CN104977202A

CN104977202A - 一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法

Info

Publication number: CN104977202A
Application number: CN201510479144.4A
Authority: CN
Inventors: 黄远洁; 莫肖敏; 孟春梅; 成晓静; 李卫东; 郑华
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2015-08-07
Filing date: 2015-08-07
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2035-08-07
Also published as: CN104977202B

Abstract

本发明公开了一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，步骤包括：1)调控实验室温度至22～30℃，湿度≤45％；2)提供带有石蜡包埋切片组织的载玻片；3)各种纯包埋剂的配制；4)EP管隔离圈的制备；5)顶扣包埋用EP管或预制包埋块的制备；6)脱蜡和水化；7)放置EP管隔离圈；8)固定和漂洗；9)脱水和浸透；10)顶扣包埋；11)聚合；12)剥离；13)修块、切片、染色及电镜观测采图。本发明的有益效果：本发明在节约试剂、减少试剂挥发所致误差的同时，使得最后得到的样品能完整剥离载玻片，方便了对石蜡包埋切片组织超微结构的进一步观察和研究。

Description

一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法

技术领域

本发明属于实验样品处理技术领域，涉及一种石蜡包埋切片组织的样品制备方法，尤其涉及一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法。

背景技术

石蜡包埋切片技术是生物医学研究领域中的重要手段，尤其是在临床病理诊断中具有重要作用。通过对石蜡包埋组织进行切片染色，可以观测到组织中的形态学变化，进而协助疾病的诊断，明确病因。

一般石蜡包埋组织切片厚度多为2～5μm，切片后通过捞片平铺于载玻片上用于进一步的HE染色或者进行免疫组织化学染色等，利用不同结构呈现不同的颜色以便于协助观察和判断组织的形态结构变化。

一些穿刺组织或者是体积微小的石蜡包埋组织，进行组织切片能得到的切片数量有限，尤其某些特殊的微小结构进行切片后可能仅能在一张或者数张切片上呈现，当需要进行多项检测时，往往由于切片数量不足而难以进行，因此，常常在不影响原有结果的前提下，对切片进行二次检测。

石蜡包埋组织切片上的组织较好地贴合在载玻片上才能顺利进行染色，而用于进一步免疫组织化学染色的切片由于需要进行多步的漂洗及高温处理等，更需要组织能紧密地贴合在载玻片上以防止在操作过程中组织脱落而导致实验失败，因此常常使用表面做过特殊处理(一般为多聚赖氨酸处理)的载玻片进行捞片平铺使得切片组织更好地贴合而不易脱落，但这一特点也使得当需要截取载玻片上的组织做进一步研究时，完好地获得组织的难度大大增加。

穿刺组织和体积微小的组织，当需要对切片上局部稀少的更为复杂和精细的组织细胞内部结构做进一步研究，借助透射电子显微镜能观察到特定的组织细胞的微观结构，正是越来越多相关研究者的需求。但是切片较薄及贴合紧密的特点使得当需要对切片上的特定的部位进行透射电镜检测时，难以通过简单的刮取将组织刮下，而强行刮取载玻片上的组织常常会破坏组织的原有结构，难以定位到待检测结构，甚至使待检测结构丢失。

对载玻片上微小的特定组织结构进行顶扣包埋，能充分利用已有的组织做进一步的透射电镜检测，尤其对于仅有的稀少组织的超微结构检测具有重要的意义。石蜡包埋组织透射电镜制样的脱蜡、固定、脱水、浸透和包埋等操作涉及到多种有毒性及挥发性液体如二甲苯、戊二醛、锇酸、丙酮等，在面积较大的载玻片上进行开放操作不仅会因液体挥发导致浓度改变进而影响样品的脱蜡、固定、脱水、浸透和包埋的效果，毒性挥发性试剂的大量使用还会对环境和健康造成影响。在对载玻片上的石蜡包埋切片组织进行顶扣包埋时，也存在包埋面过大导致含有待检测组织结构的包埋块无法完整地剥离载玻片的问题。因此，我们对常规透射电镜制样技术进行了改进，以使得石蜡包埋切片组织超微结构得到更好的呈现，解决了载玻片上的石蜡包埋切片组织在透射电镜制样过程中固定、包埋和截取时所出现的问题。同时也对解决该技术在应用于其他研究领域时所出现的类似问题提供一定的参考。

