CN103675250A - Dna氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法 - Google Patents

Dna氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，该方法包括以下步骤：实验分组及动物模型的建立，标本制作，光镜下组织形态学观察，透射电子显微镜观察，TUNEL法检测骨细胞凋亡情况，单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤，统计学处理。本方法分别于最后一次给药后第二周、第四周处死实验动物，每次每组5只；取双侧股骨头常规固定脱钙待测，HE染色计数空缺骨陷窝、电镜观察骨细胞形态变化、TUNEL法检测骨细胞凋亡、免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤，探明SANFH与骨髓造血细胞DNA氧化损伤及骨细胞凋亡之间的关系，为进一步探讨激素性股骨头缺血坏死的发病机理提供新的思路。

Description

DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法
技术领域
本发明属于股骨头坏死研究领域，尤其涉及造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法。
背景技术
激素性股骨头缺血坏死(Steroid-induced Avascular Necrosis of FemoralHead，简称SANFH)是指长期使用或短期大量使用肾上腺皮质激素(以下简称激素)引起股骨头部分缺血或完全缺血，进而导致骨细胞、骨髓造血细胞及脂肪细胞坏死的病理过程，已经得到医学界的公认。自1957年首次报道以来，临床病例屡见不乏。
SANFH主要累及中青年，多为双侧性，坏死范围广，病情远较一般的特发性股骨头缺血坏死严重，致残率极高。2003年“非典”过后，又涌现出大量病例。激素导致SANFH是一个复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚。因此，探明SANFH的病因学机制，仍然是该领域研究的重点。由于其发病机理至今未完全明确，大部分病人早期得不到明确诊断，临床亦缺少行之有效的防治方法。这不仅加深了我们探明激素性股骨头缺血坏死病因学机制的紧迫性，同时也给我们对预防、治疗激素性股骨头缺血坏死提出了新的挑战。只有探明其发病机理，才能为临床防治提供理论依据。
自60年代开始，许多学者已开始致力于研究SANFH的发病机理并提出了诸多比较分散的学说，包括：脂肪代谢紊乱、骨内压升高、骨质疏松、激素的细胞毒作用、血管内凝血、潜在血管炎及血管损伤、前凝血状态等。尽管上述研究都从不同角度阐述了SANFH的发病机理，为探讨SANFH的病因学机制奠定了一定基础，但就SANFH早期骨细胞、成骨细胞的病理改变及其潜在原因，特别是上述两类细胞死亡方式及其可逆转因素一直未能明确，至今仍有许多质疑。
90年代开始，随着分子生物学的发展，细胞凋亡理论逐渐受到众多研究者的重视，已成为研究组织器官衰老、损伤等发病机制的重要研究方向。
细胞凋亡即程序化细胞死亡，是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制细胞的主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是正常的生理过程。但是，凋亡过多或过少都可引起疾病发生。细胞凋亡的发生机制主要与氧化应激、钙稳态失衡、线粒体损伤等有关；凋亡信号转导通路受许多诱导因素及调控基因的影响，如激素和生长因子的失衡为细胞凋亡的一个重要诱因。
近年，已有学者开始对骨细胞、成骨细胞凋亡在SANFH中的作用进行了初步探讨，对其发病机制有了新的认识。遗憾的是，这些研究均未对骨细胞、成骨细胞的凋亡机制进行深入研究。
研究业已表明，细胞DNA氧化损伤细胞凋亡中扮演着重要的角色。氧化损伤即氧自由基超出生理需求时所造成的细胞损伤。AOS是原子最外层偶数电子失去一个电子后形成的具有强氧化性的集团。氧自由基化学性质活泼，破坏机体的正常氧化／还原状态，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激状态，而机体氧化损伤的后果之一就是诱导细胞凋亡。当AOS增多时，脂质、蛋白质和DNA发生过氧化，可引起DNA单链破坏及断裂。AOS的强氧化作用是细胞损伤的基本环节。DNA氧化损伤可能与人类衰老、神经退行性疾病、糖尿病以及肿瘤等许多疾病的发生有关，可引起人视网膜血管内皮细胞、人成纤维细胞等发生凋亡。
骨髓造血细胞作为股骨头的重要组成部分，在SANFH早期发生何种病理改变?是否存在DNA氧化损伤?其病理改变与骨细胞凋亡的发生时间先后关系如何?目前这些问题仍未获得有效解决。
发明内容
本发明的目的在于提供一种造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，旨在解决在SANFH早期发生何种病理改变，是否存在DNA氧化损伤，其病理改变与骨细胞凋亡的发生时间先后关系如何的问题。
