CN110408585A - 一种利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法 - Google Patents

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孙中锋
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Abstract

本发明提供一种耳后皮肤培养成纤维细胞的方法，其特征在于包括以下步骤:皮肤组织采集；组织复苏及酶解；细胞原代培养，细胞纯化；成纤维细胞扩增培养；成纤维细胞检测；成纤维细胞冻存；通过本发明所制备的成纤维细胞其活性更高、纯度更高，可用于制备高疗效的组织工程产品及美容产品。

Description

一种利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种成纤维细胞分离培养方法，尤其涉及一种利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法。
技术背景
成纤维细胞是疏松结缔组织中最主要的细胞，常附着在胶原纤维上，能合成和分泌大量的胶原蛋白。正常情况下，其处于相对静止状态，当皮肤受损时可进入增殖状态，参与组织修复，是皮肤组织受损后的主要修复细胞。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。
皮肤皱纹是由内源性自然生理衰老和外源性面部肌肉运动频发、表皮组织水分流失、不良环境因素等因素共同作用的结果。目前应用的多种除皱方法如面部提紧术、化学去皮、激光除皱和生物制剂注射法等都存在着不等的副作用且治疗效果不明显，所以寻找一种能有效除皱的方法已成为国内外相关整形美容学者们最关注的问题。近些年来随着皱纹产生机理研究的深入发现，在皮肤中成纤维细胞主要存在于真皮网织层中，是真皮层中的重要细胞，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用。而成纤维细胞的减少亦是引起皱纹产生的重要因素,因此推测在皱纹区域补充成纤维细胞可能对改善皱纹有明显的作用。
基于此，整形美容研究者们开始根据此机理开发美容产品，而在这些美容产品中最受人关注的为自体成纤维细胞除皱美容产品，但因现有除皱产品中成纤维细胞活性低，导致除皱美容效果并不十分理想。
基于成纤维细胞在组织修复及除皱美容中的作用及现有产品中成纤维细胞活性不足的特点，开发出高活性的成纤维细胞培养方法对于后期组织修复及除皱美容产品的开发至关重要。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种从耳后皮肤组织培养成纤维细胞的方法，该制备方法克服了现有培养技术的缺点，缩短了培养周期，增加了细胞数量，提高了培养的成纤维细胞的纯度及活性。
为解决上述问题，本发明提供了一种利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法，包括以下步骤
(1)组织采集：无菌条件下取耳后皮肤组织，置入含DMEM(Dulbecco's ModifiedEagle Medium，达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基)培养液的培养皿中,组织样本经两次DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)和PBS(Phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)离心清洗后，加入冻存液，冷冻保存；
(2)组织复苏及酶解：取出冻存组织，经水浴锅中快速解冻后用75％乙醇消毒1-3min；随后用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)和PBS(Phosphate buffersaline，磷酸盐缓冲液)清洗1-3次；清洗后的皮肤组织加入中性裂解酶过夜消化后，去除表皮，用无菌剪刀将真皮组织剪碎成小块；
(3)原代培养(P0)：将步骤⑵中剪碎后的皮肤组织加入到成纤维细胞专用培养液，混匀后移至培养瓶内，在含有5％CO2，37℃的培养箱中培养10-15天；
