CN104781394A - 用于培养间充质干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于培养间充质干细胞的方法，所述方法包括在2％至5％氧气的低氧条件下于含有浓度为2.1至3.8mM的钙和浓度为1.0至3.0mM的镁的培养基中培养间充质干细胞。所述培养方法通过提高间充质干细胞的增殖能力和生存力可在甚至很少的传代数内增加间充质干细胞的群。另外，通过本发明培养方法制备的间充质干细胞不仅由于其缺乏免疫原性可有效用作安全的细胞治疗剂，而且由于其优异的细胞因子分泌作用而可作为软骨再生药物。

Description

用于培养间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及用于有效培养间充质干细胞的方法。
背景技术
术语“干细胞”是在胚胎、胎儿和成人的组织中发现的一种未分化类型的体细胞的总称，其具有分化成多种特定细胞类型的潜力。干细胞的特征在于：能够通过多个细胞分裂周期(同时保持未分化状态)的自我更新，能够响应于特定刺激(环境)而分化成特定细胞类型的潜能，以及甚至是能够跨过谱系屏障(lineage barrier)并采取相对于其他组织独特的表达谱和细胞功能表型的可塑性。
可根据多种标准对干细胞分类。根据潜能可将干细胞分为：多潜能干细胞(pluripotent stem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)。多潜能干细胞具有分化成任意类型细胞的多潜能性。最近受到科学家强烈关注的胚胎干细胞和诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS)是多潜能干细胞的代表。成体干细胞(adult stem cell)表现出多能性和单能性。其中包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等。
尽管对在细胞治疗中利用人胚胎干细胞的多潜能性进行了许多尝试，但是依然保持着肿瘤发生和免疫排斥反应的高可能性，并且这是难以克服的障碍。
最近已经建议将诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)作为这些问题的解决方案。iPS细胞是通过重编程由已分化的成年体细胞人工衍生的一类多潜能干细胞。由于其完全来自患者，因此iPS细胞可避免免疫排斥反应的问题，但是，iPS细胞的肿瘤发生风险依然是需要解决的问题。
作为替代选择，正推进间充质干细胞，因为它们表现出免疫调节作用并且没有表现出肿瘤发生风险。间充质干细胞是可分化成多种细胞类型的多能干细胞，所述多种细胞包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、成神经细胞、成心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管细胞等，并且已知具有调节免疫应答的功能。
间充质干细胞可分离自多种组织(例如骨髓、脐带血、脂肪组织等)，但是并没有对其进行充分定义，因为根据间充质干细胞衍生的来源，其彼此的细胞表面标志物具有一些差异。大体上，如果它们可分化成成骨细胞、软骨细胞和成肌细胞，具有纺锤状形态，并且表达表面标志物CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)，则将这种干细胞定义为间充质干细胞。在这种情形下，不同遗传来源和/或背景的间充质干细胞彼此在其定义(即，间充质干细胞的定义)方面不具有显著差异，但是彼此通常在体内活性方面具有差异。另外，当使用间充质干细胞作为外源细胞治疗剂时，有限的间充质干细胞库(pool)并不允许进行许多选择和可用选择，甚至不顾低的体内活性。
另外，对于用作再生医学和/或细胞疗法中的细胞治疗剂的间充质干细胞，所需的间充质干细胞的最小数目为约1×109个细胞。在实践中，考虑到用于设置合适条件和测定标准的实验，最小数目还进一步增加。由多种来源供应这样数量的间充质干细胞需要至少十个体外传代。但是，在这种情况下，细胞变得衰老和变形，使得其不适合用作细胞治疗剂。
因此，需要有效地大量产生间充质干细胞的培养方法。
用于培养间充质干细胞的方法描述在韩国专利早期公开No.2003-0069115以及文献[Pittinger MF等Science，284：143-7，1999；Lazarus HM等Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995；和Kern等，Stem Cells，24：1294-1301，2006]中，但是发现难以保证可用于大量生产的细胞的数目。另外，这些方法有每次传代降低具有增殖能力的间充质干细胞之数目的缺点。例如，脐带血衍生间充质干细胞在9～10代后将不能增殖而是迅速老化，并且在骨髓或脂肪衍生间充质干细胞(lipid-derivedmesenchymal stem cell)中，这种现象在5～6代后被发现。因此，需要与常规方法相比以更高简化和更高经济效益的方式使间充质干细胞的数目增加到足够工业应用之程度的新方法。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供用于有效培养间充质干细胞的方法。