本发明是这样实现的，一种造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，该实验方法包括以下步骤：
步骤一、实验分组及动物模型的建立；
步骤二、标本制作；
步骤三、光镜下组织形态学观察；
步骤四、透射电子显微镜观察；
步骤五、TUNEL法检测骨细胞凋亡情况；
步骤六、单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤；
步骤七、统计学处理。
进一步，实验分组及动物模型的建立的具体方法如下：
采用随机数字表法，将实验动物随机分成A、B、C、D四组；
A组：10只，为模型组，静脉内注射大肠杆菌内毒素，共两次，每次100μg／kg，间隔24h，在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射甲基强的松龙，共3次，每次20mg／kg，间隔24h；
B组：10只，为对照组，静脉注射大肠杆菌内毒素，共两次，每次100μg／kg，间隔24h，在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射生理盐水，共3次，每次20mg／kg，间隔24h；
C组：10只，为对照组，静脉注射生理盐水，共两次，每次100μg／kg，间隔24h，在第2次注射完生理盐水后随即肌肉注射甲基强的松龙，共3次，每次20mg／kg，间隔24h；
D组：10只，为对照组，静脉注射生理盐水，共两次，每次100μg／kg，间隔24h，在第2次注射完生理盐水后随即肌肉注射生理盐水，共3次，每次20mg/kg，间隔24h；
将动物在最后一次注射后分别于第二、第四周空气栓塞法处死动物，每次每组5只，在相对无菌的条件下取双侧股骨头。
进一步，实验动物为成年健康日本大耳白兔40只，雌雄不限，体重2.5±0.5kg，标准饮食，单笼喂养。
进一步，标本制作的方法如下：
两次所取股骨头，一侧用5％戊二醛溶液固定，另一侧用10％甲醛溶液固定，固定时间为一周，15％乙二胺四乙酸即EDTA脱钙45天，常规石蜡包埋。
进一步，光镜下组织形态学观察的方法为：
(1)取石蜡包埋组织块，制成厚4um切片，HE染色：A、二甲苯I5min；B、二甲苯II5min；C、95％乙醇I3min；D、95％乙醇II3min；E、80％乙醇1min；F、蒸馏水1min；G、苏木精液染色10min；H、流水稍洗去苏木精液3s；I、1％盐酸乙醇3s；J、稍水洗30s；K、促蓝液返蓝30s；L、流水冲洗15min；M、蒸馏水过洗2s；N、0.5％曙红液染色3min；O、蒸馏水稍洗2s；P、80％乙醇稍洗2s；Q、95％乙醇I5min；R、95％乙醇II5min；S、无水乙醇5min；T、无水乙醇5min；U、二甲苯I5min；V、二甲苯II5min；W、二甲苯III5min；X、中性树胶封固；
(2)将(1)切片分别置于OLYMPUS显微镜100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变。
进一步，骨细胞坏死病理变化用空缺骨陷窝百分数表示，即在100倍放大倍率下，任选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，求出空缺骨陷窝所占的百分数；激素性股骨头坏死判定标准：股骨头软骨下区空缺骨陷窝率作为激素性股骨头坏死的组织学判定指标，正常成年家兔股骨头软骨下区空缺骨陷窝率为8％-12％，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过8％-12％即提示骨坏死。
进一步，透射电子显微镜观察的方法如下：
取5％戊二醛固定的股骨头组织，于股骨头软骨下0.2-0.3cm切取1mm×1mm×1mm大小骨块，5％硝酸脱钙2-3h，1％四氧化锇后固定1h，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，包埋剂与无水乙醇分别以1：1、2：1、3：1浓度混合逐层置换无水乙醇，包埋，37℃恒温箱24h浸透，60℃烤箱聚合48h，超薄切片机制备50nm超薄切片，染色即醋酸双氧铀、柠檬酸铅双染色；将超薄切片置于电子显微镜下观察。
进一步，TUNEL法检测骨细胞凋亡情况的方法为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法；
试剂组成：A、磷酸缓冲液PBS pH7.4；B、蛋白酶K200μg／ml，pH7.4；C、含2％H2O2的PBS缓冲液pH7.4；D、TdT酶缓冲液；E、TdT酶反应液；F、洗涤与终止反应缓冲液；G、0.05％二氨基联苯溶液；H、0.5％甲基绿pH4.0；I、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸；J、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体；