发明内容

本发明针对现有技术中的缺陷，提供一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，按以下步骤操作：

1.调控实验室温度至22～30℃，湿度≤45％；

2.提供带有石蜡包埋切片组织的载玻片，载玻片正面有待取样区域的石蜡包埋切片组织，待取样区域内包含待检测的组织，利用倒置显微镜对待取样检测的组织进行初步定位；

3.各种纯包埋剂的配制(所用化学试剂均为分析纯)：

1)618包埋剂的配制：按重量份数分别将12份618、8份DDSA、1份DBP、0.5份DMP-30逐样加入量杯中，充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置-20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基琥珀酸酐，DBP为邻苯二甲酸二丁酯，DMP-30为2-4-6-三-(二甲胺基甲基)苯酚；618包埋剂以下简称第一包埋剂；

2)SPI－Pon^TM 812包埋剂的配制：将按重量份数分别将10份SPI–Pon812、2.2份DDSA、8份NMA和0.3份DMP–30逐样加入量杯中,充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置-20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基琥珀酸酐，NMA为甲基纳迪克酸酐，DMP-30为2-4-6-三-(二甲胺基甲基)苯酚；SPI－Pon^TM 812包埋剂以下简称第二包埋剂；

3)Spurr(4221)包埋剂的配制：按重量份数分别将10份ERL 4221、5份DER 736、26份NSA和0.3份DMAE逐样加入量杯中，充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置-20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中ERL 4221为环氧树脂，DER 736为聚乙二醇环氧树脂，NSA为壬烯基琥珀酸酐，DMAE为二甲乙醇胺；Spurr(4221)包埋剂以下简称第三包埋剂；

4.EP管隔离圈的制备：将EP管剪除管盖，截取管口及其下长度为1～2mm的完整一圈管作为隔离圈备用，所述EP管为锥形eppendorf离心管；

5.顶扣包埋用EP管或预制包埋块的制备：

1)顶扣包埋用EP管的制备：将上步骤制备EP管隔离圈余下的EP管继续往下截除小段，直至剩余的管能套入EP管隔离圈，并将EP管底部尖端截除，最后剩余的管作为顶扣包埋用EP管备用，切下的EP管底部尖端备用于最后密闭顶扣包埋用EP管；

2)预制包埋块的制备：将配置好的第一包埋剂、第二包埋剂和第三包埋剂分别滴加入EP管中，将滴满包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合以得到包埋块，其中滴满纯包埋剂为第一包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为35℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第二包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为37℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第三包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为70℃、8～16h；聚合完成后取出EP管中的包埋块备用；

6.脱蜡和水化：将步骤2的载玻片放置于50mL离心管或50mL玻璃立缸，加入100％的二甲苯，使载玻片上的石蜡包埋组织全部浸没于二甲苯中，密闭离心管或玻璃立缸后放于烘箱中60℃进行脱蜡3次，每次5～20min，再依次用体积浓度为100％、95％、90％、80％、70％和50％的乙醇溶液进行水化处理，每种浓度处理1～10s，最后用双蒸水处理1～10s；

7.放置EP管隔离圈：将步骤6脱蜡和水化后的载玻片，在倒置显微镜的帮助下用标记笔于载玻片背面将组织待取样区域圈定，根据圈定的载玻片标记范围，于载玻片正面围绕待取样区域将组织的周边擦干，用镊子夹取步骤4的EP管隔离圈粘合于圈定的待取样区域上；

8.固定和漂洗：于步骤7的载玻片上的EP管隔离圈内滴加前固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行前固定10～60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5～20min，再滴加后固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行后固定10～60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5～20min，得到固定和漂洗后的样品；所述前固定液是质量浓度为3％的戊二醛、所述后固定液是质量浓度为1％的锇酸、所述PBS缓冲液是0.1mol/L pH7.4的磷酸钠缓冲液；

9.脱水和浸透：对上步骤固定和漂洗后的样品依次用4℃体积浓度为50％、70％、80％、90％的乙醇溶液进行处理，每次5～20min，接着用4℃体积比为1∶1的90％乙醇溶液和90％的丙酮溶液混合液对样品进行处理5～20min，然后用4℃体积浓度为90％的丙酮溶液处理5～20min，再用100％丙酮溶液处理3次，每次5～10min，再分别用100％丙酮和纯包埋剂体积比为2∶1、1∶1、1∶2的混合液对样品进行梯度浸透，依次于37℃处理样品30min，吸除丙酮和包埋剂的混合液后，用纯包埋剂于37℃处理样品12h；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种。