本发明的另一个目的是提供通过所述方法制备的间充质干细胞，所述间充质干细胞表现出优异的增殖能力和免疫学特性。
本发明的另一个目的是提供包含所述间充质干细胞的细胞治疗剂。
根据本发明的一个方面，提供了用于培养间充质干细胞的方法，所述方法包括在2％～5％氧气浓度的低氧条件(hypoxic condition)下于含有浓度为2.1至3.8mM的钙和浓度为1.0至3.0mM的镁的培养基中培养间充质干细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了通过所述方法制备的间充质干细胞，其具有改善的增殖能力、生存力、回收率(recovery rate)和免疫特性。
根据本发明的另一个方面，提供了包含本发明之间充质干细胞的细胞治疗剂。
本发明的培养方法通过提高间充质干细胞的增殖能力和生存力可在甚至很少的传代数内增加间充质干细胞的群。另外，通过本发明培养方法制备的间充质干细胞不仅由于其缺乏免疫原性可有效用作安全的细胞治疗剂，而且由于其优异的细胞因子分泌作用而可作为软骨再生药物。
附图简述
图1A和1B是示出了来源于两种不同来源的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和MSC#2)在钙离子浓度为1.8至9.3mM的α-MEM中培养后第7天时的相对于接种细胞计数的细胞计数倍数(上)以及直到21天的累积细胞计数(下)的图。在上图中，P1至P3表示传代数。
图2A和2B是示出了来源于两种不同来源的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和MSC#2)在1.8至3.6mM的总钙浓度的存在下培养7天后的细胞计数(上)以及在1.8mM至4.4mM的总钙浓度的存在下培养6天后的细胞计数(下)的图。
图3A和3B是示出了当来源于两种不同来源的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和MSC#2)在多种氧气条件(正常、3％和5％)下培养时的倍增时间(上)以及脐带血衍生间充质干细胞在所述氧气条件下培养后直到21天的累积细胞计数(下)的图。在上图中，P1至P3表示传代数。
图4示出了脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1)在通常条件(对照)、增加的钙条件(Ca2+)、低氧条件和CMH条件下培养后的倍增时间(上)和累积细胞计数(下)。在每幅图中，P5至P12代表传代数，并且CMH条件意指添加钙和镁的条件和低氧条件的组合。
图5示出了脐带血衍生间充质干细胞在通常条件(对照)、添加钙的条件(Ca2+)、低氧条件和CMH条件下培养后1和2天的细胞生存力(上图)和回收率(下图)。
图6A和6B示出了脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1至#4)在通常条件(对照)和CMH条件下培养后的倍增时间(上)和累积细胞计数(下)。在每幅图中，P1至P9代表传代数。
图7示出了来源于两种不同来源的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)在通常条件(对照)、添加钙的条件(Ca2+)、低氧条件和CMH条件下培养后干性(stemness)标志物Oct4和nanog以及衰老标志物P16的mRNA表达水平。
图8示出了在通常条件(对照)和CMH条件下传代后用SA-β-gal染色的脐带血衍生间充质干细胞的照片(上)，以及脐带血衍生间充质干细胞在通常条件(对照)、添加钙的条件(Ca2+)、低氧条件和CMH条件下培养后根据培养条件描绘的β-gal活性的图(下)。
图9示出了在诱导培养在通常条件(对照)和CMH条件下的细胞以使其分化成软骨和骨后，来源于两种不同来源的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)的照片。
图10示出了这样的图，其说明了培养在通常条件(对照)和CMH条件下的两种不同脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)是否刺激应答细胞(responding cell)(A)，其中A、B和H分别表示应答细胞、刺激细胞和PHA。
图11示出了由培养在图10条件下之脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)释放的PGE2(前列腺素E2)的水平的图。
图12是示出了由在通常条件(对照)和CMH条件下培养24小时之4种不同脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1至#4)释放的Tsp-2的水平的图。
发明详述
根据一个优选实施方案，本发明提供一种用于培养间充质干细胞的方法，所述方法包括在2％至5％氧气的低氧条件下于含有浓度为2.1至3.8mM的钙和浓度为1.0至3.0mM的镁的培养基中培养间充质干细胞。