(4)细胞纯化：当步骤⑶中细胞融合度达到50％-90％时，用含0.25％胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)消化后移至培养瓶中培养3-5天，当细胞融合度达到90％以上时，消化收获细胞，此时为第一代细胞(P1)；将第一代细胞移至培养瓶中培养2-3天后，消化收获细胞，此时为纯的成纤维第二代细胞(P2)；
(5)成纤维细胞扩增培养：将第二代细胞接种到自动细胞扩增体系培养，每天检测自动细胞扩增系统内培养液乳酸值，并用以计算扩增的理论数值,当细胞数值达理想状态时消化收获细胞，此为第三代成纤维细胞(P3)；
其中,步骤(4)中收获细胞时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。
优选地,步骤(4)中收获细胞时通过成纤维细胞专用培养液及限制消化时间来去除上皮细胞及角质细胞，以纯化成纤维细胞。
优选地,步骤(5)所述自动细胞扩增系统培养过程为:将第二代成纤维细胞的1-2×107个细胞转移到自动细胞扩增系统中，在5％CO2、37℃条件下进行培养。
优选地,步骤(5)所述自动细胞扩增系统培养过程中，在不同时间点抽取培养液检测乳酸值，计算细胞扩增的理论数值，判断系统内细胞的生长情况；当细胞生长处于指数生长期末端时，消化收获细胞。
优选地,步骤(5)所述自动细胞扩增系统培养过程中,根据载入的细胞数量，设置不同的参数:
a.1500万＞细胞上样量＞500万时,设置25mL/min的进样速度、150mL/min循环；
b.当细胞数量大于1500万时,设置25mL/min的进样速度、200mL/min循环。
当适用a时,设置培养液进液速度为25mL/min，逆时针20mL/min循环3min；
当适用b时,设置培养液进液速度为0mL/min，逆时针200mL/min循环4min。
优选地,将(5)中获得的成纤维细胞放入保存液中，分装于冻存管中，将冻存管放入冻存装置内，直接放入-86℃低温冰箱内，次日移入液氮保存罐内；所述冻存装置采用梯度降温程序，平均降温速率为-1℃/分钟。
优选地,所述成纤维细胞为第三代细胞，第三代细胞产量为2×108-8×108个，第三代成纤维细胞的纯度≥99％，第三代成纤维细胞的活性≥95％。
优选地,步骤(1)中的耳后皮肤组织为完整的皮肤组织,包括表皮、真皮、皮下组织。
优选地,所述的利用耳后细胞培养成纤维细胞的方法,还包括成纤维细胞检测的步骤：抽取样本进行细胞计数、细胞活力和安全性检测，安全性检测包括细菌和真菌、支原体、内毒素检测。
本发明与现有技术相比有较明显的优势和有益效果：
本发明提供的制作方法所收获的细胞为P3代成纤维细胞，其细胞周期短，细胞活性高，细胞产量大，细胞纯度高，并保证其稳定性，具体有益效果如下：
1.耳后皮肤组织经酶解过程去除表皮层，降低杂细胞产生；原代培养过程所采用的培养基为成纤维细胞选择性培养基，保证了细胞的纯度；
2.使用本发明所述的方法，细胞培养的周期缩短，成纤维细胞的培养时间平均约为30天，较现有“堆积培养”或“滚瓶”技术等其他方法所制备成纤维细胞缩短30-40天；由于细胞培养周期缩短，采用此方法制备的成纤维细胞活力平均为99.4％，相比之下，“堆积”或“滚瓶”技术培养体系培养的成纤维细胞往往低于90％。
3.使用本发明所述的方法获得的第三代细胞平均产量为6.0×108，此数量相当于使用其他方法传代7-10次所获得的数量，减少细胞传代次数，提高细胞稳定性。
4.本发明所述的方法中采用的冻存方法可保证细胞冻存过程中稳速下降，其冻存细胞复苏性能稳定，成活率高，进一步保证了细胞的稳定性。
附图说明
图1为实施例1中的成纤维细胞的流式检测结果图。
图2为本实施例1所获得的成纤维细胞在4倍显微镜下培养21d时的细胞状态图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效,以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种利用耳后细胞培养成纤维细胞的方法，其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。
实施例一
本实施例中提供了一种利用耳后细胞培养成纤维细胞的方法，包括以下步骤:
