CN103900883A - 绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法 - Google Patents

绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物组织学技术领域的研究，具体涉及到在透射电镜下观察所用超薄切片的制作及染色方法。一种绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，其主要特点在于包括有步骤为：（1）选取成年绒山羊，从体侧部用剪刀剪取0.8-1.2cm2的皮样；（2）样品的固定：（3）将步骤（2）固定好的皮样用0.1-0.2mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10-15min；（4）置入2%的锇酸2-4℃，固定3-5h；（5）使用0.1-0.2mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10-15min；（6）脱水；（7）包埋：在按1:1纯包埋剂和100%丙酮混合液中第一次浸透3-6h，然后在纯包埋剂中浸透10-12h。本发明的优点是流程简单，操作方便，获得的切片完整，图片结构清晰。适用于实验室科研工作者对绒山羊皮肤形态结构的研究。

Description

绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法
技术领域
本发明涉及动物组织学技术领域蛋白定位的辅助研究，具体涉及到在透射电镜下观察超薄切片的制作及染色方法。
背景技术
山羊绒是绒山羊的主要产品。毛囊是一个形态和结构较为复杂的皮肤附属器官，它控制着毛发的生长。初级毛囊生长粗毛，次级毛囊生长绒。皮肤和毛囊的结构特征不仅是其生物学特性的重要内容，且对毛产量和品质有直接重要的影响。目前运用透射电镜对毛囊进行超微结构的观察是最普遍且最佳的方法，但由于皮肤缺乏实质的组织，角化程度又比较高，相对比较脆，这个在超薄切片过程中会带来很大的挑战。拥有一套最佳的样品处理方法，和对毛囊中不同组织和结构的识别技能，为毛囊组织学的研究提供技术指导和理论依据，对实现人工调控绒生长和加快绒山羊育种进展具有重要意义。
前人研究所用方法基本停留在光镜水平，偶有涉及透射电镜的，也只是对所用方法大概的描述,且步骤较为繁琐。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法。以解决切片完整，没有碎裂，透射电镜下观察结构清晰，细胞器结构完整，用于绒山羊皮肤超微结构的研究。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，其主要特点在于包括有步骤为：
（1）选取成年的绒山羊，从体侧部用剪刀剪取0.8-1.2cm2的皮样；
（2）样品的固定：
①第一次固定：剪取0.8-1.2cm2的皮样，展平在事先准备好的玻璃片上，并置入放有第一次固定液的容器内固定，2-4℃，6-12h；
②第二次固定：从第一次固定好的皮样上采取1-1.2mm3的电镜样，置于2.5-3%的第二次固定液中固定，2-4℃，5-6h；
（3）将步骤（2）固定好的皮样用0.1-0.2mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10-15min；
（4）置入2%的锇酸2-4℃，固定3-5h；
（5）使用0.1-0.2mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10-15min；
（6）脱水：使用50%-100%酒精，脱水4-6次，每次10min-15min；使用100%丙酮脱水10-15min；然后再次使用100%丙酮脱水10-15min；
（7）包埋：在按1:1纯包埋剂和100%丙酮混合液中第一次浸透3-6h，然后在纯包埋剂中浸透10-12h。
所述的绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，还包括步骤为：
（8）染色：第一次使用5%醋酸铀乙醇溶液30-40min染色，然后第二次使用铅5-10min染色。
所使用的5%醋酸铀乙醇溶液的配方：醋酸铀5克；70%乙醇溶液100ml。
所使用的铅配方：硝酸铅2.0克；醋酸铅1.0克；枸橼酸钠3.5克；4%NaOH水溶液18ML；双蒸水定容至100ML。
所述的绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，所述的第一次固定液为3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀释液为0.2mol/L的磷酸缓冲液，PH为7.2；第二次固定液为0.2M磷酸缓冲液50ml，25%戊二醛12ml，蔗糖8g，超纯水定容至100ml。
所述的绒山羊皮肤用于电镜观察的超薄切片的制备方法，所述的包埋剂为20ML，其中MNA（甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐）7ml，SPI-PON812（环氧树脂812）9.12ml，DDSA（十二烷基琥珀酸酐）6.17ml，DMP-30（2,4,6-三【（二甲氨基）甲基】苯酚）0.3ml。