本发明的培养方法可适用于多种来源的间充质干细胞。可用于本发明的间充质干细胞的实例包括来源于脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、皮肤、羊水、脐带或牙齿的那些，但不限于此。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的培养方法适用于脐带血衍生的间充质干细胞。
另外，可应用本发明培养方法的间充质干细胞可来源于多种对象。例如，可用于本发明的间充质干细胞可获自哺乳动物(包括人)，但不限于此。在本发明的一个优选实施方案中，使用人来源的间充质干细胞。
本发明培养方法的主要特征在于使用含有浓度为2.1至3.8mM的钙和浓度为1.0至3.0mM的镁的培养基。培养基可通过调节钙和镁的浓度由用于干细胞的典型培养基制备。典型培养基的实例包括Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、α-MEM、McCoys 5A培养基、eagle基本培养基、CMRL(Connaught Medical ResearchLaboratory)培养基、Glasgow最小必需培养基、Ham F-12培养基、IMDM(Iscove改良Dulbecco培养基)、Leibovitz L-15培养基、RPMI(RoswellPark Memorial Institute)1640培养基、培养基199和Hank培养基199，但不限于此。
任选地，培养基可以含有或可不合血清。另外，可在培养基中使用血清替代物而不是血清。
在本发明的一个实施方案中，培养基含有5％至30％的胎牛血清(FBS)。在另一个实施方案中，培养基含有血清替代物。除了市售产品外，可使用人血清或人血小板裂解物中的多种生长因子(包括PDGF、TGF、IGF)和这些蛋白质家族的细胞因子可用作血清替代物。
在本发明的培养方法中，钙用于促进间充质干细胞的增殖、抑制免疫原性并刺激细胞因子分泌。在这点上，可以在培养基中使用2.1至3.8mM的浓度、优选3.3至3.8mM的浓度、并且更优选约3.6mM的浓度的钙。例如，当使用α-MEM作为培养基时，可以添加0.3至2.0mM的浓度、优选1.5至2.0mM的浓度、并且更优选约1.8mM的浓度的钙，这是因为培养基已经含有1.8mM的钙。同样地，考虑到培养基自身的钙浓度，可减去典型培养基的钙浓度容易地计算待添加的钙浓度，以获得实施本发明培养方法所需的期望浓度。
在本发明的培养基中，使用镁来防止钙的沉淀。可以在培养基中使用1.0至3.0mM的浓度、并且优选约1.8mM的浓度的镁。例如，当镁在培养基中以小于1.0mM的浓度存在时，钙倾向于沉淀。另一方面，培养基中高于3.0mM的镁浓度可能阻断胞外基质(ECM)的形成，干扰细胞在培养皿底部的附着，从而使得其易受剪切应力的影响，并且提高细胞内的矿化。例如，当使用α-MEM作为培养基时，可添加0.2至2.2mM的浓度，并且优选1.0mM的浓度的镁，因为培养基中已经含有0.8mM镁。同样地，考虑到培养基自身的镁浓度，可减去典型培养基的镁浓度容易地计算待添加的镁浓度，以获得实施本发明培养方法所需的期望浓度。
因此，根据本发明一个优选实施方案的培养基可基于补充有5％至30％胎牛血清(FBS)、0.3至2.0mM钙和0.2至2.2mM镁的α-MEM，以使得钙和镁分别总计为2.1至3.8mM和1.0至3.0mM的总量。
此外，本发明培养方法的另一个特征在于间充质干细胞的低氧培养条件。与常氧气条件相比，低氧条件促进间充质干细胞的增殖，并且抑制免疫原性并刺激细胞因子分泌。在此情形上，低氧条件是氧气含量为2％至5％的气氛。氧气浓度低于2％或高于5％时的问题是间充质干细胞的增殖显著降低。在本发明的一个优选实施方案中，间充质干细胞培养在约3％氧气的气氛中。可通过调节细胞孵育器的氧气浓度来达到低氧条件。例如，可用氮气(100％)或氮气/二氧化碳(95％/5％)净化孵育器以将常氧气氛调节为低氧气氛。可通过安装在孵育器上的氧传感器来监测孵育器中的氧气条件。
除了本发明的前述条件外，可以以常规方式培养间充质干细胞。例如，可在三维生物反应器或旋转器(spinner)或典型贴壁培养容器中培养间充质干细胞。
当钙和镁的浓度的主要特征与低氧条件的次要特征组合时，可获得协同效应。即，与单独条件相比，钙和镁的浓度与低氧条件的组合允许间充质干细胞更加有效地增殖，同时进一步提高对免疫原性的抑制和对细胞因子分泌的刺激。例如，与单独条件相比，在组合条件下，间充质干细胞进一步增殖1.5至5倍，免疫原性降低1至3倍，并且细胞因子分泌增加1.5至3倍。用于本发明培养方法的组合条件被称为“CMH条件”(钙+镁+低氧条件)。
本发明的培养方法可应用于间充质干细胞的传代。换言之，使用本发明培养方法培养的间充质干细胞可以以相同的方式传代培养。通过使间充质干细胞更有效地增殖，本发明的培养方法具有即使进行更少传代也能产生更多数目之间充质干细胞的优点。例如，在接种相同数目的细胞并且每一代的持续时间统一的情况下培养5代后，发现本发明培养方法产生的间充质干细胞数目的是常规方法的100至1000倍。