步骤⑴.组织采集：无菌条件下用皮肤取样器(皮肤环钻)取耳后直径2-4mm圆形皮肤组织，耳后皮肤组织为完整的皮肤组织,包括表皮、真皮、皮下组织，将其置入含DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养液的培养皿中；组织样本经DMEM(Dulbecco'sModified Eagle Medium)和PBS(Phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)离心清洗后，加入冻存液冷冻保存。
步骤⑵.组织复苏及酶解：冻存皮肤组织经37℃水浴锅中快速解冻后用75％乙醇消毒1-3min；随后用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)和PBS(Phosphate buffersaline，磷酸盐缓冲液)清洗1-3次；清洗后的皮肤组织加入中性裂解酶过夜消化后，去除表皮，用无菌剪刀将真皮组织剪碎0.1-0.5mm小块；
步骤⑶.P0代培养：将步骤⑵中剪碎后的皮肤组织经离心后去除上清，加入含有FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)的成纤维细胞专用培养液，用移液管吹打混匀后移至T25培养瓶内，在含有5％CO2，37℃的培养箱中培养10天，在培养过程中定期换液；
步骤⑷.细胞纯化，传代培养：当步骤⑶中细胞融合度达到50％时，用含有0.25％胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)消化后移至T75培养瓶中培养3天；在培养过程中定期换液，细胞融合度达到90％时，消化收获细胞。此时为P1代细胞。
步骤⑸.传代培养：步骤⑷中细胞融合度达到90％时，用含有0.25％胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)消化后移至T175培养瓶中培养2天；培养过程中定期换液，消化收获细胞，此时为P2代细胞。
步骤(4)(5)中收获细胞时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。收获细胞时通过成纤维细胞专用培养液及限制消化时间来去除上皮细胞及角质细胞，以纯化成纤维细胞。
步骤⑹.传代到自动细胞扩增系统及收获细胞：当步骤⑸中细胞融合度达80％时，收获细胞，将第二代成纤维细胞的1×107个细胞转移到自动细胞扩增系统中，放入自动细胞扩增系统中扩增培养；每天检测自动细胞扩增系统内培养液乳酸值，并计算扩增的理论数值；当细胞数值达理想状态时收获细胞，此为P3代成纤维细胞。
所述自动细胞扩增系统培养过程为：将收获的P2代成纤维细胞转移到自动细胞扩增系统中，该系统为全封闭扩增系统；在5％CO2、37℃条件下进行培养，扩增体系所用培养基同步骤⑶-步骤⑸；在不同时间点抽取培养液检测乳酸值，计算细胞扩增的理论数值，准确的判断系统内细胞的生长情况；当细胞生长处于指数生长期末端时，收获细胞；
本实施例中，在自动细胞扩增系统培养过程中，根据载入的细胞数量，设置参数如下:
a.1500万＞细胞上样量＞500万时用25mL/min的进样速度、150mL/min循环；设置培养液进液速度为25mL/min，逆时针20mL/min循环3min。
收获的第三代成纤维细胞具有典型的成纤维细胞形态，将获得的第三代成纤维细胞放入保存液中混匀，平均分装于冻存管中，将冻存管放入冻存装置内，直接放入-86℃低温冰箱内，次日移入液氮保存罐内；所述冻存装置采用梯度降温程序，平均降温速率为-1℃/分钟。
对第三代成纤维细胞进行活性，纯度，含量、细胞形态、细菌、真菌、支原体污染，内毒素含量等性能的检测，检测结果如下表1：
表1存活率与安全性检测结果表
参见附图1，采用流式细胞仪对自动扩增系统收获的成纤维细胞所表达的表面标记物进行分析,结果显示，该细胞类型对CD73、CD105和CD26均呈阳性，而对HLA-DR呈阴性。纯度达到99％以上，这与纯成纤维细胞群高度吻合。
参见附图2,为本实施例所获得的耳后皮肤成纤维细胞在4倍显微镜下培养21d时的细胞状态图，其表现出典型成纤维细胞生长形态。
实施例二：
本实施例中提供了一种利用耳后细胞培养成纤维细胞的方法，包括以下步骤:
