CN109666631A - 增强干细胞活性的培养方法、应用以及用于治疗中枢神经疾病的制剂、制备方法及治疗方法 - Google Patents

增强干细胞活性的培养方法、应用以及用于治疗中枢神经疾病的制剂、制备方法及治疗方法 Download PDF

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李恩琴
徐仁和
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MACAO UNIV
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Abstract

本发明提供一种增强干细胞活性的培养方法、应用以及用于治疗中枢神经疾病的制剂、制备方法及治疗方法。通过将干细胞在密闭容器中于常温条件下进行性质稳定和功能增强，提高了干细胞的干性和抗凋亡能力，显著提高干细胞在移植入人体后的治疗效果。本发明方法简单可靠，稳定高效，安全性高，具有极高的医学，科学和社会经济效益。

Description

增强干细胞活性的培养方法、应用以及用于治疗中枢神经疾 病的制剂、制备方法及治疗方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种增强干细胞活性的培养方法、应用以及用于治疗中枢神经疾病的制剂和制备方法。
背景技术
中枢神经系统包括脑和脊髓，是高等生物(如人)感觉，传导和控制功能的最重要系统。人的学习，情感，思维都集中在脑，而脊髓控制全身各种脏器的信息传入，功能维持和机体运动等。中枢神经系统的病变，其发病形式和治病原因多种多样，但是一旦发病轻则影响组织器官机能，重则危机生命，而且很多专向慢性发病，久治不愈，危害患者正常生活，致残率高，严重的威胁人类的健康增加社会的负担。
细胞是组成生命的基本单位，中枢神经系统主要由神经元细胞和神经支持细胞构成的海绵组织构成。多种退行性神经系统疾病例如帕金森氏病，阿尔斯海默症或者特发性遗传型亨廷顿舞蹈症等均是由于正常神经元细胞的衰老消失却得不到补充，导致相关脑功能核团萎缩病变，最终使患者运动功能失调或者痴呆麻木。因此，移植健康的有活性的神经元细胞是治愈此类疾病的有效手段。另外，间充质干细胞也是被广泛用于治疗神经系统疾病的功能细胞，其广泛分布于骨髓，牙髓，脂肪，胎盘和脐带血中。因其具有低免疫原性，抑制免疫反应，调节免疫机能，滋养作用和促血管形成作用被广泛使用于各种免疫性疾病和脊髓损伤疾病中。在治疗脑瘫，脑梗死和脱髓鞘行疾病中其被发现具有明显的抑制免疫反应，保护神经元，分泌碱性成纤维生长因子和神经滋养因子来滋养促进内源性神经元的再生和功能恢复，并且促进病灶部位的血管再生和循环，能够显著改善病人的症状和功能。因此，利用干细胞来治疗中枢神经系统疾病具有切实的证据，可行性高，具有迫切的医疗和社会需要。
目前的干细胞在使用前所经历的反复酶消化解离和运输方式的损耗导致细胞质量下降乃至凋亡。在使用干细胞进行输注和移植时，将解离成单细胞的干细胞通过静脉或者针对病灶进行原位移植，而移植后，大量的干细胞容易在血管中发生栓塞或者是在病灶部位聚团，导致移植的干细胞大量凋亡，并且释放各种凋亡小体和炎性因子，最终导致治疗效果的减弱，甚至恶化。因此，寻找一种合适的干细胞处理和移植方法也是满足干细胞治疗的重要技术环节。
发明内容
申请人研究发现在低温(常温)状态下，干细胞的生长和代谢都会降低，但是其干性(stemness)和抗凋亡的能力却会增强。
本发明的目的在于提供一种增强干细胞活性的培养方法，其可以显著的提高干细胞的干性以及抗凋亡能力。
本发明的另一目的在于提供上述增强干细胞活性的培养方法的应用，其可以用于制备进行干细胞治疗的制剂，并使其中的干细胞更适应低氧环境，在移植后具有良好的抗凋亡能力。
本发明的再一目的在于提供一种用于治疗中枢神经疾病的制剂的制备方法，用于制备出具有更好的抗凋亡能力的制剂，并用于治疗中枢神经疾病。
本发明的再一目的在于提供由上述制备方法制备而得的制剂。
本发明的再一目的在于提供一种中枢神经疾病的治疗方法，其可以显著的改善病症，恢复病体的运动功能。
本发明的实施例是这样实现的：
一种增强干细胞活性的培养方法，将干细胞细胞团于充有培养基的密闭容器中,隔绝氧气和二氧化碳供应的条件下培养3-11天；
