞，进而分选极小胚胎样干细胞的直接分选方法效率低下，VSELs仅占参与分选总细胞的0.04±0.01％；(2)在全骨髓贴壁培养，初步富集目的细胞亚群的基础上，间接分选VSELs的方法能够减少分选造成的VSELs损失，提高分选效率；(3)两种分选方法相比，获得的VSELs形态、大小及结构均无差别。

本实施例还说明：短期全骨髓贴壁培养，能够高效地去除非目的细胞，富集sca-1(+)、CD45(-)及lineage(-)亚群骨髓细胞；同时，多种亚群细胞共同培养，使得VSELs的体外培养环境更接近于体内骨髓微环境，利于干细胞生物学特性的维持；细胞间通过旁分泌作用促进相互生长甚至扩增；体外短期培养初步富集目的细胞，使VSELs在参与分选总细胞中的比例明显增多，提高了细胞分选效率。

Claims (4)

1.一种极小类胚胎样干细胞的制备方法，其特征在于采用全骨髓培养法，以多次更换培养液的方式逐步去除未贴壁的细胞，细胞呈明显克隆样生长后，酶解使其重新悬浮，流式细胞仪富集sca-1(+)、lineage(-)及CD45(-)的亚群细胞，即得极小类胚胎样干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于全骨髓培养法的培养时间为5-6天，更换培养液的次数为3次。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于全骨髓培养法的培养时间为5-6天，培养液的更换次数为3次，第1次为24小时，以后每隔两天清洗一次。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在该方法的具体步骤如下：

a.取出全骨髓细胞接种到塑料培养瓶中，置于37℃、含5％CO2的潮湿培养箱中培养；

b.接种后24小时初次更换培养液，去除非贴壁细胞，之后每两天更换一次培养液，共计更换3次；

c.全骨髓细胞培养5天，细胞呈明显克隆样生长后，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA液使所有细胞重新悬浮；

d.将细胞悬液加至荧光素标记抗体稀释液混匀，避光，置冰上孵育30min；

e.清洗未结合的抗体，离心，重复两次，然后重新悬浮；

f.以流式细胞仪分选sca-1(+)/lin(-)/CD45(-)亚群细胞，即极小类胚胎样干细胞。