本发明的有益效果：本发明流程简单，操作方便，获得的切片完整，图片结构清晰。适用于实验室科研工作者对绒山羊皮肤形态结构的研究。
在透射电镜下进行观察，本发明能够清晰的呈现毛囊的各层超微结构，且在切片过程中不容易发生碎片现象。
附图说明：
图1是绒山羊皮肤毛囊完整的横切超微结构显微图；
图2是绒山羊皮肤毛囊外根鞘（ORS）和内根鞘（IRS）超微结构显微图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：一种绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，包括有步骤为：
（1）选取成年的绒山羊，从体侧部用剪刀剪取0.8cm2的皮样；
（2）样品的固定：
①第一次固定：剪取0.8cm2的皮样，展平在事先准备好的玻璃片上，并置入放有第一次固定液的容器内固定，2℃，6h；
②第二次固定：从第一次固定好的皮样上采取1mm3的电镜样，置于2.5%的第二次固定液中固定，2℃，5h；
所述的第一次固定液为3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀释液为0.2mol/L的磷酸缓冲液，PH为7.2；第二次固定液为0.2M磷酸缓冲液50ml，25%戊二醛12ml，蔗糖8g，超纯水定容至100ml。
（3）将步骤（2）固定好的皮样用0.1mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10min；
（4）置入2%的锇酸2℃，固定3h；
（5）使用0.1mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10min；
（6）脱水：使用50%-100%酒精，脱水4次，每次10min-15min；使用100%丙酮脱水10min；然后再次使用100%丙酮脱水10min；
（7）包埋：在按1:1纯包埋剂和100%丙酮混合液中第一次浸透3h，然后在纯包埋剂中浸透10h。
所述的包埋剂为20ML，其中MNA（甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐）7ml，SPI-PON812（环氧树脂812）9.12ml，DDSA（十二烷基琥珀酸酐）6.17ml，DMP-30（2,4,6-三【（二甲氨基）甲基】苯酚）0.3ml。
实施例2：一种绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，包括有步骤为：
（1）选取成年的绒山羊，从体侧部用剪刀剪取1.2cm2的皮样；
（2）样品的固定：
①第一次固定：剪取1.2cm2的皮样，展平在事先准备好的玻璃片上，并置入放有第一次固定液的容器内固定，4℃，12h；
②第二次固定：从第一次固定好的皮样上采取1.2mm3的电镜样，置于3%的第二次固定液中固定，4℃，6h；
所述的第一次固定液为3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀释液为0.2mol/L的磷酸缓冲液，PH为7.2；第二次固定液为0.2M磷酸缓冲液50ml，25%戊二醛12ml，蔗糖8g，超纯水定容至100ml。
（3）将步骤（2）固定好的皮样用0.2mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min；
（4）置入2%的锇酸4℃，固定5h；
（5）使用0.2mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min；
（6）脱水：使用50%-100%酒精，脱水6次，每次10min-15min；使用100%丙酮脱水15min；然后再次使用100%丙酮脱水15min；
（7）包埋：在按1:1纯包埋剂和100%丙酮混合液中第一次浸透6h，然后在纯包埋剂中浸透12h。
所述的包埋剂为20ML，其中MNA（甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐）7ml，SPI-PON812（环氧树脂812）9.12ml，DDSA（十二烷基琥珀酸酐）6.17ml，DMP-30（2,4,6-三【（二甲氨基）甲基】苯酚）0.3ml。
实施例3：所述的绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，还包括步骤为：
步骤（1）至步骤（7）与实施例1或实施例2相同。
（8）染色：第一次使用5%醋酸铀乙醇溶液30min染色，然后第二次使用铅5min染色。
所使用的5%醋酸铀乙醇溶液的配方：醋酸铀5克；70%乙醇溶液100ml。
所使用的铅配方：硝酸铅2.0克；醋酸铅1.0克；枸橼酸钠3.5克；4%NaOH水溶液18ML；双蒸水定容至100ML。
实施例4：所述的绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，还包括步骤为：