步骤⑴.组织采集：无菌条件下用皮肤取样器(皮肤环钻)取耳后直径2-4mm圆形皮肤组织，耳后皮肤组织为完整的皮肤组织,包括表皮、真皮、皮下组织，将其置入含DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养液的培养皿中；组织样本经DMEM(Dulbecco'sModified Eagle Medium)和PBS(Phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)离心清洗后，加入冻存液冷冻保存。
步骤⑵.组织复苏及酶解：冻存皮肤组织经37℃水浴锅中快速解冻后用75％乙醇消毒1-3min；随后用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)和PBS(Phosphate buffersaline，磷酸盐缓冲液)清洗1-3次；清洗后的皮肤组织加入中性裂解酶过夜消化后，去除表皮，用无菌剪刀将真皮组织剪碎0.1-0.5mm小块；
步骤⑶.P0代培养：将步骤⑵中剪碎后的皮肤组织经离心后去除上清，加入含有FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)的成纤维细胞专用培养液，用移液管吹打混匀后移至T25培养瓶内，在含有5％CO2，37℃的培养箱中培养15天，在培养过程中定期换液；
步骤⑷.细胞纯化，传代培养：当步骤⑶中细胞融合度达到90％时，用含有0.25％胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)消化后移至T75培养瓶中培养5天；在培养过程中定期换液，细胞融合度达到95％时，消化收获细胞。此时为P1代细胞。
步骤⑸.传代培养：步骤⑷中细胞融合度达到95％时，用含有0.25％胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)消化后移至T175培养瓶中培养3天；培养过程中定期换液，消化收获细胞，此时为P2代细胞。
步骤(4)(5)中收获细胞时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。收获细胞时通过成纤维细胞专用培养液及限制消化时间来去除上皮细胞及角质细胞，以纯化成纤维细胞。
步骤⑹.传代到自动细胞扩增系统及收获细胞：当步骤⑸中细胞融合度达90％时，收获细胞，将第二代成纤维细胞的2×107个细胞转移到自动细胞扩增系统中，放入自动细胞扩增系统中扩增培养；每天检测自动细胞扩增系统内培养液乳酸值，并计算扩增的理论数值；当细胞数值达理想状态时收获细胞，此为P3代成纤维细胞。
所述自动细胞扩增系统培养过程为：将收获的P2代成纤维细胞通过专用装置转移到自动细胞扩增系统中，该系统为全封闭扩增系统；在5％CO2、37℃条件下进行培养，扩增体系所用培养基同步骤⑶-步骤⑸；在不同时间点抽取培养液检测乳酸值，计算细胞扩增的理论数值，准确的判断系统内细胞的生长情况；当细胞生长处于指数生长期末端时，收获细胞；
本实施例中，在自动细胞扩增系统培养过程中，根据载入的细胞数量，设置参数如下:
b.当细胞数量大于1500万时用25mL/min的进样速度、200mL/min的循环。设置培养液进液速度为0mL/min，逆时针200mL/min循环4min。
收获的第三代成纤维细胞具有典型的成纤维细胞形态，将获得的第三代成纤维细胞放入保存液中混匀，平均分装于冻存管中，将冻存管放入冻存装置内，直接放入-86℃低温冰箱内，次日移入液氮保存罐内；所述冻存装置采用梯度降温程序，平均降温速率为-1℃/分钟。
对第三代成纤维细胞进行活性，纯度，含量、细胞形态、细菌、真菌、支原体污染，内毒素含量等性能的检测，检测结果如下表1：
表1存活率与安全性检测结果表
采用流式细胞仪对自动扩增系统收获的成纤维细胞所表达的表面标记物进行分析,结果显示，该细胞类型对CD73、CD105和CD26均呈阳性，而对HLA-DR呈阴性。纯度达到99％以上，这与纯成纤维细胞群高度吻合。
在4倍显微镜下培养21d时的细胞状态图，其表现出典型成纤维细胞生长形态。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (11)

1.一种利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法，包括以下步骤
(1)组织采集：无菌条件下取耳后皮肤组织，置入含DMEM培养液的培养皿中,组织样本经两次DMEM和磷酸盐缓冲液离心清洗后，加入冻存液，冷冻保存；