缺口末端标记法实验步骤：A、标本预处理：将制备好的石蜡组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min，用无水乙醇洗两次，每次3min，用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min，用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液20ug／ml，于室温水解15min，去除组织蛋白；用蒸馏水洗4次，每次2min；B、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min，用PBS洗两次，每次5min；C、用滤纸吸去载玻片上组织周围的液体，在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1～5min；D、用滤纸小心吸去切片周围的液体，在切片上滴加54μlTdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1小时；E、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片提起和放下一次，使液体搅动；F、组织切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min；G、用PBS洗4次，每次5min；H、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色6min；I、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min；J、于室温用甲基绿进行复染10min，用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s；依同样方法再用100％正丁醇洗三次；K、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，OLYMPUS显微镜下观察并记录实验结果；每张切片随机选5个高倍镜视野，每个区域计数50个骨细胞，计算凋亡细胞指数即凋亡细胞数／视野中细胞总数。
进一步，单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤的方法如下：
A、切片置于0.3％H202中37℃下孵育30min；
B、0.1％胰蛋白酶消化15min；
C、加入单克隆抗体N45.1一滴，37℃下孵育2h；
D、DAB显色5min；
E、HE复染。
进一步，统计学处理的方法如下：
数据均以
Figure BSA0000098627100000061
表示，用Spss13.0软件进行统计分析，空缺骨陷窝率、骨髓造血细胞DNA氧化损伤率、骨细胞凋亡指数的统计检验采用方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD检验。
激素作为非创伤性股骨头缺血性坏死的重要原因业已被广泛接受，实验证实激素是一种细胞凋亡诱导剂，促使成骨细胞和骨细胞凋亡导致骨细胞减少，同时还影响成骨细胞功能，使成骨作用延迟，介导细胞凋亡，造成骨丢失。本实验方法进一步证实了细胞凋亡在激素性股骨头缺血坏死中的作用。
氧化性DNA损伤在生物体细胞老化、死亡的发生过程中起重要作用，自由基一直被认为是引起DNA损伤的主要因素之一。羟自由基和超氧阴离子能直接与DNA分子反应，导致DNA链断裂、碱基修饰和DNA蛋白交联等氧化性DNA损伤，其中最主要的致突变性损伤反应是C-8上乌嘌呤与胸腺嘧啶碱基颠换性突变，产生8-羟基脱氧乌苷(8-OHdG)。骨髓造血细胞作为股骨头骨组织的重要组成部分，其病理改变势必影响股骨头缺血坏死的发生发展，本实验方法证实，骨髓造血细胞DNA氧化损伤发生于骨细胞凋亡之前，是SANFH的早期分子事件。
本实验方法通过对家兔静脉注射大肠杆菌内毒素模拟出系统的前凝血状况后再应用大剂量激素，诱导出典型的激素性股骨头缺血坏死的动物模型，在此基础上对股骨头进行组织形态学、超微结构等观察；并运用免疫组织化学进行综合分析。得出以下结论：激素在导致股骨头发生缺血坏死的过程中骨髓造血细胞DNA氧化损伤率增高，骨细胞凋亡指数增高。本发明提供的实验方法说明骨髓造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡参与了激素股骨头缺血坏死中的发生。总之，激素性股骨头坏死发病机制并非单一，骨髓造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡可能是激素性股骨头坏死的发病机制之一。
本发明通过对家兔用激素诱导出股骨头缺血坏死模型，分别于最后一次给药后第二周、第四周处死实验动物，每次每组5只；取双侧股骨头常规固定脱钙待测，HE染色计数空缺骨陷窝、电镜观察骨细胞形态变化、TUNEL法检测骨细胞凋亡、免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤。探明SANFH与骨髓造血细胞DNA氧化损伤及骨细胞凋亡之间的关系。为进一步探讨激素性股骨头缺血坏死的发病机理提供新的思路。
附图说明
图1是本发明提供的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法的流程图；
图2是本发明实施例提供的第二周A组出现空缺骨陷窝400×；
图3是本发明实施例提供的第二周B组骨陷窝中骨细胞清晰可见400×；