另外，通过本发明培养方法培养的间充质干细胞不仅无免疫原性因而不引起免疫应答，而且还可有效用作人的细胞治疗剂或软骨再生剂。
因此，根据本发明的另一个方面，预期使用所述培养方法制备的间充质干细胞具有改善的增殖能力、生存力、回收率和免疫学特性。改善的免疫学特性包括无免疫原性、释放免疫抑制剂(例如，PGE2)以抑制免疫力以及增加有用细胞因子(例如，Tsp-2)的释放。
根据另一个优选实施方案，本发明提供了包含间充质干细胞的细胞治疗剂。本发明的细胞治疗剂可应用于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管细胞或肺细胞的再生或保护。另外，本发明的细胞治疗剂可用于选自以下的情形：治疗肺病；抑制或治疗肺病诱发的炎症；肺组织再生；以及抑制肺纤维化。特别地，其可用于抑制或改善肺病诱发的炎症和纤维化。另外，本发明的细胞治疗剂可用于心血管疾病的治疗或软骨再生。另外，本发明的细胞治疗剂可降低免疫应答、免疫细胞渗透或免疫原性；提高免疫调节功能；以及抑制炎症反应。另外，本发明的细胞治疗剂用于治疗自身免疫病或移植物抗宿主病(graft-vs-host disease)。
提供以下实施例来说明本发明的一些优选实施方案，而不是旨在限制本发明的范围。
为了本发明使用，人脐带血衍生间充质干细胞获自韩国MedipostCo.Ltd.。如下文所示，可通过收集脐带血、从脐带血中分离间充质干细胞以及培养所述间充质干细胞来制备细胞。
可在正常自然阴道分娩后胎盘保留在子宫内或者一旦剖腹产术后胎盘已经从子宫排出时，从由子宫排出的脐静脉收集脐带血。
在新生儿出生后，在从其收集脐带血之前，必须对从子宫排出并且通过其联系新生儿和胎盘的脐静脉进行无菌处理。
用注射器将脐带血从脐静脉抽到含有抗凝剂的袋子中。
从脐带血分离间充质干细胞并培养所述细胞的方法公开在韩国专利No.10-0494265以及许多报道(Pittinger MF， Mackay AM，等，Science，284：143-7，1999；Lazarus HM，Haynesworth SE，等，Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995)中。其中的一种在下文进行了简单描述。
通过对收集的脐带血进行离心以分离单核细胞，并洗涤多次以除去其中的杂质。然后，将所述单核细胞以适当密度接种到培养容器中并允许生长并形成单层。如在相差显微镜下观察到的，间充质干细胞形态均匀，并且生长时形成包含纺锤状细胞的集落。然后，汇合(confluence)后将细胞培养传代，直到得到必需的细胞数。
实施例1：脐带血衍生间充质干细胞根据钙浓度的增殖能力
为了检查其根据钙浓度的增殖能力，在不同钙浓度的存在下培养脐带血衍生间充质干细胞。
将在递送了知情同意书后由不同母体收集并且在冷冻状态下储存的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)解冻，并且在5％CO2条件下于37℃培养在孵育器(低氧/CO2孵育器，Thermo Scientific#3131)中的补充有10％FBS的α-MEM(Invitrogen，USA)中。当细胞生长到80～90％汇合时，通过胰蛋白酶处理使其分离成单个细胞。向α-MEM(补充有10％FBS；含有1.8mM钙和0.8mM镁)中添加多种浓度(0mM、1.5mM、3mM、4.5mM、6mM和7.5mM)的钙以将培养基的钙浓度调节到：1.8mM、3.3mM、4.8mM、6.3mM、7.8mM和9.3mM。将间充质干细胞以5,000细胞/cm2的密度接种到培养基中。为了防止钙诱导的沉淀，向每种培养基添加1mM浓度的镁(含有1.8mM的总镁浓度)。将细胞培养在21％(v/v)氧气(常氧)条件下，并在80～90％汇合后传代。使用Cellometer Auto T4细胞计数器(Nexelcom，Lawrence，MA，USA)对每一代计数。结果在图1A和1B中给出。图1A和1B是示出了来源于两种不同来源的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)在向其进一步添加0至7.5mM之不同浓度的钙的α-MEM中培养后第7天时的相对于接种细胞计数的细胞计数倍数(上)以及直到21天的累积细胞计数(下)的图。
从图1A和1B可以看到，当另外添加1.5mM浓度的钙(总钙浓度为3.3mM)时，细胞的增殖能力达到峰，这也在传代间观察到相同模式。在添加3mM或更多钙(培养基中的总钙浓度为4.8mM或更高)后，增殖能力逐渐降低。
为了确定最佳钙浓度，以进一步划分的浓度添加钙至3mM的最大值。结果在图2A和2B中示出。图2A和2B是示出了来源于两种不同来源的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)在1.8mM、2.1mM、2.4mM、2.7mM、3.0mM、3.3mM和3.6mM的总钙浓度的存在下培养7天后的细胞计数(上)以及在1.8mM、3.4mM、3.6mM、3.8mM、4.0mM、4.2mM和4.4mM的总钙浓度的存在下培养6天后的细胞计数(下)的图。