优选地培养时间是3-7天。
上述增强干细胞活性的培养方法的应用，其应用于制备干细胞制剂。
一种用于治疗中枢神经疾病的制剂的制备方法，按上述的培养方法培养神经干细胞或间充质干细胞,将获得的干细胞细胞团,去除培养基后重悬于生理盐水注射液中。
一种用于治疗中枢神经疾病的制剂，由上述用于治疗中枢神经疾病的制剂的制备方法制备而得。
一种治疗中枢神经疾病的方法，按上述的培养方法处理干细胞，然后通过鞘内注射或者脑部原位注射入病体，所述干细胞为间充质干细胞和神经干细胞中的一种或两种。
本发明实施例的有益效果是：
本发明提供的增强干细胞活性的培养方法，不仅能够显著的提高干细胞的干性和抗凋亡能力，并且还可以保证干细胞较高的存活率。经过该方法进行处理后的干细胞可以用于制备相应的干细胞制剂，并用于治疗相应的疾病。例如，本发明中，将上述的培养方法用于制备治疗中枢神经疾病的制剂，该制剂可以制备成标准品，也可以在使用时现场制备，由于经过了低氧环境的处理，使得干细胞的抗凋亡能力高，移植入病体后，不会因为病体内的低氧环境造成干细胞凋亡，依然保持良好的干性，显著的提高治疗效果。
本发明提供的治疗中枢神经疾病的方法，可以显著的提高神经干细胞或间充质干细胞在移植入病灶后的抗凋亡能力，保持更高的干性，更好的发挥各项功能，提高治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明试验例的流程图；
图2为本发明试验例获得的测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的改性金属及其制备方法、金属滤网及其制备方法进行具体说明。
目前的干细胞在使用前所经历的反复酶消化解离和运输方式的损耗导致细胞质量下降乃至凋亡。在使用干细胞进行输注和移植时，将解离成单细胞的干细胞通过静脉或者针对病灶进行原位移植，但大量的干细胞容易在血管中发生栓塞或者是在病灶部位聚团，导致移植的干细胞大量凋亡，并且释放各种凋亡小体和炎性因子，最终导致治疗效果的减弱，
申请人发现，导致这种情况的原因是因为干细胞在移植前是培养在高营养和21％氧气的环境中的，具有强烈的新陈代谢和增殖，但是移植后，进入的环境是低氧(小于13％)甚至缺氧，并且养分和糖分并不能够像在培养瓶中充分得到供应，这样大量的干细胞容易在血管中发生栓塞或者是在病灶部位聚团，导致移植的干细胞大量凋亡，并且释放各种凋亡小体和炎性因子，最终导致治疗效果的减弱，甚至恶化。
基于此，本发明提供了一种增强干细胞活性的培养方法，将干细胞细胞团于充有培养基的密闭容器中,隔绝氧气和二氧化碳供应的条件下培养3-11天；优选地,培养时间为3-7天较为适宜。其中干细胞的活性是指干细胞的干性和/或抗凋亡能力。
具体的，上述的培养方法适用于神经干细胞、间充质干细胞、多能干细胞、脂肪干细胞，肌肉干细胞和心肌干细胞上。
在本发明的一些实施方式中，干细胞细胞团由以下方式获得:将干细胞在悬浮培养条件下聚集形成细胞团。例如：干细胞在37℃培养箱中悬浮培养24-28h聚集形成细胞团，或将干细胞在20-37℃条件下悬浮培养并自发聚集形成细胞团均可。
目前，干细胞的生产依赖高标准的环境，包括洁净度，湿度，温度和气体维持的合适的酸碱度。通常是在万级培养间和百级的无菌操作台中操作，在37摄氏度，90％湿度和5％二氧化碳培养箱中以2D贴壁培养方式进行生长，通过消化传代来进行扩增。这种生长方式比较缓慢，每次使用前需要使用胰蛋白酶消化收集细胞，这种方式容易破坏细胞之间的细胞连接和损耗细胞外基质，导致细胞活性降低。如果长途运输大量干细胞则需要冷冻维持，并且后续仍然需要解冻，复苏扩增等繁琐程序。目前的干细胞在使用前所经历的反复酶消化解离和运输方式的损耗导致细胞质量下降乃至凋亡。
因此优选地，采用3D悬浮培养系统培养干细胞并形成细胞团。利用3D悬浮系统使干细胞的大量制备，便于质量控制和收集，避免了2D条件下的多次消化过程。
根据不同地干细胞数目制备不同大小规格的细胞团块(均匀球体)，优选的，球体大小介于30－250微米(μm)。
对于培养的容器，优选采用塑料容器，例如由聚乙烯、聚丙烯或密胺材料制成的容器。并且，在将干细胞置于密闭容器中时，可将密闭容器中充满培养基，作为优选的实施方式，可以将每毫升培养基中封装的干细胞的数量控制在100万-200万。