图4是本发明实施例提供的第二周C组骨陷窝中骨细胞清晰可见400×；
图5是本发明实施例提供的第二周D组骨陷窝中骨细胞清晰可见400×；
图6是本发明实施例提供的第四周A组出现大量空缺骨陷窝400×；
图7是本发明实施例提供的图6第四周B组骨陷窝中骨细胞清晰可见400×；
图8是本发明实施例提供的第四周C组骨陷窝中骨细胞清晰可见400×；
图9是本发明实施例提供的第四周D组骨陷窝中骨细胞清晰可见400×；
图10是本发明实施例提供的第二周A组，骨细胞染色质边集，细胞核固缩，可见突起形成，细胞膜完整，褶皱10000×；
图11是本发明实施例提供的第四周A组骨细胞染色质边集，细胞核固缩，可见突起形成，并见凋亡小体12000×；
图12是本发明实施例提供的第四周A组骨细胞染色质边集，细胞核固缩，可见突起形成，细胞膜，完整，褶皱10000×；
图13是本发明实施例提供的第四周D组，骨细胞细胞胞膜完整，浆内可见分布均匀的粗面内质网，胞核内，染色质分布均匀，10000×；
图14是本发明实施例提供的第二周A组未出现凋亡细胞400×；
图15是本发明实施例提供的第二周B组未出现凋亡细胞400×；
图16是本发明实施例提供的第二周C未出现凋亡细胞400×；
图17是本发明实施例提供的第二周D组未出现凋亡细胞400×；
图18是本发明实施例提供的第四周A组出现大量凋亡细胞400×
图19是本发明实施例提供的第四周B组未出现凋亡细胞400×；
图20是本发明实施例提供的第四周C组未出现凋亡细胞400×；
图21是本发明实施例提供的第四周D组未出现凋亡细胞400×；
图22是本发明实施例提供的第二周A组出现大量DNA氧化损伤的骨髓造血细胞400×；
图23是本发明实施例提供的第二周B组见少量DNA氧化损伤的骨髓造血细胞400×；
图24是本发明实施例提供的第二周C组未见DNA氧化损伤的骨髓造血细胞400×；
图25是本发明实施例提供的第二周D组见少量DNA氧化损伤的骨髓造血细胞400×；
图26是本发明实施例提供的第四周A组出现大量DNA氧化损伤的骨髓造血细胞400×；
图27是本发明实施例提供的第四周B组见少量DNA氧化损伤的骨髓造血细胞400×；
图28是本发明实施例提供的第四周C组未见DNA氧化损伤的骨髓造血细胞400×；
图29是本发明实施例提供的第四周D组见少量DNA氧化损伤的骨髓造血细胞400×。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明提供的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
1.0 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 成年健康日本大耳白兔40只，雌雄不限，体重2.5±0.5kg，标准饮食，单笼喂养。由北京富豪动物养殖中心提供，该动物已获国家医学实验学会颁发的合格证书。(合格证编号：20090137)
1.1.2 实验仪器 日立H-700H电镜(日本产)，瑞典LKB2800型超薄切片机(瑞典产)，恒温槽(中国重庆银沙试验仪器有限公司)高速台式离心机(上海精宏试验设备有限公司)，超低温冰箱(日本三洋)，石蜡包埋机(上海LEICA有限公司)，切片机(上海LEICA有限公司)展片机(天津久圣医疗电子仪器有限公司)，烤片机(天津久圣医疗电子仪器有限公司)，JD801图象分析系统(江苏捷讯公司)，MILIPORE超纯水仪，OLYMPUS显微镜。以上设备由内蒙古医学院分子生物学研究中心及电镜中心提供。
1.1.3 主要试剂 大肠杆菌内毒素(中国药品生物制品检定所提供)，甲基强的松龙(法玛西亚普强公司比利时)，单克隆抗体N45.1DNA氧化损伤检测试剂盒(日本产，Sigma-Aldrich公司)、TUNEL凋亡检测试剂盒(武汉博士德公司)。HE染色、乙二胺四乙酸脱钙液等常规试剂由内蒙古医学院分子生物学研究中心提供。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组及动物模型的建立
采用随机数字表法，将实验动物随机分成四组。A组：10只，为模型组，静脉内注射大肠杆菌内毒素，共两次，每次100μg／kg，间隔24h。在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射甲基强的松龙，共3次，每次20mg／kg,间隔24h。B组：10只为对照组，静脉注射大肠杆菌内毒素，共两次，每次100μg／kg，间隔24h。在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射生理盐水，共3次，每次20mg/kg，间隔24h。C组：10只，为对照组，静脉注射生理盐水，共两次，每次100μg／kg，间隔24h。在第2次注射完生理盐水后随即肌肉注射甲基强的松龙，共3次，每次20mg／kg，间隔24h。D组：10只，为对照组，静脉注射生理盐水，共两次，每次100μg／kg，间隔24h。在第2次注射完生理盐水后随即肌肉注射生理盐水，共3次，每次20mg/kg,间隔24h。将动物在最后一次注射后分别于第二、第四周空气栓塞法处死动物，每次每组5只，在相对无菌的条件下取双侧股骨头。
1.2.2 标本制作