从图中可以看到，随着添加0至1.8mM的钙浓度(培养基中的总钙浓度为1.8至3.6mM)，增殖能力提高，然后当添加超过1.8mM的钙浓度(培养基中的总钙浓度为3.6mM)时开始降低。由这些结果，可以理解，允许间充质干细胞之最大增殖的培养基中的最佳钙浓度是3.6mM。因此，在增殖能力方面有利的是在含有优选2.1至4.3mM的浓度、并且更优选3.3至3.8mM之浓度的钙的典型培养基中培养间充质干细胞。
实施例2：脐带血衍生间充质干细胞根据氧气浓度的增殖能力
为了检查其根据氧气浓度的增殖能力，在不同氧气浓度的存在下培养脐带血衍生间充质干细胞。
具体地，在3％或5％氧气下或在常氧(空气中21％的氧气水平)条件下以与实施例1相同的方式培养脐带血衍生间充质干细胞，只是不向补充有10％FBS的α-MEM中进一步添加钙或镁。结果在图3A和3B中给出。图3A和3B是示出了当来源于两种不同来源的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)在多种氧气条件(正常、3％和5％)下培养时，1、2和3轮传代后细胞数目加倍所需时间(上)以及脐带血衍生间充质干细胞在所述氧气条件下培养后直到21天的累积细胞计数(下)的图。
从这些图中可以看到，虽然批次之间有所差异，但是在低氧条件下测量的增殖能力比常氧条件下高。具体地，增殖能力的峰出现在3％氧气水平下，在已经培养了很多轮传代的细胞中观察到了相同的模式。另外，在达5％最大值的进一步划分的氧气条件下检查细胞的增殖能力。优选2％至5％的氧气水平(数据未示出)。
实施例3：脐带血衍生间充质干细胞根据钙(包括镁)和氧气条件之组合的增殖能力
检查脐带血衍生间充质干细胞根据钙(包括镁)和氧气浓度条件之组合的增殖能力。在通常条件(对照)、外部添加的钙(包括镁)的存在下、低氧条件以及外部添加的钙(包括镁)/低氧条件(下文称作“CMH”)下培养细胞。在这一方面，培养基包含总浓度分别为3.6M和1.8M的钙和镁(额外添加1.8mM钙和1mM镁)。得到3％的氧气水平的低氧条件。以类似于实施例1的方式培养细胞。在通常条件下5代(P5)后，将间充质干细胞在CMH条件下培养7轮传代(p12)，每代之间规律的间隔7天。
结果在图4中给出。图4示出了在所述条件下传代后细胞的倍增时间(上)和累积细胞计数(下)。
由图4的数据可以理解，与低氧条件或添加钙的条件相比，当在CMH条件下培养时，细胞的增殖能力显著提高。在许多轮传代中观察到了相同模式的作用。虽然具有一定程度的差异，但是不同批次的细胞的实验表现出了类似的结果。因此，这些结果证明，本发明的CMH条件对于增殖脐带血衍生间充质干细胞非常有效。
实施例4：脐带血衍生间充质干细胞根据培养条件的生存力和回收率
检查了本发明的CMH条件对脐带血衍生间充质干细胞之生存力和回收率的影响。为此，将脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1)培养在通常条件(对照)、低氧条件(3％)、增加的钙条件(1.8mM；培养基中的总钙水平为3.6mM)和CMH条件(3％O2+添加1.8mM钙+添加1mM镁)下，从培养容器中脱离(detach)，用基础培养基(α-MEM)洗涤三次并且在其中混悬。在保持在室温条件下的同时，检查随时间的细胞悬液的生存力和回收率。细胞生存力表示为用台盼蓝对收集并且混悬在基础培养基中的细胞染色后活细胞与死细胞的百分比，并且使用血细胞计数器对预定体积(10～20μL)的悬液中包括染蓝的活细胞的总细胞计数。回收率表示为培养后的活细胞计数与培养前的活细胞计数的百分比。
所述结果在图5中给出。图5示出了在所述条件下培养脐带血衍生间充质干细胞后1和2天的细胞生存力(上图)和回收率(下图)。
由图5可以看到，在将细胞培养在低氧条件或增加钙的条件下时，观察到其比通常条件下的细胞表现出更高的生存力和回收率，并且当将其培养在CMH条件下时，表现出甚至更高的生存力和回收率。用来自不同来源的脐带血衍生间充质干细胞获得了相同的结果，虽然其之间具有一定程度的差异。综合考虑，这些数据表明，在提高脐带血衍生间充质干细胞的生存力以回收更多细胞方面，CMH条件优于通常条件或单独条件。
将间充质干细胞(MSC#1至#4)在通常条件下和CMH条件下传代培养，并检查增殖能力。结果在图6A和图6B中给出，其示出了倍增时间(上)和累积细胞计数(下)。
由图可以看到，在许多轮传代中，与对照相比，CMH条件显著缩短了倍增时间(其是细胞增殖的指标)。另外，通过累积生长曲线数据明显的是，即使来源于相同来源，在CMH条件下获得了多得多的间充质干细胞。用不同脐带血衍生间充质干细胞的实验获得了相同的结果，虽然其之间具有一定程度的差异。这些数据表明，CMH条件更有效地诱导间充质干细胞增殖。特别地，当在脐带血衍生间充质干细胞初始传代就施加CMH条件时，产生了甚至更多的间充质干细胞。
实施例5：脐带血衍生间充质干细胞根据培养条件的干性和衰老的测定
为了检查CMH条件为何改善脐带血衍生间充质干细胞的增殖，测定了其与干细胞之增殖有关的干性和衰老。