10.顶扣包埋：

1)顶扣包埋用EP管顶扣包埋：将上步骤脱水和浸透后的样品上的包埋剂吸净，将步骤5所述的顶扣包埋用EP管倒置套入步骤4所述的EP管隔离圈内，滴加步骤9所用的纯包埋剂至倒置的顶扣包埋用EP管内；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；

2)预制包埋块顶扣包埋：滴加一滴步骤9所用的纯包埋剂至载玻片上EP管隔离圈内的待取样区域，将提前聚合好的预制包埋块套入EP管隔离圈内，轻轻按压贴合；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；

11.聚合：将上步骤完成顶扣包埋的样品放入烘箱中加热使包埋剂聚合，其中纯包埋剂为第一包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为35℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；纯包埋剂为第二包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为37℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；纯包埋剂为第三包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为70℃、8～16h；

12.剥离：将上步骤完成聚合的样品取出，掰下包埋块，所得包埋块即为石蜡包埋切片组织的透射电镜包埋块。

13.修块、切片、染色及电镜观测采图：将上步骤剥离下的石蜡包埋切片组织的透射电镜包埋块用修块仪和刀片修整，保留从载玻片剥离下的组织区域，在超薄切片机中定位、切片，获得待检测区域70～90nm厚的超薄切片。切片经过质量浓度为1～2％的醋酸双氧铀溶液及质量浓度为1～2％的柠檬酸铅溶液分别染色15～30min、5～10min后，在H-7650透射电镜中进行观测采图，所得图片即为石蜡包埋切片组织的透射电镜图片。

上述步骤5.2)中，滴加纯包埋剂入EP管中至包埋剂液面稍高于EP管管口并形成半圆鼓起于EP管口，避免气泡的产生。

上述步骤5.2)中，滴满纯包埋剂为第一包埋剂或第二包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时无需封闭EP管管口；滴满纯包埋剂为第三包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时封闭EP管管口。

上述步骤7中，用镊子夹取EP管隔离圈，管口面均匀涂抹502胶水或粘贴双面胶后迅速放置于标记笔圈定的待取样区上，轻轻按压使隔离圈紧密粘于载玻片上。

上述步骤10.1)中，将样品标签紧贴管壁放入顶扣包埋用EP管，并将顶扣包埋用EP管倒置轻轻套入粘于载玻片上的EP管隔离圈内，由EP管去底的切口处分别滴加纯包埋剂，直至包埋剂加满至切口边缘，其中包埋所用的顶扣包埋用EP管与配对使用的EP管隔离圈为同种EP管制备而成。

上述步骤10.1)中，所使用的纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种，其中，纯包埋剂为第一包埋剂或第二包埋剂的样品无需封闭顶扣包埋用EP管管底的切口；纯包埋剂为第三包埋剂的样品需使用502胶水粘合将留存的配对的EP管管底尖端对顶扣包埋用EP管管底的切口进行密闭。

上述步骤10.2)中，滴加一滴纯包埋剂至载玻片上EP管包埋隔离圈内，滴加的一滴纯包埋剂与预制包埋块所使用的纯包埋剂一致，预制包埋块所用的EP管与制备配对使用的EP管隔离圈的EP管为同种EP管。

上述步骤12中，将样品取出冷却至室温后，载玻片正面朝上放置于60℃烤片台上烤5～30s或者用酒精灯火焰于载玻片背面顶扣包埋部位烧灼5～30s，掰下包埋块，于显微镜下核实包埋块的包埋面是否截取得到了待取样区域，待取样组织是否已经剥离载玻片，并检查载玻片上是否残留有待取样组织。

本发明的优点或有益效果：

1.本发明通过使用倒置显微镜和EP管隔离圈，能尽量准确地定位圈定石蜡包埋切片组织的待取样区域。通过使用EP管隔离圈，尽量避免了因载玻片大面积开放操作，试剂易挥发导致浓度变化影响实验结果的情况，还可节约毒性挥发性试剂的使用量，减少对环境和健康的影响。

