CN109699634A - 一种间充质干细胞的超低温冻存与复苏方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种无血清间充质干细胞冻存液，以及使用该冻存液对间充质干细胞进行超低温冻存与复苏的方法。相比现有技术中含有胎牛血清的冻存液及使用其的冻存复苏方法，使用本发明的无血清冻存液对间充质干细胞进行冻存，冻存过程没有加入胎牛血清，这避免了引入异种来源蛋白可能带来的风险；采用封口操作、程序降温盒，以及通过气相液氮罐存储细胞，在确保冻存效果的同时有效降低冻存过程中液氮的进入，从而降低冻存过程中污染和复苏时炸管的风险，最终间充质干细胞复苏后的活率达到90％以上，能够满足间充质干细胞临床应用的需要。

Description

一种间充质干细胞的超低温冻存与复苏方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的超低温冻存与复苏方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是一类来源于发育早期中胚层及外胚层的多能干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。间充质干细胞在临床上可应用于解决多种血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等，此外还在神经系统修复等方面具有发展前景。

间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞，但存在以下问题：随着年龄的老化，骨髓间充质干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；其制备过程不容易质控；移植给异体时可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。

研究表明，脐带来源的间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志物，并具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低的特性；另外其取材方便，无道德伦理问题的限制，更易于工业化制备。因此，脐带间充质干细胞不仅能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。

通常干细胞冻存时的冻存液需要使用胎牛血清(FBS)，否则细胞复苏活率较低；虽然FBS可为间充质干细胞提供必要的营养物质，但FBS属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了细胞污染的几率。另外，冻存细胞的存储采用普通液氮罐居多，由于冻存管长期浸于液氮中，难免会有液氮进入到冻存管中，这样一方面增加了冻存细胞被污染的风险，另一方面在复苏细胞时也存在因操作不慎而炸管的风险。

综上所述，如何有效地提高冻存细胞的复苏率和培养扩增后的细胞活率，是目前本领域技术人员急需解决的问题。

发明内容

为了克服以上细胞冻存和复苏的现有技术中存在的缺点，本发明一个目的在于提供一种间充质干细胞冻存液，其由以下体积比的各组分组成：3-10％GMP级血清替代物，8-10％DMSO，5-25％人血白蛋白，以及55-84％α-MEM基础培养基。

在本发明上述冻存液的一些实施方案中，所述间充质干细胞冻存液由以下体积比的各组分组成：10％GMP级血清替代物如Helios或PALL牌的产品，10％DMSO，10％人血白蛋白，以及70％α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌的产品。

在本发明上述冻存液的一些实施方案中，所述间充质干细胞为从人源脐带组织获取的间充质干细胞。

本发明另一个目的在于还提供一种使用上述冻存液对间充质干细胞进行超低温冻存与复苏的方法，其包括以下步骤：

1)从原代间充质干细胞扩增的干细胞经消化后，用由基础培养基和血清替代物组成的完全培养基重悬，其中所述完全培养基中含有3-5％体积比的血清替代物，然后分别用权利要求1-3的冻存液调整细胞悬液中的细胞密度，然后将细胞悬液分装于冻存管中，贴好标签，用医用胶带封口；

2)迅速将上述冻存管放于程序降温盒中；

3)再将所述程序降温盒迅速放入-80℃冰箱中过夜；

4)将所述间充质干细胞迅速由冰箱转移至液氮罐中进行冻存；

5)将液氮冻存罐中冻存了一段时间的间充质干细胞冻存管取出，快速放入37-40℃水浴锅中，迅速摇晃冻存管，使其受热均匀，注意水面不得没过冻存管瓶盖；

6)当冻存管中的间充质干细胞融化后，迅速将所述冻存管中的干细胞转移至生理盐水中，1000-1500rpm离心3-5min，弃上清，使用生理盐水洗涤，用新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，取样测定细胞的总数和复苏活率；