为此，如实施例3所示，将脐带血衍生间充质干细胞培养在通常条件和CMH条件下。当其达到80～90％汇合时，用胰蛋白酶使细胞脱离。在通过离心除去培养基后，将细胞用PBS洗涤并且通过离心回收。将这一过程重复两次以完全从细胞除去培养基。随后，使用RNA分离试剂盒(Invitrogen)根据制造商的方案分离RNA。在逆转录酶SuperScriptTMIII(Invitrogen)的存在下使RNA逆转录成cDNA。使用干性标志物Oct4和nanog、衰老标志物P16和GADPH的特异性引物对cDNA进行实时PCR。在LightCycler 480Real-Time PCR System仪器(Roche)中，所述PCR以在95℃变性10分钟开始，并进行95℃10秒、62℃30秒和72℃10秒的30个循环。
表1
RT-PCR的引物
将通过RT-PCR获得的RNA的水平归一化到GAPDH的水平，然后比较培养在通常条件和CMH条件下之细胞的每种标志物的RNA表达水平(相对分析，ddCT方法)。
结果在图7中给出。图7示出了两种不同脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)的mRNA表达水平。
由图7可以看到，培养在CMH条件下的脐带血衍生间充质干细胞中干性标志物Oct4和nanog的表达水平高于通常条件(对照)和单独条件。衰老标志物P16表现出与Oct4相反的表达模式。这些结果表明，CMH条件维持了间充质干细胞的干性，同时抑制了衰老，从而提高了增殖能力。
为了确认CMH调节抑制间充质干细胞衰老的能力，进行以下实验。如实施例3所示，将脐带血衍生间充质干细胞在通常条件和CMH条件下培养7～8代。在除去培养基后，将细胞用PBS洗涤一次，并且用1mL的1×固定溶液(Cell Signaling Technology)在室温下孵育3～5分钟。从细胞除去固定溶液，随后将其用2mL PBS洗涤2次。随后，将细胞在37℃的孵育器中用β-半乳糖苷酶的1mL染料溶液(Cell Signaling Technology)孵育2至24小时。在从中除去染料溶液后，将细胞用1mL PBS洗涤，并且在倒置显微镜ECLIPSE TE2000-U(Nikon Co.，Kanagawa，Japan)下对所得的经染色的衰老细胞进行计数。
结果在图8中给出。图8示出了用SA-β-gal染色后的细胞的显微照片(上)和SA-β-gal活性的图(下)。通过在40至～100倍放大率下获得的照片上计算计数出的染色细胞与总细胞的比来确定SA-β-gal活性。
由图8明显的，在CMH条件下，间充质干细胞的衰老进展比添加钙的条件或低氧条件下进一步延迟，并且比通常情况进一步延迟得多。
总之，上文获得的数据证明，本发明的CMH条件比通常条件或单独条件更有效地维持干性并抑制衰老，从而可使间充质干细胞高效地增殖。
实施例6：脐带血衍生间充质干细胞根据培养条件的分化潜力和标志物表达
检查CMH条件对脐带血衍生间充质干细胞特性的影响。为此，通过软骨形成诱导(chondrogenic induction)和成骨诱导(osteogenicinduction)测定间充质干细胞的分化潜力和标志物表达。
如实施例3，将获自两种不同来源的脐带血衍生间充质干细胞(MSC#1和#2)培养在通常条件(对照)和CMH条件下，之后如下诱导其分化成软骨和骨。然后，使用染色方法对向软骨和骨的分化进行评估。
软骨形成诱导
为了在软骨形成诱导中使用，将细胞以2～2.5×105细胞的群放在15mL圆锥管中，并且离心以得到细胞沉淀。将其用D-PBS洗涤并且混悬在200～250μl分化培养基[高葡萄糖DMEM(Gibco，cat#.11995)、10ng/mlTGFβ-3(Sigma，cat#.T5425，2μg)、500ng/ml BMP-6(R&D，cat#.507-BP，20μg)、50μg/ml抗坏血酸(Sigma，cat#.A8960)、50mg/ml(1：100)ITSTM+Premix(BD，cat#.354352)、40μg/ml L脯氨酸(Sigma，cat#.P5607)、100μg/ml丙酮酸钠(Sigma，cat#.P8574)、100nM地塞米松(Sigma，cat#.D2915)]中，并且将细胞悬液等分到管中。将这些管在1,500rpm离心5分钟，然后在管稍微打开的情况下将细胞在37℃的CO2孵育器中培养4周，以诱导其分化成软骨。每周两次将一半分化培养基更换成新鲜培养基。
软骨染色方案
在软骨形成诱导之后，对细胞进行离心，用PBS洗涤，并在4％多聚甲醛中于室温下固定0.5至1小时。随后，用蒸馏水洗涤所述细胞2或3次，并使用冷冻切片法制备成切片(4～5μm厚)。将切片在95％乙醇中浸3～5分钟，并用水洗涤2次。在用0.1％番红O染色7分钟后，将细胞用70％乙醇洗涤两次，用70％乙醇洗涤一次，用95％乙醇洗涤两次，用95％乙醇洗涤一次，以及用100％乙醇洗涤两次，在二甲苯底物溶液中浸3分钟，并且干燥。然后，用脂溶性装片溶液覆盖经染色的细胞并且观察。通过比较颜色(紫色)、分化的沉淀的尺寸和形成的空隙结构来对软骨形成诱导进行评估。
成骨诱导
为了在成骨诱导中使用，将细胞以500～1000细胞/孔的密度铺在6孔板中，并且在2～4天后，将培养基更换为成骨诱导培养基(1Lα-MEM中β-磷酸甘油2.1604g，L-抗坏血酸-2-磷酸酯/盐0.012805g、地塞米松/UVAB 0.6mg、庆大霉素(10mg/ml)5ml和FBS 100ml)。将细胞用分化培养基培养2～3周，并且每三天用新鲜培养基更换。通过ALP染色法对软骨形成诱导进行评估。