两次所取股骨头，一侧用5％戊二醛溶液固定，另一侧用10％甲醛溶液固定，固定时间为一周，15％乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙45天，常规石蜡包埋。
1.2.3 光镜下组织形态学观察 取石蜡包埋组织块，制成厚4um切片，HE染色：A、二甲苯I5min；B、二甲苯II5min；C、95％乙醇I3min；D、95％乙醇II3min；E、80％乙醇1min；F、蒸馏水1min；G、苏木精液染色10min；H、流水稍洗去苏木精液3s；I、1％盐酸乙醇3s；J、稍水洗30s；K、促蓝液返蓝30s；L、流水冲洗15min；M、蒸馏水过洗2s；N、0.5％曙红液染色3min；O、蒸馏水稍洗2s；P、80％乙醇稍洗2s；Q、95％乙醇I5min；R、95％乙醇II5min；S、无水乙醇5min；T、无水乙醇5min；U、二甲苯I5min；V、二甲苯II5min；W、二甲苯III5min；X、中性树胶封固。将上述切片分别置于OLYMPUS显微镜100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变。骨细胞坏死病理变化用空缺骨陷窝百分数表示，即在100倍放大倍率下，任选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，求出空缺骨陷窝所占的百分数。激素性股骨头坏死判定标准：股骨头软骨下区空缺骨陷窝率作为激素性股骨头坏死的组织学判定指标已被广泛采用。正常成年家兔股骨头软骨下区空缺骨陷窝率为8％-12％，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示骨坏死。
1.2.4 透射电子显微镜观察 取5％戊二醛固定的股骨头组织，于股骨头软骨下0.2-0.3cm切取1mm×1mm×1mm大小骨块，5％硝酸脱钙2-3h，1％四氧化锇后固定1h，梯度酒精脱水，EPON812(环氧树脂)包埋，包埋剂与无水乙醇分别以1：1、2：1、3：1浓度混合逐层置换无水乙醇，包埋，37℃恒温箱24h浸透，60℃烤箱聚合48h，瑞典LKB2800型超薄切片机制备50nm超薄切片，染色(醋酸双氧铀、柠檬酸铅双染色)。将上述超薄切片置于日立H-700H电子显微镜下观察。
1.2.5 TUNEL法检测骨细胞凋亡情况 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30％的染色体DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180-200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，此方法为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
试剂组成：A、磷酸缓冲液PBS(pH7.4)；B、蛋白酶K(200μg／ml，pH7.4)；C、含2％H2O2的PBS缓冲液(pH7.4)；D、TdT酶缓冲液(新鲜配)；E、TdT酶反应液；F、洗涤与终止反应缓冲液；G、0.05％二氨基联苯(DAB)溶液；H、0.5％甲基绿(pH4.0)；I、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸；J、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCOR)。实验步骤：A、标本预处理：将制备好的石蜡组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液(20ug／m1)，于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，B、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。C、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1～5min。D、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1小时。E、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。F、组织切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。G、用PBS洗4次，每次5min。H、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色6min。I、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。J、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。K、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，OLYMPUS显微镜下观察并记录实验结果。TUNEL染色阳性细胞着色定于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆内出现阳性颗粒。每张切片随机选5个高倍镜视野，每个区域计数50个骨细胞，计算凋亡细胞指数(凋亡细胞数／视野中细胞总数)。