7)调整细胞密度，将上述细胞悬液中的间充质干细胞(如P2代)接种于新培养瓶中；

8)将所述培养瓶置于细胞培养箱中继续培养，并观察新一代间充质干细胞生长情况(如由P2代复苏培养后的干细胞即P3代)，取样测定间充质干细胞的总数和活率。

在本发明上述方法的一些实施方案中，所述间充质干细胞为从人源脐带组织获取的间充质干细胞。

在本发明上述方法的一些实施方案中，步骤1)中所述基础培养基为α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌的产品，且所述血清替代物为GMP级血清替代物如Helios或PALL牌的产品，并调整细胞悬液的细胞密度为6×10⁶/mL-7×10⁶/mL，然后按1mL/管将细胞悬液分装于冻存管中。

在本发明上述方法的一些实施方案中，步骤2)中所述程序降温盒为美国BIOCISION公司程序降温盒。

在本发明上述方法的一些实施方案中，步骤4)中所述液氮罐为气相液氮罐。

在本发明上述方法的一些实施方案中，步骤6)中当冻存管中的间充质干细胞融化后，迅速将所述冻存管中的干细胞转移至50mL生理盐水中，1200rpm离心3min，弃上清，使用生理盐水洗2次。

在本发明上述方法的一些实施方案中，步骤7)中以5000-6000个/cm²的起始接种密度将所述细胞悬液中的间充质干细胞接种于T-175培养瓶中，总体积为25mL/瓶。

在本发明上述方法的一些实施方案中，步骤8)中将所述培养瓶置于细胞培养箱中，于37℃、5％CO₂下继续培养3-4天。

有益效果

相比现有技术中含有胎牛血清的冻存液及使用其的冻存复苏方法，使用本发明的无血清冻存液对间充质干细胞进行冻存，冻存过程没有加入胎牛血清，这避免了引入异种来源蛋白可能带来的风险；采用封口操作、程序降温盒，以及通过气相液氮罐存储细胞，在确保冻存效果的同时有效降低冻存过程中液氮的进入，从而降低冻存过程中污染和复苏时炸管的风险，最终间充质干细胞经复苏后的活率达到90％以上，能够满足间充质干细胞临床应用的需要。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

实施例1：脐带组织小块的获取

1)将处理好的足月剖腹产健康新生儿脐带，去除脐带的结扎两端，并用眼科剪将该长10-15cm的中间段剪成2-3cm长的脐带组织段，用含1％双抗(青霉素-链霉素混合溶液)的生理盐水反复漂洗所述脐带组织段以去除血迹。

2)剖开上述脐带组织段，并去除动脉和静脉血管(2条动脉和1条静脉)及表皮组织，获得脐带华通氏胶组织段，用含1％双抗的生理盐水反复漂洗后，将其剪碎成约3mm×3mm×1mm的华通氏胶组织块。

实施例2：华通氏胶组织块的贴壁培养与原代间充质干细胞的获取

1)按照1块/cm²将剪碎至4～10mm³大小的人源脐带华通氏胶组织块接种至直径10cm的细胞培养皿中平铺贴壁，每个培养皿中加入约30-50块所述组织块，风干组织块约15min以使其减少水分、贴壁牢固；

2)向每个培养皿中轻轻加入7mL由基础培养基(α-MEM Cornig)和血清替代物(Helios GMP级)组成的完全培养基(其中含有3％体积比的血清替代物)，不要将组织块吹起，随后放入37℃、5％CO₂的培养箱中孵育培养；培养5天后更换新鲜完全培养基5mL，继续静置培养5-9天，期间每隔3-4天更换新的完全培养基；

3)待华通氏胶组织块中爬出大量间充质干细胞后，轻轻吸弃培养基上清液，使用生理盐水洗2次，然后使用TrypLE^TM(美国赛默飞世尔科技公司的Gibco牌产品)对爬出的间充质干细胞进行充分消化约3-5min，待伪足完全回缩、细胞变圆，加入5-10mL所述完全培养基终止消化，然后吹打以得到间充质干细胞悬液，用25mL移液管收集消化后的细胞悬液加入到50ml离心管中在1500rpm下离心5min，弃上清后再加入40mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀；