2.本发明对样品前后固定、漂洗和梯度乙醇溶液脱水采用低温进行，尽量减少了样品成分在处理过程中的降解和变形，有利于组织细胞结构的保存。进行顶扣包埋时，通过使用EP管隔离圈，能使包埋剂形成小而规整的包埋面，解决了包埋剂易渗漏产生过大的包埋面导致组织难以剥离载玻片的问题；通过使用预制的包埋块倒扣入EP管隔离圈内进行顶扣包埋可以使原紧密贴合于载玻片上的待检测组织较完整剥离；而使用顶扣包埋用EP管进行顶扣包埋，经EP管底部切口滴加包埋剂，一体成型聚合完成包埋并截取待取样组织，可以使原紧密贴合于载玻片上的待取样组织较完整剥离载玻片，大大改善了使用提前制备的包埋块加少量包埋剂顶扣包埋聚合所致的预制包埋块部分与待检测组织包埋块部分分离断裂的情况，有利于样品的后续切片。

3.本发明解决了在对石蜡包埋切片组织进行透射电镜样品制备过程中，载玻片面积大开放操作试剂使用量大、毒性挥发性试剂容易挥发导致浓度变化影响实验结果、样品难以固定和包埋、样品难以从载玻片上完整截取、样品包埋块不方便后续切片的问题。

4.本发明使最后得到的样品比较完整，样品破损、丢失现象大大减少，样品切片内部亚细胞结构清晰可现，使用顶扣包埋用EP管包埋的样品在剥离载玻片时无包埋块断裂情况，组织结构缺损丢失少，切片得到的细胞结构特别完整清晰。

附图说明

图1为实施例中肾穿刺石蜡包埋切片组织的定位处理例示。

图2为实施例中肾穿刺石蜡包埋切片组织包埋聚合例示。

图3为实施例中所得肾穿刺石蜡包埋切片组织的透射电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

EP管隔离圈的制备：截取EP管管口及其下方完整一圈管作为隔离圈备用。

具体操作如下：截取0.5mL锥形EP管管口及其下方长度为1mm的完整一圈管，获得EP管隔离圈。

实施例2

顶扣包埋用EP管的制备：将制备EP管隔离圈后的EP管继续往下截除完整一圈管壁，并将EP管底部尖端截除，剩余的管作为顶扣包埋用EP管备用，切下的EP管底部尖端备用于最后密闭顶扣包埋用EP管。

具体操作如下：将0.5mL锥形EP管管口及其下方长度为1mm的完整一圈管截除后，继续往下截除完整一圈管壁，直至剩余的管恰好能套入0.5mL锥形EP管所制备的EP管隔离圈内，将EP管底部的尖端截除，最后获得顶扣包埋用EP管，切下的EP管底部尖端备用于最后密闭顶扣包埋用EP管。

实施例3

一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，依次由下述步骤组成，

1.调控实验室温度至26℃，湿度45％；

2.提供带有肾穿刺石蜡包埋切片组织的载玻片，载玻片正面有待取样区域的肾穿刺石蜡包埋切片组织，待取样区域内包含待检测的肾穿刺组织，利用倒置显微镜对待取样检测的肾穿刺组织进行初步定位；

3.各种纯包埋剂的配制(所用化学试剂均为分析纯)：

1)618包埋剂的配制：按重量份数分别将12份618、8份DDSA、1份DBP、0.5份DMP-30逐样加入量杯中，充分搅拌60min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基琥珀酸酐，DBP为邻苯二甲酸二丁酯，DMP-30为2-4-6-三-(二甲胺基甲基)苯酚；618包埋剂以下简称第一包埋剂；

2)SPI－Pon^TM 812包埋剂的配制：按重量份数分别将10份SPI–Pon812、2.2份DDSA、8份NMA和0.3份DMP–30逐样加入量杯中,充分搅拌60min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基琥珀酸酐，NMA为甲基纳迪克酸酐，DMP-30为2-4-6-三-(二甲胺基甲基)苯酚；SPI－Pon^TM812包埋剂以下简称第二包埋剂；

3)Spurr(4221)包埋剂的配制：按重量份数分别将10份ERL 4221、5份DER 736、26份NSA和0.3份DMAE逐样加入量杯中，充分搅拌60min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，其中ERL 4221为环氧树脂，DER 736为聚乙二醇环氧树脂，NSA为壬烯基琥珀酸酐，DMAE为二甲乙醇胺；Spurr(4221)包埋剂以下简称第三包埋剂；