骨染色方案
将分化的细胞用PBS洗涤2次，并且在固定溶液(40％丙酮)中孵育30～45秒。将其再次用蒸馏水洗涤2或3次，并且在暗处用碱性染色溶液(Fast violet B盐)孵育30分钟。然后，将细胞用蒸馏水洗涤2次，并且用Mayer苏木精溶液处理10～20秒。在从中除去染色溶液后，将细胞用自来水洗涤、干燥、用脂溶性装片溶液覆盖并且观察。因为由于细胞内碱性磷酸酶的活化将成骨细胞染成了深棕色，所以通过染色的程度对软骨形成诱导进行评估。
结果在图9A和9B中给出。由图9A和9B可以看到，在通常条件和CMH条件下培养的间充质干细胞之间的软骨形成诱导和成骨诱导没有显著差异。
同时，检查了根据本发明方法培养的脐带血衍生间充质干细胞上细胞表面抗原的免疫表型。在此情形下，使用FACS分析表面标志物(CD34、CD73、CD45和CD105)的表达。
用胰蛋白酶消化培养在通常条件和CMH条件下的脐带血衍生间充质干细胞，并用含有2％FBS的PBS洗涤三次。使其同与FITC(异硫氰酸荧光素)缀合的造血细胞相关抗原CD34和CD45、与PE(藻红蛋白)缀合的免疫调节相关抗原CD73、以及与PE缀合的血管生成相关抗原CD105反应。然后，以类似于Western印迹的方式用第二抗体(IgG-FITC；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA)再次标记细胞，然后使用FACS检测所述第二抗体的信号以计算表达标志物的细胞与总细胞的比。在反应后，使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，SanJose，CA，USA)和软件CELLQUEST分析信号。
结果总结在下表2中。
表2
由表2的数据可以理解，培养在CMH条件和通常条件下的细胞之间的标志物蛋白表达没有显著差异。
总之，上文获得的数据证明，本发明的CMH条件对脐带血衍生间充质干细胞的基本性质没有显著影响。
实施例7：脐带血衍生间充质干细胞根据培养条件的免疫原性和免疫抑制的比较
使用如下的混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)评估根据培养条件的脐带血衍生间充质干细胞的免疫学特性。
对于阴性对照，将在10μg/ml丝裂霉素C(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)的存在下培养的脐带血衍生间充质干细胞在通常条件和CMH条件下以2×104细胞/孔的密度分别地接种到96孔板中，应答细胞(外周血单核细胞(表示为“A”)；ALLCELLS，Emeryville，CA)以1×105细胞/孔的密度接种到96孔板中，并且刺激细胞(不相关的外周血单核细胞(表示为“B”)；ALLCELLS，Emeryville，CA)以1×105细胞/孔的密度接种到96孔板中。作为阳性对照(1)，将用10μg/ml PHA-L处理的外周血单核细胞(表示为“H”，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)以1×105细胞/孔的密度添加到96孔板。对于阳性对照(2)，应答细胞和刺激细胞各自以1×105细胞/孔的密度添加。在测试组中，用外周血单核细胞、PHA-L刺激的外周血单核细胞或者应答细胞和刺激器细胞的组合(每一种单核细胞均以1×105细胞的密度使用)孵育间充质干细胞5天，并且在显微镜下观察应答细胞的增殖和集落形成。在孵育后第5天，用BrdU(BD Bioscience，San Jose，CA，USA)处理细胞，以便通过在VERSAmaxTM微板阅读器(Molecular Devices Co.，Sunnyvale，CA，USA)上测量370nm的吸光度来确定应答细胞中在之前24小时中新合成的DNA水平。
结果在图10中示出。由图10可以看到，在PHA-L(H)刺激的不相关外周血单核细胞(A+H)中诱导了增殖，而脐带血衍生间充质干细胞不刺激应答细胞，因此导致未诱导细胞增殖(hUCB-MSC+A)。特别地，观察到当脐带血衍生间充质干细胞培养在CMH条件下时，比通常条件下对应答细胞的增殖具有更大抑制作用。这些数据表明，培养在CMH下的脐带血衍生间充质干细胞比培养在通常条件下的那些较不易产生免疫原性。
当应用于其中通过应答细胞(A)与刺激细胞(B)之间的反应(即，(A+B))或通过用PHA-L人为刺激应答细胞(A)(即，(A+H))来诱导免疫应答的情况时，观察到培养在CMH条件下的脐带血衍生间充质干细胞比培养在通常条件下的那些更强地抑制应答性外周血单核细胞的增殖。在获自不同来源的脐带血衍生间充质干细胞中获得了类似结果，虽然具有一定程度的差异，但程度很轻。这些数据证明，CMH培养条件在抑制免疫原性方面优于通常条件。
在与上文所述相同的方式使间充质干细胞反应后，使用PGE2 ELISA试剂盒(Cayman，Ann Arbor，MI，USA)根据制造商方案分析由其释放的免疫抑制剂PGE2(前列腺素E2)。使用来自MLR的培养物作为样品。