4)将收集的消化后的间充质干细胞使用滤网(100-200μm)过滤，以除去细胞悬液中残余的华通氏胶组织块，所得过滤后的细胞即为制备的原代间充质干细胞(P0代)。

实施例3：间充质干细胞的传代培养

1)将间充质干细胞(首次扩增培养使用实施例2制备的人源脐带原代间充质干细胞，即P0代)通过细胞计数仪测定细胞的总数以及台盼蓝染色计算细胞活率后，将上述间充质干细胞接种到T175细胞培养瓶中，起始接种密度为约6×10³/cm²，总体积为25mL/瓶；

2)将细胞培养瓶置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3-4天，当细胞汇合度达80％-90％时，倒掉培养瓶中的培养基，使用生理盐水洗涤2次，然后按每个培养瓶7mL加入TrypLE充分消化细胞，大约消化3-5min；

3)待细胞伪足完全回缩、细胞变圆后，加入7mL如实施例2所述的完全培养基终止消化过程；然后吹打得到间充质干细胞悬液，25mL移液管收集于50mL离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，使用生理盐水洗涤2次，再加入50mL新鲜的所述完全培养基重悬细胞沉淀，颠倒混匀，对扩增后的新一代(由P0代扩增得到的即为P1代，依次连续传代则逐渐递增为P2代、P3代，等等)间充质干细胞取样测定细胞的总数和活率；

4)使用上述扩增后的新一代间充质干细胞重复步骤1)至3)继续进行传代培养(如使用P1代继续传代培养得到扩增后的P2代，由P2代继续传代培养则获得扩增后的P3代；以此类推)。

实施例4：间充质干细胞的冻存

1)配制由以下体积比的各组分组成的无血清间充质干细胞冻存液：

冻存液1：10％血清替代物(Helio GMP级)，10％DMSO，10％人血白蛋白，以及70％α-MEM基础培养基(Corning)。

冻存液2：6％血清替代物(Helio GMP级)，9％DMSO，15％人血白蛋白，以及70％α-MEM基础培养基(BI)。

冻存液3：3％血清替代物(Helio GMP级)，8％DMSO，5％人血白蛋白，以及84％α-MEM基础培养基(Hyclone)。

冻存液4：10％血清替代物(Helio GMP级)，10％DMSO，25％人血白蛋白，以及55％α-MEM基础培养基(Hyclone)。

对照冻存液：20％胎牛血清、10％DMSO、70％α-MEM基础培养基。

2)将实施例3中消化后用如实施例2所述的完全培养基重悬的已扩增的间充质干细胞(如P2代)，分别采用上述配制的冻存液调整细胞悬液的细胞密度为6×10⁶/mL-7×10⁶/mL，并按1mL/管将细胞悬液分装于冻存管中，贴好标签，用封口膜或医用胶带封口；

3)迅速将上述冻存管放于美国BIOCISION公司的程序降温盒中；

4)再将所述程序降温盒迅速放入-80℃冰箱中过夜；

5)将所述间充质干细胞迅速由冰箱转移至气相液氮罐中进行冻存。

实施例5：间充质干细胞的复苏和培养

1)将在实施例4的气相液氮冻存罐中冻存一定时间的间充质干细胞如P2代干细胞的冻存管取出，快速放入37℃水浴锅中，迅速摇晃冻存管，使其受热均匀，注意水面不得没过冻存管瓶盖；

2)当冻存管中的间充质干细胞融化后，迅速将所述干细胞转移至50mL生理盐水中，1200rpm离心3min，弃上清，使用生理盐水洗2次，用新鲜的如实施例2所述的完全培养基重悬细胞沉淀，取样测定细胞的总数和复苏率；

表1：实施例4中各种冻存液所冻存P2代细胞的复苏率

冻存液	所冻存P2代细胞的复苏率(％)
		冻存液1	93.36％
冻存液2	91.58％
		冻存液3	90.52％
冻存液4	95.43％
		对照冻存液	85.23％