4.EP管隔离圈的制备：将EP管剪除管盖，截取管口及其下长度为1mm的完整一圈管作为隔离圈备用，所述EP管为0.5mL锥形eppendorf离心管；

5.顶扣包埋用EP管或预制包埋块的制备：

2)预制包埋块的制备：将配置好的第一包埋剂、第二包埋剂和第三包埋剂分别滴加入EP管中，将滴满包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合，其中滴满纯包埋剂为第一包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为35℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第二包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为37℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第三包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为70℃、10h；聚合完成后取出EP管中的包埋块备用；

6.脱蜡和水化：将步骤2的载玻片放置于50mL离心管，加入100％的二甲苯，使载玻片上的石蜡包埋组织全部浸没于二甲苯中，密闭离心管后放于烘箱中60℃进行脱蜡3次，每次10min，再依次用体积浓度为100％、95％、90％、80％、70％和50％的乙醇溶液进行水化处理，每种浓度处理5s，最后用双蒸水处理5s；

7.放置EP管隔离圈：将步骤6脱蜡和水化后的载玻片，在倒置显微镜的帮助下用标记笔于载玻片背面将肾穿刺组织待取样区域圈定，根据圈定的载玻片标记范围，于载玻片正面围绕待取样区域将肾穿刺组织的周边擦干，用镊子夹取步骤4的EP管隔离圈粘合于圈定的待取样区域上(见附图1)；

8.固定和漂洗：于步骤7的载玻片上的EP管隔离圈内滴加前固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行前固定30min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，再滴加后固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行后固定30min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，得到固定和漂洗后的样品；所述前固定液是质量浓度为3％的戊二醛、所述后固定液是质量浓度为1％的锇酸、所述PBS缓冲液是0.1mol/L pH7.4的磷酸钠缓冲液；

9.脱水和浸透：对上步骤固定和漂洗后的样品依次用4℃体积浓度为50％、70％、80％、90％的乙醇溶液进行处理，每次10min，接着用4℃体积比为1∶1的90％乙醇溶液和90％的丙酮溶液混合液对样品进行处理10min，然后用4℃体积浓度为90％的丙酮溶液处理10min，再用100％丙酮溶液处理3次，每次10min，再分别用100％丙酮和纯包埋剂体积比为2∶1、1∶1、1∶2的混合液对样品进行梯度浸透，依次于37℃处理样品30min，吸除丙酮和包埋剂的混合液后，用纯包埋剂于37℃处理样品12h；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；

10.顶扣包埋：

1)顶扣包埋用EP管顶扣包埋：将上步骤脱水和浸透后的样品上的包埋剂吸净，将步骤5所述的顶扣包埋用EP管倒置套入步骤4所述的EP管隔离圈内(见附图1)，滴加步骤9所用的纯包埋剂至倒置的顶扣包埋用EP管内；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；

11.聚合：将上步骤完成顶扣包埋的样品放入烘箱中加热使包埋剂聚合，其中纯包埋剂为第一包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为35℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；纯包埋剂为第二包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为37℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；纯包埋剂为第三包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为70℃、10h；

12.剥离：将上步骤完成聚合的样品取出(见附图2)，掰下包埋块，所得包埋块即为石蜡包埋切片组织的透射电镜包埋块；

13.修块、切片、染色及电镜观测采图：将上步骤剥离下的石蜡包埋切片组织的透射电镜包埋块用修块仪和刀片修整，保留从载玻片剥离下的肾穿刺组织区域，在超薄切片机中定位、切片，获得肾穿刺组织待检测区域70nm厚的超薄切片。切片经过质量浓度为1％的醋酸双氧铀溶液及质量浓度为1％的柠檬酸铅溶液分别染色20min、10min后，在H-7650透射电镜中进行观测采图，所得图片即为肾穿刺石蜡包埋切片组织的透射电镜图片(见附图3)。

上述步骤7中，用镊子夹取EP管隔离圈，管口面均匀涂抹502胶水后迅速放置于标记笔圈定的待取样区上，轻轻按压使隔离圈紧密粘于载玻片上。

上述步骤10.1)中，将样品标签紧贴管壁放入顶扣包埋用EP管，并将顶扣包埋用EP管倒置轻轻套入粘于载玻片上的EP管隔离圈内，由EP管去底的切口处分别滴加纯包埋剂，直至包埋剂加满至切口边缘，其中包埋所用的顶扣包埋用EP管与配对使用的EP管隔离圈为同种0.5mL的锥形EP管制备而成。