制备ELISA测定所需的的标准物，以具有1,000pg/mL的最大密度，以及从最大密度系列对半稀释的7.8pg/mL的最小密度。将每一种标准物和测试组的培养物上清液以50μl的量添加至PGE2捕获抗体包被之板的每个孔。然后，向每个孔添加50μl PGE2AchE示踪物和50μl第一抗体，随后在4℃下孵育18小时。用洗涤缓冲液将板洗涤5次，并且向每个孔添加200μl Ellman试剂(包含在试剂盒内)，然后向每个孔添加5μl示踪物。将板在暗条件下孵育60～90分钟，并且阅读450nm的吸光度。
结果在图11中给出。由图11可以看到，观察到当脐带血衍生间充质干细胞培养在CMH下时释放的PGE2的量是通常条件下的约3.7倍。用不同脐带血衍生间充质干细胞获得了类似结果。这些数据证明，培养在CHM条件下的脐带血衍生间充质干细胞比培养在通常条件下的那些更加的免疫抑制。
实施例8：脐带血衍生间充质干细胞根据培养条件释放细胞因子的能力的体外测定
通过测量脐带血衍生间充质干细胞向软骨细胞分化期间释放的Tsp-2来测定培养条件对脐带血衍生间充质干细胞释放细胞因子能力的影响。
以与实施例3相同的方式将脐带血衍生间充质干细胞培养在通常条件(对照)和CMH条件下。当达到80～90％汇合时，通过胰蛋白酶的处理将它们脱离。在离心之后，用含有40μg/ml L-脯氨酸、0.6μg/ml地塞米松、50μg/ml抗坏血酸和100μg/ml丙酮酸钠的高葡萄糖DMEM洗涤细胞沉淀以从细胞完成除去FBS。将再次通过离心得到的脐带血衍生间充质干细胞以2.0×105细胞/400μl的密度重悬，并且以400μl的等分试样放在15mL圆锥管中。在550×g离心5分钟后，将管非常松的封闭。将所述管垂直地放在搁架中孵育24小时。一旦形成沉淀，收集上清液并且使用Tsp-2测定试剂盒(R&D systems，USA)分析Tsp-2的水平。
结果在图12中给出。Tsp-2是说明用作软骨再生剂的脐带血衍生间充质干细胞之效价的因子。释放越高水平的Tsp-2的细胞被评估为越有效地再生软骨。从图12的数据很明显的，与通常条件相比，在CMH条件下，四种不同脐带血衍生间充质干细胞均释放更高水平的Tsp-2。
总之，以上获得的数据表明培养在CMH条件下的脐带血衍生间充质干细胞具有分化成软骨细胞的优异潜力，并且因此可用作软骨再生剂。

Claims (13)

1.一种用于培养间充质干细胞的方法，其包括在2％至5％氧气的低氧条件下于含有浓度为2.1至3.8mM的钙和浓度为1.0至3.0mM的镁的培养基中培养间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质干细胞来源于脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、皮肤、羊水、脐带或牙齿。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基选自Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、α-MEM、McCoys 5A培养基、eagle基本培养基、CMRL(Connaught Medical ResearchLaboratory)培养基、Glasgow MEM、Ham F-12培养基、IMDM(Iscove改良Dulbecco培养基)、Leibovitz L-15培养基、RPMI(Roswell ParkMemorial Institute)1640培养基、培养基199和Hank培养基199。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养基含有5％至30％的胎牛血清。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养基不含胎牛血清，但含有血清替代物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基基于补充有5％至30％胎牛血清(FBS)、0.3至2.0mM钙和0.2至2.2mM镁的α-MEM。
7.根据权利要求1所述的方法，其中以与权利要求1相同的条件对所述间充质干细胞进行传代培养。
8.使用权利要求1所述的方法制备的间充质干细胞，所述间充质干细胞具有改善的增殖能力、生存力、回收率和免疫学特性。
9.一种细胞治疗剂，其包含权利要求8所述的间充质干细胞。
10.根据权利要求9所述的细胞治疗剂，其中所述细胞治疗剂可应用于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管细胞或肺细胞的再生或保护。
11.根据权利要求9所述的细胞治疗剂，其中所述细胞治疗剂可用于选自以下的情形之一：治疗肺病；抑制或治疗肺病诱发的炎症；肺组织再生；以及抑制肺纤维化。
12.根据权利要求9所述的细胞治疗剂，其中所述细胞治疗剂用于软骨再生。
13.根据权利要求9所述的细胞治疗剂，其中所述细胞治疗剂用于治疗自身免疫病或移植物抗宿主病。
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