由表1数据可知，由本发明的冻存液所冻存细胞的复苏率明显高于传统的对照冻存液所冻存细胞的复苏率，另外还观察到细胞大小均匀、轮廓清晰完整，呈现出完整细胞形态。

3)以5000-6000个/cm²的起始接种密度，将上述细胞悬液中的间充质干细胞如P2代干细胞接种于新的T-175培养瓶中，总体积为25mL/瓶；

4)将所述培养瓶置于细胞培养箱中，于37℃、5％CO₂下继续培养3-4天，并观察新一代间充质干细胞生长情况，如由P2代复苏培养后的干细胞即P3代干细胞，取样测定间充质干细胞的总数和活率。

表2：实施例4中各冻存液冻存的P2代复苏后，进行培养扩增的P3代间充质干细胞的总数和活率

表2的结果表明，相比传统的对照冻存液，由本发明的冻存液所冻存细胞在复苏后培养3-4天后，细胞数量更多且活率都在90％以上，能更好地维持细胞活性，保持良好的细胞生长状态。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下体积比的各组分组成：3-10％血清替代物，8-10％DMSO，5-25％人血白蛋白，以及55-84％α-MEM基础培养基。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下体积比的各组分组成：10％GMP级血清替代物如Helios或PALL牌产品，10％DMSO，10％人血白蛋白，以及70％α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌产品。

3.如权利要求1或2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，其中所述间充质干细胞为从人源脐带组织获取的间充质干细胞。

4.使用权利要求1-3的冻存液对间充质干细胞进行超低温冻存与复苏的方法，其包括以下步骤：

1)从原代间充质干细胞扩增的干细胞经消化后，用由基础培养基和血清替代物组成的完全培养基重悬，其中所述完全培养基中含有3-5％体积比的血清替代物，然后分别用权利要求1-3的冻存液调整细胞悬液中的细胞密度，然后将细胞悬液分装于冻存管中，贴好标签用封口膜或医用胶带封口；

2)迅速将上述冻存管放于程序降温盒中；

3)再将所述程序降温盒迅速放入-80℃冰箱中过夜；

4)将所述间充质干细胞迅速由冰箱转移至液氮罐中进行冻存；

5)将上述液氮罐中冻存了一定时间的间充质干细胞冻存管取出，快速放入37-40℃水浴锅中，迅速摇晃冻存管，使其受热均匀，注意水面不得没过冻存管瓶盖；

6)当冻存管中的间充质干细胞融化后，迅速将所述冻存管中的干细胞转移至生理盐水中，1000-1500rpm离心3-5min，弃上清，使用生理盐水洗涤，用新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，取样测定细胞的总数和复苏活率；

7)调整上述细胞悬液中的间充质干细胞如P2代的密度，然后接种于细胞培养瓶中；

8)将所述培养瓶置于细胞培养箱中继续培养，并观察新一代间充质干细胞生长情况，如由P2代复苏培养后的干细胞即P3代，取样测定间充质干细胞的总数，计算细胞活率。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述基础培养基为α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌产品，且所述血清替代物为GMP级血清替代物如Helios或PALL牌产品，并调整细胞悬液的细胞密度为6×10⁶/mL-7×10⁶/mL，然后按1mL/管将细胞悬液分装于冻存管中。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述程序降温盒为美国BIOCISION公司的程序降温盒。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述液氮罐为气相液氮罐。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤6)中当冻存管中的间充质干细胞融化后，迅速将所述冻存管中的干细胞转移至50mL生理盐水中，1200rpm离心3min，弃上清，使用生理盐水洗2次。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤7)中以5000-6000个/cm²的起始接种密度将所述细胞悬液中的间充质干细胞接种于T-175细胞培养瓶中，总体积为25mL/瓶。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤8)中将所述培养瓶置于细胞培养箱中，于37℃、5％CO₂下继续培养3-4天。