1.2.6 单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤
原理：氧化性DNA损伤在生物体细胞老化、死亡的发生过程中起重要作用，自由基一直被认为是引起DNA损伤的主要因素之一。羟自由基和超氧阴离子能直接与DNA分子反应，导致DNA链断裂、碱基修饰和DNA蛋白交联等氧化性DNA损伤，其中最主要的致突变性损伤反应是C-8上鸟嘌呤与胸腺嘧啶碱基颠换性突变，产生8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)，单克隆抗体N45.1能够与8-羟基脱氧乌苷特异性结合。A、切片置于0.3％H2O2中37℃下孵育30min；B、0.1％胰蛋白酶消化15min；C、加入单克隆抗体N45.1一滴，37℃下孵育2h；D、DAB显色5min；E、HE复染。
1.2.7 统计学处理数据均以
Figure BSA0000098627100000131
表示，用Spss13.0软件进行统计分析，空缺骨陷窝率、骨髓造血细胞DNA氧化损伤率、骨细胞凋亡指数的统计检验采用方差分析(ANOVA)，多个样本均数的两两比较采用LSD检验。A组的空缺骨陷窝率与细胞凋亡率采用线性相关，-1≤r≤+1表示两个变量呈直线相关关系，r为正数表示正相关，r为负数表示负相关。P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1 组织形态学观察 四个组的股骨头肉眼观察大体形态无明显差异。
2.1.1 光镜改变
第二周时，A组：股骨头病理切片上出现骨坏死，坏死区域主要集中于软骨下，可见骨小梁稀疏、变细，结构紊乱，造血细胞数量减少；空缺骨陷窝增加；骨髓内脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状(附图2)。B组：股骨头病理切片观察见骨小梁完整，排列整齐，致密饱满，骨小梁中骨细胞清晰可见，核大，位于中央；骨髓造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常(附图3)。C组：股骨头病理切片中未见出现骨坏死，光镜下小梁完整，排列整齐，骨小梁中骨细胞清晰可见(附图4)。D组：股骨头病理切片观察见骨小梁完整，排列整齐，致密饱满，骨小梁中骨细胞清晰可见，核大，位于中央；骨髓造血细胞丰富，脂肪细胞相对正常，形态正常(附图5)。第四周时，A组：股骨头病理切片上出现典型的骨坏死，可见骨小梁稀疏、变细，甚至断裂，结构紊乱，有碎片出现；造血细胞数量减少；成骨细胞排列不规则；空缺骨陷窝明显增加；骨髓内脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状(附图6)。B组：股骨头病理切片观察见骨小梁完整，排列整齐，致密饱满，骨小梁中骨细胞清晰可见，核大，位于中央；骨髓造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常(附图7)。C组：股骨头病理切片中未见出现骨坏死，光镜下骨小梁完整，排列整齐(附图8)。D组：股骨头病理切片观察见骨小梁完整，排列整齐，致密饱满，骨小梁中骨细胞清晰可见，核大，位于中央；骨髓造血细胞丰富，形态正常(附图9)。第二周、第四周时各组平均空缺骨陷窝率见表1。
表1 第二周、第四周时各组平均空缺骨陷窝率(％)
四个组的空缺骨陷窝率 第二周及第四周时，A组空缺骨陷窝率均明显高于B组、C组、D组，经统计分析具有显著差异(P<0.01)，B组、C组、D组间无显著性差异。第二周时F=46.775，P=0.00，第四周时，F=83.915，P=0.00，均具有统计学意义。
2.1.2 电镜改变
第二周时，A组：股骨头切片表现为骨细胞细胞核固缩，染色质边集、出现线粒体空泡、可见突起形成，胞质内有大量溶酶体及分泌颗粒，同时有骨髓内出血，B、C、D组：骨细胞，骨髓造血细胞超微结构均正常。第四周时，A组：股骨头切片表现为胞膜完整，细胞核固缩，染色质边集，细胞器消失，凋亡小体出现，B、C、D组：骨细胞，骨髓细胞超微结构均正常(附图10-13)。
2.2 TUNEL骨细胞凋亡观察 TUNEL染色阳性细胞着色定于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆内出现阳性颗粒。每张切片随机选5个高倍镜视野，每个区域计数50个骨细胞，计算凋亡细胞指数(凋亡细胞数/视野中细胞总数)。日本大耳白正常凋亡指数为2-3％。第二周时，A、B、C、D四个组骨细胞凋亡指数分别为2.20±0.47、2.00±0.53、2.20±0.37、1.60±0.47，均位于正常范围内，P>0.05，A组、B组、C组、D组间骨细胞凋亡指数无显著性差异(附图14—17)。第四周时，A模型组的骨标本上可见骨细胞核中有棕黄色颗粒的阳性细胞，骨髓组织内出现大量凋亡的骨细胞。A组细胞凋亡指数明显高于B组、C组、D组，经统计分析具有显著差异(P<0.01)，B组、C组、D组间无显著性差异。A、B、C、D组骨细胞凋亡指数分别为：32.40±1.24、2.40±1.92、1.80±0.77、2.10±0.95。F=140.30，P=0.00，具有统计学意义(附图18-21，SPSS数据分析见附录4)