步骤（1）至步骤（7）与实施例1或实施例2相同。
（8）染色：第一次使用5%醋酸铀乙醇溶液40min染色，然后第二次使用铅10min染色。
所使用的5%醋酸铀乙醇溶液的配方：醋酸铀5克；70%乙醇溶液100ml。
所使用的铅配方：硝酸铅2.0克；醋酸铅1.0克；枸橼酸钠3.5克；4%NaOH水溶液18ML；双蒸水定容至100ML。
实验例1：一种河西绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法
1材料与方法
1.1样品采集
实验材料来自甘肃省天祝县牧户羊群，选取周岁的河西绒山羊6只，连续在一年中每个月的月初从体侧部用剪刀剪取约1cm2的皮样。皮肤切口处撒上青霉素或链霉素即可自愈。
1.2样品的固定
①第一次固定
采取的1cm2的皮样先快速的展平在事先准备好的玻璃片上，放入放有固定液（3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀释液为0.2mol/L的磷酸缓冲液，PH为7.2）的容器内，4℃，12h。
②第二次固定：从第一次固定好的皮样上采取约1mm3的电镜样，固定于3%的戊二醛，4℃，5h。
3%戊二醛固定液配方（100ml为例）：
Figure BDA0000489395950000051
1.3样品的制备
按照皮肤样品特有的性质设计的方法。流程如下：
①固定好的电镜样用0.2mol/L的磷酸缓冲液（PBS）漂洗3次（每次10min）。
②2%的锇酸4℃固定3h。
③PBS漂洗3次（每次10min）。
④脱水：依次进行：
Figure BDA0000489395950000052
Figure BDA0000489395950000061
1.4样品包埋：常规包埋
纯包埋剂和100丙酮混合液（1:1）             3h
纯包埋剂                                  12h
包埋剂的配制（20ML为例）
Figure BDA0000489395950000062
所使用的5%醋酸铀乙醇溶液的配方：醋酸铀5克；70%乙醇溶液100ml。
所使用的铅配方：硝酸铅2.0克；醋酸铅1.0克；枸橼酸钠3.5克；4%NaOH水溶液18ML；双蒸水定容至100ML。
在透射电镜下进行观察，发现该方法能够清晰的呈现毛囊的各层超微结构，且在切片过程中不容易发生碎片现象。本试验例制备的河西绒山羊皮肤薄片电镜观察的结果见图1、图2。
图1为河西绒山羊皮肤毛囊完整的横切超微结构图片。
图2为河西绒山羊皮肤毛囊外根鞘（ORS）和内根鞘（IRS）超微结构图片。
上述两个切片均符合实验要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，其特征在于包括有步骤为：
（1）选取成年的绒山羊，从体侧部用剪刀剪取0.8-1.2cm2的皮样；
（2）样品的固定：
①第一次固定：剪取0.8-1.2cm2的皮样，展平在事先准备好的玻璃片上，并置入放有第一次固定液的容器内固定，2-4℃，6-12h；
②第二次固定：从第一次固定好的皮样上采取1-1.2mm3的电镜样，置于2.5-3%的第二次固定液中固定，2-4℃，5-6h；
（3）将步骤（2）固定好的皮样用0.1-0.2mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10-15min；
（4）置入2%的锇酸2-4℃，固定3-5h；
（5）使用0.1-0.2mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10-15min；
（6）脱水：使用50%-100%酒精，脱水4-6次，每次10min-15min；使用100%丙酮脱水10-15min；然后再次使用100%丙酮脱水10-15min；
（7）包埋：在按1:1纯包埋剂和100%丙酮混合液中第一次浸透3-6h，然后在纯包埋剂中浸透10-12h。
2.如权利要求1所述的绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，其特征在于还包括步骤为：
（8）染色：第一次使用5%醋酸铀乙醇溶液30-40min染色，然后第二次使用铅5-10min染色；
所使用的5%醋酸铀乙醇溶液的配方：醋酸铀5克；70%乙醇溶液100ml；
所使用的铅配方：硝酸铅2.0克；醋酸铅1.0克；枸橼酸钠3.5克；4%NaOH水溶液18ML；双蒸水定容至100ML。
3.如权利要求1所述的绒山羊皮肤用于透射电镜观察的超薄切片的制备方法，其特征在于所述的第一次固定液为3.7%的多聚甲醛和1%的戊二醛1:1的混合液，稀释液为0.2mol/L的磷酸缓冲液，PH为7.2；第二次固定液为0.2M磷酸缓冲液50ml，25%戊二醛12ml，蔗糖8g，超纯水定容至100ml。
4.如权利要求1所述的绒山羊皮肤用于电镜观察的超薄切片的制备方法，其特征在于所述的包埋剂为20ML，其中MNA7ml，SPI-PON8129.12ml，DDSA6.17ml，DMP-300.3ml。
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