上述步骤10.2)中，滴加的一滴纯包埋剂与预制包埋块所使用的纯包埋剂一致，预制包埋块所用的EP管与制备配对使用的EP管隔离圈的EP管为同种0.5mL的锥形EP管。

上述步骤12中，将样品取出冷却至室温后，用酒精灯火焰于载玻片背面顶扣包埋部位烧灼20s，掰下包埋块，于显微镜下核实包埋块的包埋面是否截取得到了肾穿刺组织待取样区域，肾穿刺待取样组织是否已经剥离载玻片，并检查载玻片上是否残留有待取样肾穿刺组织。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims

1.一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：依次由下述步骤组成，

1)调控实验室温度至22～30℃，湿度≤45％；

2)提供带有石蜡包埋切片组织的载玻片，载玻片正面有待取样区域的石蜡包埋切片组织，待取样区域内包含待检测的组织，利用倒置显微镜对待取样检测的组织进行初步定位；

3)各种纯包埋剂的配制(所用化学试剂均为分析纯)：

(1)618包埋剂的配制：按重量份数分别将12份618、8份DDSA、1份DBP、0.5份DMP-30逐样加入量杯中，充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置-20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基琥珀酸酐，DBP为邻苯二甲酸二丁酯，DMP-30为2-4-6-三-(二甲胺基甲基)苯酚；618包埋剂以下简称第一包埋剂；

(2)SPI－Pon^TM 812包埋剂的配制：将按重量份数分别将10份SPI–Pon 812、2.2份DDSA、8份NMA和0.3份DMP–30逐样加入量杯中,充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置-20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基琥珀酸酐，NMA为甲基纳迪克酸酐，DMP-30为2-4-6-三-(二甲胺基甲基)苯酚；SPI－Pon^TM 812包埋剂以下简称第二包埋剂；

(3)Spurr(4221)包埋剂的配制：按重量份数分别将10份ERL 4221、5份DER 736、26份NSA和0.3份DMAE逐样加入量杯中，充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置-20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中ERL 4221为环氧树脂，DER 736为聚乙二醇环氧树脂，NSA为壬烯基琥珀酸酐，DMAE为二甲乙醇胺；Spurr(4221)包埋剂以下简称第三包埋剂；

4)EP管隔离圈的制备：将EP管剪除管盖，截取管口及其下方长度为1～2mm的完整一圈管作为隔离圈备用；所述EP管为锥形eppendorf离心管；

5)顶扣包埋用EP管或预制包埋块的制备：

(1)顶扣包埋用EP管的制备：将上步骤制备EP管隔离圈余下的EP管继续往下截除小段，直至剩余的管能套入EP管隔离圈，并将EP管底部尖端截除，最后剩余的管作为顶扣包埋用EP管备用，切下的EP管底部尖端备用于最后密闭顶扣包埋用EP管；

(2)预制包埋块的制备：将配置好的第一包埋剂、第二包埋剂和第三包埋剂分别滴加入EP管中，将滴满包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合以得到包埋块，其中滴满纯包埋剂为第一包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为35℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第二包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为37℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第三包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为70℃、8～16h；聚合完成后取出EP管中的包埋块备用；

6)脱蜡和水化：将步骤2的载玻片放置于50mL离心管或50mL玻璃立缸，加入100％的二甲苯，使载玻片上的石蜡包埋组织全部浸没于二甲苯中，密闭离心管或玻璃立缸后放于烘箱中60℃进行脱蜡3次，每次5～20min，再依次用体积浓度为100％、95％、90％、80％、70％和50％的乙醇溶液进行水化处理，每种浓度处理1～10s，最后用双蒸水处理1～10s；

7)放置EP管隔离圈：将步骤6脱蜡和水化后的载玻片，在倒置显微镜的帮助下用标记笔于载玻片背面将组织待取样区域圈定，根据圈定的载玻片标记范围，于载玻片正面围绕待取样区域将组织的周边擦干，用镊子夹取步骤4的EP管隔离圈粘合于圈定的待取样区域上；

8)固定和漂洗：于步骤7的载玻片上的EP管隔离圈内滴加前固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行前固定10～60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5～20min，再滴加后固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行后固定10～60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5～20min，得到固定和漂洗后的样品；所述前固定液是质量浓度为3％的戊二醛、所述后固定液是质量浓度为1％的锇酸、所述PBS缓冲液是0.1mol/L pH7.4的磷酸钠缓冲液；