2.3 骨髓造血细胞DNA氧化损伤第二周时，A组骨髓造血细胞DNA氧化损伤率明显高于B组、C组、D组，经统计分析具有显著差异(P<0.01)，B组、C组、D组间无显著性差异。各组骨髓造血细胞DNA氧化损伤率分别为：29.80±1.26、8.05±1.31、8.24±1.44、8.75±1.47，F=38.18，P=0.00，具有统计学意义(附图22-25)。第四周时，A组骨髓造血细胞DNA氧化损伤率明显高于B组、C组、D组，经统计分析具有显著差异(P<0.01)，B组、C组、D组间无显著性差异。各组骨髓造血细胞DNA氧化损伤率分别为：41.60±1.67、7.80±1.78、8.20±1.48、7.80±1.64，F=189.56，P=0.00，具有统计学意义(附图25-29)。
2.4 第四周时A组中空缺骨陷窝率与骨细胞凋亡指数的线性相关分析，经统计分析，r=0.893，二者呈正相关。第四周时A组中空缺骨陷窝率与骨细胞凋亡指数见表2。
表2 第四周时A组中空缺骨陷窝率与骨细胞凋亡指数
Figure BSA0000098627100000161
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，开不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，该实验方法包括以下步骤：
步骤一、实验分组及动物模型的建立；
步骤二、标本制作；
步骤三、光镜下组织形态学观察；
步骤四、透射电子显微镜观察；
步骤五、TUNEL法检测骨细胞凋亡情况；
步骤六、单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤；
步骤七、统计学处理。
2.如权利要求1所述的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，实验分组及动物模型的建立的具体方法如下：
采用随机数字表法，将实验动物随机分成A、B、C、D四组；
A组：10只，为模型组，静脉内注射大肠杆菌内毒素，共两次，每次100μg／kg，间隔24h，在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射甲基强的松龙，共3次，每次20mg／kg，间隔24h；
B组：10只，为对照组，静脉注射大肠杆菌内毒素，共两次，每次100μg／kg，间隔24h，在第2次注射完大肠杆菌内毒素后随即肌肉注射生理盐水，共3次，每次20mg／kg，间隔24h；
C组：10只，为对照组，静脉注射生理盐水，共两次，每次100μg／kg，间隔24h，在第2次注射完生理盐水后随即肌肉注射甲基强的松龙，共3次，每次20mg／kg，间隔24h；
D组：10只，为对照组，静脉注射生理盐水，共两次，每次100μg／kg，间隔24h，在第2次注射完生理盐水后随即肌肉注射生理盐水，共3次，每次20mg／kg，间隔24h；
将动物在最后一次注射后分别于第二、第四周空气栓塞法处死动物，每次每组5只，在相对无菌的条件下取双侧股骨头。
3.如权利要求2所述的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，实验动物为成年健康日本大耳白兔40只，雌雄不限，体重2.5±0.5kg，标准饮食，单笼喂养。
4.如权利要求1所述的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，标本制作的方法如下：
两次所取股骨头，一侧用5％戊二醛溶液固定，另一侧用10％甲醛溶液固定，固定时间为一周，15％乙二胺四乙酸即EDTA脱钙45天，常规石蜡包埋。
5.如权利要求1所述的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，光镜下组织形态学观察的方法为：
(1)取石蜡包埋组织块，制成厚4um切片，HE染色：A、二甲苯I5min；B、二甲苯II5min；C、95％乙醇I3min；D、95％乙醇II3min；E、80％乙醇1min；F、蒸馏水1min；G、苏木精液染色10min；H、流水稍洗去苏木精液3s；I、1％盐酸乙醇3s；J、稍水洗30s；K、促蓝液返蓝30s；L、流水冲洗15min；M、蒸馏水过洗2s；N、0.5％曙红液染色3min；O、蒸馏水稍洗2s；P、80％乙醇稍洗2s；Q、95％乙醇I5min；R、95％乙醇II5min；S、无水乙醇5min；T、无水乙醇5min；U、二甲苯I5min；V、二甲苯II5min；W、二甲苯III5min；X、中性树胶封固；
(2)将(1)切片分别置于OLYMPUS显微镜100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变。
6.如权利要求5所述的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，骨细胞坏死病理变化用空缺骨陷窝百分数表示，即在100倍放大倍率下，任选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，求出空缺骨陷窝所占的百分数；激素性股骨头坏死判定标准：股骨头软骨下区空缺骨陷窝率作为激素性股骨头坏死的组织学判定指标，正常成年家兔股骨头软骨下区空缺骨陷窝率为8％-12％，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过8％-12％即提示骨坏死。