(2)组织复苏及酶解：取出冻存组织，经水浴锅中快速解冻后用75％乙醇消毒1-3min；随后用DMEM和磷酸盐缓冲液清洗1-3次；清洗后的皮肤组织加入中性裂解酶过夜消化后，去除表皮，用无菌剪刀将真皮组织剪碎成小块；
(3)原代培养：将步骤⑵中剪碎后的皮肤组织加入的成纤维细胞专用培养液，混匀后移至培养瓶内，在含有5％CO2，37℃的培养箱中培养10-15天；
(4)细胞纯化：当步骤⑶中细胞融合度达到50％-90％时，用含有0.25％胰蛋白酶-EDTA消化后移至培养瓶中培养3-5天，当细胞融合度达到90％以上时，消化收获细胞，此时为第一代细胞；将第一代细胞移至培养瓶中培养2-3天后，消化收获细胞，此时为纯的成纤维第二代细胞；
(5)成纤维细胞扩增培养：将第二代细胞接种到自动细胞扩增体系培养，每天检测自动细胞扩增系统内培养液乳酸值，并用以计算扩增的理论数值,当细胞数值达理想状态时消化收获细胞，此为第三代成纤维细胞。
2.根据权利要求1所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法，其特征在于,步骤(4)中收获细胞时根据细胞形态的变化来判断何时终止消化,当细胞收缩,漂起的时候立即加成纤维细胞专用培养液终止消化。
3.根据权利要求1所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法，其特征在于,步骤(4)中收获细胞时通过成纤维细胞专用培养液及限制消化时间来去除上皮细胞及角质细胞，以纯化成纤维细胞。
4.根据权利要求1所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法,其特征在于步骤(5)所述自动细胞扩增系统培养过程为:将第二代成纤维细胞的1-2×107个细胞转移到自动细胞扩增系统中，在5％CO2、37℃条件下进行培养。
5.根据权利要求1所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法,其特征在于步骤(5)所述自动细胞扩增系统培养过程中，在不同时间点抽取培养液检测乳酸值，计算细胞扩增的理论数值，判断系统内细胞的生长情况；当细胞生长处于指数生长期末端时，消化收获细胞。
6.根据权利要求1所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法,其特征在于步骤(5)所述自动细胞扩增系统培养过程中,根据载入的细胞数量，设置不同的参数:
a.1500万＞细胞上样量＞500万时,设置25mL/min的进样速度、150mL/min循环；
b.当细胞数量大于1500万时,设置25mL/min的进样速度、200mL/min循环。
7.根据权利要求6所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法，其特征在于,
当适用a时,设置培养液进液速度为25mL/min，逆时针20mL/min循环3min；
当适用b时,设置培养液进液速度为0mL/min，逆时针200mL/min循环4min。
8.根据权利要求1所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法,其特征在于:将(5)中获得的成纤维细胞放入保存液中，分装于冻存管中，将冻存管放入冻存装置内，直接放入-86℃低温冰箱内，次日移入液氮保存罐内；所述冻存装置采用梯度降温程序，平均降温速率为-1℃/分钟。
9.根据权利要求1所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法,其特征在于所述的成纤维细胞为第三代细胞，第三代细胞产量为2×108-8×108个，第三代成纤维细胞的纯度≥99％，第三代成纤维细胞的活性≥95％。
10.根据权利要求1所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法,其特征在于步骤(1)中的耳后皮肤组织为完整的皮肤组织,包括表皮、真皮、皮下组织。
11.根据权利要求1所述的利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法,其特征在于还包括成纤维细胞检测的步骤：抽取样本进行细胞计数、细胞活力和安全性检测，安全性检测包括细菌和真菌、支原体、内毒素检测。
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