9)脱水和浸透：对上步骤固定和漂洗后的样品依次用4℃体积浓度为50％、70％、80％、90％的乙醇溶液进行处理，每次5～20min，接着用4℃体积比为1∶1的90％乙醇溶液和90％的丙酮溶液混合液对样品进行处理5～20min，然后用4℃体积浓度为90％的丙酮溶液处理5～20min，再用100％丙酮溶液处理3次，每次5～10min，再分别用100％丙酮和纯包埋剂体积比为2∶1、1∶1、1∶2的混合液对样品进行梯度浸透，依次于37℃处理样品30min，吸除丙酮和包埋剂的混合液后，用纯包埋剂于37℃处理样品12h；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；

10)顶扣包埋：

(1)顶扣包埋用EP管顶扣包埋：将上步骤脱水和浸透后的样品上的包埋剂吸净，将步骤5)所述的顶扣包埋用EP管倒置套入步骤4)所述的EP管隔离圈内，滴加步骤9)所用的纯包埋剂至倒置的顶扣包埋用EP管内；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；

(2)预制包埋块顶扣包埋：滴加一滴步骤9)所用的纯包埋剂至载玻片上EP管隔离圈内的待取样区域，将提前聚合好的预制包埋块套入EP管隔离圈内，轻轻按压贴合；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；

11)聚合：将上步骤完成顶扣包埋的样品放入烘箱中加热使包埋剂聚合，其中纯包埋剂为第一包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为35℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；纯包埋剂为第二包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为37℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；纯包埋剂为第三包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为70℃、8～16h；

12)剥离：将上步骤完成聚合的样品取出，掰下包埋块，所得包埋块即为石蜡包埋切片组织的透射电镜包埋块；

13)修块、切片、染色及电镜观测采图：将上步骤剥离下的石蜡包埋切片组织的透射电镜包埋块用修块仪和刀片修整，保留从载玻片剥离下的组织区域，在超薄切片机中定位、切片，获得待检测区域70～90nm厚的超薄切片。切片经过质量浓度为1～2％的醋酸双氧铀溶液及质量浓度为1～2％的柠檬酸铅溶液分别染色15～30min、5～10min后，在H-7650透射电镜中进行观测采图，所得图片即为石蜡包埋切片组织的透射电镜图片。

2.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述步骤5)(2)中滴加纯包埋剂入EP管中至包埋剂液面稍高于EP管管口并形成半圆鼓起于EP管口，避免气泡的产生。

3.根据权利要求2所述的一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述步骤5)(2)中滴满纯包埋剂为第一包埋剂或第二包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时无需封闭EP管管口；滴满纯包埋剂为第三包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时封闭EP管管口。

4.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述步骤7)中，用镊子夹取EP管隔离圈，管口面均匀涂抹502胶水或粘贴双面胶后迅速放置于标记笔圈定的待取样区上，轻轻按压使隔离圈紧密粘于载玻片上。

5.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述步骤10)(1)中，将样品标签紧贴管壁放入顶扣包埋用EP管，并将顶扣包埋用EP管倒置轻轻套入粘于载玻片上的EP管隔离圈内，由EP管去底的切口处分别滴加纯包埋剂，直至包埋剂加满至切口边缘，其中包埋所用的顶扣包埋用EP管与配对使用的EP管隔离圈为同种EP管制备而成。

6.根据权利要求5所述的一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述步骤10)(1)中，所使用的纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种，其中，纯包埋剂为第一包埋剂或第二包埋剂的样品无需封闭顶扣包埋用EP管管底的切口；纯包埋剂为第三包埋剂的样品需使用502胶水粘合将留存的配对的EP管管底尖端对顶扣包埋用EP管管底的切口进行密闭。

7.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述步骤10)(2)中，滴加一滴纯包埋剂至载玻片上EP管包埋隔离圈内，其中滴加的一滴纯包埋剂与预制包埋块所使用的包埋剂一致，预制包埋块所用的EP管与制备配对使用的EP管隔离圈的EP管为同种EP管。

8.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述步骤12)中，将样品取出冷却至室温后，载玻片正面朝上放置于60℃烤片台上烤5～30s或者用酒精灯火焰于载玻片背面顶扣包埋部位烧灼5～30s，掰下包埋块，于显微镜下核实包埋块的包埋面是否截取得到了待取样区域，待取样组织是否已经剥离载玻片，并检查载玻片上是否残留有待取样组织。