封装后，优选的将密闭容器置于10-35℃的环境下，避免强光照射，在不能满足室温的低温户外，例如雪地，可将细胞容器置于背包，口袋中获得人体近体表温度维持细胞容器处于10度以上的环境中。
经过上述方式培养后的干细胞具有良好的干性和抗凋亡能力，因此上述方法可以应用于制备干细胞制剂，应用于治疗高等动物的疾病。经此方式处理后的干细胞移植入病体后，不会在血管中发生栓塞或者是在病灶部位聚团，发挥干细胞的滋养保护和促进再生功能，满足免疫性疾病，损伤性疾病和退行性疾病等在中枢神经系统中的细胞治疗，效果显著。具有不可估量的科学和医疗经济效益。
本发明提供一种用于治疗中枢神经疾病的制剂的制备方法，按如上述的培养方法培养神经干细胞或间充质干细胞,将获得的干细胞细胞团,去除培养基后重悬于生理盐水注射液中。按此方法即可制成成品的干细胞制剂，通过合适的储存、运输方法加以保存，用于治疗高等动物的中枢神经疾病。
需要说明的是，除了将该制剂制成成品外，也可以在治疗时临时制备，例如，在将干细胞经过上述的方式处理后，以合理的保存方式运送到目的地，再重悬于生理盐水注射液中。然后再对病体使用。
通过上述方法制备而得的用于治疗中枢神经疾病的制剂，由于经过了低氧环境的处理，使得干细胞的抗凋亡能力高，移植入病体后，不会因为病体内的低氧环境造成干细胞凋亡，依然保持良好的干性，显著的提高治疗效果。
同时，本发明还提供一种治疗中枢神经疾病的方法，按上述的培养方法处理干细胞，然后通过鞘内注射或者脑部原位注射入病体，其中的干细胞为间充质干细胞和神经干细胞中的一种或两种。
承前述，由于经过的低氧环境的处理，使干细胞具有了较强的干性以及抗凋亡能力，移植入病体后，不会在血管中发生栓塞或者是在病灶部位聚团，发挥神经干细胞或间充质干细胞的滋养保护和促进再生功能，达到治疗中枢神经系统疾病的目的。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
选取两株干细胞(其中一株由人类多能干细胞CT3分化而来，另一株分离自捐赠的骨髓血)
将两株细胞于正常的细胞培养环境进行培养，正常细胞培养环境为(37℃，5％二氧化碳，90％湿度)，培养至80％融合度。然后按以下步骤进行实验：
1.将细胞取出，去除培养基，1X PBS清洗2遍；
2.使用0.05％胰蛋白酶消化3分钟；
3.干细胞培养基(低糖DMEM，20％血清，1％非必需氨基酸，5％L-谷氨酰胺)收集细胞；
4.调整细胞浓度至8X105cells/ml,利用悬滴法制备干细胞球，25微升每滴；
5.将培养板放入正常细胞培养环境培养48小时；
6.从悬滴中收集干细胞小球；
7.1000rpm离心3分钟，去除上清；
8.加入保存新鲜培养基重悬细胞，细胞密度调整为200万细胞每毫升培养基；
9.将细胞加入1.5ml塑料离心管中，石蜡膜封口，避光保存，记为第0天，室温下(20度)保存7天；
10.第7天，离心细胞，去除上清，1X PBS清洗2遍；
11.用0.05％胰蛋白酶消化3分钟；
12.干细胞培养基(低糖DMEM，20％血清，1％非必需氨基酸，5％L-谷氨酰胺)重悬细胞；
13.对细胞进行检测，检测结果显示，两株间充质干细胞经此方法后的存活率均超过90％，并且具有正常的细胞形态。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤8中，细胞密度调整为100万细胞每毫升培养基，步骤9中，保存3天。
经检测，间充质干细胞经此方法后的存活率均超过90％，并且具有正常的细胞形态。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于步骤9中保存11天。
经检测，间充质干细胞经此方法后的存活率均超过90％，并且具有正常的细胞形态。
实施例4
本实施例与实施例1的区别仅在于步骤5中的培养方式不同，本实施例中，将培养板置于20℃条件下悬浮培养，待细胞自发聚集形成细胞团。
实施例5
本实施例提供一种用于治疗中枢神经疾病的制剂，其将实施例1处理后得到的间充质干细胞细胞团，重悬于生理盐水中形成注射液而得。该制剂的保存条件为10-37℃，避光。
试验例