7.如权利要求1所述的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，透射电子显微镜观察的方法如下：
取5％戊二醛固定的股骨头组织，于股骨头软骨下0.2-0.3cm切取1mm×1mm×1mm大小骨块，5％硝酸脱钙2-3h，1％四氧化锇后固定1h，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，包埋剂与无水乙醇分别以1：1、2：1、3：1浓度混合逐层置换无水乙醇，包埋，37℃恒温箱24h浸透，60℃烤箱聚合48h，超薄切片机制备50nm超薄切片，染色即醋酸双氧铀、柠檬酸铅双染色；将超薄切片置于电子显微镜下观察。
8.如权利要求1所述的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，TUNEL法检测骨细胞凋亡情况的方法为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法；
试剂组成：A、磷酸缓冲液PBS pH7.4；B、蛋白酶K200μg／ml，pH7.4；C、含2％H2O2的PBS缓冲液pH7.4；D、TdT酶缓冲液；E、TdT酶反应液；F、洗涤与终止反应缓冲液；G、0.05％二氨基联苯溶液；H、0.5％甲基绿pH4.0；I、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸；J、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体；
缺口末端标记法实验步骤：A、标本预处理：将制备好的石蜡组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min，用无水乙醇洗两次，每次3min，用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min，用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液20ug／ml，于室温水解15min，去除组织蛋白；用蒸馏水洗4次，每次2min；B、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min，用PBS洗两次，每次5min；C、用滤纸吸去载玻片上组织周围的液体，在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1～5min；D、用滤纸小心吸去切片周围的液体，在切片上滴加54μlTdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1小时；E、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片提起和放下一次，使液体搅动；F、组织切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min；G、用PBS洗4次，每次5min；H、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色6min；I、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min；J、于室温用甲基绿进行复染10min，用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s；依同样方法再用100％正丁醇洗三次；K、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，OLYMPUS显微镜下观察并记录实验结果；每张切片随机选5个高倍镜视野，每个区域计数50个骨细胞，计算凋亡细胞指数即凋亡细胞数／视野中细胞总数。
9.如权利要求1所述的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤的方法如下：
A、切片置于0.3％H2O2中37℃下孵育30min；
B、0.1％胰蛋白酶消化15min；
C、加入单克隆抗体N45.1一滴，37℃下孵育2h；
D、DAB显色5min；
E、HE复染。
10.如权利要求1所述的造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在缺血坏死中作用的实验方法，其特征在于，统计学处理的方法如下：
数据均以表示，用Spss13.0软件进行统计分析，空缺骨陷窝率、骨髓造血细胞DNA氧化损伤率、骨细胞凋亡指数的统计检验采用方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD检验。
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