14.将上述实施例1制备的间充质干细胞球放置在背包中，经过3天的常温运输，到达疾病猴所在猴场，疾病猴患有脊髓多发性硬化症；
15.离心去除培养基，1X PBS清洗2遍；
16.将细胞重悬于1ml 1X PBS中，吸入1ml注射器待注射；
17.将病猴麻醉后，通过鞘内注射针首先释放2ml脑脊液，以防止注射细胞时颅内压增加；
18.选取8只病食蟹猴，将16中细胞缓缓注射进入病猴鞘内，注意观察病猴反应，在本试验例注射过程中，无食蟹猴在注射时出现不良症状，(需要说明的是，在注射过程中，若发现病猴有不适现象，应立即停止注射)
19.注射完毕后，将病猴放回笼中持续观察；
在注射后的次日，可观察到病猴具有食量增加，注射后第二日可明显观察到运动协调，活动增加情况，
20.观察纪录病猴各项体征数据，3个月后将病猴处死，收集中枢神经系统样本进行病理检测。检测结果如附图2所示：
附图1示出了本试验过程的流程，请参考附图1：
其中图1(A)表示单层培养的间充质干细胞Envy－EMSC，带有绿色萤光蛋白(GFP)；
图1(B)表示步骤8中，Envy－EMSC制备形成250微米直径的细胞球；
图1(C)表示步骤14中，将Envy－EMSC细胞球封装在离心管中在常温条件下放置3天并运到猴场；
图1(D)表示步骤18将Envy－EMSC细胞球(C)在释放2ml脑脊液后直接鞘内注射到食蟹后脊柱内腔的过程。
根据附图2的分析，由图2A可以看出，在注射干细胞后，病猴的症状持续位于低水平。其中，评分标准按脊髓多发性硬化症临床症状评分标准《MS2010版McDonald诊断标准》。
图2B可以看出，通过磁共振成像(MRI)对病猴进行检测,结果可以看出，病猴经细胞治疗后对MBP呈阳性，说明将Envy－EMSC直接迁移到大脑病灶部位并转化成为少突神经细胞。
通过磁共振成像(MRI)对病猴进行检测，图2C示出了病猴在细胞治疗前后的脑结构图，其中，可以看出，治疗前，脑结构中病灶(图中的团状物)较多，经细胞治疗后脊髓多发性硬化症食蟹猴猴大脑病灶明显减少，说明炎症减轻，组织修复和改善。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种增强干细胞活性的培养方法，其特征在于，将干细胞细胞团于充有培养基的密闭容器中,隔绝氧气和二氧化碳供应的条件下培养3-11天；
优选地,培养时间为3-7天；
优选地，干细胞包括间充质干细胞、神经干细胞、多能干细胞、脂肪干细胞、肌肉干细胞或心肌干细胞。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述干细胞细胞团由以下方式获得:将干细胞在悬浮培养条件下聚集形成细胞团，优选地，采用3D悬浮培养系统培养干细胞并形成细胞团。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，细胞团的直径介于30-250μm。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，将干细胞在37℃培养箱中悬浮培养24-28h聚集形成细胞团，或将干细胞在20-37℃条件下悬浮培养并自发聚集形成细胞团。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，容器采用塑料容器，优选地，容器由聚乙烯、聚丙烯或密胺制成。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，每毫升培养基中封装的干细胞的数量为100万-200万。
7.如权利要求1-6任一项所述的培养方法在制备干细胞制剂中的应用。
8.一种用于治疗中枢神经疾病的制剂的制备方法，其特征在于，按如权利要求1-6任一项所述的培养方法培养神经干细胞或间充质干细胞,将获得的干细胞细胞团,去除培养基后重悬于生理盐水注射液中。
9.如权利要求8所述的制备方法制得的用于治疗中枢神经疾病的制剂。
10.一种治疗中枢神经疾病的方法，其特征在于，按如权利要求1-6任一项所述的培养方法处理干细胞，然后通过鞘内注射或者脑部原位注射入病体，所述干细胞为间充质干细胞和神经干细胞中的一种或两种。
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